CN108291244A - 具有支化寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含具有支化寡糖的低分子量‑阿拉伯木聚糖(LMW‑AX)的组合物，优选地至少一种支化寡糖位于LMW‑AX骨架的还原端处或还原端附近。本发明还涉及其生产和用途。本发明进一步涉及包含具有寡糖的低分子量‑阿拉伯木聚糖(LMW‑AX)的组合物，其中Araf单元的一部分已被除去以提高寡糖的收率。

Description

具有支化寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖
发明领域
本发明涉及从谷物来源获得的低分子量阿拉伯木聚糖。低分子量阿拉伯木聚糖(LMW-AX)是由阿拉伯木聚糖通过用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶水解来获得的。低分子量阿拉伯木聚糖含有用至少一个阿拉伯糖单元或木糖单元支化的寡糖。具有支化寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖作为饲料、食品、饮料、个人护理成分或作为营养补充剂是特别有用的。此外，本发明还涉及一种工艺，其中从基于谷物的乙醇工艺中分离的纤维可以用作起始底物。此外，本发明还描述了如何可以将与乙醇工艺有关的生产的具有支化寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖返回至工艺流以制备新的饲料产品。
此外，本发明还涉及如何可以以高纯度获得高分子量阿拉伯木聚糖。并且本发明还涉及如何可以获得纤维素的不溶性纤维和阿拉伯木聚糖。
此外，本发明涉及如何可以从谷物来源获得具有寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖。寡糖是由阿拉伯木聚糖通过含有阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶的酶混合物来获得的。含有寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖制品作为饲料、食品、饮料、个人护理成分或作为营养补充剂是特别有用的。此外，本发明还涉及一种工艺，其中从基于谷物的乙醇工艺中分离的纤维可以用作起始底物。此外，本发明还描述了如何可以将与乙醇工艺有关的生产的具有寡糖的低分子量阿拉伯木聚糖返回至工艺流以制备新的饲料产品。
技术背景
木聚糖半纤维素是在纤维素之后的植物界中第二最丰富的生物聚合物。在高等植物中的所有木聚糖的共同特征是它们的β-(1→4)-连接的D-吡喃木糖基(Xylp)残基的骨架。包含不同于木糖的其它糖的木聚糖被称为杂木聚糖(heteroxylan)，并且可以分为在双子叶植物的次生细胞壁中发现的葡糖醛酸木聚糖(GX)，或在谷物的初生细胞壁中发现的阿拉伯木聚糖(AX)。在谷物中的AX含量和组成随着植物来源、栽培品种以及组织而变化。大部分AX在糠组织(bran tissue)(外果皮和内果皮、种皮、珠心表皮和相关的糊粉层)中被发现，大多数糠组织是不溶于水的。
取决于来源，AX可以在骨架上具有作为支链附接的不同的取代基。最常见的结构元素是，I)未被取代的Xylp单元(uXyl)，II)被连接至Xylp单元的α-(1→2)-连接的L-阿拉伯呋喃糖基(Araf)(mXyl2)，III)被连接至Xylp单元的α-(1→3)-连接的Araf(mXyl3)，以及IV)被连接至Xylp单元的双α-(1→2)和α-(1→3)-连接的Araf(dXyl)。在玉米AX的情况下，骨架也可以被(1→2)或(1→3)连接的Xylp取代到骨架或取代到Araf取代基。另外，玉米AX中可以存在半乳糖和葡萄糖醛酸。羟基肉桂酸衍生物，主要是阿魏酸(FA)，可以被酯连接至天然AX中的少量Araf取代基上的O-5位。
两种主要的寡糖组：木寡糖(xylo-oligosaccharide)(XOS)和阿拉伯木寡糖(arabinoxylo-oligosaccharide)(AXOS)可以衍生自AX的水解。XOS是木糖线型低聚物，其通过β-(1→4)键连接，具有分子通式C5nH8n+2O4n+1，其中n是2-10的木糖单元的数目。XOS从AX的非支化区域获得，而AXOS从支化区域获得并且具有木糖骨架，木糖骨架具有作为侧链被附接到木糖单元之一的至少一个Araf基团。取决于多少个Araf基团被附接、附接至哪个残基以及化学键类型(1→2)和/或(1→3)，支化AXOS的许多不同的组合是可能的。根据谷物来源，其他支化寡糖是可想到的。例如在玉米AX的情况下，具有至骨架的(1→3)-连接的Xylp的支化寡糖是可能的。AXOS可以通过它们的取代(支化)度来区分，取代(支化)度通常被定义为阿拉伯糖单元和木糖单元之间的比率(A/X)。
对于使用LMW-AX尤其是那些含有大部分寡糖作为新兴的益生元的制剂存在商业兴趣，益生元被定义为“导致GI微生物群的组成和/或活性的特异性变化、从而对宿主健康赋予益处的选择性地发酵的成分”。AXOS和XOS益生元性质的相当多的证据现在是可获得的。AXOS和XOS被排泄物微生物群(faecal microbiota)所发酵，产生促进健康的短链脂肪酸乙酸酯/盐、乳酸酯/盐、丙酸酯/盐和丁酸酯/盐。由水解的AX获得的寡糖的益生元作用与骨架的分子量和取代度(与A/X有关)相关联。较复杂的取代模式通常导致较慢的发酵和较少的气体产生。
与在近端结肠中快速发酵的XOS相比，支化寡糖作为更有选择性和更持久的益生元可能是潜在地有效的。用阿拉伯糖支化的AXOS对某些双歧杆菌(bifidobacteria)群组是有选择性的，双歧杆菌群组被认为是有益的细菌的最重要的群组之一，这是由于双歧杆菌群组刺激免疫系统发育、产生维生素、抑制病原体、减少血液中的氨和胆固醇以及有助于在抗生素治疗之后恢复健康消化道的能力。在双歧杆菌中利用支化多糖和支化寡糖的能力是菌株依赖性的，这意味着菌株可以基于它们的碳水化合物偏好(carbohydratepreference)来分组。这意味着支化寡糖首先被双歧杆菌或其他有益的细菌利用，该双歧杆菌或其他有益的细菌能够从骨架中除去侧分支或利用较小的支化寡糖。剩余的较长木糖骨架然后可以在结肠的更远端部分中被进一步代谢，延长益生元作用。
由于支化寡糖与非支化或较少支化的多糖和寡糖相比具有良好的持水能力，因此支化寡糖也可以在食品、饲料、饮料或个人护理应用中找到技术应用。特别是从其中大量蛋白质连接至AX骨架的玉米衍生而来的支化寡糖，将适合作为不同应用中的膨胀剂(bulkingagent)、稳定剂或乳化剂。
具有寡糖的LMW-AX主要产自不同的谷物糠，但也产自谷物乙醇发酵后获得的残余物。从经济的角度来看，使用来自乙醇工艺的含有AX的残余物是吸引人的，这是由于每年来自诸如玉米和小麦的谷物来源的大的生产量。干磨是关于燃料乙醇最常用的工艺，包括以下基本步骤：1)将谷粒研磨成粉末，2)在水中成浆，3)将淀粉(与酶)加热和液化，4)用酵母发酵，5)蒸馏乙醇，6)将湿酒糟分离成稀酒糟(thin stillage)和湿饼，任选地在蒸发成糖浆之前从稀酒糟中回收玉米油，7)将糖浆与湿饼混合，8)任选地将湿酒糟及可溶物(wetdistillers grains with solubles)干燥成干酒糟及可溶物(dried distillers grainswith solubles)(DDGS)。
DDGS含有在来源于谷粒外部部分(糠)的纤维级分中存在的大量的AX。纤维级分不被认为是有价值的饲料组分，并且除去纤维部分增加DDGS的蛋白质含量。然而，由于预处理或发酵步骤从纤维释放淀粉和蛋白质，所以纤维级分富含AX。用于纤维湿法分级的商业技术对于干磨乙醇工厂(dry mill ethanol plant)是容易得到的，例如来自美国Springfield OH的Fluid Quip Process Technologies。发酵前进行的湿法分级也有助于提高发酵罐能力6-8％。在发酵之前或之后除去纤维的部分的另一个益处是用于非反刍动物应用的DDGS中的蛋白质含量相对增加。
对于不同的应用，AX的利用受限于具有低含量的淀粉、蛋白质和脂肪的合适起始材料的可用性。富含AX的底物作为制备水溶性AX的起始材料将是更优选的，因为它减少了对通过化学手段或酶促手段预加工纤维的需求。现有技术水平的另一个限制是水溶性AX的纯化，因为水溶性蛋白质、盐和木质素难以从阿拉伯木聚糖级分中除去。由于AX提取物纯度低，这限制了阿拉伯木聚糖关于许多应用的使用。
关于由通常属于糖苷水解酶家族10或11的商业内切木聚糖酶水解AX的现有技术被限于具有足够量的游离uXyl的AX底物的较不复杂的区域(低A/X比率)。这将可用于制造具有寡糖的LMW-AX的底物限制为从例如种皮、珠心表皮以及糊粉层部分分离的AX。使用热/化学方法用于从AX来源生产具有寡糖的LMW-AX的技术具有以下缺点：支链在该工艺中被除去并且可以形成不想要的副产物例如糠醛和单糖。另一方面是从AX来源释放LMW-AX的机械处理例如干球磨和空化(cavitation)在生产寡糖方面不太有效。因此，复杂的AX底物例如从外果皮和内果皮(A/X＝0.8-1.2，取决于提取和来源的选择)分离的或来自例如玉米纤维/糠的密集取代(densely substituted)的AX(A/X＝0.5)未在商业规模上被用于制造由具有寡糖的LMW-AX组成的益生元制品。
来自纤维素的不溶性纤维可用作食品添加剂。纤维素纤维可以由谷物来源制造。然而，由目前工艺使用的起始材料使用具有大部分淀粉、蛋白质和脂肪的糠级分。这限制了谷物来源用于制造纤维素纤维的应用，这是因为在提取之前利用酶进行昂贵的预加工以除去淀粉和/或蛋白质。
木聚糖半纤维素是在纤维素之后的在植物界中第二最丰富的生物聚合物。在高等植物中的所有木聚糖的共同特征是它们的β-(1→4)-连接的D-吡喃木糖基(Xylp)残基的骨架。包含不同于木糖的其它糖的木聚糖被称为杂木聚糖，并且可以分为在双子叶植物的次生细胞壁中发现的葡糖醛酸木聚糖(GX)或在谷物的初生细胞壁中发现的阿拉伯木聚糖(AX)。在谷物中的AX含量和组成随着植物来源、栽培品种以及组织而变化。大部分AX在糠组织(外果皮和内果皮、种皮、珠心表皮和相关的糊粉层)中被发现，大多数糠组织是不溶于水的。
取决于来源，AX可以在骨架上具有作为支链附接的不同的取代基。最常见的结构元素是，I)未被取代的Xylp单元(uXyl)，II)被连接至Xylp单元的α-(1→2)-连接的L-阿拉伯呋喃糖基(Araf)(mXyl2)，III)被连接至Xylp单元的α-(1→3)-连接的Araf(mXyl3)，以及IV)被连接至Xylp单元的双α-(1→2)和α-(1→3)-连接的Araf(dXyl)。在玉米AX的情况下，骨架也可以被(1→2)或(1→3)-连接的Xylp取代到骨架或取代到Araf取代基。另外，在玉米AX中可以存在半乳糖和葡萄糖醛酸。羟基肉桂酸衍生物，主要是阿魏酸(FA)，可以被酯连接至天然AX中的少量Araf取代基上的O-5位。
两种主要的寡糖组：木寡糖(XOS)和阿拉伯木寡糖(AXOS)可以衍生自AX的水解。XOS是木糖线型低聚物，其通过β-(1→4)键连接，具有分子通式C5nH8n+2O4n+1，其中n是2-10的木糖单元的数目。XOS从AX的非支化区域获得，而AXOS从支化区域获得并且具有木糖骨架，木糖骨架具有作为侧链被附接到木糖单元之一的至少一个Araf基团。取决于多少个Araf基团被附接、附接至哪个残基以及化学键类型(1→2)和/或(1→3)，支化AXOS的许多不同的组合是可能的。取决于谷物来源，其它支化寡糖是可想到的。例如在玉米AX的情况下，具有至骨架的(1→3)-连接的Xylp的支化寡糖是可能的。AXOS可以通过它们的取代(支化)度来区分，取代(支化)度通常被定义为阿拉伯糖单元和木糖单元之间的比率(A/X)。
对于使用LMW-AX尤其是含有大部分寡糖作为新兴的益生元的那些制剂存在商业兴趣，益生元被定义为“导致GI微生物群的组成和/或活性的特异性变化、从而对宿主健康赋予益处的选择性地发酵的成分”。AXOS和XOS益生元性质的相当多的证据现在是可获得的。AXOS和XOS被排泄物微生物群所发酵，产生促进健康的短链脂肪酸乙酸酯/盐、丙酸酯/盐和丁酸酯/盐。由水解的AX获得的寡糖的益生元作用与骨架的分子量和取代度(与A/X有关)相关联。较复杂的取代模式通常导致较慢的发酵和较少的气体产生。
与在近端结肠中快速发酵的XOS相比，AXOS作为更有选择性和更持久的益生元可能是潜在地有效的。用阿拉伯糖支化的AXOS对于某些双歧杆菌群组是有选择性的，双歧杆菌群组被认为是有益的细菌的最重要的群组之一，这是由于双歧杆菌群组刺激免疫系统发育、产生维生素、抑制病原体、减少血液中的氨和胆固醇以及有助于在抗生素治疗之后恢复健康消化道的能力。在双歧杆菌中利用支化多糖和支化寡糖的能力是菌株依赖性的，这意味着菌株可以基于它们的碳水化合物偏好来分组。这意味着AXOS首先被双歧杆菌或其他有益的细菌利用，该双歧杆菌或其他有益的细菌能够从骨架中除去侧分支或利用较小的支化寡糖。剩余的较长木糖骨架然后可以在结肠的更远端部分中被进一步代谢，延长益生元作用。
