CN108289913A - 从未致敏t细胞群体产生hpv抗原特异性t细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于产生识别人乳头瘤病毒或HPV抗原的抗原特异性T细胞的安全、快速且有效的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月30日提交的美国临时申请号62/248,818的优先权，所述临时申请以引用的方式并入。本申请涉及2016年3月21日提交的标题为“Generating virusor other antigen-specific cells for aT cell population”的PCT/US2016/23413，其要求2015年3月20日提交的美国临时申请号62/135,851和62/135,888的优先权；并且涉及2014年10月28日提交的标题为“Expansion of CMV-Specific T cells fromCMV-Seronegative Donors”的PCT/US2014/62698，其要求2013年10月28日提交的美国临时申请号61/896,296的优先权。所有以上文件以引用的方式并入。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
这项研究部分由来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所的基金资助，基金号：授予Catherine M.Bollard和Elizabeth J.Shpall的NCI PO1CA148600-02。
发明背景
发明领域
本发明涉及人乳头瘤病毒或HPV抗原特异性T细胞和用于从健康或未致敏供体的T细胞产生所述HPV抗原特异性T细胞的方法以及使用这些HPV特异性T细胞治疗由人乳头瘤病毒引起或与人乳头瘤病毒相关的疾病、病症或病状的基于细胞的疗法。
现有技术描述
一些目前基于T细胞的免疫疗法使用从含有T细胞和前体T细胞的样品扩增的病毒和肿瘤特异性T细胞。已显示病毒特异性T细胞在干细胞移植后针对病毒感染是有效的。使用病毒特异性T细胞群体的基于T细胞的细胞疗法可提供保护免受病毒感染的细胞并且与比抗病毒药物更少的副作用相关。1.使用扩增的病毒特异性群体的基于T细胞的疗法具有针对表达病毒的恶性肿瘤的活性2，3并且诱导清除循环白血病母细胞的移植物抗白血病作用。4
由于记忆细胞群体的产生，这些免疫疗法具有提供终身保护的优点。3来自具有记忆T细胞的样本的细胞容易离体扩增，因为所述细胞所来源的供体先前曾遇到过这些病原体，且因此存在迅速离体扩增的现有记忆病毒特异性T细胞。5更重要的是，研究表明，单一HLA匹配足以介导这些T细胞的治疗功效，具有最小副作用。因此，可产生并维持第三方细胞库，以获得此类产品的现成使用。
不幸的是，对于某些病毒感染和病毒相关肿瘤，并非所有这些细胞的潜在来源先前已经暴露于病原体。一个重要的例子是HPV，其在免疫受损的宿主中引起HPV感染6-8和HPV相关的恶性肿瘤，如宫颈癌。9-14在美国，9种HPV类型中的任一种的血清阳性率限于对于女性大约40％且对于男性大约20％。15大多数供体因此对HPV抗原未致敏。由于缺乏记忆T细胞，这对从这些样品中扩增HPV识别T细胞施加了障碍。
从这些未致敏细胞群体(如来自未暴露的/血清反应阴性的健康供体的未致敏T细胞或来自脐带血的T细胞)中扩增抗原特异性T细胞是困难的，因为这些T细胞从未在体内被抗原引发。此类群体缺乏可容易扩增的抗原特异性记忆T细胞。在其他情况下，用于从未致敏供体扩增此类抗原特异性T细胞的所提出的方法目前使用病毒、病毒感染的细胞或病毒转化的细胞。16,17
涉及使用病毒来产生用于治疗用途的抗原特异性T细胞的方法是不希望的，因为它们与临床风险增加和显著监管障碍相关。正是由于这个原因，呈肽形式的抗原已被用于扩增抗原特异性T细胞。18
这些基于肽的方法朝向从未致敏供体产生HPV特异性T细胞的应用遇到了非常有限的成功。12
产生对HPV具有特异性的T细胞的大多数成功尝试使用了来自先前已暴露于HPV抗原的患者的自体细胞。在一项这种研究中，虽然观察到超过1,200倍扩增，但这大部分限于8/156名宫颈癌患者和33/52名口咽癌患者以及仅1/20名健康供体，其中有反应的供体据信先前曾暴露于HPV抗原。12
对于第三方库应用，不管先前暴露于HPV抗原，从健康供体生成HPV特异性T细胞是至关重要的。
发明简述
根据本发明的方法有利地允许HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞的迅速和稳健扩增，提供识别靶向机会性HPV感染和HPV相关的恶性肿瘤的治疗上重要的抗原的T细胞，并且不需要使用活病毒或病毒转化的细胞。在此，本发明人描述了一种以临床上适用的方式制造这些细胞以用作供体来源的和现成的产品的新方式。本发明人利用他们在离体产生来自未致敏细胞来源的T细胞应答方面的经验来制造HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞。基于HPV的免疫学性质，本发明人修改了产生抗原呈递树突细胞的方法，修改了用于扩增T细胞的细胞因子的浓度，并且使用了人工APC来帮助扩增T细胞数量。
