CN108342412B - Cipk2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CBL互作蛋白激酶基因的用途：用于构建转基植物，转基因植物具有汞胁迫抗/耐性。所述基因为拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因AtCIPK2，用于构建转基因拟南芥，转基因拟南芥具有汞胁迫抗/耐性；所述基因为青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C.Koch)基因HsCIPK2，用于构建转基因拟南芥，转基因拟南芥具有汞胁迫抗/耐性；或是用于构建转基因水稻，转基因水稻具有汞胁迫抗/耐性。

Description

CIPK2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及CIPK2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用。

背景技术

为了适应不断变化的生存环境，植物必须应对各种生物和非生物胁迫，从而在进化过程中建立起一系列调控机制，如感知和解码各种胁迫信号、信号转导及胁迫相关基因的表达。在植物的生长和发育过程中，Ca²⁺信号是植物细胞逆境生理响应的中心调节者(Dodd et al.,2010)。Ca²⁺信号的变化首先被钙感受器感知和解码，再由钙感受器互作蛋白将信号传递到下游，从而激活下游早期响应基因的表达，最终引起各种生理响应或各种特定的应激反应(Zhu et al.,2013；郑仲仲等,2013)。在过去的十年中，钙调磷酸酶B类似蛋白(Calcinerurin B-like proteins；CBL)，即一种钙感受器，和CBL互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases；CIPKs)，为一种Ca²⁺依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶，已被证实是植物特有的一种信号系统，在植物应答各类胁迫过程中发挥重要调控功能(Hashimotoand Kudla,2011；de la Torre et al.,2013；沈金秋等,2014)。

虽然CBLs在感知胞内钙信号变化中起主导作用，但在CBL-CIPK信号模块中CIPKs是一个必不可少的组成部分。例如，在拟南芥中，AtCIPK6过表达能增加植物对盐胁迫的耐受性(Chen et al.,2013)，而下调AtCIPK6植物对盐胁迫的敏感性提高(Tripathi et al.,2009)。已有的研究表明，野生大麦(Hordeum brevisubulatum)HbCIPK2在拟南芥中的过表达增加植物对盐和渗透胁迫的抗性(Li et al.,2012)，盐生灌木白刺(Nitrariatangutorum)NtCIPK2在大肠杆菌细胞中的表达提高细胞对高盐度、碱度、渗透压、干燥、高温和低温胁迫耐受性(Zheng et al.,2014)，这些研究说明CIPK2对各种非生物胁迫的功能作用。但是，目前没有证据显示CIPK2是否参与重金属胁迫过程。

重金属已成为耕地土壤主要的污染物，重金属进入土壤后不能被土壤微生物所分解，易于在土壤中积累，被作物吸收，影响农新产品质量安全，通过食物链进而对人体健康产生危害(焦位雄等,2017；梁尧等,2013)。汞是一种持久性、高毒性、易生物富集的常见污染物(谷成等,2017)，而大米已成为中国内地人摄入汞的最重要途径(Zhang et al.,2010；Ao et al.,2017)。因此，提高水稻抗/耐汞能力，降低汞毒害具有重要的现实意义。

目前，现有已知的参与盐、渗透压、干燥等非生物胁迫的基因有AtCIPK6、NtCIPK2和HbCIPK2等，但是与重金属胁迫无任何关系。

基因AtCIPK2、HsCIPK2目前已知的功能是增加对盐、温度、干旱和渗透等胁迫的抗性，但是与重金属胁迫无任何关系。

上述参考文献具体如下：

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3、de la Torre F,Gutiérrez-Beltrán E,Pareja-Jaime Y,Chakravarthy S,Martin GB,del Pozo O(2013)The tomato calcium sensor Cbl10and its interactingprotein kinase Cipk6define a signaling pathway in plant immunity.PlantCell.25:2748-2764(de la Torre F,Gutiérrez-Beltrán E,Pareja-Jaime Y,Chakravarthy S,Martin GB,del Pozo O(2013)番茄钙传感受器Cbl10及其互作蛋白激酶Cipk6是植物免疫的一种信号途径.Plant Cell.25:2748-2764)；

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14、沈金秋,郑仲仲,潘伟槐,潘建伟(2014)植物CBL-CIPK信号系统的功能及其作用机理.植物生理学报,50(4):641-650；