寡糖由于其良好的持水能力，还可以在食品、饲料、饮料或个人护理应用中找到技术应用。特别是从其中大量蛋白质连接至AX骨架的玉米衍生的寡糖，将适合作为不同应用中的膨胀剂、稳定剂或乳化剂。
具有寡糖的LMW-AX主要产自不同谷物糠，但也产自谷物的乙醇发酵后获得的残余物。从经济的角度来看，使用来自乙醇工艺的含有AX的残余物是吸引人的，这是由于每年来自诸如玉米和小麦的谷物来源的大的生产量。干磨是关于燃料乙醇的最常用的工艺，包括以下基本步骤：1)将谷粒研磨成粉末，2)在水中成浆，3)将淀粉(与酶)加热和液化，4)用酵母发酵，5)蒸馏乙醇，6)将湿酒糟分离成稀酒糟和湿饼，任选地在蒸发成糖浆之前从稀酒糟中回收玉米油，7)将糖浆与湿饼混合，8)任选地将湿酒糟及可溶物干燥成干酒糟及可溶物(DDGS)。
DDGS含有在来源于谷粒外部部分(糠)的纤维级分中的存在的大量的AX。纤维级分不被认为是有价值的饲料组分，并且除去纤维级分增加DDGS的蛋白质含量。然而，由于预处理或发酵步骤从纤维释放淀粉和蛋白质，所以纤维级分富含AX。用于纤维湿法分级的商业技术对于干磨乙醇工厂是容易得到的，例如来自美国Springfield OH的Fluid QuipProcess Technologies。发酵前进行的湿法分级也有助于提高发酵罐能力6-8％。在发酵之前或之后除去纤维的部分的另一个益处是用于非反刍动物应用的DDGS中的蛋白质含量相对增加。
木聚糖酶被用于例如纸浆和纸张加工、生物燃料生产、烘焙和酿造工业以及动物饲料的加工。木聚糖酶能够水解在木聚糖和木聚糖衍生的寡糖中发现的β-(1→4)-木糖苷键(xylosidic linkage)。取决于使用的木聚糖酶，可以产生不同的XOS尺寸和AXOS结构。已知家族10木聚糖酶产生小的终产物。家族11木聚糖酶具有与家族10木聚糖酶相同的催化机理，但对聚合物底物的活性通常高于对低聚物底物的活性，并且与家族10木聚糖酶相比，家族11木聚糖酶针对不溶性底物具有更高的活性。
关于由通常属于糖苷水解酶家族10或11的木聚糖酶水解AX的现有技术被限于具有足够量的游离uXyl的AX底物的较不复杂的区域(低A/X比率)。这将可用于制造具有寡糖的LMW-AX的底物限制为从例如种皮、珠心表皮以及糊粉层部分分离的AX。使用热/化学方法用于从AX来源生产具有寡糖的LMW-AX的技术具有以下缺点：支链在该工艺中被除去并且可能形成不想要的副产物例如糠醛和单糖。另一方面是从AX来源释放LMW-AX的机械处理例如干球磨和空化在生产寡糖方面不太有效。因此，复杂的AX底物例如从外果皮和内果皮(A/X＝0.8-1.2，取决于提取和来源的选择)分离的或来自例如玉米纤维/糠的密集取代的AX(A/X＝0.5)未在商业规模上被用于制造由具有寡糖的LMW-AX组成的益生元制品。
对于不同的应用，AX的利用受限于具有低含量的淀粉、蛋白质和脂肪的合适起始材料的可用性。富含AX的底物作为制备水溶性AX的起始材料将是更优选的，因为它减少了对通过化学手段或酶促手段预加工纤维的需求。现有技术水平的另一个限制是水溶性AX的纯化，因为水溶性蛋白质、盐和木质素难以从阿拉伯木聚糖级分中除去。由于AX提取物纯度低，这限制了阿拉伯木聚糖关于许多应用的使用。
来自纤维素的不溶性纤维可用作食品添加剂。纤维素纤维可以由谷物来源制造。然而，由目前工艺使用的起始材料使用具有大部分淀粉、蛋白质和脂肪的糠级分。这限制了谷物来源用于制造纤维素纤维的应用，因为在提取之前利用酶进行昂贵的预加工以除去淀粉和/或蛋白质。
发明概述
在一个方面中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含具有支化寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)，所述支化寡糖优选地具有位于寡糖骨架的还原端处的至少一个阿拉伯糖或木糖。
在一个实施方案中，支化寡糖包含阿拉伯糖单元和木糖单元，优选地具有0.4-1.2的阿拉伯糖/木糖比率、优选地0.4-1.0的比率、优选地0.45-1.0的比率、优选地0.5-0.9的比率。
在一个实施方案中，组合物具有小于10kDa、优选地小于7.5kDa、优选地小于5kDa、优选地小于4kDa、优选地小于3.7kDa的平均分子量。
在一个实施方案中，寡糖含有至少一个支链，所述至少一个支链由连接到骨架的(1→3)连接的阿拉伯呋喃糖基单元或(1→3)连接的吡喃木糖基单元组成。
在一个实施方案中，组合物包含二糖，并且所述二糖与两个木糖单元或一个阿拉伯糖单元和一个木糖单元之间的(1→3)键连接。
在一个实施方案中，底物是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从包含纤维的谷物、优选地包含阿拉伯木聚糖的谷物中分离的纤维。
在一个方面中，本发明提供了一种用于生产具有支化寡糖的LMW-AX的工艺，所述工艺使用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶。
在一个实施方案中，起始材料是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从包含纤维的谷物、优选地包含阿拉伯木聚糖的谷物、优选地高度取代或密集取代的阿拉伯木聚糖级分中分离的纤维。
在一个实施方案中，起始材料是具有至少20％的基于干质量(dry mass)的阿拉伯木聚糖含量的纤维，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量为至少25％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量为至少30％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量为至少35％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量为至少37％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量为至少40％。阿拉伯木聚糖含量可以是至多90％。
在一个实施方案中，起始材料是利用机械分离被分离以增加纤维级分中的阿拉伯木聚糖含量的纤维。
这种机械分离的实例可以选自由离心分离、过滤、空气分级(classification byair)和浮选、以及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，纤维被用于提取具有降低的蛋白质水平的阿拉伯木聚糖，以减少碱性过氧化氢提取期间的起泡。
在一个实施方案中，起始材料从谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂获得。
在一个实施方案中，其中用于阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶的阿拉伯木聚糖底物是水溶性阿拉伯木聚糖，优选地利用使用碱、酸、自水解(autohydrolysis)、蒸汽爆炸、碾磨、空化或酶对纤维进行预处理来获得。
在一个实施方案中，低取代的AX通过碱提取物的酸化来沉淀，并且优选地被除去。
在一个实施方案中，水溶性阿拉伯木聚糖使用包含HCl、H2SO4、NaOH、Ca(OH)2、NH4和碱性过氧化氢中的至少一种的预处理来获得。
在一个实施方案中，预处理被重复多于一次。这种重复的预处理暗示着重复使用提取液来增加水溶性阿拉伯木聚糖的浓度。提取液是在预处理后在除去固体后获得的液体。重复的预处理可以通过材料在工艺或连续的多于一个的工艺步骤中的再循环来进行。
在一个实施方案中，碱预处理或碱性过氧化氢预处理被重复多于一次，重复使用提取液以增加水溶性阿拉伯木聚糖的浓度。
在一个实施方案中，预处理被重复至少两次、优选地多于两次，优选地通过使用碱预处理或碱性过氧化氢预处理，优选地通过重复使用提取液。
在一个实施方案中，在预处理之后剩余的任何纤维素固体被再次引入到来自谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。
在一个实施方案中，所述工艺用于生产饲料产品。
在一个实施方案中，所述工艺包括纤维加工单元，纤维加工单元包括：反应单元，反应单元适于碱提取和中和、或自水解、或酸水解和中和、或空化、或蒸汽爆炸或碾磨；以及分离单元，分离单元适于至少一种固/液分离。
在一个实施方案中，含有水溶性阿拉伯木聚糖的提取液用钙盐纯化。用钙盐纯化的目的是沉淀杂质。
在一个实施方案中，在钙盐沉淀后水溶性阿拉伯木聚糖的纯度为至少50％、优选地至少60％、优选地至少70％、优选地至少77％、优选地至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至多99％。
在一个实施方案中，氢氧化钙和/或氯化钙被用于通过沉淀杂质来纯化水溶性阿拉伯木聚糖。
在一个方面中，本发明提供根据本发明的组合物或从根据本发明的工艺获得的具有支化寡糖的LMW-AX级分的用途，优选地用于引入到谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。
在一个实施方案中，该用途是用于生产益生元产品，优选地食品、饲料、饮料成分或营养补充剂。
在一个方面中，本发明提供了食品、饲料、饮料成分或营养补充剂或个人护理产品成分，其包含根据本发明的具有支化寡糖的LMW-AX或通过根据本发明的工艺可获得的具有支化寡糖的LMW-AX。
本发明描述了如何可以使用AX特异性内切木聚糖酶来产生具有支化寡糖(图1C和图1D)或(1→3)连接的二糖(图1B)的LMW-AX。这些酶在它们对AX的支化区域的特异性方面是独特的，因为它们不水解分子的非支化区域。本发明中产生的寡糖含有至少一个由连接到骨架的(1→3)Araf单元或Xylp单元组成的支链。还可以产生为(1→3)木糖-木糖或阿拉伯糖-木糖的二糖。
在用商业木聚糖酶(来自家族10或11)或通过热/化学处理进行酶促水解后获得的LMW-AX包含阿拉伯木聚糖-寡糖(A)XOS，阿拉伯木聚糖-寡糖(A)XOS是如图1A中所示的木寡糖(XOS)和阿拉伯木寡糖(AXOS)两者的混合物。清楚的是，用木聚糖酶水解从低取代和中等取代的AX(A/X＝0.15-0.35)生产LMW-AX的现有技术方法产生XOS和AXOS的混合物，并且通常还产生大量的主要为木糖的单糖。具有高A/X比率(0.5-1.2)、比如来自小麦果皮AX或非常密集的玉米AX(A/X＝0.4-0.6)的高度支化的AX底物不容易被来自家族10或11的商业木聚糖酶水解。使用商业木聚糖酶的这些底物的木聚糖酶水解受到严重限制，并且没有获得或获得非常少的寡糖。
在本发明中，使用AX特异性内切木聚糖酶从可用于其选择性发酵或技术特性的不同的谷物来源产生具有支化寡糖的独特的LMW-AX。此外，本发明具体涉及在水解高度支化的AX例如衍生自小麦糠果皮的AX或来自玉米纤维的密集取代的AX中使用AX特异性内切木聚糖酶，以制备具有支化寡糖的LMW-AX。此外，本发明还描述了如何可以将通过纤维旁路或分离从工艺流中分离的纤维用作底物，以结合乙醇工艺制造预期的具有支化寡糖的LMW-AX。此外，本发明还描述了如何可以再次引入来自纤维加工的具有支化寡糖的LMW-AX，以制备新的动物饲料产品。
谷物糠可以用作用于制造具有支化寡糖的LMW-AX的起始材料。然而，为了获得没有淀粉和减少量的蛋白质的合适底物，通常需要预处理。较好的方式将是使用已经被加工以释放淀粉和蛋白质的纤维。在干磨乙醇工艺中，谷粒被研磨、液化以溶解淀粉，并且然后通过酵母发酵成乙醇。在此工艺期间，AX实际上保持不变并因此在纤维级分中富集。本发明优先使用从乙醇工艺中分离的纤维代替粗糠来制造具有支化寡糖的LMW-AX。这消除了对于大量预处理的需求，这将减少工艺步骤的数目和总的生产成本。
本发明暗示了干磨乙醇工艺中的各种起始点可以用于通过湿法分级来分离纤维级分(图2)。在一个实施方案中，纤维在液化前通过湿法分级分离，在另一个实施方案中，纤维在蒸馏后通过湿法分级分离。分级的各个点是可想到的，并且本发明不被视为受起始点的选择所限制。具有支化寡糖的LMW-AX的生产不被视为仅限于湿法分级的纤维，并且各种底物可被认为是起始材料，例如粗糠。在一个实施方案中，将从研磨的谷粒中分离的糠用作起始材料，在另一个实施方案中，将由DDG干法分级的纤维用作起始材料。
为了使用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶有效地生产具有支化寡糖的LMW-AX，AX必须是水溶性的。这可以通过经由酶促处理、热处理或化学处理来预处理含有AX的材料而完成。与蒸汽法、酸法或酶促法相比，本发明可以使用产生更多支化AX的碱提取。优选地使用碱和过氧化氢的组合以产生较亮的产品。优选地使用膜过滤以在提取后从含有水溶性AX的可溶相中回收碱并除去有色污染物。在碱提取之后，含有分离的水溶性AX和纤维素副产物的可溶相的中和可以使用二氧化碳来完成，以便容易中和。任选地在透析或超滤前用蛋白酶处理分离的可溶性级分以降解蛋白质。具有支化寡糖的LMW-AX的生产不被视为仅限于通过碱提取分离的AX，而是可想到各种预处理方法，例如干球磨、空化、自水解、蒸汽爆炸和酶促预处理，以使得AX级分是水溶性的。特别是与乙醇工艺结合使用的空化可以被用作用于制造水溶性AX的预处理方法，而不需要添加化学品。
