CN108341721A - 一种生物有机缓释肥、制备方法及其在土壤修复中的应用 - Google Patents

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CN108341721A CN201810366327.9A CN201810366327A CN108341721A CN 108341721 A CN108341721 A CN 108341721A CN 201810366327 A CN201810366327 A CN 201810366327A CN 108341721 A CN108341721 A CN 108341721A
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Abstract

本发明涉及一种生物有机缓释肥、制备方法及其在土壤修复中的应用，属于生物有机肥技术领域。该缓释肥是利用了蓝藻作为主要的原料，通过水解、发酵之后，再将其与有机高分子进行聚合反应，形成具有贯穿网络空间结构的缓释有机肥，同时在肥料中引入微生物，利用缓释肥的结构提供给微生物更多的生长空间，一方面提高了微生物代谢出营养成分，另一方面，提高了肥料的缓释作用效果；本发明的这种生物有机缓释肥具有较好的矿区复垦土壤的修复效果，能够有效地提高复垦土壤的有机碳含量、提高土壤团聚效果的作用。

Description

一种生物有机缓释肥、制备方法及其在土壤修复中的应用
技术领域
本发明涉及一种生物有机缓释肥、制备方法及其在土壤修复中的应用，属于生物有机肥技术领域。
背景技术
矿区复垦土壤是指以采矿业，尤其是露天采矿所产生的固体废弃物作为母质，并经过人为整理、改良，促使其加速风化、熟化，从而形成的受人为影响极大的人为土壤。这种土壤经过一定时间的风化作用和人为影响后是可以成为一种可供耕作的土壤。矿区复垦土壤与一般土壤相比，具有一定的特殊性，主要表现在土壤受扰动大，养分较少，土壤较贫瘠，且土层纵向养分规律性不强。目前农用复垦地建设方兴未艾，通过大面积土地平整后， ，使用面积增加了，但土质养分状况较贫瘠，土壤产出率低，作为耕地利用还有较大差距，需很多农艺技术措施来提高耕地肥力水平。此外，部分良田在土地平整中，其表层肥沃的熟耕土作“客土”移出，耕作层土壤结构遭到不同程度破坏，土壤营养状况也需改良与维护。因此，土壤改良与培肥势在必行。
CN107056525A公开了一种土壤改良剂及其制备方法和在宅基复垦地改良方面的应用。该种土壤改良剂包括以下原料：菌剂、活化腐植酸、蚯蚓粪、尿素。但是这种改良剂并不具有缓释效果。CN104630109A公开了一种矸石山复垦土壤用微生物制剂，由各自独立使用的三种微生物制剂构成，其中Ⅰ型微生物制剂中含有枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，Ⅱ型微生物制剂中含有冻胶样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，Ⅲ型微生物制剂中含有褐球固氮菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌，每克微生物制剂中含有有效活菌总数(2～200)×108CFU。但是这种土壤中修复过程中无法向微生物提供足够的消化物质，导致对土壤中的肥力增加效果不高。
另外，蓝藻是一种浮游生物，有单细胞的，也有多细胞的，在一般情况下，淡水中的营养物质特别是氮、磷的含量很低，往往成为浮游藻类生长的限制因子。但在受污染的湖泊水库底部的淤泥中，有机氮和有机磷的含量大量增加。造成湖水“富营养化”，引起淡水浮游藻类的大量繁殖，于无风好雨的天气，蓝藻就会疯狂暴涨，每升水中可达一亿个，导致“水华”（亦称湖靛）爆发。蓝藻的残骸会迅速腐烂，发出腥臭，严重污染水质。“水华”蓝藻中含有的蓝藻毒素能损害人的肝脏，，给以湖泊为饮用水源的人们带来潜在的危险。
因此，需要对蓝藻再次进行利用。
发明内容
本发明的目的是：提供一种生物有机缓释肥，该缓释肥是利用了蓝藻作为主要的原料，通过水解、发酵之后，再将其与有机高分子进行聚合反应，形成具有贯穿网络空间结构的缓释有机肥，同时在肥料中引入微生物，利用缓释肥的结构提供给微生物更多的生长空间，一方面提高了微生物代谢出营养成分，另一方面，提高了肥料的缓释作用效果；本发明的这种生物有机缓释肥具有较好的矿区复垦土壤的修复效果，能够有效地提高复垦土壤的有机碳含量、提高土壤团聚效果的作用。
技术方案是：
一种生物有机缓释肥的制备方法，包括如下步骤：
