CN108333160A - 面向空间应用的一种微型结构光产生装置及超分辨荧光显微系统 - Google Patents

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Abstract

面向空间应用的一种微型结构光产生装置及超分辨荧光显微系统，属于光学技术领域。直接利用结构光透射片产生结构光条纹，缩减了由于干涉产生结构光条纹所需的距离；通过改变结构光透射片的折射率来改变条纹的垂直位置，可照明样品不同切面，使超分辨荧光显微系统具有层析能力；利用背透照明，使超分辨荧光显微系统结构及装配更为简单。综合来看本发明可以在不降低超分辨空间分辨率的同时，实现结构更简单、体积更小的、具有层析能力的超分辨荧光显微系统。

Description

面向空间应用的一种微型结构光产生装置及超分辨荧光显微 系统
技术领域
本发明涉及一种面向空间应用的微型结构光产生方法、装置和超分辨荧光显微系统，主要用于基于结构光的微型化超分辨荧光显微成像，应用于生物学、分析光学、医学检测领域，属于光学技术领域。
背景技术
人类空间飞行实践已经证实，长期航天飞行将会引发航天员骨质丢失、肌肉萎缩、免疫内分泌功能下降等一系列航天医学问题。研究上述问题的产生机制及制定针对上述问题有效的防护对抗措施，已经成为我国航天医学研究面临的紧要任务。
这就要求在空间飞行中开展实时、动态的空间细胞学实验研究。地面应用的超分辨荧光观察设备由于体积较大，无法直接应用于空间环境。因此，现在迫切需要研发小型化的超分辨荧光显微成像装置，从而为航天医学应用研究提供先进的技术支撑。
荧光显微镜利用荧光基团作为探针对需要观察的部分进行染色；被染色部分被激发光激发后，荧光基团将发出荧光；通过探测荧光信号的分布，我们将获得样品的空间分布信息。由于分辨率受到衍射极限的限制，横向上极限分辨率约为200nm-300nm，纵向上极限分辨率约为500nm-700nm。这限制了其在亚细胞水平生命科学领域中的应用。
超分辨荧光显微镜是在一般宽场光照明荧光显微镜的基础上，加入结构光照明从而实现超分辨荧光显微，如图1所示。通过将宽敞照明改用(一个载频条纹)结构光照明，显微图像会带有更多的高频信息。一般通过三次以上不同相位的结构光照明，再运用特定算法从调制图像数据中提取焦平面的信息，可得到显现出更多的细节的图像，从而突破衍射极限的限制。
目前基于结构光照明的超分辨荧光显微镜系统由三大系统部分组成，如图1所示。
目前基于改变照明光空间结构的结构光照明荧光显微镜主要有3种。它们分别是：光栅型结构光照明超分辨荧光显微镜系统、数字微镜阵列型结构光照明超分辨荧光显微镜系统和空间光制器型结构光照明超分辨荧光显微镜系统。
在这3种结构光照明超分辨荧光显微镜系统中,它们需要满足两个条件才能实现超分辨荧光显微，即产生余弦结构光和改变结构光的相位及方向。除了此以外,其它的各系统和装置或处理算法均一样或类同的。
光栅型结构光照明超分辨荧光显微镜系统直接利用两束激光束干涉产生余弦结构光条纹，体积较大。此外，如果激发波长改变时，需要微调光路，这为多色荧光激发带来不便。
数字微镜阵列(Digital micromirror device DMD)由一系列微镜组成(13微米x13微米)，通过改变微镜的偏转角度实现微镜的开关，从而产生用于照明的结构条纹。不同方向、同一方向不同相位的结构照明条纹可以通过控制数字微镜阵列的系列微反射镜直接实现。
液晶空间光调制器可认为是一个周期可编程控制的闪耀光栅。它获得余弦结构光的原理与光栅型结构光照明超分辨荧光显微镜系统一样，即两束光在样品表面发生干涉，产生余弦结构光照明样品。另外，空间光调制器只能对偏振光进行调制的特点，使得光路复杂；激发光偏离空间光调制器工作波长越大，衍射效率越低，因此空间光调制器也只是对应特定的单个激发波长。
上述基于光栅、数字微镜阵列和空间光制器的结构光照明超分辨荧光显微镜系统,在面向空间应用的微型化过程中,除了它们自身光学器件具有的微型化困难之外,都共同具有获得余弦结构光所需要的光路路程很长。这对于面向空间应用微型化是最大的问题。因此，结构光产生微系统就成为面向空间应用的微型化荧光超分辨检测技术中最为关键的一项技术。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提出了一种微型结构光产生装置及微型结构光照明超分辨显微成像系统。本发明的显微成像方法能有效的减小结构光照明超分辨显微成像系统的体积，具有制作、装配简单，无机械运动，稳定性好的特点。
本发明的一个目的在于提出一种微型结构光产生装置。
本发明的微型结构光产生装置(图2)自下而上依次包括：压电陶瓷及电机转动装置(1)、激光器(2)、结构光透射片(3)、位移补偿片(4)；为了更好的阐述本发明，图中给画出了样品(5)；结构光透射片(3)为微柱透镜，结构如图3所示，透光的一面为一排半微柱凸透镜轴向平行并排阵列结构，相背的另一面为平面结构，结构光透射片的半微柱凸透镜一侧正对激光器(2)出光口，并且两者通过固定装置相连(图2c中未画出)，垂直固定在压电陶瓷及电机转动装置(1)上；结构光透射片(3)的材料为普通透镜材料或紫外固化材料，结构光透射片(3)，作用是将平行激发光聚焦成明暗结构光条纹，如图2中b所示；通过压电陶瓷及电机转动装置(1)的电动旋转台转动可以使固定在其上的激光器(2)、结构光透射片(3)、聚焦位置补偿片(4)水平旋动，从而获得不同方向的结构光条纹；通过压电陶瓷的水平平行位移可以得到不同相位的结构光条纹。聚焦位移补偿片(4)为一折射率可变的透明平板结构，作用相当于一个平板玻璃，对结构光透射片聚焦的激光进一步折射，如图2中a所示。这可以改变激光聚焦的焦点在样品中的竖直上下位置，形成照明位置可上下移动，条纹的基本结构不变的一组条纹结构光；