在其一个实施方案中，本发明提供一种用于产生HPV抗原特异性T细胞(或HPV抗原识别T细胞)的稳健方法。所产生的HPV识别T细胞可识别HPV抗原的单个表位、单一HPV抗原的多个表位或可识别不同HPV抗原上的表位。所述方法使用脉冲到不同抗原呈递细胞如树突细胞、单核细胞、K562细胞、人工抗原呈递细胞、PHA母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞和CD3-28母细胞上的HPV抗原的重叠肽文库，不同的引发和扩增细胞因子(包括但不限于IL2、IL7、IL15)和不同的选择方法(CD45RO缺失等)。16，17也可使用其他人工或替代抗原呈递细胞。由本发明产生的抗原特异性T细胞可用于治疗移植后病毒感染和肿瘤复发。这些抗原特异性T细胞及其前体可有利地储备入库(banked)或储存用于稍后施用至需要针对特定病原体或肿瘤病状的T细胞免疫的受试者。
本发明包括一种从健康供体的免疫系统特异性地产生HPV抗原特异性T细胞的方法，所述供体中的大多数将是HPV血清反应阴性的并且因此具有未感染病毒的T细胞群体。本发明是一种方法及其目的在于预防移植后以及在HPV可能有问题的其他免疫受损的环境和情况(如HPV相关的恶性肿瘤)下的病毒感染。本发明以之前从未从未致敏T细胞进行的临床上相关的方式从未致敏T细胞制备多HPV-抗原特异性T细胞。
因为本发明本身是一种方法和用途，所以它可容易地应用于从未致敏群体产生针对其他机会性病毒(如但不限于HHV6和BK病毒)的抗原特异性应答。它可扩展至包括来自与恶性肿瘤相关的疾病(如但不限于EBV和HIV)的病毒特异性抗原。它可与其他细胞产物、淋巴细胞清除方案和表观遗传修饰药物组合。其他医疗用途包括在移植前促进植入并为免疫缺陷患者提供治疗。
本发明使用脉冲到潜在不同的抗原呈递细胞(树突细胞、单核细胞、K562细胞、PHA母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞和CD3-28母细胞)上的不同重叠肽文库、不同的引发和扩增细胞因子(包括但不限于IL2、IL7、IL15)和不同的选择方法(CD45RO缺失等)来产生HPV特异性T细胞。也可使用其他人工或替代抗原呈递细胞。本发明人还描述了一种由未致敏T细胞制造的所述细胞的第三方库，以及为供体选择最佳匹配的方法。
本发明的方法安全、简单、快速且可重复，并且可用于根据用于各种不同患者的优质生产规范(GMP)产生HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞。
附图描述
图1.使用本文公开的方法从健康供体(n＝5)产生识别HPV的T细胞。与无关抗原(自身蛋白肌动蛋白)相比，所述T细胞特异性地识别HPV抗原E6和E7。示出来自单独细胞(CTL)的背景应答。这表明本发明的方法从健康供体产生HPV特异性T细胞。
图2.识别HPV的T细胞(n＝5)可在三次刺激后扩增至临床上相关的数量。这表明本发明能够稳健地制造用于临床或其他用途的HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞。
图3.识别HPV的T细胞(n＝5)具有混合表型(CD4和CD8)，其已显示促进来自T细胞输注的更好应答。细胞还表达共刺激受体CD27和CD28。
优选实施方案的详述
“辅助细胞”是为T细胞识别肽抗原提供共刺激或者以其他方式辅助T细胞识别、在肽抗原存在下变得引发或扩增的细胞，如K562细胞。辅助细胞也可以是其他人工或替代抗原呈递细胞。
“活化的T细胞”或“ATC”是通过将脐带血或含有未致敏免疫细胞的另一种样品中的单核细胞暴露于有丝分裂原如植物凝集素(PHA)和/或白细胞介素(IL)-2而获得。
“抗原”包括由免疫系统、如由免疫系统的细胞或体液臂识别的分子，如多肽、肽或糖肽或脂肽。术语“抗原”包括抗原决定簇，如长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更多个氨基酸残基的肽，所述肽与MHC分子结合、形成MHC I类或II类复合物的部分或当与抗原呈递分子复合时被识别。
T细胞抗原/表位：由T细胞识别并且触发T细胞中的免疫应答的抗原或表位(例如经由结合至主要组织相容性复合物分子(MHC)的抗原或其一部分的呈递而被T细胞上的T细胞受体特异性地识别的抗原)。T细胞抗原通常是蛋白质类或肽类。此术语包括由α-βT细胞或γ-δT细胞识别的肽抗原，以及脂质、热休克蛋白或其他可被γ-δT细胞识别的应激诱导的抗原。T细胞抗原可以是刺激CD8+T细胞应答、CD4+T细胞应答、γδT细胞应答或刺激这些应答的组合的抗原。
“抗原呈递细胞(APC)”是指一类能够呈递一种或多种呈可被免疫系统的特定效应细胞识别的肽-MHC复合物形式的抗原且由此诱导针对所呈递的一种或多种抗原的有效细胞免疫应答的细胞。专门APC的实例是树突细胞和巨噬细胞，但是任何表达MHC I类或II类分子的细胞都可潜在呈递肽抗原。
