CN108342387A - Pcsk9抑制剂类降血脂药的递送系统和生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本文公开了由脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇构成的脂质纳米颗粒,其包裹Cas9 mRNA和靶向小鼠及人中前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)基因保守区域的sgRNA分子。本文还公开了该脂质纳米颗粒的制备方法和用途,以及包含该脂质纳米颗粒的药物组合物和制剂。本文的脂质纳米颗粒和生物制剂可作为PCSK9抑制剂类降血脂药的新型递送系统。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及PCSK9抑制类降血脂药领域,更具体涉及一种新型的PCSK9抑制类降血脂药的新型递送系统和生物制剂。
背景技术
心血管疾病是发达国家当前的主要死因。随着我国生活水平的提高及相关环境因素的改变,心血管疾病的发病率也成逐年上升趋势,逐渐成为一个严重的医疗和社会问题。血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与心血管疾病的发生风险密切相关,尽管他汀(Stains)类药物是目前临床应用的降低LDL-C水平的首选药物,但是部分患者在接受最大剂量他汀类药物后仍旧无法有效降低血脂水平,而且在小部分患者中存在严重的药物副作用问题,使得其应用受到了很大局限。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9,PCSK9)是由肝脏合成的一种蛋白酶,该酶能与肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)结合,促进LDLR降解,致使血中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高。大量研究表明,外源性抑制PCSK9活性后,可加速血浆中LDL-C的清除,从而产生良好的降脂效果。目前,在临床中PCSK9抑制剂类药物的研发主要集中在PCSK9抗体药物。虽然抗体类药物能够有效的抑制PCSK9的活性,但是其存在一过性的缺点,要想维持血浆中LDL-C水平稳定,需要长期反复注射;并且如其他抗体类药物一样,PCSK9抗体类药物造价较高,保存运输比较困难,这些都给其临床应用带来较大限制。
新兴的基因编辑技术CRISPR-Cas9系统由于其高效特异的DNA剪切和编辑能力而得到了在科研领域的广泛应用。CRISPR-Cas9是在细菌中发现的一种DNA剪切系统,通过DNA内切酶Cas9在一段小RNA(guide RNA)的帮助下识别特定的DNA序列并在特定的位点进行剪切。由于需要同时表达一个大的蛋白Cas9和一个小的guide RNA,如何在人体进行安全有效的输送有特异疗效的CRISPR-Cas9系统是一个亟待解决的问题,并已经成为CRISPR-Cas9在临床应用的瓶颈。
已有的CRISPR-Cas9体内输送是通过运用腺病毒表达体系来表达Cas9和guideRNA,但是腺病毒的安全性仍有问题。而且,腺病毒在细胞内的长期稳定表达Cas9这种DNA酶,也有可能带来长期的毒副作用。基于新型的脂质纳米颗粒(LNP)的核酸输送系统已经在活体内输送小RNA比如siRNA和长链RNA比如mRNA上表现出良好的效果。
因此,对于安全有效的输送有特异性疗效的CRISPR-Cas9系统仍存在需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的LNP递送系统,通过将LNP与Cas9 mRNA和一段单链guide RNA(sgRNA)通过微流装置进行混合而得到,其能够有效的被输送到小鼠肝脏并对肝脏细胞中PCSK9基因进行剪切,达到抑制PCSK9蛋白合成的目的。该试剂提供了在人体长期安全降低血脂水平的可能性。
本发明的第一个方面涉及靶向PCSK9基因外显子区域的sgRNA分子,其具有SEQ IDNO:1~SEQ ID NO:4所示的核酸序列之一:GCCCCATGTGGAGTACATTG(SEQ ID NO:1);CGTGCGCAGGAGGACGAGGA(SEQ ID NO:2);CGTGCTCAACTGCCAAGGGA(SEQ ID NO:3);和GCATCCCGTGGAACCTGGAG(SEQ ID NO:4)
本发明的第二个方面涉及用于将基于CRISPR-Cas9系统的RNA分子运输到肝脏的脂质纳米颗粒。该脂质纳米颗粒由脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇构成。该脂质纳米颗粒包裹Cas9 mRNA和如上述第一个方面所述的sgRNA分子。
在本发明的一种实施方式中,该脂多肽分子为脂多肽的多聚体。在本发明的一种具体实施方式中,脂多肽为1,3,5-三(N1,N3,N5-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3),聚乙二醇为PEG2000。