结构光透射片(3)不仅仅可以用半圆柱透镜阵列聚焦的方式产生结构光条纹，也可以控制周期透过率阵列的方法产生同样效果的条纹。
位移补偿片(4)可以通过改变其折射率的方法实现上述结构光条纹的竖直移动。这种折射率的改变可以是利用改变光折变晶体电压的实现；也可能通过控制材料温度的方法实现折射率的改变。
综上所述本发明的微型结构光产生装置可以产生结构光条纹，并且结构光条纹的上下、左右位置及条纹方向都可以改变。
本发明的另一个目的在于提出一种微型结构光照明荧光超分辨显微系统。如图4所示，该系统自相而上依次包括微型结构光产生装置(1、2、3、4)、样品(5)、显微物镜(6)、滤波片(7)、聚焦透镜(8)、数字采集设备(9)，还包括计算机(10)，微型结构光产生装置的压电陶瓷及电机转动装置(1)和位移补偿片(4)与计算机(10)连接，数字采集设备(9)与与计算机(10)连接。
样品(5)紧贴微型结构光产生装置上面，结构光条纹照明到样品观察层；样品位于物镜(6)的物方焦平面，收集样品被结构照明光照明并激光出的荧光和部分激光光；滤波片(7)将激发光滤除，只留荧光；聚焦透镜(8)处于物镜的傅利叶变换平面，将样品荧光的频域信息成像于数字成像设备(9)处并被收集；之后计算机(10)处理频域图像信息通过超分辨图你处理算法恢复出带有更多样品细节的超分辨图像。
本发明微型结构光照明超分辨荧光显微系统的优点为：直接利用结构光透射片产生结构光条纹，缩减了由于干涉产生结构光条纹所需的距离；通过改变结构光透射片的折射率来改变条纹的垂直位置，可照明样品不同切面，使超分辨荧光显微系统具有层析能力；利用背透照明，使超分辨荧光显微系统结构及装配更为简单。综合来看本发明可以在不降低超分辨空间分辨率的同时，实现结构更简单、体积更小的、具有层析能力的超分辨荧光显微系统。
附图说明
图1为一般结构光照明超分辨显微系统示意图；
图2为微型结构光产生装置结构及原理图；
图3为微型结构光透射片示意图；
图4为微型结构光照明超分辨荧光显微系统示意图；
其中压电陶瓷及电机转动装置1、激光器2、结构光透射片3、位移补偿片4、样品5、显微物镜6、滤波片7、聚焦透镜8、数字采集设备9、计算机10。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例优先采用的微型结构光产生装置为：激光光源为100mw功率可调475nm半导体激光器；微型结构光透射片采用图3所示的半圆柱阵列微型结构光透射片结构，其折射率为1.5，半圆柱透镜半径为1微米,结构光透射片的厚度为1.5微米，产生的结构光条纹周期为1微米，对比度为0.93；焦点位置补偿片采用2微米厚度的铌酸锂晶体。最终得到的余弦结构光条纹为周期1微米，对比度0.73；压电电机及转动装置采用常用的亚纳米级平台。
如图2中c所示，结构光透射片3的微柱透镜一侧正对激光器2出光口，距离10毫米左右，并且两者通过简单固定装置相连(图2中c中未画出)，垂直固定在压电陶瓷及电机转动装置1上。使用时，通过压电陶瓷及电机转动装置1的电动旋转台转动使固定在其上的激光器2、结构光透射片3、聚焦位置补偿片4水平转动，从而获得不同方向的结构光条纹；通过压电陶瓷的水平位移可以得到不同相位的结构光条纹。改变聚焦位移补偿片4的上下表面的电场，如图2中a所示，激光光聚焦的位置上下移动。于是我们得到了一个微型的相位、条纹方向、条纹上下位置可变的结构光产生装置。
如图4示，将上述微型结构光产生装置入结构光照明超分辨荧光显微系统。此外系统还包括样品5，显微物镜6为40倍，NA为1.6、滤波片7、聚焦透镜8，数字采集设备9、计算机10。样品5紧贴微型结构光产生装置，结构光条纹照明到样品观察层；样品位于物镜6的物方焦平面，收集样品被结构照明光照明并激光出的荧光和部分激光光；滤波片7将激发光滤除，只留荧光；聚焦透镜8处于物镜的傅利叶变换平面，将样品荧光的频域信息成像于数字成像设备9处并被收集；之后计算机10处理频域图像信息通过超分辨图你处理算法恢复出带有更多样品细节的超分辨图像。
下面给出具体操作步骤：
1)在不放置样品的情况下，通过计算机控制，激光器1得到较好均一性和对比度的结构光条纹；再通过计算机控制压电陶瓷及转动装置，记录初始电压V1时结构光条纹位置图像；调节压电陶瓷及转动装置电压，记录结构光条纹相位改变2π/3时的电压V2；再次调节，记录条纹相位改变2π/3时的电压V3。
2)放置样品，打开激光器，通过微型结构光产生装置得到结构条纹照射到样品上；通过计算机控制调节压电陶瓷及转动装置电压分别为V1、V2、V3；激光发出的荧光依次通过微型结构光产生装置、物镜、滤波片、聚光镜、最后到达数字成像设备；数字成像设备采集信息后在计算计上分别得到第1、2、3幅初始图像。
3)通过计算机控制压电陶瓷及转动装置转动微型结构光产生装置，使条纹分别为相对步骤2中的条纹方向转动120°及240°，重复步骤2可以得到其余6幅初始图像。
4)计算机采用普通的超分辨荧光显微成像处理算法处理这9幅图像，得到最终的超分辨荧光显微图像。
5)计算机控制结构光聚焦位移补偿片上下表面的电压，可以将结构光条纹照明到样品不同厚度。重复1-4的步骤可以得到样品不同厚度处的超分辨荧光显微图像。