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：5～10混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理；将得到的悬浮液稀释2～4倍，在稀释液中加入HCl调节pH至3～5，再加入稀释液重量0.05～0.1wt%的酶进行酶解，酶解反应完后再经过灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.5～0.8%的阴离子表面活性剂、0.2～0.4%乳化剂、2.5～3.5%甲基丙烯酸乙酯、4.2～5.0%甲基丙烯酸、1.0～1.6%带有氨基的丙烯酸单体、1.4～2.4%N-叔丁基丙烯酰胺、0.3～0.6%醋酸、0.2～0.3%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.5～0.8%的非离子表面活性剂，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：2～5混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2～4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比4～5：0.5～1：0.3～0.8：1.2～1.5：4～6混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
进一步地，所述的外加超声波的功率是2500～4000W，频率是10～30kHz。
进一步地，所述的碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶的重量比是3～4：1～1.2：0.5～0.8。
进一步地，酶解反应时间是3～5h，反应温度是35～38℃；灭酶处理是指95℃以上高温灭酶。
进一步地，第2步中的菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是30～35℃，发酵时间是60～100h。
进一步地，所述的第3步中，阴离子表面活性剂是C10～C20烷基苯磺酸钠；带有氨基的丙烯酸单体是2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯。
进一步地，所述的第4步中，非离子表面活性剂是C8～C24的烷基聚氧乙烯醚。
进一步地，所述的磷肥磷酸二氢铵、钾肥是硫酸钾。
由上述的方法制备得到的生物有机缓释肥。
所述的生物有机缓释肥在土壤修复中的应用。
所述的土壤是矿区复垦土壤。
本发明还提供了一种生物有机缓释肥的载体。
本发明还提供了上述的生物有机缓释肥在提高复垦土壤有机碳含量中的应用。
本发明还提供了上述的生物有机缓释肥在提高复垦土壤碳库活度中的应用。
本发明还提供了上述的生物有机缓释肥在降低复垦土壤顽固性碳指数中的应用。
本发明还提供了上述的生物有机缓释肥在提高复垦土壤团聚中的应用。
本发明还提供了上述的生物有机缓释肥在提高复垦土壤酶活性中的应用。
本发明还提供了上述的生物有机缓释肥在提高复垦土壤微生物态氮的平稳释放中的应用。
有益效果
本发明提供的生物有机缓释肥利用了蓝藻作为原料，实现了蓝藻的再利用。另外，利用蓝藻中的蓝藻蛋白含量高的特点，依次通过水解、酶解后，将蓝藻蛋白分解为小分子的多肽和氨基酸，并减小蛋白的分子量，能够使其成功地与单体进行聚合为空间贯穿网络，使其具有多孔结构适合微生物的生长，并产生对蛋白质的缓释效果。本发明提供的生物有机缓释肥可以有效对复垦土壤修复，提高肥力。
附图说明
图1是土壤中的有机碳含量对比图；
图2是土壤中的活性碳I含量对比图；
图3是土壤中的活性碳II含量对比图；
图4是土壤中的碳库活度对比图；
图5是土壤中的顽固性碳指数对比图；
图6是土壤中的有机氮含量的缓释效果对比图；
具体实施方式
本发明提供的生物有机缓释肥是以蓝藻为原料，蓝藻中含有较多的蓝藻蛋白，首先通过破碎的方式使细胞破碎，再通过水解的方式进一步地使蓝藻的细胞壁被分解，更多地释放出蓝藻蛋白。蓝藻蛋白再经过菌种发酵处理的目的，是使蓝藻蛋白进一步地被细菌分解为多肽和氨基酸，使蓝藻蛋白上的氨基更多地暴露出，并减小蛋白的分子量。
由于蓝藻蛋白上的氨基被更多地暴露出，并且使分子量减小后，可以更方便地将蓝藻通过与单体发生聚合，通过蓝藻发酵物的氨基与单体上的不饱和键发生聚合，形成空间贯穿网络结构，一方面，可以得到具有高多孔性的材料，另一方面，由于蛋白被嵌入于高分子网络中，使其产生了缓释性，施加于土壤中后，载体上的多肽接枝和蛋白会缓慢地被细菌分解并进入土壤，使土壤产生均匀的改良效果。另外，由于在载体的聚合过程中，在三维空间贯穿网络中还嵌入了带有氨基的丙烯酸单体，特别是2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯，其具有pH敏感性，特别是在碱性条件下，会凝胶的解离，使载体的亲水性大大提高，能够更多地使EM菌液发酵产生的酸性产物进入土壤，减小碱性土壤的碱性，而当土壤过于酸性时，该pH敏感材料又会减小其表面的亲水性，减小了细菌的代谢产物进入土壤中，通过这样的调节可以使土壤的pH的波动性明显减小，并保持在植物生长的合适范围内。
以下实施例中，所采用的啤酒酵母菌是啤酒酵母菌CGMCC2.451，所采用的嗜酸乳杆菌是CGMCC1.1854。微生物发酵菌剂是EM复合菌剂(EM是EffectiveMicroorganesms的简称)，它是将光合菌群、酵母菌群、乳酸菌群、放线菌群、菌根菌群等5科10属80多种微生物在同一状态中复合培养成的一种定型菌剂。呈棕色半透明状液体，pH值在3.5～4.5之间。市场有售，EM菌液能够产生较多的代谢氨基酸。
