CN108348465A - 具有提高的稳定性的哺乳动物促卵泡激素组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促性腺激素领域。具体而言，本发明提供了一种改进的包含重组人促卵泡激素和氯甲酚的组合物。这种改进的组合物在高温下具有提高的稳定性，并且可用于治疗不育症，特别是在人患者中。

Description

具有提高的稳定性的哺乳动物促卵泡激素组合物
技术领域
本发明涉及促性腺激素领域。具体而言，本发明提供了一种改进的包含重组人促卵泡激素和氯甲酚的组合物。这种改进的组合物在高温下具有提高的稳定性，并且可用于治疗不育症，特别是在人患者中。
背景技术
促性腺激素是一组蛋白质激素，它调节男性和女性的性腺功能，由此在人的生育能力中起重要作用。受到促性腺激素释放激素(GnRH)刺激后，它们由脊椎动物脑垂体的促性腺细胞分泌。促性腺激素是异二聚体糖蛋白，包括促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。促性腺激素都有相同的α亚基，但包含不同的β亚基，这样确保受体结合特异性。
FSH包含92个氨基酸的α亚基和111个氨基酸的β亚基，该β亚基赋予与FSH受体的特异性结合。天然蛋白的两个亚基都被糖基化修饰。α-亚基在Asn52和Asn78天然糖基化，β-亚基则在Asn7和Asn24天然糖基化。这两个亚基都是作为前体蛋白质在细胞中产生的，然后被加工和分泌。FSH调节身体的发育、生长、青春期成熟和生殖过程。特别地，它刺激生殖细胞成熟，从而参与精子发生和卵泡发生。
卵泡发生由FSH诱导，例如通过FSH与颗粒细胞表面上的FSH受体结合。FSH受体是G蛋白偶联受体，其在FSH结合后激活偶联的G蛋白。G蛋白反过来激活腺苷酸环化酶，导致产生第二信使分子cAMP。细胞中cAMP浓度的增加激活了数个下游靶点，特别是cAMP依赖的蛋白激酶，然后导致黄体酮和雌二醇的合成。黄体酮和雌二醇由颗粒细胞分泌，诱导卵泡发生。颗粒细胞受到FSH刺激后，也释放形成抑制在脑垂体中产生和分泌FSH的负反馈环的抑制素-B。抑制素-B已显示出是FSH刺激卵巢的良好替代标志物。
FSH广泛用于不育症的治疗，或者单独使用或者与其他药物，尤其是与LH联用。在本领域中，用于人治疗的通常是从绝经后人尿(尿FSH)纯化的FSH或由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组产生的FSH。然而，由于存在不同的异构体，FSH制备物具有相当大的异质性。单独FSH异构体显示具有相同的氨基酸序列，但其糖基化的程度和性质不同。特别的同种型的特征在于碳水化合物分支结构的异质性和唾液酸(带负电荷的末端单糖单位)的不同掺入量，这两者都影响同种型的特定生物活性。因此，FSH的糖基化模式对其生物学活性具有显著的影响。
然而，来自不同供体和不同制备物的尿FSH在其碳水化合物结构上可以有显著差异，因而导致很大的批间差异。关于尿产品中存在的病毒也有安全顾虑。此外，从CHO细胞获得的FSH表现出这些仓鼠细胞特有的糖基化模式，该模式与人糖基化模式不同。这些差异导致了所获得的FSH以及进而要施用给患者的药物制备物的生物学活性和不良反应的差异。因此，在本领域中，重组FSH优选使用合适的哺乳动物或人细胞系产生。这样的重组FSH包含优化的同质糖基化模式，因此当施用于患者时具有高生物活性。
为了便于方便和安全的给药，需要稳定和无菌的FSH制剂。在本领域中，使用防腐剂来避免制剂的微生物污染。然而，已知这样的防腐剂可能有害于蛋白质的稳定性，因此可能对FSH制备物具有不利影响。
在本领域中，存在使用FSH治疗不孕症的不同方法。一些方案要求每日给患者施用FSH制备物，共14天及更长时间。可以理想地使用一次以上的稳定的FSH溶液可以省去每天制备要施用的FSH制备物的要求，因此是理想的。
因此，能够获得并提供一种FSH包含优化的均质糖基化模式的FSH制备物的需求未得到满足，其中所述制备物优选具有提高的稳定性。
本发明通过提供稳定的可以使用一次以上的FSH制备物而满足了这种需求。
令人惊奇的是，本发明人发现，防腐剂氯甲酚提高了具有哺乳动物糖基化模式的FSH肽在较高温度下的稳定性。鉴于氯甲酚所属的那类防腐剂往往妨害蛋白质的稳定性，这一发现是出乎意料的，且与现有技术相反。
***
必须注意的是，如本文使用的，除非上下文另外清楚地说明，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代。因此，例如，提及“一个表达盒”包括本文公开的表达盒中的一个或多个，提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可以用来修饰或代替本文所述的方法的等同步骤和方法。
本说明书引用的所有出版物和专利的全部内容通过引用并入本文。在通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的情况下，本说明书将取代任何此类材料。
除非另有说明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方式。本发明预期涵盖这样的等同方式。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，单词“包括/包含(comprise)”和诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”之类的变形将被理解为指的是包含所述要素或步骤或要素组或步骤组，但不排除任何其他要素或步骤或要素组或步骤组。当在本文中使用时，术语“包括/包含(comprising)”可以用术语“含有(containing)”代替，或有时可以用术语术语“具有(having)”代替。
当用于本文中时，“由……组成”不包括权利要求中未指明的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由…组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本特征和新颖性特征的材料或步骤。在本文中的每一处，术语“包括/包含(comprising)”、“基本上由……组成(consisting essentially)”和“由……组成(consist of)”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替代。
如本文所用的术语“约”或“近似”是指在给定值或范围的20％内，优选在10％内，更优选在5％内。它还包括具体数字，例如约20包括20。
除非本文中另有定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常，本文所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交技术相关使用的命名是本领域公知和常用的术语。
除非另有说明，本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且按照在本说明书中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献所描述的方式进行。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold SpringLaboratory Press，Cold Spring Hobor，N.Y.(2001)；Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，J，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to2002)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol I1976 CRC Press；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II 1976 CRC Press。本文所述的与分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学和医药学和药物化学相关使用的命名以及其实验室程序和技术是本领域公知和常用的。
在本说明书的整个文本中引用了数篇文献。本文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)，无论是上文还是下文都通过引用整体并入本文。具体而言，PCT专利申请no.WO2012/017058中公开的教导经过必要的修改同样适用于本发明。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于在先的发明而无权先于此类披露。
发明内容
本发明人已经发现，一种包含具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH和防腐剂氯甲酚的组合物在重组FSH的稳定性方面具有优越的性质。因此，本发明涉及一种包含重组FSH和氯甲酚的组合物，其中所述重组FSH具有哺乳动物糖基化模式。更确切地说，本发明人已经发现防腐剂氯甲酚提高了具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH在高温下的稳定性，其中术语高温是指高于60℃的温度。此外，可以设想重组FSH的哺乳动物糖基化模式可以是人糖基化模式。本发明的组合物可以进一步包含表面活性剂(例如泊洛沙姆188)、张力调节剂、缓冲剂、稳定剂(例如L-甲硫氨酸)和赋形剂。本发明的重组FSH可以通过在人细胞系GT-5s或由其衍生的细胞系或与其同源的细胞系或在其他人细胞系如PerC6、HT-1080或HEK293中产生来获得。此外，本发明的组合物可以能够在施用单个剂量后诱导女性卵泡生长，其中所述单个剂量优选包含25到500iU FSH，且优选肠胃外施用，特别是通过皮下注射施用。优选地，本发明的重组FSH是FSH-GEX。本发明的组合物可以是药物组合物。本发明的组合物和药物组合物均可用于不孕症治疗。本发明的组合物或药物组合物可以用于制备用于诱导卵泡生长和/或卵子成熟以及如本文所述的其它用途的药物组合物。
附图说明
图1通过体外HEK检测测定的相对于不含氯甲酚的制剂经过24个月时期FSH-GEX的效力。
图2在存在氯甲酚或作为对照的不含氯甲酚的情况下，在4℃和37℃下储存12个月后FSH的剂量反应曲线。
图3用氯甲酚(CC)、苯扎氯铵(BAK)或作为对照不用防腐剂(对照(FB))配制的FSH-GEX的动态光散射分析(Z-平均值)。
具体实施方式
本发明人已经发现，一种包含具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH和防腐剂氯甲酚的组合物在重组FSH的稳定性方面具有优越的性质。因此，本发明涉及一种包含重组FSH和氯甲酚的组合物，其中所述重组FSH具有哺乳动物糖基化模式。