具有支化寡糖的LMW-AX通过用AX特异性内切木聚糖酶温育所分离的水溶性AX获得，AX特异性内切木聚糖酶在本发明中通过指定为CtXyl5A的酶示例。这种特定的AX特异性内切木聚糖酶来自糖苷家族5(GH5)，并且最初从热纤梭菌(Clostridium thermocellum)中分离。本发明不被视为受到来自GH5的具有催化模块的阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶的选择所限制或受到分离该酶的天然有机体形式所限制。潜在地其它细菌或酵母含有阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶，并且本发明意图覆盖特异性地水解AX分子上的取代区域以产生作为终产物的支化多糖、支化寡糖或(1→3)连接的二糖的所有AX特异性内切木聚糖酶。
在AX特异性内切木聚糖酶处理之前，任选地除去支链的一部分比如Araf基团的一部分，以便提高支化寡糖的收率。取代基的除去可以通过使用任何的以下活性物进行受控的酸水解或酶促水解来完成：乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、木糖苷酶、半乳糖苷酶或葡萄糖醛酸酶。取决于最终应用，另外的利用脱盐、超滤或脱色的纯化可能是必需的。在干燥之前优先使用纳滤以除去水。
在一个实施方案中，具有支化寡糖的LMW-AX由谷物组成的组生产。在另一个更具体的实施方案中，谷物起始材料选自谷物的组，例如玉米、小麦、高粱、大米、黑麦、小米、大麦、燕麦，或但不限于这些。其它可能的起始材料是假谷物(pseudocereal)，例如但不限于藜麦(quinoa)、苋属植物(amaranth)或荞麦。
与传统DDGS相比，具有支化寡糖的LMW-AX可以在发酵后添加回到工艺流(图2)以产生具有潜在更高市场价值的新的饲料产品。这些新的饲料产品包括用于单胃动物的益生元DDGS以及用于改善瘤胃发育或治疗及预防酸中毒的反刍动物DDGS饲料。反刍动物DDGS可以通过包含单独的或与纤维素纤维残余物组合的具有支化寡糖的LMW-AX来产生。使用二氧化碳用于中和剩余的纤维素纤维残余物还具有产生通常用于动物饲料制剂的碳酸盐的增加的益处。
在一个实施方案中，湿法分级的纤维用碱性过氧化氢加工以获得具有支化寡糖的LMW-AX。除碱之外使用过氧化氢的目的是使最终产品增亮。
A.用碱性过氧化氢溶液和热来处理纤维；
B.分离固体和可溶物；
C.从B任选地用水洗涤固体；
D.用二氧化碳或其它酸中和来自C的固体，同时使用膜过滤从来自B的含有水溶性AX的可溶相中回收碱；
E.任选地将来自D的中和的白色纤维素固体再次引入到工艺流中；
F.使用二氧化碳或其他酸中和来自D的可溶性级分；
G.从F任选地使用沉淀或膜技术以进一步精制和回收水溶性AX；
H.从F或G添加AX特异性内切木聚糖酶和任选的其它腋生酶(axillary enzyme)，用于生产具有支化寡糖的LMW-AX；
I.任选地通过脱盐和活性碳来纯化来自H的具有支化寡糖的LMW-AX；
J.从H或I通过纳滤浓缩成糖浆，任选地随后干燥。
在所有实施方案中，用于生产具有支化寡糖的LMW-AX的纤维可以从单一或组合的流或来源中分离。独立于起始材料，用于湿法分级分离的步骤由以下组成：
·取出含有纤维的流的全部或一部分。
·通过离心、过滤或沉淀但不限于这些技术，使用一种方法来使纤维颗粒与其他成分分离和分开。
在使用碱或碱性过氧化氢来溶解AX的实施方案中，中和后的残余纤维素固体作为用于反刍动物的易于消化的纤维可以给予DDGS流增加的价值。这改善了消化性质，这是由于通过化学预处理已使得纤维素纤维和剩余的AX更易于进行酶促降解的事实。在纤维素固体在纤维加工后返回到工艺流的实施方案中，其不是仅限于DDGS生产，而是来自乙醇工艺的作为饲料产品终结的任何流是可想到的，例如通过湿法分级获得的湿酒糟(WDG)或高蛋白质DDG。残余的纤维素固体也可以用作纤维素乙醇的原料或用作食品成分。由于良好的持水能力，所以残余的纤维素固体作为食品成分是特别有用的。残余的纤维素固体对于其膨胀性质也是有用的。在一个实施方案中，产品是食品成分。在一个实施方案中，产品是纤维素纤维。在另一个实施方案中，产品是水溶性AX。在一个实施方案中，本发明可以是通过根据本发明的工艺获得的纤维素纤维、水溶性阿拉伯木聚糖、支化的低分子量-阿拉伯木聚糖、或低分子量-阿拉伯木聚糖。
在碱或碱性过氧化氢提取之后由AX产生具有支化寡糖的LMW-AX的实施方案中，需要在具有或没有腋生酶的情况下，使用AX特异性内切木聚糖酶来产生支化的水解产物。
独立于起始材料和分离选择，用于从含AX的材料生产具有支化寡糖的LMW-AX的步骤是：
.任选地将纤维研磨至较小的粒度
.任选地用淀粉酶和蛋白酶处理纤维
.任选地用水洗涤纤维
.释放AX作为水溶性AX的各种预处理
.在任选的中和之前或之后，任选地分离固体和可溶物
.任选地将纤维素固体残余物再次引入到用于饲料的工艺流中
.任选地通过膜过滤或沉淀进一步精制水溶性AX
.用AX特异性内切木聚糖酶处理分离的水溶性AX
.任选地进一步纯化可溶性级分
.任选地将获得的具有支化寡糖的LMW-AX引入到用于饲料的工艺流中
在所有实施方案中，可想到的是，具有支化寡糖的LMW-AX可以被添加到来自乙醇工艺的作为饲料产物终结的任何流，例如通过湿法分级获得的湿酒糟(WDG)或高蛋白质DDG，并且不是仅限于DDGS。
在存在固体和可溶物之间的分离的所有实施方案中，可以想到的是，不发生分离并且包括固体和具有支化寡糖的LMW-AX两者的全部加工过的纤维被返回到在乙醇工艺中作为饲料产物终结的任何流。或将这种制品干燥并且在其他应用中与具有支化寡糖的LMW-AX一起用作改性纤维。
在生产具有支化寡糖的LMW-AX的所有实施方案中，还可想到的是，由于AX底物的不完全水解，所以小部分的中等分子量AX(大于5kDa)仍然作为总糖的一部分存在。
在一个实施方案中，用酶、碱性过氧化氢和AX特异性内切木聚糖酶加工粗糠以获得具有支化寡糖的LMW-AX。
A.用淀粉酶和蛋白酶处理糠，随后用水洗涤；
B.用碱性过氧化氢溶液和热来处理来自A的去淀粉和去蛋白质的糠；
C.分离固体和可溶物；
D.从B任选地用水洗涤固体；
E.用二氧化碳或其它酸中和来自C的固体，同时使用膜过滤从来自C的含有水溶性AX的可溶相中回收碱；
F.任选地将来自E的中和的白色纤维素固体加入到工艺流中；
G.使用二氧化碳或其他酸中和来自C的可溶性级分；
H.任选地通过降低来自G的溶液的pH使低支化的AX沉淀并除去；
I.任选地使用沉淀或膜技术来进一步精制和回收来自H的水溶性AX；
J.从I添加AX特异性内切木聚糖酶和任选的其它腋生酶，用于产生具有支化寡糖的LMW-AX；
K.任选地通过脱盐和活性碳纯化来自J的具有支化寡糖的LMW-AX。
L.从J或K通过纳滤浓缩成糖浆，任选地随后干燥。
在使用碱性过氧化氢从谷物残余物制造水溶性AX的所有实施方案中，还可想到的是，仅使用碱而不添加过氧化氢。当最终产品的颜色对于最终应用无关紧要时，情况可能如此。
在一个实施方案中，本发明是用于生产纤维素纤维、水溶性阿拉伯木聚糖、支化的LMW-AX、或LMW-AX中的至少一种的工艺，该工艺包括以下步骤：
A.从乙醇工艺分离纤维级分；
B.通过机械工艺增加步骤A的纤维级分中阿拉伯木聚糖的浓度，获得阿拉伯木聚糖含量增加的纤维级分；
C.用碱或碱性过氧化氢溶液处理步骤B的具有增加的阿拉伯木聚糖的纤维级分，获得包含纤维素固体和水溶性阿拉伯木聚糖的溶液；
D.将步骤C的纤维素固体从含有水溶性阿拉伯木聚糖的提取液中分离，随后中和、洗涤并干燥纤维素固体；
E.任选地重复提取另外的纤维级分，重复使用来自步骤D即先前提取的提取液；
F.利用CO2降低在一次或多于一次提取后获得的提取液的pH；
G.用钙盐处理在一次或多于一次提取后获得的提取液以沉淀杂质并除去杂质；
H.使用沉淀或过滤以回收水溶性阿拉伯木聚糖；
I.用酶处理水溶性阿拉伯木聚糖以制造LMW-AX或支化的LMW-AX；
J.浓缩或干燥来自H和/或I的LMW-AX产品。
用于处理水溶性阿拉伯木聚糖的酶的实例可以是阿拉伯木聚糖特异性木聚糖酶和/或木聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。在一个实施方案中，用于处理水溶性阿拉伯木聚糖的酶可以是阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶。
在添加钙盐以沉淀杂质的所有实施方案中，可想到的是，被添加以制造支化的LMW-AX或者LMW-AX的酶是在添加钙盐之前被添加的。
任选地用弱酸或阿拉伯呋喃糖苷酶处理提取液以除去在提取液的阿拉伯木聚糖中存在的一部分分支。利用弱酸的这种处理可以在提取液的沉淀和/或过滤之前或之后进行。
在一方面中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)，其中Araf单元的一部分已被除去以提高寡糖的收率。
在一个实施方案中，具有寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)包含阿拉伯糖单元和木糖单元，优选地具有0.4-1.0的阿拉伯糖/木糖比率，优选地0.4-0.9的比率，优选地0.4-0.8的比率，优选地0.4-0.7的比率，优选地0.4-0.6的比率，优选地0.4-0.5的比率。
在一个实施方案中，寡糖级分具有小于10kDa、优选地小于7.5kDa、优选地小于5kDa、优选地小于2.5kDa、优选地小于2kDa的平均分子量。
在一个实施方案中，寡糖的收率通过将木聚糖酶与阿拉伯呋喃糖苷酶组合来提高，优选地能够除去在双取代的Xylp单元(dXyl)处的α-(1→3)-连接的Araf或能够除去在单取代的Xylp单元(mXyl)处的单α-(1→2)-连接的Araf和单α-(1→3)-连接的Araf的阿拉伯呋喃糖苷酶。优选地使用两种不同活性的阿拉伯呋喃糖苷酶的组合来获得高的寡糖收率；
在一个实施方案中，阿拉伯呋喃糖苷酶选自阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(Arabinoxylan arabinofuranohydrolase)的组，优选地选自由阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶-d3(AXH-d3)或阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶-m2,3(AXH-m2,3)组成的组。
在另一个实施方案中，在木聚糖酶处理之前通过用弱酸溶液处理来代替阿拉伯呋喃糖苷酶处理，所述弱酸例如但不限于无机酸，优选地盐酸、优选地硫酸、优选地磷酸、优选地硝酸或优选地乙酸。
在另一个实施方案中，在木聚糖酶处理之前通过用蒸汽或热压水的处理来代替阿拉伯呋喃糖苷酶处理，用蒸汽或热压水的处理例如蒸汽爆炸或自水解。
在一个实施方案中，木聚糖酶是内切木聚糖酶，优选地来自家族8、10或11，更优选地来自家族10或11，最优选地来自家族10。
在一个实施方案中，底物是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从含有纤维的谷物、优选地含有阿拉伯木聚糖的谷物中分离的纤维。
在一个实施方案中，起始材料是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从包含纤维的谷物、优选地包含阿拉伯木聚糖优选地高度取代或密集取代的阿拉伯木聚糖级分的谷物中分离的纤维。
在一个实施方案中，起始材料从谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂获得。
在一个实施方案中，其中阿拉伯木聚糖是水溶性阿拉伯木聚糖，优选地利用使用碱、酸、自水解、蒸汽爆炸、碾磨、空化或酶对纤维进行预处理来获得。
在一个实施方案中，低取代的AX通过碱提取溶液的酸化来沉淀，并且优选地被除去。
在一个实施方案中，使用包含HCl、H2SO4、NaOH、Ca(OH)2、NH4、或碱性过氧化氢中的至少一种的预处理获得水溶性阿拉伯木聚糖。
在一个实施方案中，将预处理后剩余的任何纤维素固体再次引入到来自谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。
在一个实施方案中，工艺用于生产饲料产品。
在一个实施方案中，工艺包括纤维加工单元，纤维加工单元包括：反应单元，反应单元适于碱提取和中和、或自水解、或酸水解和中和、或空化、或蒸汽爆炸或碾磨；以及分离单元，分离单元适于至少一种固/液分离。
在一个方面中，本发明提供根据本发明的组合物的用途或从根据本发明的工艺获得的具有寡糖的LMW-AX级分的用途，优选地用于引入到谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。