“对照”是为了与测试样品或测试受试者比较而使用的参考样品或受试者。阳性对照测量期望应答，并且阴性对照为样品提供预期无应答或背景应答的参考点。
“脐带血”在本领域中具有其通常含义，并且是指出生后留在胎盘和脐带中并含有造血干细胞的血液。脐带血可以是新鲜的、低温保存的或从脐带血库获得的。
术语“细胞因子”具有其在本领域中的通常含义。用于本发明的细胞因子的实例包括IL-2、IL-7和IL-15。
术语“树突细胞”或“DC”描述了在各种淋巴组织和非淋巴组织中发现的形态上相似的细胞类型的多样性群体，参见Steinman,Ann.Rev.Immunol.9:271-296(1991)。19本发明的一些实施方案涉及源自脐带血的树突细胞和树突细胞前体。
术语“效应细胞”描述了可结合至或以其他方式识别抗原并介导免疫应答的细胞。抗原特异性T细胞是效应细胞。
“人乳头瘤病毒”是感染人的乳头瘤病毒家族中的DNA病毒。至少170种亚型是已知的，其中许多是通过性接触传播的。类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82是致癌的“高风险”性传播的HPV并且可导致宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)、阴茎上皮内瘤样病变(PIN)和/或肛门上皮内瘤样病变(AIN)。6,8,20-22
HPV与普通疣相关-HPV 2型和4型(最常见)；还有类型1、3、26、29和57等。癌症和生殖器发育不良-“高风险”HPV类型与癌症相关，特别是宫颈癌，并且还可导致一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和一些口咽癌。“低风险”类型与疣或其他病状相关。高风险：16、18(引起最多的宫颈癌)；还有31、33、35、39、45、52、58、59等。跖疣(蚁冢状疣)–HPV 1型(最常见)；还有类型2、3、4、27、28和58等。肛门生殖器疣(尖锐湿疣或性病湿疣)–HPV 6型和11型(最常见)；还有类型42、44和其他。低风险：6、11(最常见)；还有13、44、40、43、42、54、61、72、81、89和其他。扁平疣-HPV 3型、10型和28型。屠夫疣–HPV 7型。赫克病(局灶性上皮增生)–HPV 13型和32型。6，8，20-22
“浸润淋巴细胞”是已经进入特定生物隔室或组织、粘膜层(例如，上皮、固有层)或皮层(例如，角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层和真皮)中的淋巴细胞。这些包括浸润瘤、肿瘤或癌症(包括宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、口咽癌、外阴癌或阴道癌)的那些。它包括已经浸润了乳头状瘤(包括鳞状细胞乳头状瘤、内翻性乳头状瘤、尿路上皮乳头状瘤、乳腺导管内乳头状瘤)或疣(如足底或生殖器疣)的淋巴细胞。可选择由浸润淋巴细胞识别的抗原以诱导对特定组织中的HPV相关病状具有特异性的T细胞。
术语“分离的”是指从通常与物质相关的组分中分离出来，例如，分离的脐带血单核细胞可以是与红细胞、血浆和/或脐带血的其他组分分离的细胞。
“粘膜(Mucosa)”或粘膜(mucous membranes)具有其常规解剖和生理意义。这些包括眼粘膜、鼻粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、支气管粘膜和声带衬里、食管粘膜、胃粘膜、肠粘膜、肛门粘膜、阴茎粘膜和阴道粘膜以及子宫内膜(其是子宫的粘膜)。粘膜易受HPV感染。
“未致敏”T细胞或其他免疫效应细胞是未暴露于抗原或呈递能够活化所述细胞的肽抗原的抗原呈递细胞的细胞。
本申请含义内的“肽文库”或“重叠肽文库”是肽的复杂混合物，其总体上涵盖蛋白质抗原的部分或完整序列，特别是机会性病毒的部分或完整序列。所述混合物内的连续肽彼此重叠，例如，肽文库可由长度为15个氨基酸的肽构成，所述肽与文库中的相邻肽重叠11个氨基酸残基并且可跨越蛋白质抗原的整个长度或选择抗原的部分。肽文库是可商购的并且可针对特定抗原定制。用于接触、脉冲或负载抗原呈递细胞的方法是众所周知的并且通过参考Ngo，等人(2014)而并入。23
术语“前体细胞”是指可分化、成熟或以其他方式转化成另一种细胞的细胞。例如，“T细胞前体细胞”可分化成T细胞，并且“树突状前体细胞”可分化成树突细胞。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于人、猿、马、牛、猪、犬、猫、鼠、其他农场动物、运动动物或宠物。受试者包括需要抗原特异性T细胞的那些受试者，如患有淋巴细胞减少症的受试者、经历免疫系统消融的受试者、正在进行移植和/或免疫抑制方案的受试者、具有未致敏或发育中免疫系统的受试者(如新生儿)或正在进行脐带血或干细胞移植的受试者。
HPV16 E6/E7特异性T细胞的产生
从JPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)购买HPV16-E6(蛋白质IDP03126)和HPV16-E7(P03129)的重叠肽文库(重叠11个氨基酸的15聚体)。将肽在二甲亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中复原。
使用MACS珠粒(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)通过CD14选择从PBMC中分离单核细胞并在DC培养基[CellGenix培养基(CellGenix GmbH,Freiburg,Germany)和1％丙氨酰-谷氨酰胺(GlutaMAX；Gibco Life Technologies,Grand Island,NY)]中在24孔板(1x106个细胞/孔)中与800U/mL粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(R&D Systems,Minneapolis,MN)和1000U/mL IL-4(R&D Systems)一起培养。
将DC在第3天用GM-CSF和IL-4喂养。在第5天的早上，从所述孔中取出1ml培养基，并将1μL肽混合物(E6和E7)添加至每个孔中。在第5天的下午至少一个小时后，通过每孔添加1mL DC培养基与以下这些最终浓度的细胞因子来使DC成熟：100ng/mL IL-6(R&DSystems)、10ng/mL IL-1β(R&D Systems)、10ng/mL TNFα(R&D Systems)、1μg/mL地诺前列酮E2(R&D Systems)、800U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4以及30ng/mL LPS。
在第7天，收获DC并以1x105个细胞/mL重新悬浮于CTL培养基[45％克里克培养基(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)、45％RPMI-1640(HyClone,Logan,UT)、10％人AB血清(Gemini BioProducts,West Sacramento,CA)以及1％GlutaMAX]中。将CD14阴性PBMC解冻并以1x106个细胞/mL重新悬浮于CTL培养基中。在具有10ng/mL IL-6、10ng/mL IL-7(R&DSystems)、10ng/mL IL-12(R&D Systems)和10ng/mL IL-15(R&D Systems)的CTL培养基中以1:10比率(DC:CD14-)用负载肽的DC刺激细胞。
在第一次刺激后9至12天，收获T细胞，计数并在CTL培养基中以1x106个细胞/mL的浓度(1x106个细胞/mL24孔板的每孔)用新制备的负载肽的DC和IL-7以及IL-15(或可替代地用IL-7、IL-12和IL-15，或IL-6、IL-7、IL-12和IL-15)再次刺激。必要时用IL-2(R&DSystems)补充细胞培养物。
在第二次刺激7天后，收获T细胞，计数，以2.5x105/mL重新悬浮，并用新制备的负载肽的DC和IL-2以及IL-15第三次刺激。必要时用交替的IL-2或IL15(R&D Systems)补充细胞培养物。或者，给予细胞以上提及的其他抗原呈递细胞–也负载有肽。
如图1-3所示评价通过这种方法产生的HPV特异性T细胞。这些图显示，本文公开的方法从获自未感染HPV的健康供体获得的细胞产生识别HPV E6和E7抗原的T细胞。这些细胞可如本文所述进行扩增并表现出具有混合表型(CD4和CD8)的细胞表面标志物。已显示混合表型可促进来自T细胞输注的更好应答。细胞还表达共刺激受体CD27和CD28。
混合的CD4+CD8+细胞表面标志物的表达一直与诱导针对感染性病原体(如多次、潜伏和高水平持续病毒感染的那些)的获得性免疫应答相关。CD4+CD8+T细胞扩展了参与抗病毒免疫应答的T细胞群体的感知；Nacimbene,等人,Blood 2004 104:478-486。本文描述的方法产生识别HPV的大量混合的CD4+CD8+T细胞，并且可潜在充当抗HPV免疫性的比具有其他细胞表面表型的T细胞更优异的效应子。
CD4+、CD45RO+和CD27+T细胞标志物的表达与HPV持续性降低和对HPV感染的抗性相关；Rodriguez,等人,Int J Cancer2011年2月1日；128(3):597–607。通过本文公开的方法产生的HPV特异性T细胞可潜在地用于保护具有或处于获得持续HPV感染风险的受试者。这些处于风险中的受试者包括吸烟者、吸烟者或咀嚼烟草的使用者、口腔卫生不佳者(其处于口咽癌的增加的风险)、免疫系统减弱者(包括疾病如HIV)、服用免疫抑制药物或方案者(如癌症患者或接受输血或组织移植的受试者)以及处于较高宫颈癌风险的患者(包括有多个子女的妇女、使用(特别是长期使用)口服避孕药的妇女)。患有以慢性炎症为特征的疾病、病症或病状的受试者或年老个体(例如，处于或在50、60、70或80岁以上)与正常受试者相比也具有持续HPV感染的较高风险。