“FSH组合物”可以是包含FSH或由FSH组成的任何组合物或物质。它可以是固体或液体形式，并且可以包含除了FSH之外的其他成分。特别地，FSH制备物可以是包含FSH和合适溶剂(例如水和/或醇)的溶液，或者可以是粉末，例如在含有FSH的溶液冻干后获得的粉末。FSH制备物的合适实例是在细胞中表达FSH后，特别是在FSH纯化后获得的组合物，或包含FSH的药物组合物。除了FSH之外，FSH制备物可以含有例如本文所述的溶剂、稀释剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、盐、佐剂和/或表面活性剂。用于本文的术语“FSH制备物”特别是指“包含FSH的组合物”。这些术语优选地在本文中作为同义词使用。
术语“FSH”是指促卵泡激素，一种促性腺激素，FSH是由两个亚基组成的糖蛋白，分别标记为α和β亚基。优选地，FSH是人FSH，特别是由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的α亚基和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的β亚基组成的人FSH。然而，在一个或两个亚基中可以存在一个或多个，例如1个、1或2个、多至3个、多至5个、多至10个或多至20个氨基酸取代、添加和/或缺失。优选地，α亚基的氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、更优选至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的总体同源性或同一性。此外，β亚基的氨基酸序列优选与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％、更优选至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的总体同源性或同一性。FSH的亚基优选是两条分离的多肽链，然而，本文所用的术语“FSH”还包括其中两个亚基彼此共价连接的实施方案，例如，通过交联剂或连接多肽链，以及其中一个或两个亚基被进一步分成若干多肽链的实施方案。优选地，根据本发明的FSH能够结合和/或激活FSH受体，优选人FSH受体。本文使用的术语“FSH”特别是指制备物中的所有FSH蛋白。因此，术语“FSH”特别是指FSH制备物或组合物中的全部FSH蛋白整体。
优选地，FSH蛋白的两个亚基包含连接到多肽链上的一个或多个碳水化合物结构。更优选地，碳水化合物结构与亚基的天冬酰胺残基连接。在特别优选的实施方案中，α亚基包含与Asn52和Asn78连接的两个碳水化合物结构，和/或β亚基包含与Asn7和Asn24连接的两个碳水化合物结构。携带碳水化合物结构的氨基酸残基分别相对于根据SEQ ID NO：1和2的α和β亚基的人氨基酸序列来指定。人FSH的糖部分优选由岩藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡糖胺和/或唾液酸组成。
根据本发明使用的FSH优选是重组FSH，更优选是重组人FSH。术语“重组FSH”是指并非由活的人体或动物体天然产生，然后从其产生的样品如尿液、血液或其它体液、粪便或人体或动物体的组织中获得的FSH。优选地，从经被生物技术工程化的细胞，特别是已经用编码FSH或FSH的α或β亚基的核酸转化或转染的细胞中获得重组FSH。根据优选的实施方案，重组FSH是从包含编码FSH的外源核酸的人细胞中获得的。相应的外源核酸可以例如通过使用一个或多个表达载体而被引入，所述表达载体能够通过例如转染被引入宿主细胞中。用于重组产生蛋白质和FSH的相应方法在现有技术中是公知的，因此不需要进一步描述。
术语“核酸”包括单链和双链核酸和核糖核酸以及脱氧核糖核酸。它可以包含天然存在的以及合成的核苷酸，并且它可以天然地或人工地被修饰，例如通过甲基化、5′-和/或3′-封端。
术语“载体”在本文中以其最通用的含义使用，并且包含用于核酸的任何中间载体，所述中间载体例如能使所述核酸被引入原核和/或真核宿主细胞，并且适当时被整合入宿主细胞的基因组。这种载体优选在宿主细胞中复制和/或表达。载体优选包含一个或多个用于选择包含该载体的宿主细胞的选择标记。合适的选择标记是为宿主细胞提供例如针对特定抗生素的抗性的抗性基因。其他合适的选择标记是，例如，用于诸如DHFR或GS等酶的基因。能够表达重组蛋白(包括FSH)的载体以及能够在宿主细胞中以高产量表达重组蛋白的合适的表达盒和表达元件在现有技术中是公知的，并且也是可商购的，因此在此不需要详述。
根据本发明的FSH是糖基化的，即它被连接到多肽链上的一个或多个，优选四个寡糖修饰。这些寡糖，也称为聚糖或碳水化合物，可以是直链或分支的糖链，并且优选是复合型N-连接的寡糖链。根据分支的数目，寡糖被称作单-、双-、三-或四天线(或甚至五天线)的。单天线的寡糖是无分支的，而双-、三-或四天线的寡糖分别具有一个、两个或三个分支。因此具有更高级天线数(antennarity)的糖蛋白具有更多寡糖端点，并且可以携带更多功能性末端糖单元，例如唾液酸。如本文所用的“至少三天线”是指具有至少3的天线数的寡糖，包括三天线、四天线和五天线寡糖。如本文所用的“至少四天线”是指具有至少4的天线数的寡糖，包括四天线和五天线寡糖。就复合型N-聚糖而言，优选的平分型GlcNAc残基不被视为分支或天线，因此不增加FSH的天线数。
如本文所提及的FSH的糖基化模式特别是指根据本发明的FSH制备物中的所有FSH蛋白的全部糖基化模式。具体而言，包含在FSH蛋白中并因此连接到FSH制备物中的FSH多肽链上的任何聚糖结构都纳入考虑并反映在糖基化模式中。
优选地，本发明的FSH的哺乳动物糖基化模式是人糖基化模式。
本发明的组合物还包含防腐剂氯甲酚。术语“防腐剂”是指加入到制剂中作为抗微生物剂、抗真菌剂、抗支原体剂、抗朊病毒剂和/或抗菌剂的化合物或组合物。氯甲酚优选以产生有效保持制剂基本上无污染(适用于注射)的浓度的量使用。防腐剂氯甲酚的浓度优选为或约为0.005％(抑菌剂质量/溶剂质量)至为或约为1.00％，更优选为或约为0.02％(抑菌剂质量/溶剂质量)至为或约为0.15％，最优选为或约为0.05％至为或约为0.1％。
令人惊奇的是，本文中要求保护的组合物中使用的防腐剂氯甲酚不会通过使蛋白质变性，例如通过影响FSH的异二聚体结构，而对FSH的生物学活性产生不利的影响。此外，与包含在没有氯甲酚的组合物中的具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH相比，防腐剂氯甲酚出乎意料地提高了具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH在高温下的稳定性。这一发现特别令人意料不到，因为防腐剂添加到组合物中时提高所述组合物中包含的FSH的稳定性是未知的。此外，这种作用涉及防腐剂氯甲酚和具有哺乳动物糖基化模式的FSH的组合。当在包含FSH的组合物中使用防腐剂苯扎氯铵时，发明人没有观察到稳定性的提高(参见图2)。
可以观察到稳定性提高的所述高温是至少25℃，至少30℃，至少35℃，40℃，至少45℃，至少50℃，至少55℃C，至少60℃，至少65℃，至少70℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃或至少90℃。在一个优选的实施方案中，所述高温为37℃或更高。
术语“稳定性”是指本发明组合物中FSH的物理、化学和构象稳定性(包括维持生物学效力)。蛋白质制剂的不稳定可能由以下引起：蛋白质分子的化学降解或聚集而形成更高级的聚合物，异二聚体解离成单体，去糖基化，修饰糖基化，氧化(特别是α-亚基)，或减少本发明组合物中包含的FSH多肽的至少一种生物学活性的任何其他结构修饰。由于稳定性提高，本发明的FSH组合物保质期延长。
本发明的组合物可以进一步包含表面活性剂以减少聚集。如果所述制剂施用时使用泵或塑料容器，则这些添加剂就特别有用，因为所述添加剂使由于小瓶和/或递送装置(例如注射器、泵、导管等)的表面上吸附引起的生物学效力的损失最小化。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向，由此降低了生物学效力的损失。合适的表面活性剂可选自环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，优选Pluronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88和PluronicID F68。在本发明的优选实施方案中，加入到本发明组合物中的表面活性剂是泊洛沙姆(Poloxamer)188。
本发明的组合物可以进一步包含张力调节剂。“张力调节剂”是一种生理上耐受的化合物，它赋予制剂合适的张力，以防止与制剂接触的细胞膜上的水净流动。化合物，例如甘油通常以已知浓度用于此目的。其他合适的张力调节剂包括但不限于氨基酸或蛋白质(例如甲硫氨酸或白蛋白)、盐(例如氯化钠)和糖(例如葡萄糖、蔗糖和乳糖)，和/或许多其他在本领域中熟知的张力调节剂。
本发明的组合物可以进一步包含缓冲剂。术语“缓冲剂”是指已知在制剂中用于药物或兽药用途是安全的化合物的溶液，其具有维持或控制制剂的pH在制剂所需的pH范围内的作用。用于控制pH在中等酸性pH至中等碱性pH的可接受的缓冲剂包括但不限于诸如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸的化合物。“TRIS”是指2-氨基-2-羟甲基-1，3，-丙二醇，及其任何药理学上可接受的盐。本发明组合物包含的优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
该组合物可以覆盖很宽的pH范围，例如约pH 4到约pH 10。优选地，本发明的FSH组合物的pH为5.5或约5.5至9.0或约9.0，更优选pH为6.0或约6.0至8.5或约8.5，包括约pH7.0、pH 8.0和8.2，最优选为或约pH 7.0。
本发明的组合物可以进一步包含稳定剂。术语“稳定剂”是指加入到本发明的组合物中以使蛋白质降解(包括聚集、失活和氧化)最小化的化合物。这种降解可以通过外部因素如热和光加速，或者在不含人血液制品如白蛋白的制剂中，或者在含有防腐剂的多剂量制剂中加速。
本文也设想稳定剂是L-甲硫氨酸。US 5272135描述了向组合物中加入游离L-甲硫氨酸抑制具有包含至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸序列的多肽中的甲硫氨酸残基的氧化。据信甲硫氨酸残基的氧化与储存制备物的容易渗透氧气的塑料容器如聚丙烯或低密度聚乙烯(LDPE)有关。
本文进一步设想，所述组合物可以包含赋形剂。本文描述了赋形剂的实例，并且本领域技术人员已知其它实例。