实施例1 生物有机缓释肥的制备
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：5混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理，所述的外加超声波的功率是2500W，频率是10kHz；将得到的悬浮液稀释2倍，在稀释液中加入HCl调节pH至3，再加入稀释液重量0.05wt%的酶进行酶解，酶解反应时间是3h，反应温度是35℃，酶解反应完后再经过95℃灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶按重量比是3：1：0.5的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液，菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是30℃，发酵时间是60h；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.5%的阴离子表面活性剂十八烷基苯磺酸钠、0.2%乳化剂、2.5%甲基丙烯酸乙酯、4.2%甲基丙烯酸、1.0%2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯、1.4%N-叔丁基丙烯酰胺、0.3%醋酸、0.2%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.5%的十八烷基聚氧乙烯基醚，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：2混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比4：0.5：0.3：1.2：4混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
实施例2 生物有机缓释肥的制备
第1步，将蓝藻与水按照重量比1： 10混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理，所述的外加超声波的功率是4000W，频率是30kHz；将得到的悬浮液稀释4倍，在稀释液中加入HCl调节pH至5，再加入稀释液重量0.1wt%的酶进行酶解，酶解反应时间是5h，反应温度是38℃，酶解反应完后再经过95℃灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶按重量比是4： 1.2： 0.8的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液，菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是35℃，发酵时间是100h；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.8%的阴离子表面活性剂十八烷基苯磺酸钠、0.4%乳化剂、3.5%甲基丙烯酸乙酯、5.0%甲基丙烯酸、1.6%2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯、2.4%N-叔丁基丙烯酰胺、0.6%醋酸、0.3%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.8%的十八烷基聚氧乙烯基醚，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：5混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比5： 1： 0.8： 1.5： 6混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
实施例3 生物有机缓释肥的制备
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：7混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理，所述的外加超声波的功率是3000W，频率是20kHz；将得到的悬浮液稀释3倍，在稀释液中加入HCl调节pH至4，再加入稀释液重量0.08wt%的酶进行酶解，酶解反应时间是3～5h，反应温度是35～38℃，酶解反应完后再经过95℃灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶按重量比是4：1：0.6的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液，菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是32℃，发酵时间是80h