15、郑仲仲,沈金秋,潘伟槐,潘建伟(2013)植物钙感受器及其介导的逆境信号途径.遗传,35(7):875-884。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供CIPK2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供CBL互作蛋白激酶(CBL-interactingprotein kinases,CIPKs)基因的用途：用于构建转基植物，所述转基因植物具有汞胁迫抗/耐性。

作为本发明的CBL互作蛋白激酶基因的用途的改进：

所述基因为拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因AtCIPK2，用于构建转基因拟南芥，所述转基因拟南芥具有汞胁迫抗/耐性；基因AtCIPK2的核苷酸序列，GenBank登录号NM_120789；

所述基因为青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C.Koch)基因HsCIPK2，用于构建转基因拟南芥，所述转基因拟南芥具有汞胁迫抗/耐性；或是用于构建转基因水稻，所述转基因水稻具有汞胁迫抗/耐性；基因HsCIPK2的核苷酸序列，GenBank登录号KP638475。

作为本发明的CBL互作蛋白激酶基因的用途的进一步改进：所述转基因拟南芥和水稻具有抗/耐汞(HgCl₂)性。

作为本发明的CBL互作蛋白激酶基因的用途的进一步改进：

用基因AtCIPK2、HsCIPK2分别构建质粒，分别获得表达载体35S::AtCIPK2和35S::HsCIPK2；将表达载体35S::AtCIPK2、35S::HsCIPK2分别导入到野生型拟南芥(Columbia-0,Col-0)，或者将表达载体35S::HsCIPK2导入到野生型日本晴水稻(Nipponbare,Oryzasativa L.ssp.Japonica)中，培养、筛选，获得转基因植株。

备注：所述筛选为选择满足抗性培养基条件生长的植株，在其T1代或T2代进行RT-PCR鉴定CIPK2在转基因植株中的表达水平，收集T1和T2代种子，在抗性培养基上筛选，结合孟德尔分离比，不再出现分离为T3代纯合系。

在本发明中，AtCIPK2基因通过农杆菌介导的花序侵染法将表达载体导入野生型拟南芥，再培育成转基因植株；HsCIPK2基因将表达载体通过农杆菌侵染水稻成熟胚诱导的愈伤组织，再将转化后的愈伤组织培育成转基因植株。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、拟南芥AtCIPK2和青藏高原一年生野生大麦HsCIPK2基因的生物信息学分析、克隆和载体构建：

为研究青藏高原一年生野生大麦HSCIPK2在各种非生物胁迫下的生理作用，以水稻日本晴OsCIPK2和拟南芥ATCIPK2的全长cDNA为探针，对大麦全长cDNA文库进行同源性源序列搜索，并以RT-PCR和测序法从青藏高原一年生野生大麦幼苗总cDNA库中分离出HsIPCK2 CDS。预测的氨基酸序列比较显示，类似于OsCIPK2和ATCIPK2，HSCIPK2包含两个CIPK特异性保守功能域，包括具有激活环的N-末端激酶结构域和具有NaF基序的C-末端调节域(图6)；

通过PCR技术，分别从拟南芥Col-0和青藏高原一年生野生大麦X74克隆CIPK2基因编码序列CDS，通过酶切连接等分子生物学技术将该基因构建到转化表达载体,即35S::AtCIPK2和35S::HsCIPK2(图1)，再通过测序验证。

二、转基因

拟南芥转基因通过花序侵染法将两类表达载体(35S::AtCIPK2和35S::HsCIPK2)导入到野生型拟南芥Col-0，获得AtCIPK2和HsCIPK2基因超表达的转基因株系(T1、T2代)和纯合株系(T3代)。

水稻转基因通过农杆菌侵染水稻成熟胚诱导的愈伤组织，将35S::HsCIPK2表达载体导入到水稻日本晴，获得HsCIPK2基因超表达的转基因株系(T1、T2代)和纯合株系(T3代)。

备注说明：T2、T3代的获取方式分别为：选择满足抗性培养基条件生长的植株，在其T1代或T2代进行RT-PCR鉴定CIPK2在转基因植株中的表达水平，收集T1和T2代种子，在抗性培养基上筛选，结合孟德尔分离比，不再出现分离为T3代纯合系。

三、外源基因CIPK2在拟南芥和水稻中的表达水平

通过转基因技术获得了CIPK2超表达转基因拟南芥和水稻植株，并通过RT-PCR方法检测转基因植株T2代中目标基因CIPK2的表达水平，分别获得多个超表达转基因株系(图2)。