而且，本发明组合物中的FSH优选具有改进的糖基化模式。特别地，高量的平分型GlcNAc残基和/或高量的2，6-偶联的唾液酸以及高量的硫酸化寡糖可能是FSH高活性的原因。此外，根据本发明的FSH组合物还显示出更多样和更复杂的糖基化模式，这意味着与例如获得自CHO细胞的传统FSH制备物相比，制备物中存在更多不同的聚糖结构。相信源自CHO的FSH仅能够激活靶细胞中的一个单一途径，而根据本发明的改进的FSH由于其独特的糖基化模式，显然通过多种不同的途径发挥其生物学活性，从而产生增加的生物反应。这些途径中的一些涉及cAMP信号传导，而另一些新的途径则是cAMP非依赖的。
因此，组合物中的FSH优选具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20％；和/或
(ii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少30％；和/或
(iii)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少30％；和/或
(iv)它是多样的糖基化模式。
还设想，糖基化模式包含特征(i)、(ii)和(iii)中的至少两个，并且优选地，包含特征(i)、(ii)和(iii)的全部。
术语“唾液酸”特别是指神经氨酸的任何N-或O-取代的衍生物。它可以指5-N-乙酰神经氨酸和5-N-羟乙酰神经氨酸，但优选仅指5-N-乙酰神经氨酸。唾液酸，特别是5-N-乙酰神经氨酸优选通过2，3-或2，6-键与糖链连接。优选地，在本文所述的FSH组合物中，2，3-以及2，6-偶联的唾液酸都存在。
本发明的“聚糖的相对量”是指在包含FSH的组合物中连接于FSH糖蛋白的聚糖的特定百分比或百分比范围。特别地，聚糖的相对量是指包含在FSH蛋白中并且因此与包含FSH的组合物中的FSH多肽链相连的所有聚糖的特定百分比或百分比范围。100％的聚糖指分别与FSH制备物的或包含FSH的组合物中的FSH糖蛋白相连的所有聚糖。例如，携带平分型GlcNAc的聚糖的相对量为60％是指一种FSH制备物，其中包含在FSH蛋白中并且因此与所述FSH制备物中的FSH多肽链相连的所有聚糖中的60％包含平分型GlcNAc残基，而包含在FSH蛋白中并且因此与所述FSH制备物中的FSH多肽链相连的所有聚糖中的40％不包含平分型GlcNAc残基。
本文给出的数值，特别是特定糖基化特征的相对量优选理解为近似数值。具体而言，所述数值优选可以达到10％更高和/或更低，特别是达到9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％更高和/或更低。
“2，6-偶联的唾液酸的相对量”是指为2，6-偶联的唾液酸的唾液酸总量的特定百分比或百分比范围。因此，2，6-偶联的唾液酸的相对量为100％意味着所有唾液酸都是2，6-偶联的唾液酸。例如，2，6-偶联的唾液酸的相对量为60％是指一种FSH制备物，其中包含在FSH蛋白质中并且因此与所述FSH制备物中的FSH蛋白的寡糖链相连的所有唾液酸中的60％通过2，6-键连接，而包含在FSH蛋白质中并且因此与所述FSH制备物中的FSH蛋白的寡糖链相连的所有唾液酸中的40％不是通过2，6-键连接，而是例如通过2，3-键连接或2，8-键连接。
术语“多样的糖基化模式”具体是指制备物或组合物中FSH蛋白的糖基化模式，所述糖基化模式包含多种不同的聚糖结构。不同的聚糖结构是寡糖结构，其因至少一个单糖单元和/或至少一个化学修饰(例如，硫酸盐残基、乙酰基残基等)的存在/缺失、量和/或位置而不同。优选地，只有其相对量为糖基化模式中的聚糖结构总量的至少0.02％、更优选至少0.03％、至少0.05％、至少0.07％、至少0.1％、至少0.15％、至少0.2％、至少0.25％、至少0.3％或至少0.5％，一种特定的“不同的寡糖结构”才在这一方面加以考虑。多样的糖基化模式特别是指一种糖基化模式，其包含至少5种不同的聚糖结构。优选地，所述多样的糖基化模式包括至少7种、更优选至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少55种和最优选至少60种不同的聚糖结构。多样的糖基化模式还特别是指一种制备物或组合物中FSH的糖基化模式，其糖基化模式包含比在相应的制备物或组合物中的从CHO细胞获得的FSH更多的不同的聚糖结构，具体地，所述糖基化模式包含比从CHO细胞获得的FSH多至少10％、优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少70％、至少80％、至少90％、和最优选至少100％的不同的聚糖结构。
FSH的唾液酸化程度通常以Z值表示。Z值表示糖蛋白的聚糖结构的相对负电荷。Z值按以下公式计算：
Z＝A1％*1+A2％*2+A3％*3+A4％*4
其中A1％是具有-1电荷的聚糖的百分比，A2％是具有-2电荷的聚糖的百分比，A3％是具有-3电荷的聚糖的百分比，A4％是具有-4电荷的聚糖的百分比。这些百分比是相对于连接到FSH的所有聚糖计算的，包括带电的以及不带电荷的聚糖。聚糖的电荷可以由聚糖中包含的任何带电的单糖单元或取代基提供，特别是由唾液酸残基和/或硫酸根基团和/或磷酸根基团提供。由于FSH的聚糖的电荷一般仅由它们的唾液酸残基决定，并且FSH通常具有四个聚糖结构，所以Z值表示FSH上唾液酸的量或FSH的酸度。然而，当FSH也包含大量的硫酸化聚糖时，Z值则表示唾液酸和硫酸根基团的组合量。
在某些实施方案中，本发明提供了一种FSH制备物，其中所述制备物中的FSH具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少35％；
(ii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少60％；和
(iii)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少30％。
优选地，所述FSH是重组FSH，并且因此可通过在宿主细胞中重组产生获得，所述宿主细胞优选是人宿主细胞。提供相应的糖基化模式的合适的人宿主细胞在下文中描述。
优选地，糖基化模式包含特征(i)、(ii)和(iii)中的至少两个(特别是包含特征(i)和(ii)、(i)和(iii)或(ii)和(iii))，更优选包含特征(i)、(ii)和(iii)的全部。此外，糖基化模式可以进一步包含相对量为至少15％的至少四天线聚糖，和/或相对量为至少80％的携带一个或多个唾液酸残基的聚糖，和/或相对量为至少95％的携带半乳糖的聚糖，和/或相对量为至少60％的携带末端半乳糖单位的聚糖分支，和/或相对量为至少1％、优选至少2.5％的携带硫酸根基团的聚糖。末端半乳糖单元可以任选地进一步携带唾液酸残基。组合物中的重组FSH优选具有至少200的Z值。
携带bisGlcNAc的聚糖的相对量优选为至少25％、至少27％、至少30％、至少35％、至少38％或至少40％。更优选地，该相对量在约25％至约60％的范围内，特别是在约35％至约60％的范围内，或在约38％至约50％的范围内，或者在约40％到约45％的范围内。根据一个实施方案，该相对量为约42％。携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量优选为至少83％、至少85％或至少88％，更优选在约85％至约98％的范围内，或者在约88％至约95％的范围内，最优选约90％。Z值优选为至少210，更优选为至少215、至少220、至少230或至少240。较高的Z值，例如可通过富集FSH制备物的酸性和/或负电荷的FSH蛋白获得。优选地，至少四天线聚糖的相对量为至少16％、至少17％、至少18％或至少19％，更优选为至少20％或至少21％。至少三天线聚糖，尤其是三天线和四天线聚糖的相对量优选为至少25％、至少30％、至少35％或至少40％，更优选为至少45％、至少50％或至少55％。优选地，携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％，更优选为至少75％或至少78％。该相对量可以在约70％至约90％的范围内，特别是在约75％至约85％的范围内。优选地，2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少40％、至少45％、至少50％、至少53％、至少55％、至少60％或至少65％，特别是在约40％至约99％的范围内，优选在约40％至约80％的范围内，在约50％至约60％的范围内或在约53％至约70％的范围内。优选地，2，3-偶联的唾液酸与2，6-偶联的唾液酸之比在约1∶10至约7∶3的范围内，更优选在约1∶5至约3∶2的范围内或在约1∶2至约1∶1的范围内，最优选在约2∶3到约1∶1的范围内。在优选的实施方案中，2，6-偶联的唾液酸的相对量超过2，3-偶联的唾液酸的相对量。携带半乳糖的聚糖的相对量优选为至少97％，最优选为约98％。优选地，携带任选地被唾液酸残基修饰的半乳糖单元的聚糖分支的相对量为至少65％，更优选为至少70％或至少73％。该相对量优选在约60％至约95％的范围内，更优选在约70％至约80％的范围内。优选地，携带硫酸根基团的聚糖(硫酸化寡糖)的相对量为至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％或至少5％，更优选为至少7％、至少10％或至少12％。根据一个实施方案，携带硫酸根基团的聚糖的相对量不超过50％，优选不超过40％、35％、30％、25％或20％。
在优选的实施方案中，制备物中的FSH具有多样的糖基化模式，其中制备物中的FSH包含至少45种或优选至少50种不同的聚糖结构，其中不同的聚糖结构中的每一种具有制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量。在一个实施方案中，制备物中的FSH包含至少35种或优选至少40种不同的聚糖结构，其中不同的聚糖结构中的每一种具有制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.1％的相对量；和/或制备物中的FSH包含至少20种或优选至少25种不同的聚糖结构，其中不同的聚糖结构中的每一种具有制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.5％的相对量；在另一个实施方案中，制备物中的FSH包含的不同的聚糖结构比相应制备物中从CHO细胞获得的FSH多至少40％、优选多至少50％，其中不同的聚糖结构中的每一种具有相应制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％、0.1％或0.5％的相对量。
在优选的实施方案中，根据本发明的重组FSH制备物不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)或可检测量的NeuGc。此外，根据本发明的重组FSH制备物还优选不包含Galili表位(Galα1，3-Gal结构)或可检测量的Galili表位。