由本文所公开的方法产生的T细胞还包含高频率或水平的共刺激受体CD27和CD28，如图3中所示。
表达CD27的T细胞可经由CD27共刺激。已知病毒调节CD27的表达作为逃避宿主免疫系统的手段。表达CD27的T细胞的产生为这些细胞在急性或持续性病毒感染期间诱导病毒特异性免疫提供了手段，Welten,等人,J Virol.2013年6月；87(12):6851-65。本文公开的方法产生大量识别为CD27+的HPV抗原并将能够经由CD27共刺激的T细胞。T细胞持久性通过CD27共刺激促进并且可提供受试者(如感染HPV或具有持续性HPV感染的受试者)的过继免疫疗法的临床功效。负责体内CD27介导的人T细胞存活的机制可包括抗凋亡分子的上调、的CD4帮助和CD8+T细胞在体内产生自分泌IL-2；；Song,等人,Oncoimmunology,2012年7月1日；1(4):547–549。
表达CD28的T细胞可在抗病毒T细胞应答的效应期期间经由CD28共刺激。不表达CD28或其中CD28受体被阻断的T细胞表现出对病毒的应答降低并导致凋亡增加和病毒清除减少；Dolfi,等人,J Immunol.2011年4月15日；186(8):4599-608。本文公开的方法产生大量识别为CD28+的HPV抗原并将能够经由CD28共刺激的T细胞。
根据本发明的方法范围广泛。例如，它可用于预防与异基因干细胞移植后HPV相关的疾病，或它可用于预防HPV恶性肿瘤如宫颈癌的复发。现在进一步描述本发明的具体非限制性实施方案。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于产生HPV抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括(a)将来自含有未致敏免疫细胞的任何细胞来源的单核细胞分成若干部分；(b)用PHA或另一种有丝分裂原和IL-2刺激所述样品的一部分以产生在后续刺激过程中起抗原呈递功能的ATC活化的T细胞(“ATC”)，并且任选地用放射或另一种试剂处理所述ATC以抑制它们的过生长；(c)使T细胞和T细胞前体细胞(例如，非贴壁细胞，CD3+细胞，CD14-细胞)与树突细胞和树突状前体细胞(例如，贴壁细胞，CD11C+或CD14+细胞)分离；(d)低温保存或以其他方式保存所述T细胞和T细胞前体细胞；(e)用产生树突细胞并使树突细胞成熟的细胞因子或其他试剂和至少一种HPV肽抗原或HPV抗原混合物使第二部分中的树突细胞和树突状前体细胞分化以产生呈递至少一种HPV肽抗原的抗原呈递树突细胞，并且任选地用辐射或足以抑制其过生长的另一种试剂处理所述抗原呈递树突细胞；(f)在IL-6、IL-7、IL-12和IL-15的任何组合或全部存在下用在(e)中产生的树突状抗原呈递细胞刺激来自(d)的低温保存或以其他方式保存的T细胞和T细胞前体细胞以产生识别所述至少一种HPV肽抗原的抗原特异性T细胞；(g)在所述至少一种HPV肽抗原存在下，任选地在潜在人工或替代抗原呈递细胞或其他辅助细胞存在下在IL-2和/或IL-15存在下用(b)的ATC刺激通过(f)产生的抗原特异性T细胞；任选地，重复(g)一次或多次；以及(h)回收识别至少一种肽抗原的抗原特异性T细胞。
识别HPV抗原的T细胞可基于细胞表面标志物进一步分离或纯化。T细胞表型包括具有以下标志物中的一种或多种的细胞：CD4+、CD8+、CD4+/CD25+、CD45RO+、CD27+、CD28+和/或PD1。T细胞表型包括CD4+CD8+；CD27+CD28+以及CD4+、CD45RO+和CD27+。可使用本领域中已知的方法从所需的HPV识别T细胞中除去或分离具有不希望的表型的细胞。
在根据本发明的方法中，不必要使用存活病毒来产生识别HPV抗原的T细胞。在上述实施例中，未使用HPV或任何活病毒的菌株来产生任何T细胞。所述抗原来自JPT：使用了E6和E7抗原。尽管如此，本文所述的方法可用来自其他来源的HPV抗原实施，所述来源如病毒感染的细胞溶解产物、完整病毒蛋白质以及编码HPV抗原的质粒或DNA序列或病毒载体。
如上述实施方案中所述的方法还可包括在(a)之前分离含有未致敏T细胞的单核细胞。在这种方法中使用的单核细胞可从脐带血、干细胞或其他来源的对HPV抗原未致敏或对特定HPV株或特定HPV抗原未致敏的细胞获得。因此，在这种方法中使用的单核细胞可从对至少一种HPV肽抗原未致敏的造血干细胞获得；或从含有来自其免疫系统对至少一种HPV肽抗原未致敏的受试者的干细胞、前体T细胞或T细胞的样品获得。
根据本发明的方法可包括(b)用PHA和IL-2刺激所述样品的第一部分以产生活化的T细胞(“ATC”)。这些ATC可低温保存或以其他方式储备入库以供以后使用或可立即使用。优选地，所述ATC被新鲜使用并与(f)中产生的抗原特异性T细胞混合，而不需要低温保存ATC或抗原特异性T细胞。例如，在(b)中制备的PHA母细胞可在所述方法开始后14-16天使用，以对(f)中产生的抗原特异性T细胞提供第二次刺激。