备注说明：与对照相比，表达明显加强的，为超表达转基因株系。

四、AtCIPK2和HsCIPK2基因功能鉴定

萌发5天的AtCIPK2和HsCIPK2超表达拟南芥纯合株系(T3代)和野生型拟南芥Environ Health Perspect 118:1183–1188幼苗，在分别含HgCl₂(2、3、4μM)、CuSO₄(20、40、60μM)和CdCl₂(25、50、75μM)等重金属盐培养基上，表面生长72小时后，测量统计相对根伸长量(％)。结果表明，2μM和3μM HgCl₂处理后，CIPK2超表达植株初生根相对伸长量显著高于野生型(图3A)；2μM HgCl₂处理时，根相对伸长量Col-0,83.1％±11.2％；AtCIPK2,104.7％±15.5％；HsCIPK2,89.1％±8.8％；当3μM HgCl₂处理时，Col-0,8.6％±7.5％；AtCIPK2-9,17.9％±7.5％；HsCIPK2-15,14.3％±10.6％)。当4μM HgCl₂处理时，Col-0、AtCIPK2和HsCIPK2根伸长不存在显著差异。相反，CuSO₄或CdCl₂处理，CIPK2超表达植株初生根相对伸长量与野生型之间无显著性差异(图3B和3C)。

萌发4天的HsCIPK2超表达转基因水稻纯合株系(T3代)和日本晴(非转基因对照；NT)幼苗，在分别含有HgCl₂(0.5μM)、CdCl₂(5μM)、PbCl₂(5μM)和CuSO₄(0.25μM)等重金属盐的液体培养基中，培养24小时。超表达HsCIPK2超表达植株初生根相对伸长量显著高于对照NT(图4)。综上所述，这些结果证明超表达CIPK2提高植株对汞毒的抗/耐性。

采用活细胞成像技术，观测HsCIPK2-GFP在拟南芥根尖表皮细胞中的亚细胞定位。发现HsCIPK2-GFP融合蛋白主要定位于细胞质膜、细胞质和细胞核，而对照GFP蛋白仅定位于细胞质和细胞核(图5A-J)。拟南芥响应HgCl₂(1μM)胁迫时，根表皮细胞质膜、细胞质和核的HsCIPK2-GFP荧光信号迅速增强(图5K-O)。定量分析发现，经HgCl₂处理10分钟后，与空白对照相比，转基因株系根表皮细胞质膜HsCIPK2-GFP荧光强度分别增加约20％和50％，60分钟后达到峰值(分别增加50％和70％)(图5U)，与此相反，相同处理条件下，对照GFP荧光信号明显减弱(图5P-T)。这些结果表明汞胁迫能快速影响HsCIPK2-GFP的质膜定位。

由于工业化的加速，我国耕地土壤重金属污染严重，保守统计达10％(约1.5亿亩)的耕地受到重金属污染威胁。因此，治理和预防土壤重金属污染刻不容缓，其中培育耐性强、稳产高产的作物品种是一条持续有效的途径。基因工程技术的发展使得应用CIPK基因调节作物适应不同逆境条件成为可能。本发明通过分子克隆技术获得拟南芥AtCIPK2和青藏高原一年生野生大麦HsCIPK2基因，通过转基因获得超表达转基因材料，并初步鉴定了该CIPK2基因的功能。本发明使拟南芥和水稻植株生长具有良好的汞逆境抗/耐性，从而促进其生长发育。本发明明确了AtCIPK2和HsCIPK2在抗重金属汞毒性方面的功能，发明成果可用于通过生物技术调节作物CBL互作蛋白激酶基因的表达，从而培育在抗逆境胁迫或产量方面有显著提高的作物新品种。本发明具有良好的应用前景。

综上所述，本发明涉及一种通过PCR克隆拟南芥(Arabidopsis thaliana)和青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C.Koch)CBL互作蛋白激酶(CBL-interactingprotein kinases,CIPKs)基因AtCIPK2和HsCIPK2，并且通过转基因技术获得拟南芥和水稻(Oryza sativa L.)超表达转基因株系，利用该基因超表达提高野生型拟南芥和水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)植株对汞逆境胁迫的抗/耐性，从而有利于植株在汞逆境条件下的生长发育。即，本发明获得了能使植物具有汞胁迫耐性的基因，以及由此获得的转基因植物，和利用所述基因对植物进行改造的方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是拟南芥和野生大麦转化表达载体35S:AtCIPK2和35S:HsCIPK2双CaMV 35S启动子的控制之下示意图，图1A为简明结构示意图，图1B为植物表达载体图谱；