；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.7%的阴离子表面活性剂十八烷基苯磺酸钠、0.3%乳化剂、3.0%甲基丙烯酸乙酯、4.5%甲基丙烯酸、1.2%2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯、1.8%N-叔丁基丙烯酰胺、0.4%醋酸、0.25%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.6%的十八烷基聚氧乙烯基醚，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：4混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2～4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比4.5：0.6：0.4：1.3：5混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
对比例1
与实施例1的区别是：在载体中的单体中未加入2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯。
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：7混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理，所述的外加超声波的功率是3000W，频率是20kHz；将得到的悬浮液稀释3倍，在稀释液中加入HCl调节pH至4，再加入稀释液重量0.08wt%的酶进行酶解，酶解反应时间是3～5h，反应温度是35～38℃，酶解反应完后再经过95℃灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶按重量比是4：1：0.6的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液，菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是32℃，发酵时间是80h；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.7%的阴离子表面活性剂十八烷基苯磺酸钠、0.3%乳化剂、3.0%甲基丙烯酸乙酯、4.5%甲基丙烯酸、1.8%N-叔丁基丙烯酰胺、0.4%醋酸、0.25%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.6%的十八烷基聚氧乙烯基醚，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：4混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2～4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比4.5：0.6：0.4：1.3：5混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
对比例2
与实施例1的区别是：未对蓝藻进行酶解处理。
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：7混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理，所述的外加超声波的功率是3000W，频率是20kHz；将得到的悬浮液稀释3倍，在稀释液中加入HCl调节pH至4；
第2步， 对第1步得到的稀释液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液，菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是32℃，发酵时间是80h；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.7%的阴离子表面活性剂十八烷基苯磺酸钠、0.3%乳化剂、3.0%甲基丙烯酸乙酯、4.5%甲基丙烯酸、1.2%2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯、1.8%N-叔丁基丙烯酰胺、0.4%醋酸、0.25%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.6%的十八烷基聚氧乙烯基醚，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：4混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2～4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比4.5：0.6：0.4：1.3：5混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