在本发明的一种实施方式中,脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为15∶25∶45∶0.75或15∶30∶40∶0.75。Cas9 mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为(1∶10)-(1∶5)。在一种优选的实施方式中,Cas9 mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为1∶10。
本发明的第三个方面涉及一种生物制剂,其包含本发明第二个方面所述脂质纳米颗粒、Cas9 mRNA和/或本发明第一个方面所述的sgRNA分子,以及药学上可接受的赋形剂和辅料。
本发明的第四个方面涉及脂质纳米颗粒的制备方法,该方法包括:
(i)将脂多肽分子、胆固醇和聚乙二醇溶于酒精中,得到第一溶液;并将Cas9 mRNA和/或sgRNA分子溶于水,得到第二溶液;
(ii)在微流装置中混合所述第一溶液和所述第二溶液,形成所述脂质纳米颗粒。所述制备方法中的脂多肽为1,3,5-三(N1,N3,N5-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3);所述聚乙二醇为PEG2000;并且该sgRNA分子为本发明第一个方面所述的sgRNA分子。
在一种具体的实施方式中,所述脂质纳米颗粒的半径为80-160nm,优选80-120nm。
本发明的包裹有CRISPR-Cas9系统的脂质纳米颗粒和包含该脂质纳米颗粒的生物制剂能够安全有效地输送有特异性疗效的CRISPR-Cas9系统,同时避免腺病毒递送系统带来的安全性问题和毒副作用。
附图说明
图1:根据本发明的方法通过微流装置合成包含Cas9 mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒的方法的示意图。
图2:根据本发明的一种实施方式的用于合成脂质纳米颗粒的微流体芯片的显微镜照片,其中示意性示出了在显微镜下观察到的通道。
图3:根据本发明的一种实施方式通过微流体芯片合成包含Cas9mRNA或sgRNA的脂质纳米微粒的示意图。
图4:靶向小鼠和人PCSK9基因组的sgRNA设计。A.小鼠PCSK9基因组成及sgPsck9-mE3的靶向区域;B.人PCSK9基因组成及sgPsck9-hC1,4,5的靶向区域。
图5:通过瞬时转染Cas9/sgRNA共表达载体,在NIH-3T3和293T细胞系中对PCSK9基因的靶向切割作用。A.实验流程示意图;B.提取NIH-3T3T细胞系基因组,T7E1错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效果,酶切后的目的条带用黑色三角箭头()标识;C.提取293T细胞系基因组,T7E1错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效果,酶切后的目的条带用黑色三角箭头()标识。
图6:TT3脂质纳米微粒合成及体内表达验证。A.TT3脂质纳米微粒合成方法示意图;B.动态光散射测量TT3-O3和TT3-O14脂质纳米微粒的粒径及分布;C.提取小鼠肝细胞中的RNA,反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测Cas9 mRNA水平;D.提取小鼠肝细胞中的RNA,反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测sgRNA水平;E.Western检测尾静脉注射后6h小鼠肝脏中的Cas9蛋白表达水平;F.Western检测尾静脉注射后6h小鼠脾脏中的Cas9蛋白表达水平。
图7:单次注射TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9 mRNA和sgPsck9-mE3在野生型C57/B6J小鼠模型中抑制PCSK9蛋白的作用。A.小鼠实验流程示意图;B.实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏中PCSK9蛋白mRNA表达水平;C.T7E1错配酶实验检测sgPsck9-mE3在Psck9基因中引起特异的基因剪切,而在对照组中没有发现特异性的剪切,酶切后的目的条带用黑色三角箭头()标识;D.Western检测单次尾静脉注射后24h小鼠肝脏中的PCSK9蛋白表达水平。
图8:多次(两次)注射TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9 mRNA和sgPsck9-mE3在野生型C57/B6J小鼠模型中抑制PCSK9蛋白的作用。A.小鼠实验流程示意图;B.实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏中PCSK9蛋白mRNA表达水平;C.T7E1错配酶实验检测sgPsck9-mE3在Psck9基因中引起特异的基因剪切,而在对照组中没有发现特异性的剪切,酶切后的目的条带用黑色三角箭头()标识;D.Western检测多次尾静脉注射后小鼠肝脏中的PCSK9蛋白表达水平。