载体用pCAMBIA2300，卡那霉素抗性基因(NPTII)作为转基因筛选标记，35S:AtCIPK2和35S:HsCIPK2载体用35S启动子后接全长AtCIPK2和HsCIPK2CDS，用于转基因后可获得超表达AtCIPK2和HsCIPK2的转基因植株。

图2是拟南芥转基因株系(T2代)和水稻转基因株系(T1代)半定量RT-PCR鉴定AtCIPK2和HsCIPK2转基因表达结果；

图2A为AtCIPK2拟南芥转基因株系和野生型Col-0对照，外源AtCIPK2转基因表达水平与Col-0内源AtCIPK2基因表达水平相比，至少有2个独立转基因株系(T2.9和T2.18)具有超表达水平；

图2B为HsCIPK2拟南芥转基因株系和野生型Col-0对照，HsCIPK2在Col-0中表达，至少有5个独立转基因株系(T2.4、T2.7、T2.10、T2.14和T2.15)具有超表达水平；

图2C为HsCIPK2水稻转基因株系和野生型日本晴(NC；negative control)对照，HsCIPK2在野生型日本晴中表达，至少有2个独立转基因株系(1-1和6-6、6-8)具有超表达水平；

在图2A-2C中，AtActin和OsActin分别为拟南芥和水稻持家基因--肌动蛋白编码基因Actin的PCR产物(用作PCR内参)。

图3是AtCIPK2和HsCIPK2拟南芥超表达株系对重金属(汞、铜和镉)胁迫处理的抗/耐性鉴定结果；

图3A-3C分别为AtCIPK2和HsCIPK2拟南芥超表达株系和Col-0幼苗经不同浓度HgCl₂(0、2、3和4μM；图3A)、CuSO₄(0、20、40和60μM；图3B)和CdCl₂(0、25、50和75μM；图3C)胁迫处理后初生根相对伸长量；根相对伸长率(RER；％；相对平均值±标准偏差)统计结果，经t检验，发现AtCIPK2和HsCIPK2拟南芥转基因植株对汞抗/耐性显著提高(与相同处理浓度Col-0比较，*、**和***分别表示P＜0.05、0.01和P＜0.001)。

图4是HsCIPK2水稻超表达株系对重金属(汞、镉、铅和铜)胁迫处理的抗/耐性鉴定结果；

图4A-4D分别为HsCIPK2水稻超表达株系和非转基因再生株系(NT；non-transgenic regeneration lines；野生型对照)幼苗分别经HgCl₂(0.5μM；图4A)、CdCl₂(5μM；图4B)、PbCl₂(5μM；图4C)、CuSO₄(0.25μM；图4D)胁迫处理后初生根相对伸长量；根相对伸长率(RER；％；相对平均值±标准偏差)统计结果，经t检验，发现HsCIPK2水稻转基因植株对汞抗/耐性显著提高(与NT比较；*表示P＜0.05)。

图5是HsCIPK2-GFP根尖表皮细胞亚细胞定位和HgCl₂胁迫处理对HsCIPK2-GFP亚细胞定位的影响；

图5A-5E为HsCIPK2-GFP在根尖表皮细胞的亚细胞定位，图5F-5J为GFP在根尖表皮细胞的亚细胞定位。其中5A和5F为GFP荧光，5B和5G为FM4-64染色，5C和5H为DAPI染色，5D和5I分别是A-C和F-H的叠加(暗视场)，5E和5J分别是A-D和F-I的叠加(明视场)；→和

所指分别为HsCIPK2-GFP和GFP在细胞膜(FM4-64染色)和细胞核(DAPI染色)上的定位；

图5K-5T是HgCl₂胁迫处理对HsCIPK2-GFP亚细胞定位的影响。图5K-5O为激光共聚焦显微镜观察1μM HgCl₂胁迫处理(10、30、60和90min)后的HsCIPK2-GFP亚细胞定位。图5U为根尖表皮细胞质膜GFP信号定量结果。*和***分别表示P＜0.05和0.001(t检验；与空白对照相比)。图5K中虚线框表示HsCIPK2-GFP质膜信号的定量方法示意图。标尺＝25μm。

图6是HsCIPK2与OsCIPK2和AtCIPK2氨基酸序列比对分析。三个不同物种CIPK2索引号分别为野生大麦HsCIPK2(KP638475)、拟南芥AtCIPK2(AAF86506)和水稻OsCIPK2(ACD76974)。实线框所示分别表示两个保守功能域，激活环和NAF基序。*表示三个高度保守的氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸和Tyr)，为激活环中的可能的磷酸化位点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、拟南芥、青藏高原一年生野生大麦和水稻的培养

