CN108324248B - 双色荧光激发神经信号光纤记录系统及记录方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统及记录方法，其记录系统包括激发光源、荧光探测器、光路筛选装置、光纤耦合回路和采集卡；其方法为利用激发光源提供两种颜色的激发光，将两种激发光被耦合在同一根光纤中，激发产生的两种荧光信号同样通过这根光纤被传输和分别收集。荧光探测器中利用荧光探针对荧光蛋白进行标记，由于其中一路荧光信号源自不受钙离子浓度调控的普通荧光探针，其荧光亮度不会受到该脑区神经元活动强弱的影响，因此可以作为对照组来排除光纤缠绕和实验动物剧烈运动引起的信号伪迹，从而实现实验动物的自身对照。通过增大多模光纤的数值孔径，提高荧光信号的收集效率。

Description

双色荧光激发神经信号光纤记录系统及记录方法

技术领域

本发明涉及神经信号记录技术领域，特别涉及一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统及记录方法。

背景技术

哺乳动物的大脑具有极其复杂的结构和功能，对大脑各个核团功能的理解和解析需要基于一定的观察和记录手段。通过对特定行为范式下的实验动物相关脑区的神经元活动进行实时的观测和记录，能够为我们理解该核团的功能机制以及进一步理解和治疗相关神经性疾病提供重要的数据参考和理论支持。

电生理记录通过将金属或者玻璃电极植入到相关核团来记录神经元的电活动，是一种最直接和精确的记录方法。但是这种电极与神经细胞接触试的记录方法容易受到电磁和运动干扰、不能维持较长的时间，并且神经元之间的类型差异也很难通过放电活动进行准确的区分。神经元的电活动是细胞膜上离子通道的开启引起胞内外的离子浓度变化所导致的，其中钙离子浓度的增加是神经元兴奋性增加的一种很好的间接度量指标。钙敏感的荧光探针特别是钙敏感荧光蛋白是通过检测细胞内钙离子浓度变化来间接反映神经元活动的一种指示剂，能够将细胞内钙离子浓度的变化转化为荧光探针亮度的变化，具有神经元特异性和持久稳定的特点。光纤记录系统利用一根柔性多模光纤将激发光传输的相应脑区，并将激发荧光蛋白产生的荧光信号传输回探测光路进行检测和采集，能够长时间稳定的记录相关脑区的神经元在特定行为范式下的活动情况，是对传统电生理记录方法的一种补充。光纤记录系统利用光纤介导传输信号，具有良好的电磁屏蔽特点，但是实验动物运动导致的光纤缠绕会引起记录信号的波动进而导致信噪比的下降甚至产生假的信号。这就需要在实验上设置相应的对照试验来排除实验动物剧烈运动引起的假信号，对于记录时间较长或者行为范式比较复杂的情况下，往往造成实验动物和实验时间的浪费。并且已有的光纤记录系统在特定行为范式中记录实验动物相关脑区神经活动时无法完全排除由于光纤缠绕和实验动物自身剧烈运动产生的信号伪迹，需要额外的实验动物来进行对照实验以验证实验组的数据有效性。

因此，有必要在此基础上做必要的改进，实现实验动物的自身对照以提高实验效率和实验数据的准确性。

发明内容

本发明的目的旨在至少解决所述的技术缺陷之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统及记录方法，已解决传统光纤记录系统无法进行自身对照排除运动噪音导致实验资源浪费和实验数据精度下降的问题。

为了实现上述目的，本发明一方面的实施例提供一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统，包括激发光源、荧光探测器、光路筛选装置、光纤耦合回路和采集卡；

所述激发光源，用于提供两种不同光谱范围的激发单色光；每种所述激发单色光分别对应荧光探测器标记荧光蛋白时，所使用的荧光探针的最优激发峰；

所述光路筛选装置，用于提高每种所述激发单色光的非相干性，并将激发单色光进行光路偏转后发送至所述光纤耦合回路；

所述光纤耦合回路，用于将每种激发单色光进行耦合；并将耦合的光信号传输到相应的被测神经元；

所述荧光探测器，包括钙敏感荧光探针、普通荧光探针和探测器；所述钙敏感荧光探针和普通荧光探针分别用于标记被测神经元的荧光蛋白；所述钙敏感荧光探针用于标记被测神经元活动荧光蛋白；所述普通荧光探针用于标记运动伪迹荧光蛋白；利用每种所述激发单色光在被测神经元上表达时，荧光蛋白被激发而产生的不同的荧光；每种所述荧光经所述光路筛选装置，进行筛选；所述荧光探测器采集筛选后的每种荧光，并进行低通滤波，发送至采集卡；