具体实施方式
除非另有说明,否则本发明的上下文中所用的术语具有下面给出的含义。本文没有具体给出含义的其他术语具有其在本领域中通常的含义。
1.定义:
TT3:1,3,5-三(N1,N3,N5-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺
PDMS:聚二甲基硅氧烷
DOPE:二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)
PEG:聚乙二醇
2.材料和方法
本发明的一种实施方式涉及新型LNP递送系统,包含:脂质纳米颗粒、Cas9mRNA和/或sgRNA,其中脂质纳米颗粒由脂多肽分子与胆固醇和聚乙二醇构成。
图1中示出了根据本发明的方法通过微流装置合成包含Cas9 mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒的方法的示意图。将TT3、DOPE、PEG 2000和胆固醇溶于酒精中,并将Cas9mRNA和/或sgRNA溶于水中,然后将两种溶液一起在微流装置中被快速混合,形成半径为80-160nm的颗粒。
2.1.靶向PCSK9基因的sgRNA序列设计
从Genebank中获得小鼠和人的PCSK9基因序列,通过CRISPR设计工具(http://www.genome-engineering.org/crispr/)及sgRNA的设计原则,评估PCSK9基因序列上得分较高的靶位点设计sgRNA。选取并合成4条分别靶向小鼠或人PCSK9基因中外显子区域的sgRNA,分别命名为mE3和hC1,4,5。
表1中示出了靶向PCSK9基因的sgRNA的序列,及其所靶向在PCSK9基因上的外显子区域。
表1:靶向PCSK9基因外显子区域的sgRNA序列
2.2.sgPsck9-mE3,sg PCSK9-hC1,4,5表达载体的构建
根据设计的sgRNA序列,在其5’末端加上CACCG得到正向寡核苷酸序列,在其互补链的5’末端加上AAAC,3’末端加上C得到反向寡核苷酸序列,分别合成正向和反向寡核苷酸序列。将合成的序列用T4多聚核苷酸激酶于37℃处理30分钟使其磷酸化,95℃变性5分钟、以1.5℃/分钟降温至25℃退火后,得到具有BsmBI(或BbsI)粘性末端的双链DNA片段,如下:
正向:5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
反向:CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’
磷酸化、变性及退火体系为:
将双链DNA片段和用BbsI酶切过的PX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene#42230)载体进行连接,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上,筛选阳性菌落,提取阳性菌落质粒进行分析及测序,确定gRNA表达载体构建成功,命名为PX330-PCSK9gRNA(mE3,hC1,4,5)。
2.3.在NIH-3T3或293T细胞系中检测瞬时检测转染Cas9和sgRNA表达载体对于相
应PCSK9基因序列的剪切作用
将NIH-3T3或293T细胞系接种于12孔板中,每孔2.5×105个,待细胞密度达到70%-80%时进行转染。用NEOFECTTM DNA transfection reagent转染前述Cas9/sgRNA表达载体,过夜更换37℃预热的新鲜培养基,继续培养72h后收集细胞细胞。柱纯化法提取细胞中的DNA,用T7E1错配酶检测瞬时转染Cas9/sgRNA表达载体后,NIH-3T3或293T细胞中PCSK9基因列是否产生了突变。
2.4.柱纯化法提取DNA/RNA
使用广州美基生物科技有限公司(Magen)公司的DNA/RNA共提试剂盒(catalog#R5111),并按其试剂盒中所述方法从培养细胞和小鼠肝脏样品同时抽提RNA和DNA。
2.5.T7E1错配酶检测
根据sgRNA-mE3,sgRNA-hC1,4,5在相应PCSK9基因组上的靶位点设计引物PCR扩增出包含sgRNA靶位点的片段,表2中示出了引物序列。
表2:根据sgRNA-mE3,sgRNA-hC1,4,5在PCSK9基因组上的靶位点设计的PCR引物
PCR体系如下:
PCR反应循环
使用Axygen公司胶回收试剂盒或天根公司超薄PCR产物纯化试剂盒回收PCR得到目的片段,具体方法按照公司提供的说明书进行,Nanodrop测定DNA浓度。
向回收得到的目的片段中加入NEB Buffer2,按如下方式退火:
向退火产物中加入1μl T7E1内切酶,37℃,30min。加入6X Purple Loading Dye,2%琼脂糖凝胶电泳检测。
Cas9在识别的PAM上游3bp的位置切断目的DNA双链。表3中示出了预测的酶切目的片段大小。
表3:sgRNA的预测的酶切目的片段大小