本发明特别提供了具有人糖基化模式的FSH。由于这些糖基化特征，引起副作用的外源免疫原性非人结构不存在，这意味着避免了已知由某些外来糖结构引起的不希望的副作用或弊端，所述某些外来糖结构例如对于啮齿类动物生产系统已知的免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal结构)，或者其它结构如已知来自例如酵母系统的免疫原性高甘露糖结构。因此，设想组合物中的重组FSH包含以下特征中的一个或多个：
(a)糖基化模式包含相对量为至少85％的携带一个或多个唾液酸残基的聚糖；
(b)糖基化模式包含相对量为至少18％的至少四天线聚糖；
(c)Z值为至少200；
(d)它是人重组FSH；和/或
(e)它是由人细胞系或人细胞产生的。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量在约25％至约50％的范围内；
(ii)至少四天线聚糖的相对量为至少16％；
(iii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％；
(iv)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少53％；
(v)携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88％；
(vi)Z值为至少220；
(vii)携带半乳糖的聚糖的相对量为至少95％；
(viii)携带任选地被唾液酸残基修饰的末端半乳糖单元的聚糖分支的相对量为至少60％；
(ix)携带硫酸根基团的聚糖的相对量为至少3％；
(x)它包含至少45种不同的聚糖结构，其中不同的聚糖结构中的每一种具有制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量；
(xi)它包含至少35种不同的聚糖结构，其中不同的聚糖结构中的每一种具有制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.1％的相对量；
(xiii)它包含至少20种不同的聚糖结构，其中不同的聚糖结构中的每一种具有制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.5％的相对量；和/或
(xiv)它包含的不同的聚糖结构比相应制备物中从CHO细胞获得的FSH多至少40％，其中不同的聚糖结构中的每一种具有相应制备物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量。
本文还设想，组合物中的重组FSH具有包含以下特征的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量在约25％至约50％的范围内；
(ii)至少四天线聚糖的相对量为至少16％；
(iii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％；
(iv)2，6-偶联的唾液酸的相对量在约53％至约99％的范围内；和
(v)携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88％。
在某些优选的实施方案中，根据本发明的重组FSH组合物具有下表1中列出的糖基化模式之一：
表1：特定的糖基化参数
示出的是具有以下特征的聚糖的相对量：
B：平分型GlcNAc；2，6-S：2，6-偶联的唾液酸；硫酸根：硫酸化聚糖；S＞0：至少一个唾液酸；Z：Z值；四：至少四天线聚糖
在表1中列出的实施方案1至12中，平分型GlcNAc的相对量优选为至少25％，而不是至少20％；和/或2，6-偶联的唾液酸的相对量优选为至少55％、更优选至少60％，而不是至少53％；和/或硫酸化寡糖的相对量优选为至少3％、更优选至少10％，而不是至少2.5％。表1中列出的糖基化模式优选为人糖基化模式和/或不包含NeuGc和Galili表位。
根据本发明的FSH优选是人FSH，其可通过在人细胞，优选人细胞系中产生获得。所述人细胞系优选来源于人血细胞，特别是髓性细胞系，优选髓性白血病细胞系。所述细胞系优选是永生的。在一个优选的实施方案中，用于产生根据本发明的FSH的细胞系是细胞系GT-5s，由Glycotope有限公司(Robert-Rossle-Str，10，13125柏林(德国))根据布达佩斯条约的要求于2010年7月28日保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)(Inhoffenstraβe 7B，38124不伦瑞克(德国))，保藏编号为DS ACC3078；或由其衍生的细胞系、或同源细胞系。GT-5s是永生化的人髓性白血病细胞系，其能够提供如本文所述的特定的糖基化模式。根据本发明，术语“GT-5s”和“GT-5s细胞系”也包括由GT-5s衍生的细胞或细胞系。由GT-5s衍生的细胞系可以例如任选地在处理GT-5s细胞以便增强它们的突变率后通过随机或特异性地从GT-5s培养物中筛选单个克隆或细胞组获得，或通过基因改造GT-5s细胞系获得。筛选到的克隆或细胞组可以进一步按照如上所述进行处理和/或可以进行更多轮的筛选。特别地，与GT-5s同源的细胞系是永生化的人髓性细胞系。优选地，由GT-5s衍生或与GT-5s同源的细胞系能够提供具有类似于从GT-5s获得的糖基化模式的FSH。优选地，由GT-5s衍生或与GT-5s同源的细胞系产生的FSH具有如本文所述的糖基化特征中的一个或多个，特别是携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20％；和/或携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少30％；和/或2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少30％；和/或多样的糖基化模式。由GT-5s衍生或与GT-5s同源的细胞系能够表达具有如本文描述的优选的糖基化模式的FSH，特别是具有选自表1的糖基化模式的FSH。由GT-5s衍生或与GT-5s同源的细胞系产生的FSH的近似糖基化模式优选与从GT-5s获得的FSH的糖基化模式相差20％或更低，更优选15％或更低、10％或更低或5％或更低，特别是在选自如下的糖基化特征中的一个或多个、优选全部的方面：bisGlcNAc的相对量、唾液酸化聚糖的相对量、硫酸化聚糖的相对量、2，6-偶联的唾液酸的相对量、岩藻糖的相对量、四天线聚糖的相对量、携带半乳糖的聚糖分支的相对量以及Z值。此外，根据本发明的FSH优选是具有如本文所公开的一个或多个特异性糖基化特征的人FSH，优选具有选自表1的糖基化模式的人FSH。细胞系GT-5s以及由其衍生的细胞系和与其同源的细胞系是特别有优势的，因为它们提供非常稳定和均质的蛋白质产生，特别是FSH蛋白产生。它们具有非常好的批次间一致性，即当从不同的生产批次获得或者以不同的规模和/或用不同的培养程序生产时所产生的蛋白质和它们的糖基化模式都是相似的。特别地，如本文所述的多样的糖基化模式在使用这些细胞系以表达FSH的不同生产批次间是高度可重现的。
可互换使用的术语“细胞(cell)”和“细胞(cells)”和“细胞系”，优选指一种或多种哺乳动物细胞，特别是人细胞。该术语包括细胞或细胞群的后代。本领域技术人员将认识到，“细胞”包括单个细胞的子代，并且由于天然的、意外的或刻意的突变和/或改变，子代不必与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA补体方面)。“细胞”优选是指分离的细胞和/或培养的细胞，其未被掺入活的人体或动物体内。
因此，本发明提供了可通过在人宿主细胞或人细胞系中产生获得的重组FSH组合物。优选地，重组FSH可从人髓性细胞系获得，所述人髓性细胞系优选永生化人髓性白血病细胞系，特别是细胞系GT-5s或由其衍生的细胞系或与GT-5s同源的细胞系。发现在所述细胞系中产生的FSH表现出如上所述的糖基化模式，并且特别表现出本文所述的有益的治疗和药理学作用。因此，本发明还涉及用于通过在合适的细胞系，特别是如上所述的细胞系，优选细胞系GT-5s、由GT-5s衍生的细胞系或与GT-5s同源的细胞系中重组表达FSH产生重组FSH制备物的方法。重组FSH还可以在其他人细胞系如PerC6、HT-1080或HEK293，或由PerC6、HT-1080或HEK293衍生的细胞系，或与PerC6、HT-1080或HEK293同源的细胞系中表达。分别产生的重组FSH可以被分离并任选地被纯化。
因此，重组FSH组合物优选可通过包括以下步骤的方法获得：
(i)在适用于表达FSH的条件下培养包含编码FSHα和β亚基的核酸的人宿主细胞，优选由细胞系GT-5s衍生的或同源的细胞系，或由细胞系如PerC6、HT-1080或HEK293衍生的或同源的细胞系；和
(ii)分离FSH。
用于表达的人宿主细胞优选是髓性细胞，特别是永生化髓性白血病细胞，并且优选是细胞系GT-5s、或者由细胞系GT-5s衍生的或者是与其同源的细胞系，或者是细胞系如PerC6、HT-1080或HEK293，或由细胞系如PerC6、HT-1080或HEK293衍生的细胞系，或与其同源的细胞系。培养人宿主细胞以使得它们表达FSH。合适的培养条件是本领域技术人员已知的。
FSH的分离优选地还包括以下步骤：
(a)在FSH由人细胞分泌时获得培养物上清液，或在FSH不被分泌时裂解人细胞；
(b)使用色谱步骤例如反相色谱、尺寸排阻色谱和/或疏水相互作用色谱从培养物上清液或细胞裂解物中分离FSH；和
(c)任选地通过除去碱性FSH同种型获得FSH的酸性级分，优选通过使用包括除去碱性FSH同种型的洗涤步骤的阴离子交换色谱，所述洗涤步骤例如在约pH 5.0或约pH 4.5或约pH 4.0下进行的洗涤步骤。
用于重组FSH的合适的纯化方法在例如美国专利申请号US 61/263,931、欧洲专利申请号EP 09 014 585.5和PCT专利申请号WO 2011/063943中有描述。
优选地，编码FSHα亚基的核酸和编码FSHβ亚基的核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含在允许在人宿主细胞中表达的合适的表达载体中。编码FSHα亚基的核酸和编码FSHβ亚基的核酸可以包含在同一载体中，但优选包含在分开的载体中。此外，它们也可以从使用适当的元件例如IRES元件的一个表达盒表达。优选地，FSH由人细胞分泌。在优选的实施方案中，人细胞的培养在发酵罐中和/或在无血清条件下进行。