在一个实施方案中，该用途是用于生产益生元产品，优选地食品、饲料、饮料成分或营养补充剂。
在一个方面中，本发明提供了食品、饲料、饮料成分或营养补充剂或个人护理产品成分，其包含根据本发明的具有寡糖的LMW-AX或通过根据本发明的工艺可获得的具有寡糖的LMW-AX。
清楚的是，用木聚糖酶水解生产寡糖的现有技术方法对于低取代和中等取代的AX(A/X＝0.15-0.35)是最有效的。具有高A/X比率(0.5-1.2)、例如来自小麦果皮AX或非常密集的玉米AX(A/X＝0.4-0.6)的高度支化的AX底物不容易被单独的木聚糖酶水解成寡糖(图11)。
本发明描述了如何可以使用阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶的组合来生产更多的寡糖(图11)。阿拉伯呋喃糖苷酶是特异性酶，其在除去AX骨架的阿拉伯糖基团、打开骨架以用于在特定位置处进行内切木聚糖酶水解方面是独特的。组合作用促进了从复杂或密集取代的AX底物生产寡糖。获得的寡糖是阿拉伯木聚糖-寡糖(A)XOS，其为如图1中所示的木寡糖(XOS)和阿拉伯木寡糖(AXOS)两者的混合物。
在本发明中，使用阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶的组合从可用于其选择性发酵或技术特性的不同谷物来源产生具有寡糖的LMW-AX。此外，本发明具体涉及在混合物中一起使用这些酶以用于改善的寡糖生成(图5)。此外，本发明还描述了如何可以将通过纤维旁路或分离从工艺流中分离的纤维用作底物，以结合乙醇工艺制备预期的具有寡糖的LMW-AX。此外，本发明还描述了如何可以再次引入来自纤维加工的具有寡糖的LMW-AX，以制备新的动物饲料产品。
谷物糠可以用作用于制造具有寡糖的LMW-AX的起始材料。然而，为了获得没有淀粉和减少量的蛋白质的合适底物，通常需要预处理。较好的方式将是使用已经被加工以释放淀粉和蛋白质的纤维。在干磨乙醇工艺中，将谷粒研磨、液化以溶解淀粉，并且然后通过酵母发酵成乙醇。在此工艺期间，AX实际上保持不变并因此在纤维级分中富集。本发明优先使用从乙醇工艺中分离的纤维代替粗糠来制造具有寡糖的LMW-AX。这消除了对于大量预处理的需求，这将减少工艺步骤的数目和总的生产成本。
本发明暗示了干磨乙醇工艺中的各种起始点可以用于通过湿法分级分离纤维级分(图8)。在一个实施方案中，纤维在液化前通过湿法分级分离，在另一个实施方案中纤维在蒸馏后通过湿法分级分离。分级的各个点是可想到的，并且本发明不被视为受起始点的选择所限制。具有寡糖的LMW-AX的生产不被视为仅限于湿法分级的纤维，并且各种底物可被认为是起始材料，例如粗糠。在一个实施方案中，将从研磨的谷粒中分离的糠用作起始材料，在另一个实施方案中，将从DDG(S)干法分级的纤维用作起始材料。
为了从复杂的AX有效地生产具有寡糖的LMW-AX，AX必须是水溶性的。这可以通过经由酶促处理、热处理或化学处理来预处理含有AX的材料而完成。与蒸汽方法、酸方法或酶促方法相比，本发明优选地使用产生更多支化AX的碱提取。优选地使用碱和过氧化氢的组合以产生较亮的产品。优选地使用膜过滤以在提取后从含有水溶性AX的可溶相中回收碱并除去有色污染物。在碱提取之后，含有分离的水溶性AX和纤维素副产物的可溶相的中和可以使用二氧化碳来完成，以便容易中和。任选地在透析或超滤前用蛋白酶处理分离的可溶性级分以降解蛋白质。具有寡糖的LMW-AX的生产不被认为仅限于通过碱提取分离的AX，而是各种预处理方法是可想到的，例如干球磨、空化、自水解、蒸汽爆炸和酶促预处理，以使得AX级分是水溶性的。特别是与乙醇工艺结合使用的空化可以被用作用于制造水溶性AX的预处理方法，而不需要添加化学品。
具有寡糖的LMW-AX通过用阿拉伯呋喃糖苷酶温育分离的水溶性AX获得，阿拉伯呋喃糖苷酶除去支链的一部分，例如Araf基团的一部分，并且内切木聚糖酶在本发明中通过将两种不同的阿拉伯呋喃糖苷酶与家族10内切木聚糖酶一起使用被例示。本发明不被视为受阿拉伯呋喃糖苷酶和内切木聚糖酶的选择所限制。本发明旨在覆盖阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶的所有组合以水解AX分子上的高度取代的区域或复杂的区域以产生寡糖。
取代基的除去也可以通过受控的酸水解、蒸汽或自水解来完成。可以用于改善寡糖的生成的其它可想到的活性物包括以下活性物：乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、木糖苷酶、半乳糖苷酶或葡萄糖醛酸酶。取决于最终应用，另外的利用脱盐、超滤或脱色的纯化可能是必需的。在干燥之前优先使用纳滤以除去水。
在一个实施方案中，具有寡糖的LMW-AX由谷物组成的组生产。在另一个更具体的实施方案中，谷物起始材料选自谷物的组，例如玉米、小麦、高粱、大米、黑麦、小米、大麦、燕麦，或但不限于这些。其它可能的起始材料是假谷物，例如但不限于藜麦、苋属植物或荞麦。
与传统DDGS相比，具有寡糖的LMW-AX可以在发酵后添加回到工艺流(图8)以产生具有潜在更高市场价值的新的饲料产品。这些新的饲料产品包括用于单胃动物的益生元DDGS以及用于改善瘤胃发育或治疗及预防酸中毒的反刍动物DDGS饲料。反刍动物DDGS可以通过包含单独的或与纤维素纤维残余物组合的具有寡糖的LMW-AX来产生。使用二氧化碳用于中和剩余的纤维素纤维残余物还具有产生通常用于动物饲料制剂的碳酸盐的增加的益处。
在一个实施方案中，湿法分级的纤维用碱性过氧化氢加工以获得具有寡糖的LMW-AX。除碱之外使用过氧化氢的目的是使最终产品增亮。
A.用碱性过氧化氢溶液和热来处理纤维；
B.分离固体和可溶物；
C.从B任选地用水洗涤固体；
D.用二氧化碳或其它酸中和来自C的固体，同时使用膜过滤从来自B的含有水溶性AX的可溶相中回收碱；
E.任选地将来自D的中和的白色纤维素固体再次引入到工艺流中；
F.使用二氧化碳或其他酸中和来自D的可溶性级分；
G.从F任选地使用沉淀或膜技术以进一步精制和回收水溶性AX；
H.从F或G添加阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶，用于生产具有寡糖的LMW-AX；
I.任选地通过脱盐和活性炭纯化来自H的具有寡糖的LMW-AX。
J.从H或I通过纳滤浓缩成糖浆，任选地随后干燥。
在所有实施方案中，用于生产具有寡糖的LMW-AX的纤维可以从单一或组合的流或来源中分离。独立于起始材料，用于湿法分级分离的步骤由以下组成：
.取出含有纤维的流的全部或一部分。
.通过离心、过滤或沉淀但不限于这些技术，使用一种方法来使纤维颗粒与其他成分分离和分离。
在使用碱或碱性过氧化氢溶解AX的实施方案中，中和后的残余的纤维素固体作为用于反刍动物的易于消化的纤维可以给予DDGS流增加的价值。这改善了消化性质，这是由于通过化学预处理已使得纤维素纤维和剩余的AX更易于进行酶促降解的事实。在纤维素固体在纤维加工后返回到工艺流的实施方案中，其不是仅限于DDGS生产，而是来自乙醇工艺的作为饲料产物终结的任何流都是可想到的，例如通过湿法分级获得的湿酒糟(WDG)或高蛋白质DDG。残余的纤维素固体也被用作纤维素乙醇的原料或用作食品成分。
在碱或碱性过氧化氢提取之后由AX生产具有寡糖的LMW-AX的实施方案中，当期望改善寡糖的生成时，需要使用阿拉伯呋喃糖苷酶或用蒸汽或酸处理。
独立于起始材料和分离选择，用于从含AX的材料生产具有寡糖的LMW-AX的步骤是：
.任选地将纤维研磨至较小的粒度
.任选地用淀粉酶和蛋白酶处理纤维
.任选地用水洗涤纤维
.释放AX作为水溶性AX的各种预处理
.在任选的中和之前或之后，任选地分离固体和可溶物
.任选地将纤维素固体残余物再次引入到用于饲料的工艺流中
.任选地通过膜过滤或沉淀进一步精制水溶性AX
.用阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶处理分离的水溶性AX
.任选地进一步纯化可溶性级分
.任选地将获得的具有寡糖的LMW-AX引入到用于饲料的工艺流中
在所有实施方案中，可想到的是，具有寡糖的LMW-AX可以被添加到来自乙醇工艺的作为饲料产物终结的任何流，例如通过湿法分级获得的湿酒糟(WDG)或高蛋白质DDG，并且不是仅限于DDGS。
在存在固体和可溶物之间的分离的所有实施方案中，可想到的是，不发生分离并且包括固体和具有寡糖的LMW-AX两者的全部加工过的纤维被返回到乙醇工艺中的作为饲料产物终结的任何流。或将这种制品干燥并且在其它应用中与具有寡糖的LMW-AX一起用作改性纤维。
在生产具有寡糖的LMW-AX的所有实施方案中，其可以是较长的寡糖(10-20kDa之间)和较小的寡糖(0.4-10kDa之间)的混合物。
在一个实施方案中，用碱性过氧化氢加工粗糠或富集果皮的糠(在木聚糖酶处理以释放低取代的AX后获得或通过脱皮处理获得)以释放水溶性AX，随后使用阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶的酶混合物水解以获得具有寡糖的LMW-AX。
A.任选地用淀粉酶和蛋白酶处理糠，然后用水洗涤；
B.用碱性过氧化氢溶液和热来处理糠、富集果皮的糠或来自A的糠；
C.分离固体和可溶物；
D.从B任选地用水洗涤固体；
E.用二氧化碳或其它酸中和来自C的固体，同时使用膜过滤从来自C的含有水溶性AX的可溶相中回收碱；
F.任选地将来自E的被中和的白色纤维素固体加入到工艺流中；
G.使用二氧化碳或其他酸用于中和来自C的可溶性级分；
H.任选地通过降低来自G的溶液的pH使低支化的AX沉淀并除去；
I.任选地使用沉淀或膜技术进一步精制和回收来自H的水溶性AX；
J.从I添加阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶，用于产生具有寡糖的LMW-AX；
K.任选地通过脱盐和活性炭纯化来自J的具有寡糖的LMW-AX；
L.从J或K通过纳滤浓缩成糖浆，任选地随后干燥。
在使用碱性过氧化氢由谷物残余物制造水溶性AX的所有实施方案中，也可以想到的是，仅使用碱而不添加过氧化氢。当最终产品的颜色对于最终应用无关紧要时，情况可能如此。
在一个实施方案中，预处理被重复多次。这种重复的预处理暗示着重复使用提取液来增加水溶性阿拉伯木聚糖的浓度。提取液是在预处理后在除去固体后获得的液体。重复的预处理可以通过材料在工艺或连续的多于一个的工艺步骤中的再循环来进行。
在一个实施方案中，碱预处理或碱性过氧化氢预处理被重复多于一次，重复使用提取液以增加水溶性阿拉伯木聚糖的浓度。
在一个实施方案中，预处理被重复至少两次、优选地多于两次，优选地通过使用碱预处理或碱性过氧化氢预处理，优选地通过重复使用提取液。
在一个实施方案中，起始材料是具有至少20％的基于干质量的阿拉伯木聚糖含量的纤维，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量是至少25％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量是至少30％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量是至少35％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量是至少37％，在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖含量是至少40％。阿拉伯木聚糖含量可以是至多90％。
在一个实施方案中，起始材料是利用机械分离来分离以增加纤维级分中的阿拉伯木聚糖含量的纤维。
这种机械分离的实例可以选自由离心分离、过滤、空气分级和浮选、以及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，纤维被用于提取具有降低的蛋白质水平的阿拉伯木聚糖，以减少碱性过氧化氢提取期间的起泡。
在一个实施方案中，用钙盐纯化含有水溶性阿拉伯木聚糖的提取液。用钙盐纯化的目的是沉淀杂质。
在一个实施方案中，在钙盐沉淀后水溶性阿拉伯木聚糖的纯度是至少50％、优选地至少60％、优选地至少70％、优选地至少77％、优选地至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至多99％。
在一个实施方案中，氢氧化钙和/或氯化钙被用于通过沉淀杂质来纯化水溶性阿拉伯木聚糖。
由于良好的持水能力，残余的纤维素固体作为食品成分是特别有用的。残余的纤维素固体对于其膨胀性质也是有用的。在一个实施方案中，产品是食品成分。在一个实施方案中，产品是纤维素纤维。在另一个实施方案中，产品是水溶性AX。在一个实施方案中，本发明可以是通过根据本发明的工艺获得的纤维素纤维、水溶性阿拉伯木聚糖、支化的低分子量-阿拉伯木聚糖、或低分子量-阿拉伯木聚糖。
在一个实施方案中，本发明是用于生产纤维素纤维、水溶性阿拉伯木聚糖、支化的LMW-AX或LMW-AX中的至少一种的工艺，其包括以下步骤：
A.从乙醇工艺中分离纤维级分；