对比例3
与实施例1的区别是：蓝藻经过发酵处理后，未经过聚合反应，直接与其它的肥料混合。
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：7混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理，所述的外加超声波的功率是3000W，频率是20kHz；将得到的悬浮液稀释3倍，在稀释液中加入HCl调节pH至4，再加入稀释液重量0.08wt%的酶进行酶解，酶解反应时间是3～5h，反应温度是35～38℃，酶解反应完后再经过95℃灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶按重量比是4：1：0.6的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液，菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是32℃，发酵时间是80h；发酵后，经过减压浓缩、喷雾干燥后，得到蓝藻发酵物；
第3步，在去离子水中加入溶液重量0.7%的阴离子表面活性剂十八烷基苯磺酸钠、0.3%乳化剂、3.0%甲基丙烯酸乙酯、4.5%甲基丙烯酸、1.2%2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯、1.8%N-叔丁基丙烯酰胺、0.4%醋酸、0.25%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.6%的十八烷基聚氧乙烯基醚，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：4混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2～4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体、蓝藻发酵物按照重量比4.5：0.6：0.4：1.3：3.6：1.4混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
生物有机缓释肥在复垦土壤修复中对有机碳的影响
本试验在山西省吕梁地区孝义市阳泉曲镇克俄村露天矿区进行。该地属砂页岩低山黄土丘陵区，土层深度0-20cm，有机碳1.184g/kg，全氮0.27g/kg，全磷45mg/kg，有效磷mg/kg，速效钾mg/kg，pH 8.12。将以上实施例1-3和对比例1-3中的缓释肥施加于土壤中，每亩施加45kg，另设常规有机肥（鸡粪肥）对比，施加量为每亩3方，以及空白组。
试验过程中，在土壤上种植玉米，于玉米播种前（2016年4月12日）施加上述肥料，并于玉米秋收2016年10月18日取土壤样品，取样采用多点混合方法，土壤采样深度为0-20cm。
土壤活性碳、氮库采用硫酸水解法测定。酸水解是一种分离和量化有机质的不稳定和顽抗组分的常用技术。该方法已应用于多种有机质组分分馏和模拟研究中，发现可以相当准确地测量不同土壤有机质池。这种方法非常容易操作，并且比物理或生物分离方法要节省很多时间。使用两步酸水解，并以硫酸作为萃取剂，以确定活性碳、氮库和顽固性碳库。
所用仪器：摇床、离心器、100ml硬质(不受硫酸腐蚀，不含碳)离心管若干(根据土样数确定)、烘箱、250ml三角瓶、消煮管、5ml移液管、水浴锅、分析天平(0．00xx)、凯氏定氮仪。
试剂配制：
(1)重铬酸钾标液：0.8000mo1·L-1，标准溶液。称取经130℃烘干的重铬酸甲39.22459溶于水中，定容于1000ml容量瓶中。
(2)浓硫酸(分析纯)。
(3)0.2mo1/LFeSO4溶液。称取硫酸亚铁(化学纯)56.0g溶于水中，加浓H2SO4 5ml，稀释到1L。
(4)指示剂。邻菲罗啉指示剂：称取邻菲罗啉(分析纯)1.4859与FeSO4·7H2O0.6959，溶于100ml水中。
(5)2.5molH2SO4溶液。1 33ml分析纯浓硫酸，定容至1 000m1．
(6)13mol/L H2SO4溶液。346ml分析纯浓硫酸，定容至500ml。
(7)0.1mol/L硫酸亚铁溶液。27.89溶于水中，加浓H2SO45ml，稀释到lL。
c．流程：
1 土样处理。风干土。处理方法同测土壤有机碳一致，由于矿区土壤变异性大，为了增加土壤的均匀度，以期减免实验误差，过0.10mm筛。
2 用分析天平称取1.0000克土样，放入硬质试管中。
3 加入2.5mol/L H2SO4 20ml，稍摇匀加盖，放入水浴锅煮45分钟。
4 取出稍冷却即离心，10000r/min 5分钟，倒出水解液(三角瓶)。
5 再往离心管中加入20ml一次水，(倒水时尽量冲掉壁上的粘液)把离心管粘土的一侧朝外放，10000r/min离心5分钟，洗液加到上面的水解液中，待测。