2.6.包裹Cas9mRNA或sgRNA的脂质纳米微粒的合成
2.6.1用于合成脂质纳米微粒的PDMS微流体芯片制备
将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物和固化剂在烧杯中充分混合,放入真空箱内除去混合物内的气泡。浇铸到使用光刻加工的SU-8模具上,放入烘箱内加热固化,从SU-8模具上揭下固化后的PDMS块。在PDMS块上结构的入口和出口位置打孔,沿芯片边界裁切PDMS块。对PDMS块做氧气等离子体清洗,将PDMS块对准,按压键合。每次在合成脂质纳米微粒前用氧气等离子体做亲水处理。
2.6.2脂质纳米微粒合成
下表4中示出了各脂质纳米微粒的两种配方(O3配方和O14配方):
表4:脂质纳米微粒的组成
合成方法:用无水乙醇溶解各脂质成分得到储液,按包裹的Cas9 mRNA或sgRNA的质量以及各脂质成分的比例计算各脂质成分所需用量,将配制好的乙醇相的脂质成分与水相的RNA组分一起推入微流体芯片装置使其快速混合,通过静电相互作用组装成内部包裹有RNA的脂质纳米微粒。用于小鼠体内实验的脂质纳米微粒在尾静脉注射前需用3.5K MWCO的透析卡在PBS缓冲液中透析1小时,透析完成后于4℃保存。图3中是示出了根据本发明的一种实施方式通过微流体芯片合成包含Cas9mRNA或sgRNA的脂质纳米微粒的示意图。
脂质纳米微粒的表征:用动态光散射(DLS)测量合成的脂质纳米微粒粒径和分布,用Quant-iT RiboGreen RNA Kit检测脂质纳米微粒的包裹效率。
2.6.3Quant-iT RiboGreen试剂盒定量检测脂质纳米微粒的包裹效率
用DEPC水稀释20×TE溶液配制成1×TE工作液,将合成的脂质纳米微粒一份用1×TE工作液按1∶100的比例稀释,一份用含有Triton-X100(终浓度为1%)的1×TE工作液按1∶100的比例稀释,室温放置15分钟以破坏脂质纳米微粒从而释放出包裹的RNA。
在透明的平底96孔板中各加入100μl样品稀释液,同时设置浓度为0,10,50,90,100ng/ml的RNA标准品稀释孔。在各孔中加入100μl ReagentA工作液,室温避光反应5分钟后用荧光酶标仪读数,激发光480nm,发射光520nm。根据标准品的读数绘制标准曲线,计算各样品的RNA浓度,脂质纳米微粒的包裹效率计算公式为:(1-不加入Triton-X100反应孔RNA浓度/加入Triton-X100反应孔RNA浓度)×100%
2.7.在小鼠模型中分析检测脂质纳米微粒对于PCSK9蛋白的抑制作用
分别合成包裹Cas9 mRNA和靶向PCSK9的sgRNA或对照sgRNA的脂质纳米微粒。通过尾静脉注射包裹Cas9 mRNA的脂质纳米微粒到野生型C57BL/6小鼠体内,6小时后再次通过尾静脉注射包裹靶向PCSK9的sgRNA或对照sgRNA的脂质纳米微粒。sgRNA注射24h后,腹腔注射400ul Avertin麻醉小鼠,心脏PBS灌流后,取出肝脏,液氮速冻保存。或者,在第一次sgRNA注射后,等待1天,进行第二次Cas9mRNA/sgRNA脂质纳米微粒尾静脉注射,之后等待24h,按前述方法处死小鼠并保存组织。
肝脏匀浆后用BCA法测定蛋白浓度并作标准化,用Western Blot方法检测肝脏PCSK9蛋白表达水平,PCSK9抗体从R&D公司购买(AF3985)。柱纯化法提取肝脏DNA和RNA,RNA反转录成cDNA后用荧光实时定量PCR检测其中的PCSK9mRNA含量;用T7E1错配酶检测,经过注射包裹Cas9mRNA和靶向PCSK9基因序列的sgRNA的脂质纳米微粒后,小鼠肝脏细胞中PCSK9基因组序列是否产生了突变。表5中列出了荧光实时定量引物。
表5:荧光实时定量引物
Cas9 mRNA或sgRNA的质量以及各脂质成分的比例可随脂质成分的性质以及用于注射的动物而变化。多种途径可以用于施用本发明的包裹有CRISPR-Cas9系统的脂质纳米颗粒和包含该脂质纳米颗粒的生物制剂:包括皮下、肌肉内、真皮内、静脉内、腹膜内、和脾内等等。
3.结果
3.1.靶向PCSK9基因序列的sgRNA设计及验证
从Genebank中获得小鼠和人的PCSK9基因序列,通过CRISPR设计工具及sgRNA的设计原则,评估PCSK9基因序列上得分较高的靶位点设计sgRNA。选取并合成4条分别靶向小鼠或人PCSK9基因中外显子区域的sgRNA,分别命名为mE3和hC1,4,5。
图4A示出了小鼠PCSK9基因组成及sgRNA mE3的靶向区域;图4B示出了人PCSK9基因组成及sgRNAhC1,4,5的靶向区域。
3.2.瞬时转染Cas9/sgRNA表达载体在NIH-3T3和293T细胞系中对PCSK9基因序列
靶向切割效果的鉴定
因为CRISPR系统介导的基因编辑可以通过瞬时转染表达相应组分完成,我们在NIH-3T3和293T细胞系中评估了瞬时转染Cas9/sgRNA共表达载体对PCSK9基因序列靶向切割效果。图5示出了瞬时转染基于Cas9/sgRNA表达载体的CRISPR/Cas9系统在在NIH-3T3和293T细胞系中对PCSK9基因序列靶向切割作用,其中图5A为实验流程示意图;图5B、C示出柱纯化法提取NIH-3T3和293T细胞DNA后,T7E1 错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效果,酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识。