拟南芥野生型(Col-0)种子表面消毒(用70％乙醇进行表面消毒10分钟，随后用10％NaClO消毒30分钟，最后用水漂洗8次)，黑暗4℃冷处理3天，置于0.5×Murashige&Skoog(MS)琼脂平板(1.5％琼脂和1％蔗糖，W/V，pH 5.6)培养。幼苗在人工气候培养室(昼夜温度22/20℃，16/8小时光周期，光照强度80μmol m^-2s^-1)、琼脂平板垂直放置。

青藏高原一年生野生大麦X74(Hordeum spontaneum C.Koch)和水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)种子用70％乙醇进行表面消毒10分钟，随后用10％NaClO消毒30分钟，最后用水漂洗8次。在黑暗25℃，大麦无菌种子置于CaCl₂(0.1mM CaCl₂；pH5.8)溶液浸湿的两层滤纸之间萌发1天，种子转移到新的CaCl₂溶液浸湿的脱脂棉滤纸上继续培养4天(黑暗25℃)。水稻种子在黑暗(4℃)处理3天，然后在37℃下萌发3天，最后将发芽种子转移到CaCl₂溶液浸湿的脱脂棉滤纸上继续培养4天(14小时光28℃/10小时暗25℃)。

实施例2、拟南芥AtCIPK2和野生大麦HsCIPK2基因的克隆

ATCIPK2(AAF86506；AT5G07070)和OsCIPK2(ACD7694)的全长cDNA作为探针在大麦的全长cDNA文库(Hordeum vulgare L.；http://earth.lab.nig.ac.jp/～dclust/cgi- bin/barley_pub/)中搜索同源基因。基于与ATCIPK2和OsCIPK2的高度同源性的cDNA序列，利用逆转录(RT)-PCR扩增HSCIPK2的全长编码序列(CDS)。用RNeasy Plant Mini Kit试剂盒(QiAGEN)分离青藏高原一年生野生大麦X74的总RNA，随后用SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)合成了第一链cDNA。用Lasergene software(MegAlign)对CIPK2的氨基酸排列进行生物信息学分析。氨基酸序列的比对分析显示，类似于OsCIPK2和ATCIPK2，HSCIPK2包含两个CIPK特异性功能域，即具有激活环的N-末端激酶结构域和具有NaF基序的C-末端调节域(图6)。此外，HSCIPSK2与OsCIPK2和ATCIPK2分别有86％和64％的氨基酸一致，表明与双子叶植物CIPK2相比，不同的单子叶植物CIPK2有更高的同源性。CIPK2的一个新的同源基因HsIPSK2的CDS及推导的氨基酸序列存入GenBank(登录号KP638475)。

备注说明：拟南芥基因AtCIPK2，GenBank登录号NM_120789；其核苷酸序列如SEQID NO:1所示；青藏高原一年生野生大麦基因HsCIPK2，GenBank登录号KP638475；其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

利用特异性引物(表1)，通过PCR扩增、限制性酶切，并与含2×35S启动子的转化载体(pCAMBIA2300)连接，构建花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制下的AtCIPK2和HsCIPSK2载体(图1)，具有卡那霉素抗性标记。含35S启动子的载体pCAMBIA1300和GFP(编码绿色荧光蛋白)分别用于构建Pro35S:HsCIPK2-GFP载体和Pro35S:GFP(作为阴性对照)。构建载体通过测序确认构建成功。

表1、用于CIPK2克隆、RT-PCR和荧光定量PCR的引物序列

实施例3、AtCIPK2和HsCIPK2基因超表达转基因拟南芥的培育

拟南芥转基因原始受体材料为拟南芥野生型(Col-0)，通过农杆菌介导的花序浸染法导入野生型拟南芥Col-0。可参考已经公开的硕士学位论文“拟南芥网格蛋白轻链的功能分析”(浙江师范大学，2012.4)。