6 吸取2.5ml重铬酸钾标液、2.5ml浓硫酸、6ml上述溶液加入消煮管中，加热到170℃，保持7分钟，最后转移到三角瓶加啉啡罗林指示剂，用硫酸亚铁溶液0.1mol/L滴定，同时做三个无土空白，最后计算得出活性碳I；
7 试管中没水解的剩余物60℃烘干，加13 mol/L H2SO4 2 mL，振荡过夜，然后加一次水24 mL稀释该酸到lmol/L。
8 在105℃加热3h，取出稍冷却即离心，10000r/min 5分钟，倒出水解液(--角瓶)
9 再往离心管中加入24ml一次水，(倒水时尽量冲掉壁上的粘液)把离心管粘土的一侧朝外放，10000r/min离心5分钟，洗液加到上面的水解液中，待测。
10 吸取2.5ml重铬酸钾标液、2.5ml浓硫酸、6ml上述溶液加入消煮管中，石蜡或磷酸浴加热到170℃，保持7分钟，最后转移到三角瓶加啉啡罗林指示剂，用硫酸亚铁溶液0.1mol/L滴定。计算得出活性库II；
土壤有机碳的测定采用重铬酸钾容量法。
碳库活度=土壤活性有机碳含量(g/kg)/土壤非活性有机碳含量(g/kg)；
顽固性碳指数RIc=顽固性碳含量(g/kg)/总有机碳(g/kg)*100%
顽固性碳含量=总有机碳(g/kg)- (活性碳I+活性碳II) (g/kg)
表1 土壤中的碳库含量的测定结果
＃相对于空白组P<0.05，▲相对于实施例3组P<0.05
从表中可以看出，采用本发明提供的蓝藻缓释肥，可以有效地增加对土壤有机碳，不仅补充输入了有机碳源，又改善了土壤物理、化学性状，刺激了土壤微生物活性，加速有机质的生物降解，提高了作物的生物量，对提高矿区复垦土壤有机碳含量起到了很大作用，促进了矿区复垦土壤总有机碳的累积。而通过实施例3和对比例1对比可以看出，由于未在载体中加入含氨基pH敏感单体，导致了无法在碱性土壤中提高缓释肥料的亲水性，降低了微生物发酵产物向土壤中的排放，使有机碳的含量不高。并且采用上述的有机缓释肥可以有效地提高复垦土壤中的活性有机碳的含量、降低顽固性碳指数。土壤中的有机碳含量如图1-图5所示。
土壤团聚体的测定
根据土壤团聚体湿筛法测定方法，约100g风干土壤样品，用机构湿筛法测定（机器型号：ZY200-1，上海德玛信息技术有限公司生产）土壤团聚体的组成。具体方法为：将样品放置于最大孔径筛上，孔径自上而下为5mm、2mm、1mm、0.5mm、0.25mm，先用水浸泡10min后，在整个套筛处于最下端时，最顶层筛的上边缘保持低于水面，竖直上下振筛10min；从各级筛层将土粒分别转移至铝盒当中，去除水分烘干称重，最后计算得到各级团聚体的质量百分比。团聚体的稳定性用平均重量直径来表述：
其中di表示该等级土壤团聚体的平均颗粒直径，在数值上等于两级筛孔的平均值，wi表示i级土壤团聚体组分的重量（g），W为不同粒径土壤团聚体的总重。
表2 土壤中的颗粒大小分布的测定结果
＃相对于空白组P<0.05，▲相对于实施例3组P<0.05
从上表中可以看出，本发明提供的生物有机缓释肥应用于复垦土壤时，可以有效地使土壤团聚，使大于2mm的颗粒比例明显的提高；通过实施例3和对比例3对比可以看出，蓝藻蛋白未经过聚合反应而直接加入至肥料中，由于未参加到三维贯穿网络中，导致负载的吸附性不好，不能提高对土壤中的小颗粒的吸附和团聚的效果。
土壤酶活性的测定
(1)蔗糖酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，结果以24 h后1 g土壤中葡萄糖的质量(mg)表示蔗糖酶活性(Sue)；
(2)过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定，结果以20 min后1 g土壤的0.1 M高锰酸钾的体积(mL)表示过氧化氢酶活性(Cat)；
(3)磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定，结果以24 h后1 g土壤的酚毫克数(mg)(用P表示，结果需乘0.32)表示磷酸酶活性(Pho)；
(4)脲酶活性用苯酚钠一次氯酸钠比色法测定，结果以24h后1g土壤中NH3-N的质量(rag)表示脲酶活性(Ure)。
脲酶活性：Ure-a×V×n/m
式中：a为由标准曲线求得的NH3-N浓度(mg·mL-1)；V为显色液体积(50 mL) ；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。
用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(mL)为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(mL)为A。
(A-B)×T即为过氧化氢酶活性。以20 min后lg土壤的0.1 N高锰酸钾的体积(mL)表示。式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。
蔗糖酶活性：Suc-a×V×n/m