图5中所示的方法包括如下步骤:在接种的NIH-3T3和293T细胞系中用NEOFECTTMDNA transfection reagent瞬时转染Cas9/sgRNA共表达载体,72h后收取细胞。柱纯化法提取NIH-3T3或293T细胞中的DNA,用特异性引物扩增包含Cas9靶向位点的片段并按前述方法退火使其错配,T7E1错配酶实验结果表明mE3,hC1,4,5均能靶向剪切PCSK9DNA序列。
3.3.包裹CRISPR系统RNA组分的TT3脂质纳米微粒合成及体内表达验证
由于mRNA与siRNA有着不同的特性,尤其在分子量上相距甚远,Cas9mRNA大约有4200nt,使其在利用脂质纳米微粒包裹时更为困难。我们通过体外筛选和优化,得到用于递送mRNA的新型的TT3脂质纳米微粒,合成方法示意图如图6A所示。经过优化得到的两种配方的TT3脂质纳米微粒:TT3-O3和TT3-O14。以60μg/ml作为Cas9mRNA的起始浓度合成相应的TT3-O3和TT3-14脂质纳米微粒,动态光散射测量其粒径和分布,结果显示相比较于TT3-14,TT3-O3配方合成的脂质纳米微粒半径更小且分布更加集中(图6B)。图6A-F中示出了TT3脂质纳米微粒合成及体内表达验证,其中图6A为TT3脂质纳米微粒合成方法示意图;图6B示出了动态光散射测量TT3-O3配方和TT3-O14配方脂质纳米微粒的粒径及分布;图6C为提取小鼠肝细胞中的RNA,反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测Cas9 mRNA水平;图6D示出了提取小鼠肝细胞中的RNA,反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测sgRNA水平;图6E示出了Western检测尾静脉注射后6h小鼠肝脏中的Cas9蛋白表达水平;图6F示出了Western检测尾静脉注射后6h小鼠脾脏中的Cas9蛋白表达水平。
以60μg/ml作为RNA的起始浓度合成包裹Cas9 mRNA和B6sgRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒,在C57BL/6小鼠中通过尾静脉注射包裹Cas9mRNA和B6sgRNA的TT3-O3脂质纳米微粒(5μg/20g体重),于不同时间点收取小鼠肝脏检测TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA的表达。图6C和图6D中的RT-qPCR结果显示在尾静脉注射6h后,肝细胞内已经能够检测到Cas9mRNA、sgRNA,12h后Cas9mRNA、sgRNA已经下降到较低的水平。尾静脉注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒6h后,在肝脏中能够检测到Cas9的蛋白表达(图6E)而在脾脏中检测不到(图6F),证明TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的RNA组分主要在肝脏中高表达。
实施例
实施例1:瞬时转染方法递送的Cas9mRNA和sgRNA-mE3、hC1、hC4,hC5在NIH-3T3和
293T细胞系中对PCSK9基因序列靶向剪切作用
前文所述,我们所构建的PX330-PCSK9gRNA(mE3,hC1-hC5)可以在细胞内同时表达Cas9蛋白及相应的sgRNA,因此我们NIH-3T3和293T细胞系中瞬时转染PX330-PCSK9gRNA(mE3,hC1,4,5)表达载体后,评估Cas9蛋白和相应的sgRNA对PCSK9基因序列的靶向切割作用。
图5示出经瞬时转染方法递送的Cas9mRNA和sgRNA-mE3、hC1、hC4,hC5在NIH-3T3和293T细胞系中对PCSK9基因序列靶向剪切作用。图5A示出了实验流程的示意图;图5A示出了T7E1错配酶实验检测经Cas9/sgRNA(mE3)在NIH-3T3细胞中靶向剪切DNA双链效果,酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识;图5B示出了T7E1错配酶实验检测经Cas9/sgRNA(hC1,4,5)在293T细胞中靶向剪切DNA双链效果,酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识。
以上结果表明,我们所设计的sgRNA(mE3,hC1,4,5)在小鼠细胞系(NIH-3T3)和人源细胞系(293T)中,确实能引导Cas9蛋白对相应的PCSK9基因序列进行有效的靶向切割。
实施例2:TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-mE3在野生型C57/B6