虽然本领域技术人员可选择用于根据本发明的方法中的合适数量的细胞，但这种方法可包括在(b)中用PHA和IL-2刺激约1至200万、优选5至1500万、最优选约8至1200万个单核脐带血细胞。本领域技术人员可根据需要调整细胞数量或其他工艺条件以按比例放大或按比例缩小产生识别HPV肽抗原的T细胞的方法。在根据本发明的方法中，(b)可包括产生T-母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞或CD3-CD28母细胞而不是PHA母细胞作为活化的T细胞。
这种方法可使用通过以下方式与树突细胞和树突状前体细胞分离的T细胞和/或T细胞前体细胞：在足以使第二部分中的细胞粘附至细胞培养板或装置的条件下经由塑料粘附培养所述第二部分，且然后从所述细胞培养板或装置中除去T细胞和T细胞前体细胞，并回收附着于固体培养基的树突细胞和树突状前体细胞。或者，可通过使用特异性地识别每个群体的抗体、通过基于CD14的选择(例如，使用MAC珠粒)或通过其他已知的细胞分选方法来磁性地分离这两个细胞群体。可将分离的细胞群体低温保存或以其他方式储备入库以供以后使用或可立即用于产生T细胞或树突细胞。这些群体也可在本文所述的后续处理步骤后低温保存或以其他方式储备入库，所述后续处理步骤产生负载有肽抗原或抗原特异性T细胞的成熟树突细胞。
在本发明的方法中，在(e)中，树突细胞和树突状前体细胞可在树突细胞的分化和维持所需的细胞因子(包括但不限于IL-4和GM-CSF)存在下生长；并且在(e)中，可使树突细胞和树突状前体细胞经历用树突细胞成熟细胞因子或试剂成熟，所述细胞因子或试剂选自由(但不限于)以下中的一种或多种组成的组：LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE-1、PGE-2和其他免疫佐剂(例如寡核苷酸)以及IL-4和GM-CSF。
在本发明的一些实施方案中，在(f)中或之前，可处理T细胞或T细胞前体细胞以扩增CD45RA阳性细胞；或在(f)中或之前，可处理T细胞和T细胞前体以消减CD45RO阳性细胞。可处理具有特定标志物的其他T细胞以扩增或消减具有特定细胞表面表型(如本文所述的那些表型中的任一种)的HPV识别T细胞。
在根据本发明的方法中，所述至少一种抗原可包含跨越整个HPV蛋白或HPV抗原的一系列重叠肽。在一些实施方案中，可选择抗原特异性T细胞以识别机会性HPV的至少一种抗原，所述机会性HPV是医院内或医源性获得的或者传播至医院中的受试者(例如医院内获得性感染)或通过特定发明模式，如通过与粘膜、皮肤直接接触或通过性接触获得。所述至少一种肽抗原可包含HPV抗原或肽文库，如HPV E1-E5抗原或肽文库；HPV E6或E7抗原或肽文库；HPV L1或L2抗原或肽文库；或其混合物。
所述至少一种肽抗原可以是由从感染HPV的部位、组织或细胞分离的T细胞识别的肽抗原。
本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其包含通过根据本发明的方法产生的抗原特异性T细胞。此类抗原特异性T细胞可识别1种、2种、3种、4种、5种或更多种HPV株、血清型、抗原或表位。这种组合物可包含从不同细胞来源分离的单核细胞，所述细胞来源优选主要包括但不限于含有未致敏免疫细胞的样品；源自这些相同来源的抗原呈递细胞，如树突细胞、PHA母细胞(其中含有PHA或另一种有丝分裂原)；IL-2以及维持所述细胞的活力的培养基；以及任选地共刺激T细胞的K562细胞或其他非自体细胞，包括人工或替代抗原呈递细胞，其中任选地，所述细胞已进行处理以防止过生长。
在另一个实施方案中，所述组合物可包含已与树突细胞和树突状前体细胞(例如，贴壁细胞，CD11C+或CD14+细胞)分离并且对HPV肽抗原未致敏的T细胞和T细胞前体细胞(例如，非贴壁细胞，CD3+细胞，CD14-细胞)；在培养期中的各个点的细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种；以及维持所述T细胞和T细胞前体细胞的活力的培养基。
本发明的其他实施方案包括一种库或细胞储存设施，所述库或细胞储存设施包括通过实施方案1的方法产生的识别HPV肽抗原的T细胞的一种或多种样品与储存或冷冻培养基的组合；其中所述一种或多种样品任选地通过描述其来源的信息(包括全部或部分DNA序列信息)、描述其组织相容性的信息(包括主要和/或次要组织相容性抗原或标志物)和/或关于它所含有或识别的肽抗原的信息而相联系、鉴定或索引。这种抗原特异性T细胞库可包括通过实施方案1的方法产生的冷冻或其他方式保存的存活HPV抗原特异性T细胞的多个样品。
本发明的另一个实施方案构成一种试剂盒，所述试剂盒包括已与树突细胞和树突状前体细胞(例如，贴壁细胞，CD11C+或CD11+细胞)分离并且对HPV肽抗原未致敏的T细胞和T细胞前体细胞(例如，非贴壁细胞，CD3+细胞，CD14-细胞)；细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种；维持所述T细胞和T细胞前体细胞的活力的培养基；已与所述T细胞和T细胞前体细胞分离的树突细胞或树突状前体细胞；维持所述树突细胞或树突状前体细胞的活力的培养基；共刺激T细胞的K562细胞、人工或替代抗原呈递细胞、其他非自体细胞，所述细胞任选地经处理以预防过生长；以及至少一种HPV肽抗原或HPV肽混合物。