式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg·mL-1）；V为显色液体积(50 mL) ；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。
土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。
磷酸酶活性以每克土壤的酚质量(mg)表示（用P表示，结果需乘0.32）。
表3 土壤中的酶活性的测定结果
＃相对于空白组P<0.05，▲相对于实施例3组P<0.05
从表中可以看出，本发明提供的生物有机缓释肥应用于复垦土壤的修复时，可以显著地提高土壤中的酶的活性，实施例3和对比例2比较可以看出，通过对蓝藻进行酶解处理可以有效地使蓝藻蛋白的分子量减小，并能够成功地与聚合物形成空间网络，使蛋白分子接枝于多孔聚合物材料上，提高了生物利用率，使土壤中的酶活性提高。
有机缓释肥对于微生物态氮的缓释效果
从施肥日起，每隔1个月测定土壤中的微生物态氮的含量，考察其缓释效果，每个土壤取5份样品，深度10-20cm，计算其平均值。其中土壤微生物量氮的测定：取新鲜土样30 g左右，于放置有50 mL无醇氯仿小烧杯的真空干燥器内，灭菌5 d，加0.5mol/L的K2SO4于灭菌后的土样中，振荡30 min，过滤。设不灭菌对照组。吸取滤液15 mL，加浓H2SO4，酸化后先浓缩至3 mL左右，后按凯氏定氮法测定滤液中的全氮，以代氏合金还原硝态氮，换算系数0.54。
表4 土壤中有机氮含量 mg/kg
有机氮含量随时间变化曲线如图6所示，从图中可以看出，使用本发明的缓释肥能够有效地保持土壤中有机氮的平稳释放，通过实施例3与对比例1可以看出，利用使负载载体上的具有pH敏感性单体接枝后，可以有效使微生物发酵产生的成分释放进土壤中，提高了土壤中的有机氮的平稳释放；通过实施例3和对比例2可以看出，通过对蓝藻酶解之后，可以有效地将蛋白固定于载体上接枝，使有机肥产生更好的缓释效果。

Claims (10)

1.一种生物有机缓释肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步，将蓝藻与水按照重量比1：5～10混合，在机械破碎和外加超声波的作用下对蓝藻进行破碎处理；将得到的悬浮液稀释2～4倍，在稀释液中加入HCl调节pH至3～5，再加入稀释液重量0.05～0.1wt%的酶进行酶解，酶解反应完后再经过灭酶处理，所述的酶是碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶的混合；
第2步， 对第1步得到的酶解液中加入菌种进行发酵，得到蓝藻发酵液；
第3步，在第2步所得的蓝藻发酵液中加入溶液重量0.5～0.8%的阴离子表面活性剂、0.2～0.4%乳化剂、2.5～3.5%甲基丙烯酸乙酯、4.2～5.0%甲基丙烯酸、1.0～1.6%带有氨基的丙烯酸单体、1.4～2.4%N-叔丁基丙烯酰胺、0.3～0.6%醋酸、0.2～0.3%引发剂，混合均匀后作为水相；
第4步，在二甲苯中加入二甲苯重量0.5～0.8%的非离子表面活性剂，混合均匀作为油相；
第5步，将水相和油相按照体积比1：2～5混合后，在反应器中通入氮气，再加入油水混合物重量2～4wt%的交联剂N-N’亚甲基双丙烯酰胺，在氮气条件下回流反应；反应结束后，滤出固体物，并用乙醇清洗，得到载体；
第6步，将饼粕、磷肥、钾肥、微生物菌液、载体按照重量比4～5：0.5～1：0.3～0.8：1.2～1.5：4～6混合均匀，压制成颗粒，即得生物有机缓释肥。
2.根据权利要求1所述的生物有机缓释肥的制备方法，其特征在于，所述的外加超声波的功率是2500～4000W，频率是10～30kHz。
3.根据权利要求1所述的生物有机缓释肥的制备方法，其特征在于，所述的碱性纤维素酶、碱性木聚糖酶和漆酶的重量比是3～4：1～1.2：0.5～0.8；酶解反应时间是3～5h，反应温度是35～38℃；灭酶处理是指95℃以上高温灭酶。
4.根据权利要求1所述的生物有机缓释肥的制备方法，其特征在于，第2步中的菌种是啤酒酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合，发酵温度是30～35℃，发酵时间是60～100h；所述的第3步中，阴离子表面活性剂是C10～C20烷基苯磺酸钠；带有氨基的丙烯酸单体是2-二甲基氨基乙基丙烯酸酯。
5.根据权利要求1所述的生物有机缓释肥的制备方法，其特征在于，所述的第4步中，非离子表面活性剂是C8～C24的烷基聚氧乙烯醚。
6.根据权利要求1所述的生物有机缓释肥的制备方法，其特征在于，所述的磷肥磷酸二氢铵、钾肥是硫酸钾。
7.权利要求1～6任一项所述的生物有机缓释肥的制备方法所直接得到的生物有机缓释肥。
8.权利要求7所述的生物有机缓释肥在土壤修复中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的土壤是矿区复垦土壤。
10.权利要求7所述的生物有机缓释肥在提高复垦土壤微生物态氮的平稳释放中的应用。
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