小鼠模型中抑制PCSK9蛋白的作用
在证实了经基于瞬时转染方法表达Cas9mRNA和sgPsck9-mE3在NIH-3T3细胞系中对PCSK9基因序列的靶向切割作用后,我们进一步评估了用TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgPsck9-mE3在野生型C57/B6小鼠模型中抑制PCSK9蛋白的作用。
图7和图8示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgPsck9-mE3在野生型C57/B6小鼠模型中抑制PCSK9蛋白的作用。图7,8A示出了小鼠实验流程示意图;图7,8B示出了实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏中PCSK9蛋白mRNA表达水平;图7,8C示出了T7E1错配酶实验检测sgPsck9-mE3在Psck9基因中引起特异的基因剪切;图7,8D示出了Western检测小鼠肝脏中的PCSK9蛋白表达水平。
图7A中示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgPsck9-mE3在野生型C57/B6小鼠模型中的实验流程:通过尾静脉注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒(200μl/10g体重),6h后尾静脉注射包裹sgRNA-mE3或对照组sgGFP的TT3-O3配方脂质纳米微粒(100μl/10g体重)。24h后麻醉处死小鼠,PBS心脏灌流后收取小鼠肝脏。实时荧光定量PCR检测结果显示相比于sgGFP对照组,sgPsck9-mE3实验组小鼠的PCSK9mRNA表达水平有显著下降(图7B)。T7E1 错配酶实验检结果显示sgPsck9-mE3在Psck9基因中引起特异的基因剪切,而在sgGFP对照组中没有发现特异性的剪切(图7C)。Western Blot实验结果显示相比于sgGFP对照组,sgPsck9-mE3实验组小鼠的PCSK9蛋白表达水平有所下降(图7D)。
图8A中示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgPsck9-mE3在野生型C57/B6小鼠模型中的实验流程:通过尾静脉注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒(200μl/10g体重),6h后尾静脉注射包裹sgRNA-mE3或对照组sgGPF的TT3-O3配方脂质纳米微粒(100μl/10g体重)。等待1d后,再次按照前述流程和剂量通过尾静脉注射包裹Cas9mRNA或sgPsck9-mE3的TT3-O3配方脂质纳米微粒,之后等待24h麻醉处死小鼠,PBS心脏灌流后收取小鼠肝脏。实时荧光定量PCR检测结果显示相比于sgGFP对照组,sgPsck9-mE3实验组小鼠的PCSK9mRNA表达水平有显著下降(图8B)。T7E1错配酶实验检结果显示sgPsck9-mE3在Psck9基因中引起特异的基因剪切,而在sgGFP对照组中没有发现特异性的剪切(图8C)。Western Blot实验结果显示相比于sgGFP对照组,sgPsck9-mE3实验组小鼠的PCSK9蛋白表达水平有所下降(图8D)。
以上结果表明,TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNAmE3在野生型C57/B6小鼠模型中对PCSK9蛋白mRNA的表达有显著降低作用,且对于野生型C57/B6小鼠模型中PCSK9蛋白的表达有一定的抑制作用。
上文中提及的所有出版物和专利均通过引用方式并入本文。本发明的所述方法和系统的各种变化对本领域技术人员而言显而易见的而不背离本发明的范围和精神。尽管已结合具体优选的实施方式对本发明进行描述,但应理解,本发明不限于这些具体实施方式。实际上,本领域的技术人员知晓的可用于实现本发明的所述方式的各种变更都包括在本发明的范围内,本发明的范围由权利要求限定。
Claims (11)
1.靶向小鼠和人PCSK9基因外显子区域的sgRNA分子,其具有如下核酸序列之一:
GCCCCATGTGGAGTACATTG(SEQ ID NO:1),
CGTGCGCAGGAGGACGAGGA(SEQ ID NO:2),
CGTGCTCAACTGCCAAGGGA(SEQ ID NO:3),和
GCATCCCGTGGAACCTGGAG(SEQ ID NO:4)。
2.脂质纳米颗粒,由脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇以15∶25∶45∶0.75或15∶30∶40∶0.75的摩尔比构成,其中所述脂质纳米颗粒包裹Cas9 mRNA和如权利要求1中所述的sgRNA分子,并且其中Cas9 mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为(1∶10)-(1∶5)。