通过在人宿主细胞或人细胞系中产生获得的重组FSH组合物优选地表现出本文就根据本发明的重组FSH制备物描述的特征，特别地，其糖基化模式包含上文所述的特征中的一个或多个，优选包含至少一种如表1和/或权利要求12至17中所述的糖基化模式。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的重组FSH是重组人FSH(rhFSH)，优选可通过在人细胞系，例如细胞系GT-5s、PerC6、HT-10-80或HEK293中产生获得，所述细胞系包含编码人FSH亚基的一种或多种核酸和用于在宿主细胞中表达所述一种或多种核酸的元件。优选地，rhFSH的α亚基具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1在其全长上具有至少80％，优选至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同源性或优选同一性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，rhFSH的α亚基在第52和78位包含天冬酰胺残基，并在氨基酸Asn52和Asn78处被糖基化。rhFSH的β亚基优选具有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQID NO：2在其全长上具有至少80％，优选至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同源性或优选同一性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，rhFSH的β亚基在第7和24位包含天冬酰胺残基，并且在氨基酸Asn7和Asn24处被糖基化。
在本发明进一步优选的实施方案中，根据本发明的重组FSH组合物能够
(a)在没有显著量的cAMP被释放的浓度下；和/或
(b)通过诱导不依赖于cAMP信号传导的信号转导途径，
刺激颗粒细胞中黄体酮的释放。
根据本发明，术语“其中没有显著量的cAMP被释放”或类似表述，分别地特别指由细胞或组织释放的cAMP的量小于在用以导致最大cAMP释放的浓度的FSH刺激后获得的由细胞或组织释放的cAMP量的25％，优选小于20％，更优选小于15％、小于10％、小于7.5％、小于5％或小于2.5％。这些细胞或组织对FSH的刺激敏感或响应，如颗粒细胞或Sertoli细胞。不依赖于FSH的cAMP释放，即在不存在FSH的情况下也发生的cAMP释放，不在本方面考虑。
优选地，“显著量的cAMP的释放”或“cAMP的显著释放”是指在无FSH时cAMP释放的以上的cAMP任何释放，特别是在测量误差以上的任何可检测的cAMP释放。在实施例中描述了用于测量cAMP释放的标准程序，并且该标准程序可以用于确定cAMP的显著或非显著的释放。“cAMP的释放”是指cAMP的细胞内释放和/或cAMP的细胞外释放或分泌，优选仅指cAMP的分泌。cAMP是指作为细胞信号转导中的第二信使分子的环腺苷单磷酸。cAMP在细胞中由ATP通过腺苷酸环化酶合成。“不依赖于cAMP信号传导”的生物过程或信号转导途径优选不涉及腺苷酸环化酶的活化。
根据另一个实施方案，根据本发明的重组FSH制备物能够通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。在实验中令人惊讶地发现，上述的糖基化模式导致重组FSH相应的新的药理学特征，所述重组FSH表现出本文所述的药理学和治疗优势。
根据一个实施方案，重组FSH组合物能够在诱导颗粒细胞释放cAMP所需的最小浓度以下的浓度下刺激颗粒细胞中黄体酮的释放。以下提及的黄体酮、雌二醇和/或cAMP的释放是指在约1×104至约1×106个颗粒细胞/ml，优选在约5×104至约1×105个颗粒细胞/ml中，特别是在如下面实施例2所述的条件下的体外释放。
优选地，根据本发明的重组FSH制备物能够在不诱导cAMP释放或诱导小于20pmol/ml、小于15pmol/ml、小于10pmol/ml、小于5pmol/ml的cAMP释放的浓度下释放至少100ng/ml、至少150ng/ml、至少200ng/ml，优选至少250ng/ml、至少300ng/ml或至少400ng/ml的黄体酮。
此外，根据本发明的重组FSH组合物优选能够在低于人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)所需的浓度的FSH浓度下释放至少100ng/ml、至少200ng/ml，优选至少300ng/ml或至少400ng/ml的黄体酮。因此，它优选能够在其中人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)不导致相应的、分别同等高的黄体酮释放的浓度下释放至少100ng/ml、至少200ng/ml，优选至少300ng/ml或至少400ng/ml的黄体酮。如实施例所示，与人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)相比，根据本发明的重组FSH诱导分别刺激更强烈的黄体酮的产生。
根据本发明的重组FSH组合物可以具有随后描述的特征中的一个或多个，所述特征可以如PCT专利申请号WO 2012/017058中所述的在颗粒细胞检测中测定。
此外，根据本发明的重组FSH组合物优选能够在不诱导cAMP释放或诱导小于20pmol/ml、小于15pmol/ml、小于10pmol/ml、小于5pmol/ml的cAMP释放的浓度下释放至少50nmol/l、至少75nmol/l、至少100nmol/l、至少125nmol/l或至少150nmol/l的雌二醇。
此外，根据本发明的重组FSH组合物优选能够在低于人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)所需的浓度的FSH浓度下释放至少50nmol/l、至少75nmol/l、至少100nmol/l、至少125nmol/l、至少150nmol/l、至少200nmol/l、至少250nmol/l、至少300nmol/l或至少350nmol/l的雌二醇。因此，它优选能够在其中人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)不导致相应的、分别同等高的雌二醇释放的浓度下释放至少50nmol/l、至少75nmol/l、至少100nmol/l、至少125nmol/l、至少150nmol/l、至少200nmol/l、至少250nmol/l、300nmol/l或至少350nmol/l的雌二醇。如实施例所示，与人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)相比，根据本发明的重组FSH制备物诱导分别刺激更强烈的雌二醇的产生。
因此，组合物中的重组FSH具有以下如可以在颗粒细胞检测中测定的特征中的一个或多个：
(a)它能够在诱导颗粒细胞释放cAMP所需的最小浓度以下的浓度下刺激颗粒细胞中黄体酮的释放；
(b)它能够在不诱导cAMP释放或诱导小于10pmol/ml的cAMP释放的FSH浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少200ng/ml的黄体酮的释放；
(c)它能够在低于人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)所需的浓度的浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少100ng/ml的黄体酮的释放；和/或
(d)它能够在其中人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)不导致相应的黄体酮释放的浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少100ng/ml的黄体酮的释放。
本文所述的关于cAMP释放和性类固醇表达的相应特征可以通过使用例如PCT专利申请号WO 2012/017058中描述的颗粒细胞检测来分析和测定。
如本文所讨论的，根据本发明的重组FSH制备物可以能够早已在其中没有显著量的cAMP释放的浓度下刺激或共刺激性类固醇如黄体酮的释放，特别是在颗粒细胞中黄体酮的释放；特别地，根据本发明的重组FSH可以能够在诱导颗粒细胞释放cAMP所需的最小浓度以下的浓度下刺激颗粒细胞中性类固醇如黄体酮的释放。此外，在某些实施方案中，根据本发明的重组FSH制备物能够通过诱导不依赖于cAMP信号传导的信号转导途径刺激黄体酮的释放，特别是在颗粒细胞中黄体酮的释放。优选地，不育症治疗包括通过根据本发明的重组FSH诱导不依赖于cAMP信号传导的信号转导途径，导致刺激黄体酮释放。然而，包括cAMP信号传导的其他信号转导途径可以另外地由重组FSH激活。在其他实施方案中，不育症治疗不涉及由根据本发明的重组FSH诱导cAMP的显著释放。
根据本发明的术语“不育症治疗”是指治疗与人或动物受试者的生殖或生育有关的功能障碍或疾病；特别地，不育症治疗包括辅助生殖技术、促排卵、体外受精、宫内人工授精，以及实现或改善生殖细胞成熟，例如卵泡发生和精子发生。
在本发明的一个优选实施方案中，组合物中的重组FSH能够在施用单个剂量后诱导女性卵泡生长，其中所述单个剂量优选包含25到500IU FSH，并且优选经肠胃外施用，特别是通过皮下注射施用。
在本发明进一步优选的实施方案中，重组FSH是FSH-GEX。
根据本发明的重组FSH组合物优选存在于药物组合物中。因此，在本发明的另一个实施方案中是包含根据本发明的重组FSH组合物的药物组合物。该药物组合物可以用于本文定义的不育症治疗。所述药物组合物可以包含其它药学活性剂，特别是用于不育症治疗的其他药剂，例如其它促性腺激素，特别是LH和/或CG，优选重组和/或人LH或CG。可替代地，包含重组FSH的药物组合物可以设计成与所述其它药学活性剂联合使用。
术语“药物组合物”特别是指适用于给人或动物施用的组合物，即含有药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或其盐或前药以及载体、稀释剂或药物赋形剂如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂。FSH的国际单位(IU)参见尿FSH的第一个国际标准WHO 92/512(WHO Tech Rep.系列号872，1988)，并根据增强卵巢增重法(Steelman，S.L.&Pohley，F.M，(1953)Endocrinology 53，604-616)测定。
此外，本发明提供了根据本发明的重组FSH制备物或根据本发明的药物组合物，其用于不育症治疗，以及用于治疗不育症的方法，其包括给患者施用根据本发明的重组FSH制备物或根据本发明的药物组合物。
术语“患者”根据本发明是指人类、非人灵长类动物或其他动物，特别是诸如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物如小鼠和大鼠的哺乳动物。在特别优选的实施方案中，患者是人类。在患者是人类的情况下，FSH优选是人FSH。患者可以是男性或女性，优选是女性。