前述描述公开了特定实施方案。如本领域技术人员将理解的，本文公开的途径、方法、技术、材料、装置等可在如本领域技术人员所理解的另外实施方案中体现，本申请的意图是涵盖并包括这种变化。因此，这种描述是说明性的并且不应被视为限制以下权利要求的范围。本文中的引用以引用的方式并入，尤其是出于具体地描述所引用的主题或在相同或相邻段落或章节中的主题的目的。
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Claims (30)
1.一种用于产生HPV抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括：
(a)将来自含有未致敏免疫细胞的任何细胞来源的单核细胞分成若干部分；
(b)用PHA或另一种有丝分裂原和IL-2刺激所述样品的第一部分以产生在后续刺激过程中起抗原呈递功能的ATC活化的T细胞(“ATC”)，并任选地用放射或另一种试剂处理所述ATC以抑制其过生长；
(c)使T细胞和T细胞前体细胞与树突细胞和树突状前体细胞分离；
(d)低温保存或以其他方式保存所述T细胞和T细胞前体细胞；
(e)用产生树突细胞并使树突细胞成熟的细胞因子或其他试剂和至少一种HPV肽抗原或HPV抗原混合物使第二部分中的树突细胞和树突状前体细胞分化以产生呈递至少一种HPV肽抗原的抗原呈递树突细胞，并且任选地用辐射或足以抑制其过生长的另一种试剂处理所述抗原呈递树突细胞；
(f)在IL-7和IL-15存在下用在(e)中产生的所述树突状抗原呈递细胞刺激来自(d)的所述低温保存或以其他方式保存的T细胞和T细胞前体细胞以产生识别所述至少一种HPV肽抗原的抗原特异性T细胞；
(g)在所述至少一种HPV肽抗原存在下，任选地在K562细胞或其他辅助细胞存在下在IL-2和/或IL-15存在下用(b)的所述ATC刺激通过(f)产生的抗原特异性T细胞；任选地，重复(g)一次或多次；以及
(h)回收识别至少一种肽抗原的抗原特异性T细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括在(a)之前分离含有未致敏T细胞的单核细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞从脐带血获得。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞从对所述至少一种HPV肽抗原未致敏的造血干细胞获得。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞从含有来自其免疫系统对所述至少一种HPV肽抗原未致敏的受试者的干细胞、前体T细胞或T细胞的样品获得。
6.如权利要求1所述的方法，其中(b)包括用PHA和IL-2刺激所述样品的第一部分以产生活化的T细胞(“ATC”)。
7.如权利要求1所述的方法，其包括在(b)中用PHA和IL-2刺激约1至200万个、优选5至1500万个、最优选约8至1200万个单核脐带血细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其中(b)包括产生T-母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞或CD3-CD28母细胞而不是PHA母细胞作为活化的T细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中通过以下方式使T细胞和/或T细胞前体细胞与树突细胞和树突状前体细胞分离：在足以使所述第二部分中的细胞粘附至细胞培养板或装置的条件下经由塑料粘附培养所述第二部分，且然后从所述细胞培养板或装置中除去T细胞和T细胞前体细胞，并回收附着于固体培养基的所述树突细胞和树突状前体细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中在(e)中，所述树突细胞和树突状前体细胞在树突细胞的分化和维持所需的细胞因子存在下生长，所述细胞因子包括但不限于IL-4和GM-CSF。
11.如权利要求1所述的方法，其中在(e)中，使所述树突细胞和树突状前体细胞经历用树突细胞成熟细胞因子或试剂成熟，所述细胞因子或试剂选自由以下中的一种或多种组成的组：LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE-1、PGE-2和其他免疫佐剂以及IL-4和GM-CSF。