3.根据权利要求2所述的脂质纳米颗粒,其中,所述脂多肽分子为1,3,5-三(N1,N3,N5-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3),所述聚乙二醇为PEG2000,所述sgRNA分子为如权利要求1中所述的sgRNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的脂质纳米颗粒,其中,所述脂多肽分子为脂多肽的多聚体。
5.根据权利要求2或3所述脂质纳米颗粒,其中,Cas9 mRNA和sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为1∶10。
6.根据权利要求2或3所述的脂质纳米颗粒,其中,所述脂质纳米颗粒的半径为80-160nm。
7.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒,其中,所述脂质纳米颗粒的半径为80-120nm。
8.包含如权利要求2至7中任一项所述脂质纳米颗粒、Cas9 mRNA和如权利要求1中所述的sgRNA分子,以及药学上可接受的赋形剂和辅料的药物组合物。
9.脂质纳米颗粒的制备方法,所述方法包括:
(i)将脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇溶于酒精中,得到第一溶液;并将Cas9 mRNA和/或sgRNA分子溶于水,得到第二溶液;
(ii)在微流装置中混合所述第一溶液和所述第二溶液,形成所述脂质纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述脂多肽分子为1,3,5-三(N1,N3,N5-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3),所述聚乙二醇为PEG2000,所述sgRNA分子为如权利要求1中所述的sgRNA分子。
11.一种通过抑制PCSK9蛋白从而降低血脂的方法,所述方法包括向受试者给予有效量的如权利要求1-7所述脂质纳米颗粒或权利要求8所述药物组合物的步骤。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110215522A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-10 | 南方科技大学 | 一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用 |
WO2020037882A1 (zh) * | 2018-08-21 | 2020-02-27 | 杭州观梓健康科技有限公司 | 一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞及其制备方法和用途 |
WO2020156575A1 (en) * | 2019-02-02 | 2020-08-06 | Shanghaitech University | Inhibition of unintended mutations in gene editing |
CN114525258A (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-24 | 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 | 一种表达pcsk9阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
WO2024061296A3 (en) * | 2022-09-22 | 2024-06-13 | Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. | Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105688229A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-06-22 | 华东师范大学 | 靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡及应用 |
CN105886498A (zh) * | 2015-05-13 | 2016-08-24 | 沈志荣 | CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA |
CN105899658A (zh) * | 2013-12-12 | 2016-08-24 | 布罗德研究所有限公司 | 针对hbv和病毒性疾病以及障碍的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用 |
CN110352242A (zh) * | 2016-12-23 | 2019-10-18 | 哈佛大学的校长及成员们 | Pcsk9的基因编辑 |