所述采集卡，用于捕获荧光探测器发送的荧光，并将所捕获的荧光进行数字化处理，并导入计算机进行存储。

优选的，所述光路筛选装置包括多个二相色镜和滤光片；所述滤光片设置在激发光源和二相色镜之间，用于过滤除激发单色光或荧光之外的其他色光；每个所述二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向光纤耦合回路中轴线。

优选的，所述光纤耦合光路包括物镜和X-Y二维调节架，所述X-Y二维调节架上固定设有多模光纤，所述多模光纤的中心调节至物镜聚焦光斑焦点位置。

进一步，所述物镜数值孔径应大于等于所述多模光纤的数值孔径。

优选的，所述激发单色光包括两种，一种采用波长范围在450-480nm的蓝光光源，另一种采用波长范围在597-570nm的黄光光源。

本发明还提出一种双色荧光激发神经信号光纤记录方法，包括以下步骤：

步骤S1，利用激发光源，发射两种不同光谱范围的激发单色光；每种所述激发单色光分别对应荧光探测器标记荧光蛋白时，使用的荧光探针的最优激发峰；

步骤S2，将每种激发单色光进行光路筛选；并将筛选后的多种激发单色光传输到光纤耦合回路；

步骤S3，将多种激发单色光利用光纤耦合回路进行耦合；并将耦合的光信号传输到相应的被测神经元；

步骤S4，利用钙敏感荧光探针和普通荧光探针分别对被测神经元的荧光蛋白进行标记，其中，所述钙敏感荧光探针标记被测神经元活动荧光蛋白；所述普通荧光探针标记运动伪迹荧光蛋白；利用每种所述激发单色光在被测神经元上表达时，荧光蛋白被激发而产生的不同的荧光；将每种所述荧光经光路筛选装置，进行筛选；所述荧光探测器采集筛选后的每种荧光，并进行低通滤波，发送至采集卡；

步骤S5，利用采集卡，将荧光探测器发送的荧光，进行数字化处理，并导入计算机进行存储采集和存储。

优选的，在步骤S2中和步骤S4中，利用多个二相色镜和滤光片实现光路筛选；其中，所述滤光片设置在激发光源和二相色镜之间，过滤除激发单色光或荧光之外的其他色光；每个所述二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向光纤耦合回路中轴线。

进一步，所述物镜数值孔径应大于等于所述多模光纤的数值孔径。

优选的，步骤S3中，光纤耦合光路包括物镜和X-Y二维调节架，所述二维调节架上固定设有多模光纤，所述多模光纤的中心调节至物镜聚焦光斑焦点位置。

优选的，所述激发单色光包括两种，一种采用波长范围在450-480nm的蓝光光源，另一种采用波长范围在597-570nm的黄光光源。

根据本发明实施例的提供的一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统及记录方法，利用两种颜色的激发光被耦合在同一根光纤中，激发产生的两种荧光信号同样通过这根光纤被传输和分别收集。由于其中一路荧光信号源自不受钙离子浓度调控的普通荧光探针，其荧光亮度不会受到该被测神经元活动强弱的影响，因此可以作为对照组来排除光纤缠绕和实验动物剧烈运动引起的信号伪迹，从而实现实验动物的自身对照。通过增大多模光纤的数值孔径，提高荧光信号的收集效率。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例提供的双色荧光激发神经信号光纤记录系统的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的双色荧光激发神经信号光纤记录方法的流程图；

图3为本发明实施例提供的双色荧光激发神经信号记录系统中光路偏转和荧光筛选的示意图；

图中：1、第一激发光源；2、第二激发光源；C1、第一探测器；C2、第二探测器；3、光路筛选装置；A1、第一滤光片，A2、第二滤光片，A3、第三滤光片，A4、第四滤光片，B1、第一二相色镜，B2、第二二相色镜，B3、第三二相色镜，4、光纤耦合回路；401、物镜；402、X-Y二维调节架；403、多模光纤；5、采集卡。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