B.通过机械工艺增加步骤A的纤维级分中阿拉伯木聚糖的浓度，获得阿拉伯木聚糖含量增加的纤维级分；
C.用碱或碱性过氧化氢溶液处理步骤B的具有增加的阿拉伯木聚糖的纤维级分，获得包含纤维素固体和水溶性阿拉伯木聚糖的溶液；
D.将步骤C的纤维素固体从含有水溶性阿拉伯木聚糖的提取液中分离，然后中和，洗涤并干燥纤维素固体；
E.任选地重复提取另外的纤维级分，重复使用来自步骤D即先前提取的提取液；
F.利用CO2降低在一次或多于一次提取后获得的提取液的pH；
G.用钙盐处理在一次或多于一次提取后获得的提取液以沉淀杂质并除去杂质；
H.使用沉淀或过滤以回收水溶性阿拉伯木聚糖；
I.用酶处理水溶性阿拉伯木聚糖以制备LMW-AX或支化的LMW-AX；
J.浓缩或干燥来自H和/或I的LMW-AX产品。
用于处理水溶性阿拉伯木聚糖的酶的实例可以是阿拉伯木聚糖特异性木聚糖酶和/或木聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。
在添加钙盐以沉淀杂质的所有实施方案中，可想到的是，被添加以制备支化的LMW-AX或者LMW-AX的酶是在添加钙盐之前被添加的。
任选地用弱酸或阿拉伯呋喃糖苷酶处理提取液以除去在提取液的阿拉伯木聚糖中存在的一部分分支。用弱酸的这种处理可以在提取液沉淀和/或过滤之前或之后进行。
附图简述
图1.通过阿拉伯木聚糖的水解衍生的分子的分子结构，A)阿拉伯木聚糖-寡糖，其是由来自家族10或11的商业木聚糖酶获得的木寡糖和阿拉伯木寡糖之间的混合物，B)二糖，其是来自玉米纤维阿拉伯木聚糖的由阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶产生的(1→3)连接的木糖-木糖或阿拉伯糖-木糖，C)由阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶产生的来自玉米纤维阿拉伯木聚糖的支化寡糖，和D)由阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶产生的来自小麦糠阿拉伯木聚糖的支化寡糖。
图2.流程图，其描述从谷粒分离纤维、来自通过湿法分级的纤维旁路或纤维分离的纤维分离、或来自从DDGS的干法分级的纤维的纤维分离。然后将这些纤维进料到纤维加工单元，在纤维加工单元中生产具有支化寡糖的LMW-AX作为主要产品。任选地将纤维加工后的纤维素固体残余物返回到用于饲料的流，同时可以添加具有支化寡糖的LMW-AX的一部分以在新的饲料产品中引入益生元性质。
图3.流程图，其描述了用于获得具有支化寡糖的LMW-AX的与乙醇工艺有关的纤维加工操作。
图4.A)玉米酒糟样品的照片，B)来自玉米酒糟样品的分级的纤维的照片，C)来自玉米AX的冷冻干燥的具有支化寡糖的LMW-AX，和D)碱性过氧化氢提取玉米纤维之后的冷冻干燥的纤维素残余物。
图5.显示样品中存在的寡糖的HPAED-PAD色谱图，A)用3种不同的木聚糖酶水解的玉米阿拉伯木聚糖，和B)在利用阿拉伯呋喃糖苷酶温育之前和之后，通过阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶CtXyl5A从玉米阿拉伯木聚糖获得的支化寡糖。标准是A：阿拉伯糖，X：木糖，X2：木二糖，X3：木三糖，X4：木四糖，X5：木五糖，X6：木己糖，A2XX：α-(1→2)-阿拉伯呋喃糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基，A3X：α-(1→3)-阿拉伯呋喃糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基。
图6.显示在不同SEC部分中存在的寡糖的HPAED-PAD色谱图，该不同SEC级分从由阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶CtXyl5A产生的具有支化寡糖的小麦糠LMW-AX中获得。标准是A：阿拉伯糖，X：木糖，X2：木二糖，X3：木三糖，X4：木四糖，X5：木五糖，X6：木己糖，A2XX：α-(1→2)-阿拉伯呋喃糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基-β(1→4)-吡喃木糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基，A3X：α-(1→3)-阿拉伯呋喃糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基-β-(1→4)-吡喃木糖基。
图7.通过水解阿拉伯木聚糖衍生的阿拉伯木聚糖-寡糖，其是木寡糖和阿拉伯木寡糖之间的混合物。
图8.流程图，其描述从谷粒分离纤维、来自通过湿法分级的纤维旁路或纤维分离的纤维分离或来自从DDGS的干法分级的纤维的纤维分离。然后将这些纤维进料到纤维加工单元，在纤维加工单元中生产具有寡糖的LMW-AX作为主要产品。任选地将纤维加工后的纤维素固体残余物返回到用于饲料的流，同时可以添加具有寡糖的LMW-AX的一部分以在新的饲料产品中引入益生元性质。
图9.流程图，其描述用于获得具有寡糖的LMW-AX的与乙醇工艺有关的纤维加工操作。
图10.A)玉米酒糟样品的照片，和B)来自玉米酒糟样品的分级纤维的照片。
图11.显示酶促水解的玉米阿拉伯木聚糖样品中存在的寡糖的HPAEC-PAD色谱图。已经使用了内切木聚糖酶和阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶的不同组合。“+”符号指示酶以酶混合物形式同时使用，而“->”符号指示酶处理是连续的，之间是酶灭活步骤。
图12.被洗涤的纤维(左)和去淀粉的玉米糠(右)用碱性过氧化氢处理所产生的泡沫的照片。
发明详述
具有支化寡糖的LMW-AX由含有AX的谷物纤维通过碱性过氧化氢提取然后用AX特异性内切木聚糖酶温育来制备。
在第一个实例中，通过纤维的分级和洗涤(图4B)将纤维从玉米酒糟样品(图4A)中分离。通过碱性过氧化氢来加工纤维以产生水溶性AX，该水溶性AX具有分别基于回收的AX或基于固体部分中剩余的AX的高收率76-88％。然后，将可溶相分离并透析以除去有色组分和盐。最后，将透析后的水溶性AX用AX特异性内切木聚糖酶温育以产生具有支化寡糖的LMW-AX(图4C)和纤维素固体残余物(图4D)。表1中示出了玉米酒糟、经洗涤的分级的纤维和具有支化寡糖的LMW-AX的糖组成。水溶性AX的纯度可以通过在透析前任选的蛋白酶处理来进一步提高。具有支化寡糖的LMW-AX的纯度可以通过超滤和纳滤进一步提高，以分别回收添加的木聚糖酶并除去添加的CaCl2。
与来自家族10和11)的内切木聚糖酶的比较表明，AX特异性内切木聚糖酶在从玉米AX生产支化寡糖方面更加有效(图5A)，家族10和11是产生LMW-AX的最常用的木聚糖酶家族。通过将样品用两种选择性地除去附接到寡糖的Araf单元的阿拉伯呋喃糖苷酶温育确证这些寡糖是支化的(图5B)。由AX特异性内切木聚糖酶获得的具有支化寡糖的LMW-AX不含可检测到的β-(1→4)连接的XOS或木糖，这意味着由这种类型的酶产生的所有产物是真正地支化的或(1→3)连接的二糖，这与用家族10或11木聚糖酶获得的水解产物相反(图5A)。
来自玉米纤维的分离的水溶性AX在透析后具有55kDa的平均分子量和棉白色。在用AX特异性内切木聚糖酶温育后，平均分子量降低至对应于18-19个糖单元的2.5kDa。该实验证明，AX特异性内切木聚糖酶在甚至从复杂AX底物例如从玉米分离的复杂AX底物中产生支化寡糖方面是优异的。然而使用家族10或11木聚糖酶的现有技术工艺在水解复杂AX方面效率较低并且不能产生足够量的寡糖(图5A)。通过家族10木聚糖酶获得的Mw的分析揭示，该木聚糖酶家族只能将分子量降低至24kDa，而家族11根本不降低分子量(55kDa)。这解释了为什么使用家族10木聚糖酶获得极少数寡糖，并且为什么家族11木聚糖酶不能水解玉米AX(图5A)。这激励将化学预处理例如碱提取与AX特异性内切木聚糖酶组合使用以获得具有支化寡糖的LMW-AX。
玉米纤维碱性过氧化氢提取后所获得的纤维素残余物具有基于干质量的36％的纤维素含量和14％的AX含量(A/X＝0.38)。可以将该残余物加回到工艺流，引入用于反刍动物的容易消化的纤维素纤维。可选择地，该残余物可以用作纤维素乙醇原料或用作食品添加剂。
来自玉米纤维的具有支化寡糖的LMW-AX的详细描述
平均分子量：2.5kDa
A/X比率：0.56
含有在骨架的还原端木糖上的具有至少一个(1→3)连接的Araf单元或(1→3)连接的Xylp单元的支化寡糖。还可以含有由(1→3)连接的木糖-木糖(D-吡喃木糖-β-(1→3)-木糖)或阿拉伯糖-木糖(L-阿拉伯呋喃糖-α-(1→3)-木糖)组成的两种不同的二糖。
表1.玉米酒糟、分离的玉米纤维、来自玉米纤维的水溶性AX和来自玉米AX的具有支化寡糖的LMW-AX的总糖组成(g/g)、阿拉伯木聚糖含量(％干质量)和阿拉伯糖与木糖比率(A/X)。表1还示出了前分离纤维(front separated fiber)(玉米糠)和去淀粉的前分离纤维(玉米糠)的总糖组成(g/g)、阿拉伯木聚糖含量(％干质量)和阿拉伯糖与木糖比率(A/X)。
注意：AX含量被计算为(阿拉伯糖+木糖)x0.88。来自玉米AX的具有支化寡糖的LMW-AX相对于来自玉米纤维的水溶性AX的相对较低的阿拉伯木聚糖含量是由于向反应混合物添加的CaCl2和酶。A/X：阿拉伯糖与木糖比率。
在第二个实例中，将高度支化的AX级分(A/X＝0.88和87kDa的平均分子量)通过碱性过氧化氢从小麦糠(A/X＝0.55和基于干质量26％AX)中分离并且用AX特异性内切木聚糖酶处理。低支化的AX级分A/X＝0.34通过在酶处理之前降低提取物的pH来除去。可选择地，不降低pH并将两种AX级分保持在相同的级分中将产生具有0.81的平均A/X的底物。
具有支化寡糖的LMW-AX通过用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶水解高度支化的AX级分(0.88的A/X)获得。所得到的LMW-AX使用SEC进行分级，并且将各级分冷冻干燥、称重并分析其阿拉伯糖与木糖的比率(表2)。
表2.由高度支化的小麦糠阿拉伯木聚糖产生的具有支化寡糖的LMW-AX的级分1-5、质量百分比、分子量范围和A/X比率。
级分 总质量百分比 Mw范围(kDa) A/X
I 12.2％ 88.3-24.5 0.94
II 6.4％ 24.5-6.8 0.99
III 32.6％ 6.8-1.9 0.85
IV 43.6％ 1.9-0.53 0.85
V 5.2％ 0.53-0.15 0.85
AX特异性内切木聚糖酶在水解来自小麦糠的非常复杂的AX中是高效的。大部分水解产物(76.2％)的尺寸(size)在6.8-0.5kDa的范围内，对应于52-5个糖单元；并且43.6％的水解产物的尺寸在1.9-0.5kDa的范围内，对应于14-5个糖单元；这意味着在LMW-AX样品中存在大部分的支化寡糖。这也由HPAEC-PAD寡糖分析(图6)获得的结果确证，其中级分III和级分IV包含大部分的支化寡糖。
来自小麦糠的具有支化寡糖的LMW-AX的详细描述
平均分子量：3.6kDa
A/X比率：对于尺寸小于5kDa的级分，为0.88和0.85。
含有在骨架的还原端木糖上的具有至少一个(1→3)连接的Araf单元或(1→3)连接的Xylp单元的支化寡糖。还可以含有由(1→3)连接的木糖-木糖(D-吡喃木糖-β-(1→3)-木糖)或阿拉伯糖-木糖(L-阿拉伯呋喃糖-α-(1→3)-木糖)组成的两种不同的二糖。
本发明的一个方面涉及通过从谷物乙醇厂中分离纤维来生产水溶性阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的工艺。一个实施方案涉及一种工艺，其中纤维从由谷粒、湿工艺流或干DDGS组成的组的至少一个中分离。另一个实施方案涉及一种工艺，其中谷物乙醇工厂是干磨乙醇工厂。另一个实施方案涉及一种工艺，其中水溶性阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖使用利用碱、酸、蒸汽或酶的湿分级纤维的处理而获得。湿分级纤维可以来自干磨乙醇工厂，但不是排他性的。另一个实施方案涉及一种工艺，其中将所获得的阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的级分引入到用于生产益生元产品的流中。为了增强终产品的目的，也可想到将其它添加剂添加到该流中。另一个实施方案涉及一种工艺，其中将所获得的阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的级分引入到用于生产饲料的流中，以获得益生元饲料产品。另一个实施方案涉及一种工艺，其中将所获得的阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的级分引入到所述谷物乙醇工厂的流中。另一个实施方案涉及一种工艺，其中将生产水溶性阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖后剩余的用过的固体引入到用于生产饲料产品的流中。所用过的固体可以作为改性的纤维被引入，帮助反刍动物消化。此外，本发明可以包括纤维加工单元，该纤维加工单元包括：反应单元，反应单元适于提取或水解、以及中和；分离单元，分离单元适于至少一种固/液分离。