本文还设想，根据本发明的重组FSH制备物甚至在施用仅单个剂量后就能够引起生物学效应。具体而言，根据本发明的FSH制备物或根据本发明的药物组合物能够在仅施用单个剂量的FSH制备物或药物组合物后就诱导患者，特别是人患者中的卵泡生长和/或卵子成熟。优选地，与从人尿获得和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，在施用仅单个剂量后实现的所述生物学效应更高，尤其是卵泡生长和/或卵子成熟是更显著的和/或在更高比率的所治疗患者中实现。所述单个剂量特别包含至少10IU FSH，优选至少15IU FSH、至少20IU FSH或至少25IU FSH，和/或1000IU FSH或更少，优选750IU FSH或更少、500IU FSH或更少、300IU FSH或更少、200IU FSH或更少、150IU FSH或更少、100IU FSH或更少或50IUFSH或更少。优选地，所述单个剂量包含约10IU到约500IU FSH，更优选约20IU到约300IUFSH，例如约25IU FSH、约75IU FSH或约100IU FSH。
本文设想将根据本发明的重组FSH制备物以使得患者的循环系统中FSH浓度小于10IU/L的剂量施用给患者。在某些实施方案中，要施用给患者的剂量使得患者的循环系统中FSH浓度小于约8IU/L、或小于约6IU/L，特别是小于约5IU/L、小于约4IU/L、小于约3IU/L或小于约2IU/L。患者的循环系统中FSH的浓度例如在约0.2至约10IU/L的范围内，特别是在约0.3至约8IU/L、约0.4至约7IU/L或约0.5至约1IU/L的范围内。特别地，FSH以不诱导cAMP显著释放的剂量施用给患者。然而，根据本发明的重组FSH制备物也可以以使得患者的循环系统中FSH浓度更高的剂量施用。如果FSH制备物施用数天，则可能出现这种情况。例如，本发明的FSH制备物可以施用2至20天，优选4至18天，甚至更优选6至15天。在FSH施用数天的情况下，单个剂量可以是约150IU或更少、或约125IU或更少，优选约100IU或更少，甚至更优选约75IU或更少。也可以设想，所述单个剂量可以是约50IU或更少，或甚至25IU或更少。施用本发明的FSH可以例如使得患者的循环系统中的FSH浓度小于约18IU/L、或小于约15IU/L、或小于约12IU/L，特别是小于约10IU/L、小于约8IU/L或小于约5IU/L。
在进一步的实施方案中，如本文所述，根据本发明的重组FSH制备物能够通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
因此，本发明还涉及本文所述的重组FSH组合物或药物组合物，其用于同样不依赖于cAMP诱导和/或刺激性类固醇分泌。此外，本发明还涉及上述重组FSH组合物或药物组合物，其用于通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。另外，本发明还涉及本文所述的重组FSH组合物或药物组合物，其用于在不诱导显著cAMP释放的FSH浓度下诱导和/或刺激性类固醇分泌。此外，本发明还涉及本文所述的重组FSH制剂或药物组合物，其用于在比常用的尿FSH或从CHO细胞获得的重组FSH低得多的浓度下诱导性类固醇分泌。本文详细讨论了所述各种用途，特别是用于不育症治疗的药理学和治疗优势。
“性类固醇”，也称为性腺类固醇或性激素，特别是指与脊椎动物雄激素或雌激素受体相互作用的类固醇激素。术语“性类固醇”包括雄激素，例如合成代谢类固醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮、二氢睾酮和睾酮；雌激素，例如雌二醇、雌三醇和雌酮；和黄体酮。优选地，性类固醇是指天然存在的性类固醇，更优选是指天然的人性类固醇。根据本发明优选的性类固醇是雌二醇和黄体酮，特别是黄体酮。
特别地，不育症治疗可以包括通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。然而，不育症治疗可以另外包括通过涉及cAMP信号转导的一种或多种其他生物过程刺激生殖细胞成熟；在其他实施方案中，不育症治疗不涉及通过所述的其他生物过程刺激生殖细胞成熟。
生殖细胞成熟优选包括卵泡生长和/或精子发生。此外，FSH通过其刺激生殖细胞成熟的生物过程可以包括性类固醇特别是黄体酮的分泌，优选通过颗粒细胞分泌。优选地，不依赖于cAMP信号传导的生物过程是指通过不涉及cAMP作为信使分子的信号转导途径诱导的性类固醇特别是黄体酮的分泌，优选通过颗粒细胞分泌。
在优选的实施方案中，不育症治疗包括辅助生殖技术、促排卵、体外受精(例如胞质内精子注射体外受精)、配子输卵管内移植、宫内授精、女性排卵障碍治疗、女性卵子成熟激素严重缺乏症的治疗、男性精子产生不足的治疗，和/或实现或改善生殖细胞成熟，例如卵泡发生和精子发生，特别是例如在体外受精刺激方案期间和/或用于无排卵障碍治疗的女性卵泡成熟。
在本发明进一步优选的实施方案中，重组FSH组合物或药物组合物具有以下特征中的一个或多个：
(i)它能够在仅施用单个剂量后诱导卵泡生长和/或卵子成熟；和/或
(ii)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更短的循环半衰期；和/或
(iii)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更低的生物利用度；和/或
(iv)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有相似或更高的疗效。
在进一步的实施方案中，与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，根据本发明的重组FSH制备物具有更短的循环半衰期。特别是，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更低的循环半衰期。优选地，该循环半衰期比从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物的循环半衰期短至少5％，更优选短至少10％、至少15％或至少20％。在某些实施方案中，与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，特别是在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中，根据本发明的重组FSH制备物具有更低的生物利用度。优选地，该生物利用度比从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物的生物利用度低至少5％，更优选低至少10％、至少15％或至少20％。此处的所述生物利用度优选是指在药代动力学研究中在施用限定量的FSH后的不同时间点测定血清FSH浓度获得的曲线下面积(AUG)值。优选在通过皮下注射施用FSH后，特别是在单个剂量施用后测定循环半衰期和生物利用度，其中所述单个剂量优选包含约10至约1000IU FSH，更优选包含约25IU至约500IU FSH或约50IU至约300IU FSH，特别是约100IU FSH。具体而言，循环半衰期和生物利用度按照PCT专利申请号WO2012/017058记载的测定。
在优选的实施方案中，特别地，在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中，根据本发明的重组FSH组合物或药物组合物具有与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH组合物或药物组合物类似或甚至更高的疗效。术语“疗效”优选指当施用于受试者时刺激雌二醇和/或抑制素-B释放的能力。疗效优选通过在皮下注射施用FSH后测量一名或多名受试者的血液或血清中雌二醇和/或抑制素-B浓度来测定，特别是在单个剂量施用后，其中所述单个剂量优选包含约10至约1000IU FSH，优选包含约25IU至约500IU FSH或约50IU至约300IU FSH，特别是包含约100IU FSH。具体而言，疗效按照PCT专利申请号WO 2012/017058中的测定。类似的疗效特别是指通过相应的FSH制备物刺激的雌二醇和/或抑制素-B释放导致雌二醇和/或抑制素-B的浓度彼此相差不超过25％，优选不超过20％、不超过15％或不超过10％。
根据本发明的药物组合物可以是单个单位剂量或多个单位剂量的形式。优选地，药物组合物是包含根据本发明的重组FSH的无菌溶液，其进一步包含一种或多种选自溶剂(例如水)、缓冲物质、稳定剂、防腐剂、赋形剂、表面活性剂和盐的成分。单个单位剂量优选包含约10IU至约750IU FSH，更优选包含约25IU至约500IU FSH、约50IU至约400IU FSH或约100IU至约300IU FSH。多个单位剂量包含足够提供多个单个剂量的FSH，特别是至少5个、至少10个、至少20个或至少50个单个剂量。所述药物组合物可以例如是注射笔的形式。
优选地，根据本发明的重组FSH制备物用于肠胃外施用给患者。特别地，重组FSH通过注射或输注，例如静脉内、肌内或皮下施用。在本发明的某些实施方案中，重组FSH存在于药物组合物中。合适的给药方案可以由技术人员确定，并且可以源自本领域的常识。
从人尿获得的FSH组合物特别是从绝经后妇女的尿获得的。在CHO细胞中表达的FSH制备物例如在CHO细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达。从人尿获得的FSH制备物和在CHO细胞中表达的FSH制备物优选是可商购的和批准的药物制备物，特别地分别是Bravelle和Gonal-f。当比较不同FSH制备物的效果时，特别是它们的循环半衰期、生物利用度和疗效，通过将FSH制备物以相同的给药方案通过相同的施用途径施用给相似受试者，并且采用相同或相似其他条件进行分析。
此外，设想根据本发明的FSH组合物或药物组合物可以用于制备用于诱导卵泡生长和/或卵子成熟和/或如权利要求24至30中任一项所定义的用途的药物组合物。
实施例
以下实施例对本发明进行举例说明，但不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：氯甲酚存在或不存在的情况下FSH的活性测定
FSH-GEXTM与稳定转染的HEK293细胞上表达的hFSHR结合并引起cAMP的产生。为进行刺激检测，收获HEK293-FSH-R细胞并以5×104细胞/ml(500μL/孔)的密度接种到24孔板中。细胞在含有10％FCS、2％L-谷氨酰胺和1μM雄烯二酮的DMEM中在37℃和8％CO2下培养过夜。随后，除去上清液，用DMEM洗涤贴壁细胞，并加入浓度范围为1500-1.46ng/ml的FSH-GEXTM。在含有10％FCS、2％L-谷氨酰胺和1μM雄烯二酮的DMEM中进行FSH-GEXTM的系列稀释。所有样品均一式两份进行操作。在37℃和8％CO2下孵育3小时后，收集300μl上清液并在-80℃下储存用于下一步的分析。将剩余的细胞在37℃和8％CO2下再孵育21小时。总共24小时后，将平板在-80℃下冷冻。通过解冻并在剩余的上清液中上下移液来制备细胞裂解物。汇集来自一式两份样品的裂解物并通过离心(1200rpm(311xg)，5min)澄清。