如图1所示，本发明实施例的一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统，包括激发光源、荧光探测器、光路筛选装置、光纤耦合回路和采集卡。激发光源提供两种不同光谱范围的激发单色光；每种激发单色光分别对应荧光探测器标记荧光蛋白时，所使用的荧光探针的最优激发峰。

在本发明的另一个实施例中，激光光源设有两个第一激光光源1和第二激发光源2；对应的激发单色光也包括两种，一种采用波长范围在450-480nm的蓝光光源，另一种采用波长范围在597-570nm的黄光光源。作为优选的，如图1所示，图中激发光源1为波长为470nm左右的蓝光光源；激发光源2为波长为570nm左右的黄色光源。

光路筛选装置用于提高每种激发单色光的非相干性，并将激发单色光进行光路偏转后发送至光纤耦合回路。

光纤耦合回路用于将每种激发单色光进行耦合；并将耦合的光信号传输到相应的被测神经元。

荧光探测器，包括钙敏感荧光探针、普通荧光探针、第一探测器C1、第二探测器C2；钙敏感荧光探针和普通荧光探针分别用于标记被测神经元的荧光蛋白；钙敏感荧光探针用于标记被测神经元活动荧光蛋白；普通荧光探针用于标记运动伪迹荧光蛋白；利用每种激发单色光在被测神经元上表达时，荧光蛋白被激发而产生的不同的荧光；每种荧光经光路筛选装置，进行筛选；荧光探测器采集筛选后的每种荧光，并进行低通滤波，发送至采集卡；

在本发明的一个实施例中，钙敏感荧光探针和普通荧光探针在进行荧光蛋白标记时，分别采用GCaMP6绿色钙敏感荧光蛋白和mCherry红色荧光蛋白。

采集卡5用于捕获荧光探测器发送的荧光，并将所捕获的荧光进行数字化处理，并导入计算机进行存储。

在本发明的一个实施例中，光路筛选装置包括多个二相色镜和滤光片；滤光片设置在激发光源和二相色镜之间，用于过滤除激发单色光或荧光之外的其他色光；每个二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向光纤耦合回路中轴线。

如图1所示，第一滤光片A1：带通，透过波长上限应小于第一二相色镜B1的截止波长，设置在激发光源1的激光发射口，用于提高激发光源1的单色性。

第二滤光片A2：带通，设置在第一探测器C1的荧光输入口；用于滤除绿色荧光以外的杂散光。

第一二相色镜B1：长通，截止波长介于第一滤光片A1的透过波长上限和第二滤光片A2的透过波长下限之间，将第一激发光源1的激发光反射到耦合光路。

第三滤光片A3：带通，透过波长上限应小于第三二相色镜B3的截止波长，下限应大于第二二相色镜2的截止波长，用于提高第二激发光源2的单色性。

第二二相色镜B2：长通，截止波长介于第二滤光片A2的透过波长上限和第三滤光片A3的透过波长下限之间，将第一激发光源1激发产生的绿色荧光反射到第一探测器C1所在光路上。

第四滤光片A4：带通，设置在第二探测器C2的荧光输入口；用于滤除红色荧光以外的杂散光。

第三二相色镜B3：长通，截止波长介于第三滤光片A3的透过波长上限和第四滤光片A4的透过波长下限之间，将第二激发光源2的激发光反射到耦合光路。

在本发明的另一个实施例中，光纤耦合光路包括物镜401和X-Y二维调节架402，X-Y二维调节架402上固定设有多模光纤403，多模光纤403的中心调节至物镜401聚焦光斑焦点位置。

激发光源1和激发光源2发出的激发单色光，均通过二相色镜偏转90度到耦合光路，并且在耦合光路光轴完全重叠。两路激发光通过物镜被耦合在同一根光纤中，并传输到相应的被测神经元。为了在较低荧光漂白效应的情况下采集到高信噪比的信号，系统同样需要尽可能使用大数值孔径的多模光纤，以提高荧光信号的收集效率。物镜数值孔径应大于等于所用光纤的数值孔径，以充分利用光纤收集到的荧光，光纤的前端面位于耦合物镜的焦面中心。