本发明的另一方面涉及包含通过根据本发明的工艺可获得的水溶性阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的产品。本发明的另一方面涉及根据本发明的工艺用于生产水溶性阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的用途。本发明的又另一方面涉及包含通过根据本发明的工艺可获得的水溶性阿拉伯木聚糖或阿拉伯木聚糖衍生的寡糖的食品、饲料、饮料成分或营养补充剂。
在另一个实例中，碱性过氧化氢提取被重复一次以增加提取液中水溶性AX的浓度。结果显示，再次重复提取不显著降低提取的AX的收率，对于提取1和提取2收率分别为79％和78％。相反，通过重复使用提取液重复提取将水溶性AX的浓度增加了98％，分别从第一次提取的15.5g/L增加到第二次提取的30.7g/L。在一个实施方案中，水溶性AX的浓度是15g/L至35g/L。这例证了，重复使用提取液一次或多于一次对于增加水溶性AX含量是有用的，由此减少对化学品的需求并使下游加工更有效。纤维素固体的品质对于每次提取是相似的，这表明重复使用提取液不显著改变纤维素固体的特性。
在另一个实例中，来自碱性过氧化氢提取的水溶性AX通过氯化钙沉淀来纯化。在将溶液通过二氧化碳中和至pH 7.5后添加氯化钙。在添加氯化钙溶液后立即形成白色沉淀物。沉淀物由碳酸钙组成，碳酸钙从溶液中共沉淀污染物，将水溶性AX的纯度增加了31％，通过从溶液中选择性地除去非糖分子将水溶性AX的纯度从59％增加到77％。在一个实施方案中，水溶性AX的浓度的增加为从59％至77％。AX的损失不显著，这示出以成本有效的方式纯化水溶性阿拉伯木聚糖的可能性。唯一必需的要求是通过例如超滤对水溶性阿拉伯木聚糖进行脱盐以达到基于干质量超过70％的纯度。
表3.水溶性阿拉伯木聚糖样品透析后的总阿拉伯糖木聚糖含量(％干质量)
样品 阿拉伯木聚糖含量(％干质量)
来自玉米纤维的水溶性AX 59
经钙盐处理的来自玉米纤维的水溶性AX 77
在另一个实例中，比较了碱性过氧化氢提取期间两种不同的纤维来源的起泡。如图12中所示的结果例证了使用被洗涤以除去污染物的纤维来源的重要性。具有基于干质量超过40％AX和减少的蛋白质的量的纤维来源在碱提取期间显著减少泡沫。与去淀粉前分离纤维(玉米糠)相比，通过使用具有基于干质量41％AX的经洗涤的纤维来源将泡沫减少五倍，使用20ml的总提取体积，泡沫从50ml下降至10ml。这意味着，选择具有超过40％AX的纤维似乎对于减少提取期间的起泡问题至关重要。此实例示出，使用高AX含量的纤维来减少碱性过氧化氢提取期间起泡的问题是至关重要的。
具有寡糖的LMW-AX从含AX的谷物纤维通过碱性过氧化氢提取然后用阿拉伯呋喃糖苷酶和内切木聚糖酶温育来制备。
可容易除去的Araf单元的一部分被除去以在AX结构中打开孔以用于木聚糖酶水解，从而促进从复杂AX底物产生寡糖。
在第一个实例中，通过纤维的分级和洗涤(图4B)将纤维从玉米酒糟样品(图4A)中分离。通过碱性过氧化氢来加工纤维以产生水溶性AX，该水溶性AX具有分别基于回收的AX或基于固体部分中剩余的AX的高收率76-88％。然后，将可溶相分离并透析以除去有色组分和盐。最终，将透析后的水溶性AX用不同的阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)和来自家族10的代表性内切木聚糖酶的组合温育。在HPAEC-PAD上分析所得到的寡糖以评估哪种酶组合产生最高量的寡糖(图11)。表1中示出了玉米酒糟、经洗涤的分级的纤维和具有寡糖的LMW-AX的糖组成。水溶性AX的纯度可以通过在透析前任选的蛋白酶处理来进一步提高。具有寡糖的LMW-AX的纯度可以通过超滤和纳滤进一步提高，以分别回收添加的酶并除去单糖。
仅使用内切木聚糖酶的比较示出，单独的内切木聚糖酶在将AX底物水解成寡糖方面不是有效的，内切木聚糖酶是产生寡糖的最常用的木聚糖酶活性物。相反，选择性地除去Araf单元的阿拉伯呋喃糖苷酶的添加对于从玉米AX中更有效地产生寡糖是必需的(图11)。
来自玉米纤维的分离的水溶性AX在透析后具有55kDa的平均分子量和棉白色。在用木聚糖酶10温育后获得的Mw的分析揭示了，单独的此木聚糖酶仅仅可以将分子量降低到大于24kDa。这表明，另外的酶对于产生寡糖是必需的。仅在用包含阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶两者的酶混合物温育后，才存在Mw的降低。获得两种级分，一种具有10-20kDa的较高Mw而另一种具有0.4-10kDa的低Mw。这激励将阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶一起使用以从复杂的AX或密集取代的AX中获得具有寡糖的LMW-AX。实验还示出，与按顺序进行处理相比，通过用阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶同时进行酶促处理形成的寡糖更多。因此，包含阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶的酶混合物是产生寡糖的优选方法。
玉米纤维碱性过氧化氢提取后所获得的纤维素残余物具有基于干质量的36％的纤维素含量和14％的AX含量(A/X＝0.38)。可以将该残余物加回到工艺流，引入用于反刍动物的容易消化的纤维素纤维。可选择地，该残余物可以用作纤维素乙醇原料或用作食品添加剂。
来自玉米纤维的具有寡糖的LMW-AX的详细描述
分子量：0.4-20kDa
A/X比率：0.4-0.5
表4.玉米酒糟、分离的玉米纤维、来自玉米纤维的水溶性AX和来自玉米AX的具有寡糖的LMW-AX的总糖组成(g/g)、阿拉伯木聚糖含量(％干质量)和阿拉伯糖与木糖比率(A/X)。
注意：AX含量被计算为(阿拉伯糖+木糖)x0.88。来自玉米AX的具有寡糖的LMW-AX相对于来自玉米纤维的水溶性AX的相对较低的阿拉伯木聚糖含量是由于向反应混合物添加的酶。A/X：阿拉伯糖与木糖比率。
在一个实施方案中，本发明涉及包含具有寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)的组合物，其中Araf单元的一部分已被除去以提高寡糖的收率。在另一个实施方案中，具有寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)包含阿拉伯糖单元和木糖单元，优选地具有0.4-1.0的阿拉伯糖/木糖比率，优选地0.4-0.9的比率，优选地0.4-0.8的比率，优选地0.4-0.7的比率，优选地0.4-0.6的比率，优选地0.4-0.5的比率。在另一个实施方案中，平均分子量小于10kDa，优选地小于7.5kDa，优选地小于5kDa，优选地小于2.5kDa，优选地小于2kDa。在本发明的另一个实施方案中，寡糖的收率通过将木聚糖酶与阿拉伯呋喃糖苷酶组合来提高，优选地能够除去在双取代的Xylp单元(dXyl)处的α-(1→3)-连接的Araf的阿拉伯呋喃糖苷酶或能够除去在单取代的Xylp单元(mXyl)处的单α-(1→2)-连接的Araf和单α-(1→3)-连接的Araf的阿拉伯呋喃糖苷酶。优选地使用阿拉伯呋喃糖苷酶的两种不同活性物的组合来获得高的寡糖收率；在另一个实施方案中，阿拉伯呋喃糖苷酶选自阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)的组，优选地选自由阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶-d3(AXH-d3)或阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶-m2,3(AXH-m2,3)组成的组。在另一个实施方案中，在木聚糖酶处理之前通过用弱酸溶液的处理来代替阿拉伯呋喃糖苷酶处理，弱酸例如但不限于无机酸、优选地盐酸、优选地硫酸、优选地磷酸、优选地硝酸或优选地乙酸。在另一个实施方案中，在木聚糖酶处理之前通过用蒸汽或热压水的处理来代替阿拉伯呋喃糖苷酶处理，用蒸汽或热压水的处理例如蒸汽爆炸或自水解。在另一个实施方案中，木聚糖酶是内切木聚糖酶，优选地来自家族8、10或11，更优选地来自家族10或11，最优选地来自家族10。在另一个实施方案中，本发明是一种组合物，其中底物是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从含有纤维的谷物、优选地含有阿拉伯木聚糖的谷物中分离的纤维。
本发明的另一方面涉及一种工艺，其中起始材料是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从包含纤维的谷物、优选地包含阿拉伯木聚糖的谷物优选地高度取代或密集取代的阿拉伯木聚糖级分的谷物中分离的纤维。在另一个实施方案中，起始原料从谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂获得。在另一个实施方案中，阿拉伯木聚糖是水溶性阿拉伯木聚糖，优选地利用使用碱、酸、自水解、蒸汽爆炸、碾磨、空化或酶对纤维进行预处理而获得。在另一个实施方案中，低取代的AX通过碱提取溶液的酸化来沉淀，并且优选地被除去。在另一个实施方案中，使用包含HCl、H2SO4、NaOH、Ca(OH)2、NH4或碱性过氧化氢中的至少一种的预处理获得水溶性阿拉伯木聚糖。在另一个实施方案中，将预处理后剩余的任何纤维素固体再次引入来自谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。在另一个实施方案中，工艺用于生产饲料产品。在另一个实施方案中，本发明包括纤维加工单元，纤维加工单元包括：反应单元，反应单元适于碱提取和中和、或自水解、或酸水解和中和、或空化、或蒸汽爆炸或碾磨；以及分离单元，分离单元适于至少一种固/液分离。
本发明的另一方面涉及根据本发明的组合物或从根据本发明的工艺获得的具有寡糖的LMW-AX级分的用途，优选地用于引入到谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。另一个实施方案涉及本发明用于生产益生元产品、优选地食品、饲料、饮料成分或营养补充剂的用途。
本发明的另一方面涉及一种食品、饲料、饮料成分或营养补充剂或个人护理产品成分，包含根据本发明的具有寡糖的LMW-AX或通过根据本发明的工艺可获得的具有寡糖的LMW-AX。
实施例
实施例1：从分级的玉米纤维制备具有支化寡糖的LMW-AX。
材料和方法
酶
来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶(阿拉伯木聚糖酶(Arabinoxylanase))(CtXyl5A)购自Nzytech(里斯本，葡萄牙)。来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的家族10木聚糖酶(RmXyn10A)如Falck等人(2013)中描述的来制备。Pentopan mono bg，一种商业的家族11木聚糖酶从Novozymes(Bagsvaerd，丹麦)获得。高纯度重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(E-ABFCJ和E-AFAM2)购自Megazyme(威克洛，爱尔兰)。
底物
从美国玉米干磨乙醇生产商接收的干玉米酒糟的样品。将27g的样品过筛通过1mm，用手分离出大纤维颗粒并用水洗涤，并且然后冷冻干燥。
工艺步骤
冻干的纤维(150mg)用由50％NaOH(Merck)调节至pH 11.5的2％(w/w)H2O2溶液(Sigma)提取。在0、20和40分钟的时间间隔添加等体积的新鲜制备的碱性H2O2溶液至5％的最终干重含量。添加防沫剂曲通X-100以减少起泡。提取温度为90℃，且总提取时间为90分钟。反应在玻璃管中进行，使用磁棒连续搅拌。
提取后，通过以3900g离心持续10分钟分离可溶相和不可溶相。将沉淀物(pellet)用5体积的去离子水洗涤一次并再次离心以回收被捕获在沉淀物中的残留的可溶物。加入干冰形式的二氧化碳以中和可溶相和不可溶相。将可溶级分在3.5kDa透析袋(Spectra/por,Spectrumlabs,USA)中用去离子水透析持续24小时。透析后，将样品作为水溶性玉米阿拉伯木聚糖回收，并取出一部分并冷冻干燥。将固体纤维素级分冷冻干燥并且相当于初始纤维的34％的质量被回收。