Claims (6)

1.面向空间应用的一种微型结构光产生装置，其特征在于，自下而上依次包括：压电陶瓷及电机转动装置(1)、激光器(2)、结构光透射片(3)、位移补偿片(4)；结构光透射片(3)为微柱透镜，透光的一面为一排半微柱凸透镜轴向平行并排阵列结构，相背的另一面为平面结构，结构光透射片的半微柱凸透镜一侧正对激光器(2)出光口，并且两者通过固定装置相连，垂直固定在压电陶瓷及电机转动装置(1)上；通过压电陶瓷及电机转动装置(1)的电动旋转台转动使固定在其上的激光器(2)、结构光透射片(3)、聚焦位置补偿片(4)水平旋动，从而获得不同方向的结构光条纹；通过压电陶瓷的水平平行位移得到不同相位的结构光条纹；聚焦位移补偿片(4)为一折射率可变的透明平板结构，对结构光透射片聚焦的激光进一步折射，改变激光聚焦的焦点在样品中的竖直上下位置，形成照明位置可上下移动，条纹的基本结构不变的一组条纹结构光。
2.按照权利要求1所述的面向空间应用的一种微型结构光产生装置，其特征在于，结构光透射片(3)的材料为普通透镜材料或紫外固化材料，结构光透射片(3)，作用是将平行激发光聚焦成明暗结构光条纹。
3.按照权利要求1所述的面向空间应用的一种微型结构光产生装置，其特征在于，位移补偿片(4)可以通过改变其折射率的方法实现上述结构光条纹的竖直移动；这种折射率的改变是利用改变光折变晶体电压的实现；或通过控制材料温度的方法实现折射率的改变。
4.一种微型结构光照明荧光超分辨显微系统，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的微型结构光产生装置。
5.按照权利要求4所述的一种微型结构光照明荧光超分辨显微系统，其特征在于，该系统自相而上依次包括微型结构光产生装置、样品(5)、显微物镜(6)、滤波片(7)、聚焦透镜(8)、数字采集设备(9)，还包括计算机(10)，微型结构光产生装置的压电陶瓷及电机转动装置(1)和位移补偿片(4)与计算机(10)连接，数字采集设备(9)与计算机(10)连接。
6.按照权利要求5所述的一种微型结构光照明荧光超分辨显微系统，其特征在于，样品(5)紧贴微型结构光产生装置上面，结构光条纹照明到样品观察层；样品位于物镜(6)的物方焦平面，收集样品被结构照明光照明并激光出的荧光和部分激光光；滤波片(7)将激发光滤除，只留荧光；聚焦透镜(8)处于物镜的傅利叶变换平面，将样品荧光的频域信息成像于数字成像设备(9)处并被收集；之后计算机(10)处理频域图像信息通过超分辨图你处理算法恢复出带有更多样品细节的超分辨图像。
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