实施例4、HsCIPK2基因超表达转基因水稻的培育

水稻转化用日本晴成熟胚诱导愈伤组织。水稻种子表面灭菌后，成熟胚在含N6D的琼脂平板培养基上诱导愈伤组织。微黄致密的愈伤组织用于根瘤农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)介导基因转化。有良好生长性的愈伤组织转移到含G418(150mg/L；Amresco)固体选择培养基，选择卡那霉素抗性活跃组织，随后转移到含G418(100mg/L)的固体分化培养基，诱导绿苗。最后，在含G418(70mg/L)固体生根培养诱导生根。炼苗后的再生试管苗(T1代)进行水培。经RT-PCR检测T1代植株，确认含35S::HsCIPK2载体的转基因植物为超表达株系。RNA分离和cDNA合成按前述方法。根据OsCIPK2的HsCIPK2非同源区设计RT-PCR引物(表1)。水稻看家基因OsActin2作为内参，野生型日本晴cDNA样品作为阴性对照(NC)。水稻转基因株系外源HsCIPK2和内源OsActin2的PCR扩增均27循环。经G418-抗性选择(即，满足不再出现分离条件)获得HsCIPK2超表达转基因株系的纯合株系T3代。

实施例5、转基因拟南芥和水稻目的基因表达量检测

用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测外源基因在拟南芥转基因株系中的表达。如上所述方法，从T2卡那霉素抗性转基因株系分离总RNA并合成第一链cDNA。用表1的特异性引物，cDNA模板通过PCR扩增AtCIPK2(34个周期)、HsCIPK2(34个周期)和AtActin11(AT3G12110；28个周期；作为内参对照)。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析(图2)。所得结果为：获得编号为T2.9和T2.18两个超表达(AtCIPK2)株系；获得编号为T2.4、T2.7、T2.10、T2.14和T2.15五个超表达(HsCIPK2)株系。

同理，对用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测外源基因在水稻转基因株系中的表达；具体为：T1代植株RNA分离和cDNA合成按上述方法RT-PCR引物见表1。水稻看家基因OsActin2作为内参，野生型日本晴cDNA样品作为阴性对照(NC)。水稻转基因株系外源HsCIPK2和内源OsActin2的PCR扩增均27循环，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析(图2)；所得结果为：获得编号为1和6两个超表达株系。

根据图2，我们能得知：AtCIPK2、HsCIPK2转入拟南芥和水稻中，成功获得超表达转基因株系。

实施例6、AtCIPK2和HsCIPK2拟南芥超表达株系的抗/耐重金属鉴定

为了鉴定AtCIPK2和HsCIPK2拟南芥超表达株系对重金属(汞、铜和镉)胁迫处理的抗/耐性，利用初生根生长来鉴定胁迫处理对AtCIPK2和HsCIPK2超表达拟南芥的影响。将拟南芥野生型(Col-0)和转基因T3代5日龄垂直生长幼苗从0.5×MS琼脂平板(1.5％琼脂和1％蔗糖，W/V，pH 5.6)转移到分别含HgCl₂、CuSO₄和CdCl₂的0.5×MS琼脂平板上，HgCl₂(0、2、3和4μM)、CuSO₄(0、20、40和60μM)和CdCl₂(0、25、50和75μM)垂直培养3天，初生根伸长用ImageJ software(http://rsb.info.nih.gov/ij)测定。初生根长度在处理前(0天)和经3天处理后分别测量一次。为减少处理前(0d)因生理差异对根生长造成的影响，以根相对伸长率(RER；％)评价。根伸长的平均值与对照(Col-0)比较，RER(相对平均值±标准偏差)反映重金属对根生长的毒性。公式计算RERs：RER＝(RL_T3d-RL_T0d)/(RL_M3d-RL_M0d)×100％。RL_T0d和RL_T3d分别为处理前(0天)和胁迫处理3天后的根长(RL；mm)，RL_M0d和RL_M3d分别为0天和3天对照组的根长。三次独立实验、每处理45棵幼苗的测定数据用于统计分析，以非转基因株系(Col-0；野生型)为对照，Student’s t-test(two tails；type 2)进行统计学评价，发现AtCIPK2和HsCIPK2拟南芥转基因植株对汞抗/耐性显著提高(与相同处理浓度Col-0比较，*、**和***分别表示P＜0.05、0.01和P＜0.001)(图3)。

实施例7、HsCIPK2转基因水稻的抗/耐重金属鉴定

日本晴水稻(NT)和转基因HsCIPK2株系水稻(T3代)4日龄幼苗用于抗/耐重金属鉴定。4日龄幼苗分别经0.5μM HgCl₂、5μM CdCl₂、5μM PbCl₂和0.25μM CuSO₄胁迫处理24小时，根长度测定方法、相对伸长率(RER；％)的计算及统计同上述实施例6。统计结果显示HsCIPK2水稻转基因植株对汞抗/耐性显著提高(与NT比较；*表示P＜0.05)，而对镉、铅和铜并没有显著性变化(图4)，说明HsCIPK2在水稻中表达有汞抗/耐性专一性。