为了测定cAMP含量，通过商购的竞争性EIA(环AMP-酶免疫测定试剂盒，Enzo lifesciences)分析上清液。该检测按照制造商提供的方案进行。采用未经进一步稀释的非乙酰化的样品。来自刺激检测的一式两份的孔在EIA中作为单份测量。用酶标仪(infiniteF200，TECAN)测量450nm处的吸光度，并计算噪声/信号比以评估作为刺激细胞的标志物的cAMP释放。噪声/信号比大于1表示细胞释放cAMP。噪声/信号比越高，cAMP释放越多。基于剂量反应曲线测定EC50，并用测试样品(在此情况下为含有氯甲酚的样品)的EC50除以参考物质(在这种情况下为不含氯甲酚的样品)的EC50得到效力。当在相应的测试点观察到效力为＞0.8到＜1.2时，测试样品被认为是有完全活性的。
经过在4℃下24个月的活性测定的结果说明在整个测试期间在氯甲酚存在的情况下FSH的完全生物学活性(参见图1)。此外，当储存温度升高至37℃时，对照样品与含有氯甲酚的样品相比活性降低，表明后者的稳定效果(参见图2)。
实施例2：动态光散射(DLS)，熔点
使用Zetasizer Nano ZS ZEN3600(Malvern Instruments)，通过动态光散射测定熔点。将20μL样品装入12μL比色皿(低容量石英比色皿ZEN2112，cat#105.251.006-QS，Hellma)中。DTS v5.1对照软件中的测量参数是：“Mark-Houwink参数”，材料“蛋白质”(RI1.45)，缓冲液“50mg/mL蔗糖”(计算粘度1.1685-0.4754cP，取决于温度)，“多种窄模式”，“寻求最佳位置”，“自动衰减选择”，运行时间“自动”，运行次数1，测量次数1。以2度的增量，温度从20℃升高到90℃。在测量之前，将比色杯在每个温度步骤平衡2分钟。散射光的检测角度为173°(反向散射)。测得的Z平均值(以nm计的直径)根据升高的温度进行评估。
结果在图3中给出。与不含防腐剂或苯扎氯铵的制剂相反，防腐剂氯甲酚使FSH分子稳定，如可以通过温度依赖的Z平均值的最低增加看出。
项目
1.一种包含重组FSH和氯甲酚的组合物，其中所述重组FSH具有哺乳动物糖基化模式。
2.根据项1所述的组合物，其中所述重组FSH与包含在没有氯甲酚的组合物中的具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH相比在高温下具有提高的稳定性。
3.根据项2所述的组合物，其中所述高温为37℃或更高。
4.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物糖基化模式是人糖基化模式。
5.根据前述项中任一项所述的组合物，其还包含表面活性剂。
6.根据项5所述的组合物，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆188。
7.根据前述项中任一项所述的组合物，其还包含张力调节剂。
8.根据前述项中任一项所述的组合物，其还包含缓冲剂。
9.根据前述项中任一项所述的组合物，其还包含稳定剂。
10.根据项9所述的组合物，其中所述稳定剂是L-甲硫氨酸。
11.根据前述项中任一项所述的组合物，其还包含赋形剂。
12.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20％；和/或
(ii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少30％；和/或
(iii)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少30％；和/或
(iv)它是多样的糖基化模式。
13.根据项12所述的组合物，其中所述糖基化模式包含特征(i)、(ii)和(iii)中的至少两个；优选地，包含特征(i)、(ii)和(iii)的全部。
14.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述重组FSH可通过
(i)在人细胞系GT-5s或由其衍生的细胞系或与其同源的细胞系中产生获得；或者
(ii)在人细胞系PerC6中产生获得。
15.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH包含以下特征中的一个或多个：
(a)糖基化模式包含相对量为至少85％的携带一个或多个唾液酸残基的聚糖；
(b)糖基化模式包含相对量为至少18％的至少四天线聚糖；
(c)Z值为至少200；
(d)它是人重组FSH；和/或
(e)它是由人细胞系或人细胞产生的。
16.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量在约25％至约50％的范围内；
(ii)至少四天线聚糖的相对量为至少16％；
(iii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％；
(iv)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少53％；
(v)携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88％；
(vi)Z值为至少220；
(vii)携带半乳糖的聚糖的相对量为至少95％；
(viii)携带任选地被唾液酸残基修饰的末端半乳糖单元的聚糖分支的相对量为至少60％；
(ix)携带硫酸根基团的聚糖的相对量为至少3％；
(x)它包含至少45种不同的聚糖结构，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量；
(xi)它包含至少35种不同的聚糖结构，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.1％的相对量；
(xii)它包含至少20种不同的聚糖结构，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.5％的相对量；和/或
(xiii)它包含的不同的聚糖结构比相应组合物中从CHO细胞获得的FSH多至少40％，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有相应组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量。
17.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量在约25％至约50％的范围内；
(ii)至少四天线聚糖的相对量为至少16％；
(iii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％；
(iv)2，6-偶联的唾液酸的相对量在约53％至约99％的范围内；
(v)携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88％。
18.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH能够
(a)在没有显著量的cAMP被释放的浓度下；和/或
(b)通过诱导不依赖于cAMP信号传导的信号转导途径，
刺激颗粒细胞中黄体酮的释放。
19.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH能够通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
20.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH具有以下如可以在颗粒细胞检测中测定的特征中的一个或多个：
(a)它能够在诱导颗粒细胞释放cAMP所需的最小浓度以下的浓度下刺激颗粒细胞中黄体酮的释放；
(b)它能够在不诱导cAMP释放或诱导小于10pmol/ml的cAMP释放的FSH浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少200ng/ml的黄体酮的释放；
(c)它能够在低于人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)所需的浓度的浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少100ng/ml的黄体酮的释放；和/或
(d)它能够在其中人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)不导致相应的黄体酮释放的浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少100ng/ml的黄体酮的释放。
21.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的重组FSH能够在施用单个剂量后诱导女性卵泡生长，其中所述单个剂量优选包含25到500IU FSH，并且优选经肠胃外施用，特别是通过皮下注射施用。
22.根据前述项中任一项所述的组合物，其中所述重组FSH是FSH-GEX。
23.根据项1至22中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
24.根据项1至22中任一项所述的组合物或根据项23所述的药物组合物，其用于不育症治疗。
25.根据项24所述的组合物或药物组合物，其中给患者施用的剂量使得患者的循环系统中的FSH浓度在约0.2至约10IU/L，优选约0.4至约7IU/L的范围内。
26.根据项1至22中任一项所述的组合物或根据项23所述的药物组合物，其用于同样不依赖于cAMP诱导和/或刺激性类固醇分泌。
27.根据项1至22中任一项所述的组合物或根据项23所述的药物组合物，其用于通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
28.根据项1至22中任一项所述的组合物或根据项23所述的药物组合物，其用于在不诱导显著cAMP释放的FSH浓度下诱导和/或刺激性类固醇分泌。
29.根据项24至27中任一项所述的组合物或药物组合物，其用于不育症治疗，其中所述不育症治疗包括辅助生殖技术，促排卵，体外受精例如胞质内精子注射体外受精，配子输卵管内移植，宫内授精，女性排卵障碍治疗，女性卵子成熟激素严重缺乏症的治疗，男性精子产生不足的治疗；和/或实现或改善生殖细胞成熟，例如卵泡发生和精子发生，特别是例如在体外受精刺激方案期间和/或用于无排卵障碍治疗的女性卵泡成熟。
30.根据项24至29中任一项所述的组合物或药物组合物，其中所述重组FSH组合物或药物组合物具有以下特征中的一个或多个：
(i)它能够在仅施用单个剂量后诱导卵泡生长和/或卵子成熟；和/或
(ii)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更短的循环半衰期；和/或
(iii)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更低的生物利用度；和/或
(iv)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有相似或更高的疗效。