木聚糖酶温育全部是使用基于阿拉伯木聚糖干基的1.25％的酶于pH 7和50℃进行24小时。反应在水浴中温育。本发明中描述的具有支化寡糖的LMW-AX由40mg干重的水溶性玉米阿拉伯木聚糖通过阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶CtXyl5A与加入到反应混合物中的2mM CaCl2来产生。反应后，将所有样品冷冻干燥。
样品中支化寡糖的表征通过将样品与1.0U/mg的两种不同的阿拉伯呋喃糖苷酶温育来进行，该两种不同的阿拉伯呋喃糖苷酶分别地除去(1→3)双连接的阿拉伯呋喃糖基单元(E-AFAM2)或除去单连接的(1→2)或(1→3)阿拉伯呋喃糖基单元(E-ABFCJ)。使用20mM磷酸钠缓冲剂在pH 5.8在50℃进行反应持续24h。
总糖的表征
将水溶性阿拉伯木聚糖级分和具有支化寡糖的LMW-AX级分的总糖组合物用2MTFA在110℃水解持续60分钟。通过蒸发中和TFA。碱提取后的玉米酒糟、分离的玉米纤维和纤维素残余物中的总糖组合物在30℃用72％H2SO4预水解持续1小时，然后将样品稀释至4％H2SO4并在100℃水解持续3小时。通过加入Ca(OH)2完成H2SO4的中和。通过使用CarboPacPA20柱(250mm×3mm，5.5μm)和以0.5mL/min的20mM NaOH流动相的HPAEC-PAD对来自TFA和H2SO4水解的回收的中性单糖进行分析。单糖标准品(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88乘以(％阿拉伯糖+％木糖)。在减去任何游离的葡萄糖之后，纤维素样品中的总纤维素含量被计算为0.90乘以％葡萄糖。
寡糖的表征
通过使用(ICS-5000)、使用CarboPac PA200柱(250mm x 3mm,5.5μm)以及以0.5mL/min的100mM NaOH的流动相和0-120mM的乙酸钠(Sigma)的线性梯度(0-30min)的结合有脉冲电化学检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)对所获得的寡糖进行分析。使用的单糖标准品、木寡糖标准品和阿拉伯木寡糖标准品如下：阿拉伯糖和木糖(Sigma)、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木己糖、阿拉伯木二糖(arabinoxylobiose)和阿拉伯木三糖(arabinoxylotriose)(Megazyme)。分析之前，所有样品均过滤通过0.22μm过滤器。通过如下进行支化寡糖的确定：将支化的低分子量阿拉伯木聚糖样品与如上所述的两种不同的阿拉伯呋喃糖苷酶温育，释放双Araf单元和单Araf单元，并在HPAEC-PAD上分析样品。
分子量的表征
分子量分析通过具有IR检测器(RI-101，Shodex，日本)的高效液相色谱法(HPLC；Dionex Ultimate 3000)、使用用于多糖分析的柱(Shodex，日本)SB-806HQ和恒定的25mM乙酸钠缓冲液pH 5.0的流动相(0.5mL min-1)来确定。注射体积是20μL。使用的标准品含有分子量为P-400(36.6x104)、P-200(20.0x104)、P-100(11.3x104)、P-50(4.88x104)、P-20(2.17x104)、P-10(1.00x104)和P-5(0.62x104)的普鲁分支葡聚糖(pullulan)标准品(Shodex,日本)和基于木糖的标准品木己糖(MW＝810.7Da)(Megazyme，爱尔兰)和木糖(MW＝150.13Da)(Sigma)。
实施例2：从小麦糠制备具有支化寡糖的LMW-AX。
酶
来自热纤梭菌的阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶(阿拉伯木聚糖酶)(CtXyl5A)购自Nzytech(里斯本，葡萄牙)。热稳定的α-淀粉酶0.12U/g(Thermamyl)和蛋白酶(Neutralse 0.8L)购自Sigma。
底物
使用商业小麦糠( Mill 瑞典)作为起始原料。一部分糠在刀磨机(FOSS)中碾磨通过1.5mm筛目尺寸用于总糖的分析。
工艺
将250g小麦糠(94％干质量)在2.5L DI水中的悬浮液(1:9w/v)用HCl 8M调节至pH6.0，并且用热稳定的α-淀粉酶0.12U/g在90℃处理持续90分钟，以水解淀粉。然后，将糠用热的自来水冲洗以除去可溶物，直到获得澄清的渗透物。通过将糠与蛋白酶0.035U/g在50℃温育持续4小时制备新的水中的悬浮液(1:9w/v)以除去蛋白。此后，将糠用热自来水然后用去离子水冲洗，然后真空干燥。
在60℃和200rpm搅拌下，用1L pH 11.5的含2％过氧化氢的氢氧化钠稀释碱溶液提取去淀粉和去蛋白的小麦糠(50g干重)持续4小时。添加防沫剂曲通X-100以减少起泡。提取后，通过过滤除去固体并且将溶液离心(SIGMA)6000g持续20分钟。上清用8M HCl中和并加入辣根过氧化物酶以除去剩余的过氧化氢。含有AX(A/X＝0.81)的提取物再次以6000g离心持续20分钟以除去沉淀。
然后将回收的上清调节至pH 4.0并保持3小时以沉淀低支化AX(A/X＝0.34)。通过在6000g离心持续20分钟并丢弃低支化AX来回收高度支化的AX级分(A/X＝0.88)。离心后的上清用NaOH中和至pH 7。加入蛋白酶0.00125U/mL并将样品在50℃温育过夜。通过乙醇沉淀从溶液回收AX至最终浓度为80％，并将样品搅拌持续1小时。通过在3000g离心持续3分钟回收沉淀的AX。沉淀物用80％乙醇洗涤一次并通过离心回收。然后使沉淀物风干并然后溶解于50℃的MQ水中，并用NaOH将pH调节至7。
30mL高度取代的水溶性小麦糠阿拉伯木聚糖的木聚糖酶温育使用水浴在50℃进行持续24小时。用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶CtXyl5A(0.5mg)水解阿拉伯木聚糖。在反应混合物中还含有2mM CaCl2以稳定酶。反应之后，样品被冷冻干燥并被称为来自小麦糠的具有支化寡糖的LMW-AX。
总糖的表征
将水溶性阿拉伯木聚糖、具有支化寡糖的LMW-AX和来自SEC的分离的级分的总糖组合物用2M TFA在110℃水解持续60分钟。通过蒸发中和TFA。通过在30℃用72％H2SO4预水解持续1小时，然后将样品稀释至4％H2SO4并在100℃水解持续3小时来确定研磨小麦糠中的总糖组分。通过加入Ca(OH)2完成H2SO4的中和。通过使用CarboPac PA20柱(250mm×3mm，5.5μm)和以0.5mL/min的20mM NaOH的流动相的HPAEC-PAD对来自TFA和H2SO4水解的回收的中性单糖进行分析。单糖标准品(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88乘以(％阿拉伯糖+％木糖)。
寡糖的表征
通过使用(ICS-5000)、使用CarboPac PA200柱(250mm x 3mm,5.5μm)以及以0.5mL/min的100mM NaOH的流动相和0-120mM的乙酸钠(Sigma)的线性梯度(0-30min)的结合有脉冲电化学检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)对寡糖进行分析。使用的单糖标准品、木寡糖标准品和阿拉伯木寡糖标准品如下：阿拉伯糖和木糖(Sigma)、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木己糖、阿拉伯木二糖和阿拉伯木三糖(Megazyme)。
分子量和级分收集的表征
使用Sephacryl S-200HR柱(600×16mm)和IR检测器和恒定脱气过滤水的流动相(0.3mL min-1)进行分子量和级分收集的分析。将具有10g/L的通过用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶CtXyl5A水解阿拉伯木聚糖获得的具有支化寡糖的LMW-AX的2.5mL样品过滤通过0.45μm并注入。收集3mL的级分。将级分在5个不同的时间间隔(每次60分钟)合并在一起并冷冻干燥。使用分子量为P-400(36.6x104)、P-200(20.0x104)、P-100(11.3x104)、P-50(4.88x104)、P-20(2.17x104)、P-10(1.00x104)和P-5(0.62x104)的普鲁分支葡聚糖标准品(Shodex，日本)，将标准品用于计算各级分的分子量范围。还使用基于木糖的标准品木己糖(MW＝810.7Da)(Megazyme，爱尔兰)和木糖(MW＝150.13Da)(Sigma)。
实施例3：用分级的玉米纤维制备具有寡糖的LMW-AX。
材料和方法
酶
来自海洋红嗜热盐菌的家族10木聚糖酶(RmXyn10A)如在Falck等人(2013)中描述的来制备。高纯度重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶购自Megazyme(威克洛，爱尔兰)：分别从(1→2)或(1→3)单取代的Xylp单元mXyl2和mXyl3中除去Araf的纤维弧菌(Cellvibriojaponicus)(E-ABFCJ)在文中和图11中被称为AXH-m2,3。从双(1→2)和(1→3)取代的Xylp单元dXyl中除去(1→3)Araf的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(E-AFAM2)在文中和图11中被称为AXH-d3。
底物
干玉米酒糟的样品从美国玉米干磨乙醇生产商接收。将27g的样品过筛通过1mm，用手分离出大纤维颗粒并用水洗涤，然后冷冻干燥。
工艺步骤
冻干纤维(150mg)用由50％NaOH(Merck)调节至pH 11.5的2％(w/w)H2O2溶液(Sigma)提取。以0、20和40分钟的时间间隔添加等体积的新鲜制备的碱性H2O2溶液至5％的最终干重含量。添加防沫剂曲通X-100以减少起泡。提取温度为90℃，且总提取时间为90分钟。反应在玻璃管中进行，使用磁棒连续搅拌。
提取后，通过以3900g离心持续10分钟分离可溶相和不可溶相。将沉淀物用5体积的去离子水洗涤一次并再次离心以回收被捕获在沉淀物中的残留的可溶物。加入干冰形式的二氧化碳以中和可溶相和不可溶相。将可溶级分在3.5kDa透析袋(Spectra/por,Spectrumlabs,USA)中用去离子水透析持续24小时。透析后，将样品作为水溶性玉米阿拉伯木聚糖回收，并取出一部分并冷冻干燥。将固体纤维素级分冷冻干燥并且相当于初始纤维34％的质量被回收。
通过用1.0U/mg阿拉伯呋喃糖苷酶(AXH-m2,3和/或AXH-d3)和1％(wt/wt)木聚糖酶(Xyn10)的不同组合温育样品，从水溶性玉米阿拉伯木聚糖(10g/L)制备本发明描述的具有寡糖的LMW-AX。“+”符号表示酶以酶混合物形式同时使用，而“->”符号表示酶处理是连续的，在这些处理之间使用通过煮沸15min的酶灭活步骤。所有反应在50℃在pH 7进行持续24小时。反应在加热块中温育。
混合物组合
.只有Xyn10
.Xyn10+AXH-m2,3
.Xyn10+AXH-d3
.Xyn10+AXH-m2,3+AXH-d3
.(AXH-m2,3+AXH-d3)→Xyn10
总糖的表征
水溶性阿拉伯木聚糖级分和具有寡糖的LMW-AX级分的总糖组合物用2M TFA在110℃水解持续60分钟。通过蒸发中和TFA。碱提取后的玉米酒糟、分离的玉米纤维和纤维素残余物中的总糖组合物在30℃用72％H2SO4预水解1小时，然后将样品稀释至4％H2SO4并在100℃水解持续3小时。通过加入Ca(OH)2完成H2SO4的中和。通过使用CarboPac PA20柱(250mm×3mm，5.5μm)和以0.5mL/min的20mM NaOH流动相的HPAEC-PAD对来自TFA和H2SO4水解的回收的中性单糖进行分析。单糖标准品(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88乘以(％阿拉伯糖+％木糖)。在减去任何游离的葡萄糖之后，纤维素样品中的总纤维素含量被计算为0.90乘以％葡萄糖。
寡糖的表征
通过使用(ICS-5000)、使用CarboPac PA200柱(250mm x 3mm,5.5μm)以及以0.5mL/min的100mM NaOH的流动相和0-120mM的乙酸钠(Sigma)的线性梯度(0-30min)的结合有脉冲电化学检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)对所获得的寡糖进行分析。使用的单糖标准品、木寡糖标准品和阿拉伯木寡糖标准品如下：阿拉伯糖和木糖(Sigma)、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木己糖、阿拉伯木二糖和阿拉伯木三糖(Megazyme)。在HPAEC-PAD上分析之前，所有样品过滤通过0.22μm过滤器。