实施例8、超表达HsCIPK2-GFP拟南芥根尖表皮细胞亚细胞定位和HgCl₂胁迫处理对HsCIPK2-GFP亚细胞定位的影响

垂直培养5日龄超表达HsCIPK2-GFP转基因幼苗和GFP幼苗，在含5μg/ml4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)的0.5×MS培养液中处理10分钟(黑暗)，用0.5×MS培养液洗涤，然后在含1μM N-(3-triethylammoniumpropyl]-4[6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl]pyridinium dibromide(FM4-64)的0.5×MS培养液中处理2分钟，用于共聚焦显微观察，分析HsCIPK2-GFP的亚细胞定位(图5A-J)。

为了测定汞毒害对HSCIPK2-GFP亚细胞分布的影响，垂直培养5日龄超表达HsCIPK2-GFP转基因幼苗和GFP幼苗在1μm HgCl₂ 0.5×MS液体培养基中培养10-90分钟，然后进共聚焦成像(图5K-T)。

使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5AOBS)拍摄图像。GFP激发波长为488nm(氩激光)，FM4-64为543nm(氦/氖激光)，DAPI为355nm(UV激光)。在465-532nm处检测到GFP、651-761nm处检测到FM4-64、420-470nm检测到DAPI。对于GFP荧光强度的定量分析，相同处理或相同基因型，激光共聚焦显微镜的激光、针孔和增益设置相同。测量质膜(PM)处的GFP荧光信号的强度，使用ImageJ software(http://rsb.info.nih.gov/ij)的徒手画线工具(freehand line tool)分析数据图的ROIs(regions of interest)，并以与30分钟对照相比的相对荧光强度(％)表示。共聚焦实验独立重复至少3次，定量数据用student’s ttest进行统计分析。结果表明氯化汞毒性迅速启动HsCIPK2表达(图5U)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 兰州大学