31.根据项1至22中任一项所述的组合物或根据项23所述的药物组合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于诱导卵泡生长和/或卵子成熟和/或如项24至30中任一项所定义的用途。

Claims (30)

1.一种包含重组FSH和氯甲酚的组合物，其特征在于，所述重组FSH具有人糖基化模式。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述重组FSH与包含在没有氯甲酚的组合物中的具有哺乳动物糖基化模式的重组FSH相比在高温下具有提高的稳定性。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述高温为37℃或更高。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是泊洛沙姆188。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含张力调节剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含缓冲剂。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含稳定剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述稳定剂是L-甲硫氨酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含赋形剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20％；和/或
(ii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少30％；和/或
(iii)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少30％；和/或
(iv)它是多样的糖基化模式。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述糖基化模式包含所述特征(i)、(ii)和(iii)中的至少两个；优选地，包含所述特征(i)、(ii)和(iii)的全部。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述重组FSH可通过
(i)在人细胞系GT-5s或由其衍生的细胞系或与其同源的细胞系中产生获得；或者
(ii)在人细胞系PerC6中产生获得。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH包含以下特征中的一个或多个：
(a)所述糖基化模式包含相对量为至少85％的携带一个或多个唾液酸残基的聚糖；
(b)所述糖基化模式包含相对量为至少18％的至少四天线聚糖；
(c)Z值为至少200；
(d)它是人重组FSH；和/或
(e)它是由人细胞系或人细胞产生的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征中的一个或多个的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量在约25％至约50％的范围内；
(ii)至少四天线聚糖的相对量为至少16％；
(iii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％；
(iv)2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少53％；
(v)携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88％；
(vi)Z值为至少220；
(vii)携带半乳糖的聚糖的相对量为至少95％；
(viii)携带任选地被唾液酸残基修饰的末端半乳糖单元的聚糖分支的相对量为至少60％；
(ix)携带硫酸根基团的聚糖的相对量为至少3％；
(x)它包含至少45种不同的聚糖结构，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有所述组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量；
(xi)它包含至少35种不同的聚糖结构，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有所述组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.1％的相对量；
(xii)它包含至少20种不同的聚糖结构，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有所述组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.5％的相对量；和/或
(xiii)它包含的不同的聚糖结构比相应组合物中从CHO细胞获得的FSH多至少40％，其中所述不同的聚糖结构中的每一种具有所述相应组合物中FSH的聚糖结构总量的至少0.05％的相对量。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH具有包含以下特征的糖基化模式：
(i)携带平分型N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量在约25％至约50％的范围内；
(ii)至少四天线聚糖的相对量为至少16％；
(iii)携带岩藻糖的聚糖的相对量为至少35％；
(iv)2，6-偶联的唾液酸的相对量在约53％至约99％的范围内；和
(v)携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88％。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH能够
(a)在没有显著量的cAMP被释放的浓度下；和/或
(b)通过诱导不依赖于cAMP信号传导的信号转导途径，
刺激颗粒细胞中黄体酮的释放。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH能够通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH具有以下如能够在颗粒细胞检测中测定的特征中的一个或多个：
(a)它能够在诱导颗粒细胞释放cAMP所需的最小浓度以下的浓度下刺激颗粒细胞中黄体酮的释放；
(b)它能够在不诱导cAMP释放或诱导小于10pmol/ml的cAMP释放的FSH浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少200ng/ml的黄体酮的释放；
(c)它能够在低于人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)所需的浓度的浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少100ng/ml的黄体酮的释放；和/或
(d)它能够在其中人尿FSH或在CHO细胞中产生的重组FSH(Gonal F)不导致相应的黄体酮释放的浓度下在约5×104至约1×105颗粒细胞/ml中刺激至少100ng/ml的黄体酮的释放。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的重组FSH能够在施用单个剂量后诱导女性卵泡生长，其中所述单个剂量优选包含25到500IU FSH，并且优选经肠胃外施用，特别是通过皮下注射施用。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述重组FSH是FSH-GEX。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物或根据权利要求23所述的药物组合物，其用于不育症治疗。
24.根据权利要求23所述的组合物或药物组合物，其特征在于，给患者施用的剂量使得所述患者的循环系统中的FSH浓度在约0.2至约10IU/L，优选约0.4至约7IU/L的范围内。
25.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物或根据权利要求22所述的药物组合物，其用于同样不依赖于cAMP诱导和/或刺激性类固醇分泌。
26.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物或根据权利要求22所述的药物组合物，其用于通过不依赖于cAMP信号传导的生物过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
27.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物或根据权利要求22所述的药物组合物，其用于在不诱导显著cAMP释放的FSH浓度下诱导和/或刺激性类固醇分泌。
28.根据权利要求23至26中任一项所述的组合物或药物组合物，其用于不育症治疗，其中所述不育症治疗包括辅助生殖技术，促排卵，体外受精例如胞质内精子注射体外受精，配子输卵管内移植，宫内授精，女性排卵障碍治疗，女性卵子成熟激素严重缺乏症的治疗，男性精子产生不足的治疗；和/或实现或改善生殖细胞成熟，例如卵泡发生和精子发生，特别是例如在体外受精刺激方案期间和/或用于排卵障碍治疗的女性卵泡成熟。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的组合物或药物组合物，其特征在于，所述重组FSH组合物或药物组合物具有以下特征中的一个或多个：
(i)它能够在仅施用单个剂量后诱导卵泡生长和/或卵子成熟；和/或
(ii)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更短的循环半衰期；和/或
(iii)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有更低的生物利用度；和/或
(iv)与从人尿获得的和/或在CHO细胞中表达的FSH制备物相比，它在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一者或多者中具有相似或更高的疗效。
30.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物或根据权利要求22所述的药物组合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于诱导卵泡生长和/或卵子成熟和/或如权利要求23至29中任一项所定义的用途。
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