分子量的表征
使用通过具有IR检测器(RI-101，Shodex，日本)的高效液相色谱法(HPLC；DionexUltimate 3000)使用用于多糖分析的柱(Shodex，日本)SB-806HQ和恒定的25mM乙酸钠缓冲液pH 5.0的流动相(0.5mL.min-1)来确定分子量分析。注射体积是20μL。使用的标准品含有分子量为P-400(36.6x104)、P-200(20.0x104)、P-100(11.3x104)、P-50(4.88x104)、P-20(2.17x104)、P-10(1.00x104)和P-5(0.62x104)的普鲁分支葡聚糖标准品(Shodex，日本)和基于木糖的标准品木己糖(MW＝810.7Da)(Megazyme，爱尔兰)和木糖(MW＝150.13Da)(Sigma)。
实施例4重复使用来自预处理的提取液
为了提高提取液中水溶性阿拉伯木聚糖的浓度而不增加纤维与提取液的比率，提取液在另一个后续提取中重复使用。
底物
从美国玉米干磨乙醇生产商接收发酵后的分离的纤维级分的样品。将纤维用水洗涤并过滤通过1mm过滤器以回收基于干质量基准的超过40％的AX含量的级分(41％)。通过在30℃用72％H2SO4持续1小时、然后将样品稀释至4％H2SO4并在100℃水解持续3小时来确定AX含量。通过加入Ba(OH)2完成H2SO4的中和。
重复提取的工艺
洗涤纤维(1.44g干重)用由50％NaOH(Merck)调节至pH 11.5的2％(w/w)H2O2溶液(Sigma)提取。以0、20和40分钟的时间间隔添加等体积的新鲜制备的碱性H2O2溶液至5％的最终干重含量。添加防沫剂曲通X-100以减少起泡。提取温度为90℃，且总提取时间为90分钟。反应在玻璃管中进行，使用磁棒连续搅拌。
提取后，通过以3900g离心持续10分钟分离可溶相和不可溶相。将沉淀物用10ml的去离子水洗涤一次并再次离心以回收被捕获在沉淀物中的残留的可溶物。将洗涤水加回上清至终体积为30ml，并取样进行糖分析。用NaOH重新将pH调节至11.5，然后使用与第一次提取所述的相同的工艺将溶液用于提取1.44g的洗涤过的纤维。第二次提取后，通过以3900g离心持续10分钟分离可溶相和不可溶相。将沉淀物用10ml的去离子水洗涤一次并再次离心以回收被捕获在沉淀物中的残留的可溶物。将洗涤水加回上清至终体积为30ml，并取样进行糖分析。将去离子水加入到两种沉淀物中，然后加入干冰形式的二氧化碳以中和含有纤维素纤维的不可溶相。使用40ml去离子水再次洗涤沉淀物以除去残留的盐，然后冷冻干燥。
总糖的表征
将水溶性阿拉伯木聚糖级分的总糖组合物用2M TFA在110℃水解持续60分钟。通过蒸发中和TFA。碱提取后的洗涤的纤维和纤维素残余物中的总糖组合物在30℃用72％H2SO4预水解持续1小时，然后将样品稀释至4％H2SO4并在100℃水解持续3小时。通过加入Ba(OH)2完成H2SO4的中和。通过使用CarboPac PA20柱(250mm×3mm，5.5μm)和以0.5mL/min的20mM NaOH流动相的HPAEC-PAD对来自TFA和H2SO4水解的回收的中性单糖进行分析。单糖标准品(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88乘以(％阿拉伯糖+％木糖)。在减去任何游离的葡萄糖之后，纤维素样品中的总纤维素含量被计算为0.90乘以％葡萄糖。
实施例5：通过用氯化钙沉淀来纯化水溶性阿拉伯木聚糖的工艺
通过加入干冰形式的二氧化碳将来自实施例4中描述的工艺的第二次提取后回收的上清中和至pH 7.5。将10ml样品在3.5kDa透析袋(Spectra/por,Spectrumlabs,USA)中用去离子水透析24小时。透析后，将样品作为水溶性玉米阿拉伯木聚糖回收，并取出一部分并冷冻干燥。将另一份10ml的上清样品与3ml 1M CaCl2混合以使杂质与CaCO3一起沉淀。通过以6000g离心持续20分钟除去沉淀，并如上所述透析10ml上清并冷冻干燥。
总糖的表征
将水溶性阿拉伯木聚糖级分的总糖组合物用2M TFA在110℃水解持续60分钟。通过蒸发中和TFA。通过使用CarboPac PA20柱(250mm×3mm，5.5μm)和以0.5mL/min的20mMNaOH流动相的HPAEC-PAD对来自TFA水解的回收的中性单糖进行分析。单糖标准品(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88乘以(％阿拉伯糖+％木糖)。在减去任何游离的葡萄糖之后，纤维素样品中的总纤维素含量被计算为0.90乘以％葡萄糖。
实施例6：纤维来源的比较
为了比较作为制造纤维素的底物的不同纤维来源，比较了来自两种不同纤维来源的玉米纤维胶和AXOS的提取期间的泡沫产生。从欧洲玉米干磨乙醇生产商处接收一种也被称为玉米糠的前分离纤维样品。
将前分离纤维在用HCl 8M调节至pH 6.0的、35.7g干质量的玉米糠在0.6L DI水中的悬浮液(1:9w/v)中去淀粉，并且用热稳定的α-淀粉酶0.12U/g在90℃处理持续90分钟以水解淀粉。然后，将糠用热的自来水冲洗以除去可溶物，直到获得澄清的渗透物。然后冷冻干燥糠。
洗涤纤维(1.0g干重)和去淀粉的前分离纤维(玉米糠)用由50％NaOH(Merck)调节至pH 11.5的2％(w/w)H2O2溶液(Sigma)提取。一旦稳定就记录泡沫水平。
前分离纤维(玉米糠)和去淀粉的前分离纤维(玉米糠)中的总糖组合物在30℃用72％H2SO4预水解持续1小时，然后将样品稀释至4％H2SO4并在100℃水解持续3小时。通过加入Ba(OH)2完成H2SO4的中和。通过使用CarboPac PA20柱(250mm×3mm，5.5μm)和以0.5mL/min的20mM NaOH的流动相的HPAEC-PAD对来自H2SO4水解的回收的中性单糖进行分析。单糖标准品(SIGMA)如下：阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及木糖。在减去任何游离的阿拉伯糖之后，样品中的总阿拉伯木聚糖含量被计算为0.88乘以(％阿拉伯糖+％木糖)。在减去任何游离的葡萄糖之后，纤维素样品中的总纤维素含量被计算为0.90乘以％葡萄糖。
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Claims (19)

1.一种组合物，所述组合物包含具有支化寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)，优选地具有位于寡糖骨架的还原端处的至少一种阿拉伯糖或木糖；
优选地，所述支化寡糖包含阿拉伯糖单元和木糖单元，优选地具有0.4-1.2的阿拉伯糖/木糖比率，优选地0.4-1.0的比率，优选地0.45-1.0的比率，优选地0.5-0.9的比率；优选地具有小于10kDa、优选地小于7.5kDa、优选地小于5kDa、优选地小于4kDa、优选地小于3.7kDa的平均分子量；优选地，所述寡糖含有至少一个支链，所述支链由连接到所述骨架的(1→3)连接的阿拉伯呋喃糖基单元或(1→3)连接的吡喃木糖基单元组成；优选地，所述组合物包含二糖并且所述二糖与两个木糖单元或一个阿拉伯糖单元和一个木糖单元之间的(1→3)键连接，优选地底物是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从包含纤维的谷物、优选地包含阿拉伯木聚糖的谷物中分离的纤维。
2.一种用于生产纤维素纤维、水溶性阿拉伯木聚糖、支化低分子量-阿拉伯木聚糖、或低分子量-阿拉伯木聚糖中的至少一种的工艺，包括以下步骤：
A.从乙醇工艺中分离纤维级分；
B.通过机械工艺增加步骤A的所述纤维级分中的阿拉伯木聚糖的浓度，获得阿拉伯木聚糖含量增加的纤维级分；
C.用碱或碱性过氧化氢溶液处理步骤B的阿拉伯木聚糖增加的所述纤维级分，获得包含纤维素固体和水溶性阿拉伯木聚糖的溶液；
D.将步骤C的所述纤维素固体从含有水溶性阿拉伯木聚糖的提取液中分离，然后中和、洗涤并干燥所述纤维素固体；
E.任选地重复使用来自步骤D即先前提取的所述提取液来重复另外的纤维级分的提取；
F.用CO2降低在一次或多于一次提取后获得的所述提取液的pH；
G.用钙盐处理在一次或多于一次提取后获得的所述提取液以沉淀杂质，并且除去沉淀物；
H.使用沉淀或过滤以回收水溶性阿拉伯木聚糖；
I.用酶处理所述水溶性阿拉伯木聚糖以制成低分子量-阿拉伯木聚糖或支化低分子量-阿拉伯木聚糖；
J.浓缩或干燥来自H和/或I的所述低分子量-阿拉伯木聚糖产品。
3.一种用于生产根据权利要求1或2的具有支化寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖的工艺，所述工艺使用阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的工艺，其中起始材料是从含纤维的谷粒、含纤维的湿工艺流或干燥的干酒糟及可溶物(DDGS)中的至少一种中分离的纤维，优选地从包含纤维的谷物、优选地包含阿拉伯木聚糖的谷物、优选地高度取代或密集取代的阿拉伯木聚糖级分中分离的纤维。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的工艺，其中所述起始材料从谷物乙醇工厂获得，优选地干磨乙醇工厂。
6.根据权利要求2-5中任一项所述工艺，其中用于所述阿拉伯木聚糖特异性内切木聚糖酶的阿拉伯木聚糖底物是水溶性阿拉伯木聚糖，优选地利用使用碱、酸、自水解、蒸汽爆炸、碾磨、空化或酶对所述纤维进行预处理来获得。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的工艺，其中低取代的AX通过碱提取物的酸化来沉淀，并且优选地被除去。
8.根据权利要求6或7所述的工艺，其中所述水溶性阿拉伯木聚糖使用包含HCl、H2SO4、NaOH、Ca(OH)2、NH4和碱性过氧化氢中的至少一种的预处理来获得。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的工艺，其中在所述预处理之后剩余的任何纤维素固体被再次引入到来自谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。
10.根据权利要求9所述的工艺，其中所述工艺用于生产饲料产品。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的工艺，包括纤维加工单元，所述纤维加工单元包括：反应单元，所述反应单元适于碱提取和中和、或自水解、或酸水解和中和、或空化、或蒸汽爆炸或碾磨；以及分离单元，所述分离单元适于至少一种固/液分离。
12.根据权利要求1所述的组合物或从根据权利要求2-11所述的工艺获得的具有支化寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖级分的用途，优选地用于引入到谷物乙醇工厂、优选地干磨乙醇工厂的流中。
13.根据权利要求12所述的用途，用于生产益生元产品，优选地食品、饲料、饮料成分或营养补充剂。
14.一种食品、饲料、饮料成分或营养补充剂或个人护理产品成分，包含根据权利要求1的具有支化寡糖的所述低分子量-阿拉伯木聚糖或通过根据权利要求2-11中任一项所述的工艺可获得的具有支化寡糖的所述低分子量-阿拉伯木聚糖。
15.一种组合物，包含具有寡糖的低分子量-阿拉伯木聚糖(LMW-AX)，其中所述阿拉伯呋喃糖(Araf)单元的一部分已经被除去以提高寡糖的收率，优选地在木聚糖酶处理之前用弱酸溶液的处理来代替阿拉伯呋喃糖苷酶，所述弱酸是例如但不限于无机酸、优选地盐酸、优选地硫酸、优选地磷酸、优选地硝酸或优选地乙酸，或者在所述木聚糖酶处理之前用蒸汽或热压水的处理来代替阿拉伯呋喃糖苷酶，所述蒸汽或热压水的处理是例如蒸汽爆炸或自水解。
16.用于根据权利要求2-11所述的工艺中的纤维，所述纤维具有至少20％的基于干质量的阿拉伯木聚糖含量，优选地所述阿拉伯木聚糖含量为至少25％，优选地所述阿拉伯木聚糖含量为至少30％，优选地所述阿拉伯木聚糖含量为至少35％，优选地所述阿拉伯木聚糖含量为至少37％，优选地所述阿拉伯木聚糖含量为至少40％。
17.通过根据权利要求2-11所述的工艺获得的纤维素纤维、水溶性阿拉伯木聚糖、支化低分子量-阿拉伯木聚糖、或低分子量-阿拉伯木聚糖。
18.根据权利要求2-11所述的工艺，其中预处理被重复至少两次，优选地多于两次，优选地通过使用碱或碱性过氧化氢预处理，优选地通过重复使用所述提取液。
19.根据权利要求2-11所述的工艺，其中含有水溶性阿拉伯木聚糖的提取液通过沉淀纯化，优选地用钙盐，优选地通过氢氧化钙和/或氯化钙，其中钙盐沉淀和过滤或沉淀后的水溶性阿拉伯木聚糖的纯度为至少50％，优选地至少60％，优选地至少70％，优选地至少77％，优选地至少80％，优选地至少85％，优选地至少90％，优选地至少95％，优选地至多99％。
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