CN110638788A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-03 | 广州医科大学 | 一种能够沉默Pcsk9蛋白的siRNA、其纳米递送系统及应用 |
-
2017
- 2017-01-24 CN CN201710065450.2A patent/CN108342387B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105899658A (zh) * | 2013-12-12 | 2016-08-24 | 布罗德研究所有限公司 | 针对hbv和病毒性疾病以及障碍的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用 |
CN105886498A (zh) * | 2015-05-13 | 2016-08-24 | 沈志荣 | CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA |
CN105688229A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-06-22 | 华东师范大学 | 靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡及应用 |
CN110352242A (zh) * | 2016-12-23 | 2019-10-18 | 哈佛大学的校长及成员们 | Pcsk9的基因编辑 |
CN110638788A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-03 | 广州医科大学 | 一种能够沉默Pcsk9蛋白的siRNA、其纳米递送系统及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIN LI等: "An Orthogonal Array Optimization of Lipid-like Nanoparticles for mRNA Delivery in Vivo", 《NANO LETT》 * |
CHAO JIANG: "A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutically targeting HBV DNA and pcsk9 in vivo", 《CELL RESEARCH 》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020037882A1 (zh) * | 2018-08-21 | 2020-02-27 | 杭州观梓健康科技有限公司 | 一种具有同时降低甘油三酯和胆固醇作用的干细胞及其制备方法和用途 |
WO2020156575A1 (en) * | 2019-02-02 | 2020-08-06 | Shanghaitech University | Inhibition of unintended mutations in gene editing |
US11384353B2 (en) | 2019-02-02 | 2022-07-12 | Shanghaitech University | Inhibition of unintended mutations in gene editing |
CN110215522A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-10 | 南方科技大学 | 一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用 |
CN110215522B (zh) * | 2019-06-13 | 2022-11-08 | 南方科技大学 | 一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用 |
CN114525258A (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-24 | 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 | 一种表达pcsk9阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
WO2024061296A3 (en) * | 2022-09-22 | 2024-06-13 | Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. | Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease |
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Publication number | Publication date |
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