本系统在安装时，将三个二相色镜B1-B3与探测器C2、滤光片A4，以及耦合光路(物镜及二维调节架)同轴固定，二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向耦合光路部分；将光源1、2及对应的带通滤光片(A1、A3)同轴固定并分别固定在二相色镜1和3的镀膜面一侧，两光路光轴高度一致并呈90度偏转；探测器1及滤光片A2同轴放置并固定在二相色镜B2镀膜面一侧，两光路光轴高度一致并呈90度偏转；多模光纤固定在二维调节架上，并调节至物镜聚焦光斑焦点位置；两探测器输出信号经过低通滤波后被同一采集卡采集和存储。

在激发光照射下，被测神经元上表达的两种颜色荧光蛋白会被同时激发产生荧光，两种荧光信号由于光谱范围不同，通过二线色镜和滤光片的设置最终分别被两个光电探测器所检测和记录。钙敏感荧光蛋白由于受到神经元活动的调控，荧光亮度会随着神经元活动强弱而产生相似的变化。而普通荧光蛋白的荧光亮度仅受激发光强度和蛋白表达密度的影响，不考虑漂白的情况下亮度在实验中基本维持不变。两种荧光蛋白的荧光和激发光在光纤中传输的过程都会受到光纤缠绕和实验动物运动的影响，产生强度的变化。因此，在实验中可以通过普通荧光通道的信号在特定行为中的波动情况来判断钙敏感荧光通道的信号是否真实源自对应脑区神经元的活动，从而实现实验动物的自身对照。

本发明还提供一种双色荧光激发神经信号光纤记录方法，包括以下步骤：

步骤S1，利用激发光源，发射两种不同光谱范围的激发单色光；每种激发单色光分别对应荧光探测器标记荧光蛋白时，所使用的荧光探针的最优激发峰；

如图2所示，在本发明的另一个实施例中，激发单色光包括两种，一种采用波长范围在450-480nm的蓝光光源，另一种采用波长范围在597-570nm的黄光光源。做为优选的，如图1所示，图中激发光源1为波长为470nm左右的蓝光光源；激发光源2为波长为570nm左右的黄色光源。

步骤S2，将每种激发单色光进行光路筛选；并将筛选后的多种激发单色光传输到光纤耦合回路；

步骤S3，将多种激发单色光利用光纤耦合回路进行耦合；并将耦合的光信号传输到相应的被测神经元；

步骤S4，利用钙敏感荧光探针和普通荧光探针分别对被测神经元的荧光蛋白进行标记，其中，钙敏感荧光探针标记被测神经元活动荧光蛋白；普通荧光探针标记运动伪迹荧光蛋白；利用每种激发单色光在被测神经元上表达时，荧光蛋白被激发而产生的不同的荧光；将每种荧光经光路筛选装置，进行筛选；荧光探测器采集筛选后的每种荧光，并进行低通滤波，发送至采集卡；

步骤S5，利用采集卡，将荧光探测器发送的荧光，进行数字化处理，并导入计算机进行存储采集和存储。

在本发明的一个实施例中，钙敏感荧光探针和普通荧光探针在进行荧光蛋白标记时，分别采用GCaMP6绿色钙敏感荧光蛋白和mCherry红色荧光蛋白。

在本发明的一个实施例中，在步骤S2中和步骤S4中，利用多个二相色镜和滤光片实现光路筛选；其中，滤光片设置在激发光源和二相色镜之间，过滤除激发单色光或荧光之外的其他色光；每个二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向光纤耦合回路中轴线。

如图1所示，第一滤光片A1：带通，透过波长上限应小于第一二相色镜B1的截止波长，设置在激发光源1的激光发射口，用于提高激发光源1的单色性。

第二滤光片A2：带通，设置在第一探测器C1的荧光输入口；用于滤除绿色荧光以外的杂散光。

第一二相色镜B1：长通，截止波长介于第一滤光片A1的透过波长上限和第二滤光片A2的透过波长下限之间，将第一激发光源1的激发光反射到耦合光路。

第三滤光片A3：带通，透过波长上限应小于第三二相色镜B3的截止波长，下限应大于第二二相色镜2的截止波长，用于提高第二激发光源2的单色性。

第二二相色镜B2：长通，截止波长介于第二滤光片A2的透过波长上限和第三滤光片A3的透过波长下限之间，将第一激发光源1激发产生的绿色荧光反射到第一探测器C1所在光路上。