<120> CIPK2在提高水稻抗/耐汞能力中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2112

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

aggaactctt agattttcct ttatttcttt tttaaaacat aaaatccaaa aatataaata 60

aaaagaattt agacagagga gcagaactga gtccactagt caaccaaaca gagagatccg 120

ttcgttctct tttgtctttc ggattcatcc ctcaattcgg tttcatcata caagagagaa 180

gtgactgttt cttcttcctt tctctttcga gtggtttctc ttcgtcttgc ttctcaatct 240

ttttgttaca ggagatatcg aaatcggttt tgtgttgttg gtctaaaagg ttagacttct 300

gagtcctgat cctattgtgc ttttttgatt cagtagtagt taacctaact tgatttggaa 360

tcaacaaact gggtttaaaa actcaaatgc tttgaggtag tagtttgaag tttgtagatt 420

ttaaggatgg agaacaaacc aagtgtatta actgaaagat atgaagttgg gaggttattg 480

ggtcaaggta cttttgctaa agtgtatttt ggaaggagta atcataccaa cgagagtgta 540

gctatcaaga tgattgacaa ggacaaagtt atgagagtcg ggcttagcca gcaaatcaag 600

cgagagatct ctgtaatgag gatcgctaaa cacccgaatg tcgttgagtt atacgaggtt 660

atggctacaa agtcaaggat ttactttgtt attgagtatt gtaaaggtgg tgagcttttc 720

aacaaggttg caaaaggaaa acttaaagaa gatgttgctt ggaagtattt ttatcagctt 780

attagtgcgg ttgatttttg tcacagccgc ggagtttatc accgcgacat taagccggaa 840

aatcttttgt tggatgacaa tgataatctt aaggtatctg attttggttt aagtgcgctt 900

gctgattgca agcggcaaga tggtcttcta catacaactt gtggtacacc tgcttatgtt 960

gcgcccgagg ttattaaccg aaaaggatac gagggtacga aagcggatat ttggtcttgt 1020

ggtgttgttt tgtttgttct tttggctggt tatcttcctt tccatgacac taatcttatg 1080

gagatgtata ggaagatagg taaagcagac ttcaagtgtc ccagctggtt tgctcctgag 1140

gtaaagagac tattgtgtaa gatgttggac cctaaccatg agactagaat cactattgca 1200

aaaatcaagg agagttcttg gttcagaaag ggtttgcatt tgaagcaaaa aaagatggaa 1260

aagatggaga aacaacaagt cagagaggct actaatccca tggaagctgg aggttcaggc 1320

caaaatgaaa acggagaaaa ccacgagccg cctcgacttg ctaccttgaa tgctttcgat 1380

atcatcgcct tgtctacggg gtttggtctg gcaggacttt ttggggatgt atatgacaag 1440

cgagaatcta ggttcgcgtc gcaaaaacct gcttcagaga tcatttctaa gctagtagag 1500

gttgccaagt gcctgaagct gaagataaga aagcaaggcg caggcttgtt caaactggaa 1560

agagtaaagg aaggaaaaaa cggaattttg acgatggatg cagagatatt ccaagtgacg 1620

ccgacgtttc acctggtgga agtgaagaaa tgtaatggag atacaatgga gtatcagaag 1680

ttagtggagg aggatcttag gcctgctttg gcagatattg tttgggtttg gcaaggcgag 1740

aaggagaaag aggagcagtt actgcaggat gaacaaggag agcaagaacc atcatagcaa 1800

gttcagctac aagcctacaa ctgcaagcac atgaattgtt gcaggaacat gaaaatggta 1860

accctcttgc gacttcagct gaaacagaag caagcatcaa gaaactctaa cgaaaacaga 1920

ggaaggaaaa caataacaat tgcacaaaat ggattctttt tgcatataga ctacaaaaat 1980

tgtagatagt tgattgattt gtaacaacta cgagcttttt ttttaccttg cctcttgtga 2040

agttttgaac gtatattgtt tcatgagtac agtaattgaa tttctttaag agtttggtcg 2100

atacatagca gc 2112

<210> 2

<211> 1353

<212> DNA

<213> 青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C. Koch)

<400> 2

atgggggagc agaaggggaa tattctgatg cacaagtacg agatggggaa gatgctcggg 60

caggggacct ttgccaaggt ctaccatgcc cgcaacatcg agacctcgca gagcgtcgcc 120

atcaaggtga ccgacaagga gaaggttctg aagggcgggc tcacggacca gatcaagcgc 180

gagatctctg tgatgaagct ggtcaagcac cctaacattg ttcagatgta tgaggtcatg 240

gcgaccaaaa ccaagattta ctttgtgttg gagcatgtca agggcggtga gctgtttaac 300

aaggttcaga gaggaaggct caaggaagat gctgcaagga agtacttcca gcagctgatc 360

tgcgcagttg acttttgtca cagcaggggc gtctatcacc gtgatttgaa gcccgagaac 420

cttcttcttg atgagaacag caacctgaaa gtttcagatt ttggtctgag caccatttct 480

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gtgatcctct ttgtgcttat ggctgggtat ctcccgttcc aggataagaa tctgatgaac 660

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agcaactcag caattgaagg caaggaacaa gaaacaaaga agctctccaa catgaatgct 960

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gaggacatcg caaagggcat gcagctgaag ctcgtcaaga aggatggtgg catgttgaag 1140

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gtcacccctg acttccatct tgtggagttg aagaagacaa acggcgatac tctggagtac 1260

cagagggtct ttaaccagga gatgaggccg gcgctgaagg acatagtctg ggcttggcaa 1320

ggcgagccgc agccgcagca gcaatcttgt tga 1353

Claims (2)

1.CBL互作蛋白激酶基因的用途，其特征是：用于构建转基因植物，所述转基因植物具有汞胁迫抗/耐性；

所述基因为拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因AtCIPK2，用于构建转基因拟南芥，所述转基因拟南芥具有汞胁迫抗/耐性；基因AtCIPK2的核苷酸序列的GenBank登录号为NM_120789；

或所述基因为青藏高原一年生野生大麦（Hordeum spontaneum C. Koch）基因HsCIPK2，用于构建转基因拟南芥，所述转基因拟南芥具有汞胁迫抗/耐性；或是用于构建转基因水稻，所述转基因水稻具有汞胁迫抗/耐性；基因HsCIPK2的核苷酸序列的GenBank登录号为KP638475。

2.根据权利要求1所述的CBL互作蛋白激酶基因的用途，其特征是：

用基因AtCIPK2、HsCIPK2分别构建质粒，分别获得表达载体35S::AtCIPK2和35S:: HsCIPK2；将表达载体35S::AtCIPK2、35S::HsCIPK2分别导入到野生型拟南芥，或者将表达载体35S::HsCIPK2导入到野生型日本晴水稻中，培养、筛选，获得转基因植株。

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