第四滤光片A4：带通，设置在第二探测器C2的荧光输入口；用于滤除红色荧光以外的杂散光。

第三二相色镜B3：长通，截止波长介于第三滤光片A3的透过波长上限和第四滤光片A4的透过波长下限之间，将第二激发光源2的激发光反射到耦合光路。

在本发明的另一个实施例中，步骤S3中光纤耦合光路包括物镜401和X-Y二维调节架402，X-Y二维调节架402上固定设有多模光纤403，多模光纤403的中心调节至物镜401聚焦光斑焦点位置。

激发光源1和激发光源2发出的激发单色光，均通过二相色镜偏转90度到耦合光路，并且在耦合光路光轴完全重叠。两路激发光通过物镜被耦合在同一根光纤中，并传输到相应的被测神经元。为了在较低荧光漂白效应的情况下采集到高信噪比的信号，系统同样需要尽可能使用大数值孔径的多模光纤，以提高荧光信号的收集效率。物镜数值孔径应大于等于所用光纤的数值孔径，以充分利用光纤收集到的荧光，光纤的前端面位于耦合物镜的焦面中心。

在激发光照射下，被测神经元上表达的两种颜色荧光蛋白会被同时激发产生荧光，两种荧光信号由于光谱范围不同，通过二线色镜和滤光片的设置最终分别被两个光电探测器所检测和记录。钙敏感荧光蛋白由于受到神经元活动的调控，荧光亮度会随着神经元活动强弱而产生相似的变化。而普通荧光蛋白的荧光亮度仅受激发光强度和蛋白表达密度的影响，不考虑漂白的情况下亮度在实验中基本维持不变。两种荧光蛋白的荧光和激发光在光纤中传输的过程都会受到光纤缠绕和实验动物运动的影响，产生强度的变化。因此，在实验中可以通过普通荧光通道的信号在特定行为中的波动情况来判断钙敏感荧光通道的信号是否真实源自对应脑区神经元的活动，从而实现实验动物的自身对照。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。

Claims (7)

1.一种双色荧光激发神经信号光纤记录系统，其特征在于，包括激发光源、荧光探测器、光路筛选装置、光纤耦合回路和采集卡；

所述激发光源，用于提供两种不同光谱范围的激发单色光；每种所述激发单色光分别对应荧光探测器标记荧光蛋白时，所使用的荧光探针的最优激发峰；

所述光路筛选装置，用于提高每种所述激发单色光的非相干性，并将激发单色光进行光路偏转后发送至所述光纤耦合回路；

所述光纤耦合回路，用于将每种激发单色光进行耦合；并将耦合的光信号传输到相应的被测神经元；

所述荧光探测器，包括钙敏感荧光探针、普通荧光探针和探测器；所述钙敏感荧光探针和普通荧光探针分别用于标记被测神经元的荧光蛋白；所述钙敏感荧光探针用于标记被测神经元活动荧光蛋白；所述普通荧光探针用于标记运动伪迹荧光蛋白；利用每种所述激发单色光在被测神经元上表达时，荧光蛋白被激发而产生的不同的荧光；每种所述荧光经所述光路筛选装置，进行筛选；所述荧光探测器采集筛选后的每种荧光，并进行低通滤波，发送至采集卡；

所述采集卡，用于捕获荧光探测器发送的荧光，并将所捕获的荧光进行数字化处理，并导入计算机进行存储；

所述光路筛选装置包括多个二相色镜和滤光片；所述滤光片设置在激发光源和二相色镜之间，用于过滤除激发单色光或荧光之外的色光；每个所述二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向光纤耦合回路中轴线；

其中，第一滤光片：带通，透过波长上限应小于第一二相色镜的截止波长，设置在激发光源的激光发射口，用于提高激发光源的单色性；

第二滤光片：带通，设置在第一探测器的荧光输入口；用于滤除绿色荧光以外的杂散光；

第三滤光片：带通，透过波长上限应小于第三二相色镜的截止波长，下限应大于第二二相色镜的截止波长，用于提高第二激发光源的单色性；

第二二相色镜：长通，截止波长介于第二滤光片的透过波长上限和第三滤光片的透过波长下限之间，将第一激发光源激发产生的绿色荧光反射到第一探测器所在光路上；

第四滤光片：带通，设置在第二探测器的荧光输入口；用于滤除红色荧光以外的杂散光；

第三二相色镜：长通，截止波长介于第三滤光片的透过波长上限和第四滤光片的透过波长下限之间，将第二激发光源的激发光反射到耦合光路。

2.根据权利要求1所述的双色荧光激发神经信号光纤记录系统，其特征在于，所述光纤耦合回路包括物镜和X-Y二维调节架，所述X-Y二维调节架上固定设有多模光纤，所述多模光纤的中心调节至物镜聚焦光斑焦点位置。

3.根据权利要求2所述的双色荧光激发神经信号光纤记录系统，其特征在于，所述物镜数值孔径大于或等于所述多模光纤的数值孔径。

4.根据权利要求1所述的双色荧光激发神经信号光纤记录系统，其特征在于，所述激发单色光包括两种，一种采用波长范围在450-480nm的蓝光光源，另一种采用波长范围在597-570nm的黄光光源。

5.一种双色荧光激发神经信号光纤记录方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1，利用激发光源，发射两种不同光谱范围的激发单色光；每种所述激发单色光分别对应荧光探测器标记荧光蛋白时，所使用的荧光探针的最优激发峰；

步骤S2，将每种激发单色光进行光路筛选；并将筛选后的多种激发单色光传输到光纤耦合回路；

步骤S3，将多种激发单色光利用光纤耦合回路进行耦合；并将耦合的光信号传输到相应的被测神经元；

步骤S4，利用钙敏感荧光探针和普通荧光探针分别对被测神经元的荧光蛋白进行标记，其中，所述钙敏感荧光探针标记被测神经元活动荧光蛋白；所述普通荧光探针标记运动伪迹荧光蛋白；利用每种所述激发单色光在被测神经元上表达时，荧光蛋白被激发而产生的不同的荧光；将每种所述荧光经光路筛选装置，进行筛选；所述荧光探测器采集筛选后的每种荧光，并进行低通滤波，发送至采集卡；

步骤S5，利用采集卡，将荧光探测器发送的荧光，进行数字化处理，并导入计算机进行存储采集和存储；

在步骤S2中和步骤S4中，利用多个二相色镜和滤光片实现光路筛选；其中，所述滤光片设置在激发光源和二相色镜之间，过滤除激发单色光或荧光之外的其他色光；每个所述二相色镜均横向倾斜45度角放置，镀膜面朝向光纤耦合回路中轴线；

其中，第一滤光片：带通，透过波长上限应小于第一二相色镜的截止波长，设置在激发光源的激光发射口，用于提高激发光源的单色性；

第二滤光片：带通，设置在第一探测器的荧光输入口；用于滤除绿色荧光以外的杂散光；

第三滤光片：带通，透过波长上限应小于第三二相色镜的截止波长，下限应大于第二二相色镜的截止波长，用于提高第二激发光源的单色性；

第二二相色镜：长通，截止波长介于第二滤光片的透过波长上限和第三滤光片的透过波长下限之间，将第一激发光源激发产生的绿色荧光反射到第一探测器所在光路上；

第四滤光片：带通，设置在第二探测器的荧光输入口；用于滤除红色荧光以外的杂散光；

第三二相色镜：长通，截止波长介于第三滤光片的透过波长上限和第四滤光片的透过波长下限之间，将第二激发光源的激发光反射到耦合光路。

6.根据权利要求5所述的双色荧光激发神经信号光纤记录方法，其特征在于，步骤S3中，光纤耦合光路包括物镜和X-Y二维调节架，所述X-Y二维调节架上固定设有多模光纤，所述多模光纤的中心调节至物镜聚焦光斑焦点位置。

7.根据权利要求5所述的双色荧光激发神经信号光纤记录方法，其特征在于，所述激发单色光包括两种，一种采用波长范围在450-480nm的蓝光光源，另一种采用波长范围在597-570nm的黄光光源。

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