12.如权利要求1所述的方法，其中在(f)中或之前，处理所述T细胞或T细胞前体细胞以扩增CD45RA阳性细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其中在(f)中或之前，处理T细胞和T细胞前体以消减CD45RO阳性细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗原包含跨越整个HPV蛋白或抗原的一系列重叠肽。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞识别机会性HPV的至少一种抗原，所述机会性HPV是医院内或医源性获得的或者传播至医院中的受试者或是医院内获得性感染。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种肽抗原包含HPV抗原或肽文库。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种肽抗原包含HPV E1-E5抗原或肽文库。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种肽抗原包含HPV E6或E7抗原或肽文库。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种肽抗原包含HPV L1或L2抗原或肽文库。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种肽抗原是由从感染HPV的部位、组织或细胞分离的T细胞识别的肽抗原。
21.一种组合物，其包含通过如权利要求1所述的方法产生的抗原特异性T细胞。
22.一种组合物，其包含从不同细胞来源分离的单核细胞、源自这些相同来源的抗原呈递细胞和维持所述细胞的活力的培养基，以及任选地共刺激T细胞的K562细胞或其他非自体细胞，其中，任选地，所述细胞已进行处理以防止过生长。
23.一种组合物，包含：
i.T细胞和T细胞前体细胞，所述T细胞和T细胞前体细胞已与树突细胞和树突状前体细胞分离并且对HPV肽抗原未致敏，
ii.在培养期中的各个点的细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种，以及
iii.维持所述T细胞和T细胞前体细胞的活力的培养基。
24.一种T细胞，其通过根据权利要求1所述的方法产生，所述T细胞识别至少HPV表位并且具有细胞表面表型CD4+CD8+。
25.一种T细胞，其通过根据权利要求1所述的方法产生，所述T细胞识别至少HPV表位并且具有细胞表面表型CD4+、CD45RO+和CD27+。
26.一种T细胞，其通过根据权利要求1所述的方法产生，所述T细胞识别至少HPV表位并且具有细胞表面表型CD27+和CD28+。
27.一种通过根据权利要求1所述的方法产生的T细胞的用途，其用于预防或治疗HPV感染。
28.一种库或细胞储存设施，其包括通过如权利要求1所述的方法产生的识别HPV肽抗原的T细胞的一种或多种样品与储存或冷冻介质的组合；其中所述一种或多种样品任选地通过描述其来源的信息，包括全部或部分DNA序列信息；描述其组织相容性，包括主要和/或次要组织相容性抗原或标志物的信息；和/或关于它所含有或识别的肽抗原的信息而相关联、鉴定或索引。
29.一种抗原特异性T细胞库，其包括通过如权利要求1所述的方法产生的低温或其他方式保存的存活HPV抗原特异性T细胞的多种样品。
30.一种试剂盒，其包括：
i.T细胞和T细胞前体细胞，所述T细胞和T细胞前体细胞已与树突细胞和树突状前体细胞分离并且对HPV肽抗原未致敏，
ii.细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15中的至少一种，
iii.维持所述T细胞和T细胞前体细胞的活力的培养基；
iv.已与所述T细胞和T细胞前体细胞分离的树突细胞或树突状前体细胞，
v.维持所述树突细胞或树突状前体细胞的活力的培养基；
vi.共刺激T细胞的K562细胞或其他非自体细胞，所述细胞任选地经处理以防止过生长，以及
vii.至少一种HPV肽抗原或HPV肽混合物。
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| MARCUS O.BUTLER ET AL: "A panel of human cell-based artificial APC enables the expansion of long-lived antigen-specific CD4+ T cells restricted by prevalent HLA-DR alleles", 《INTERNATIONAL IMMUNOLOGY》 * |
| PATRICK J. HANLEY ET AL: "CMV-specific T cells generated from naïve T cells recognize atypical epitopes and may be protective in vivo", 《IMMUNOTHERAPY》 * |
| PATRICK J. HANLEY ET AL: "Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes", 《BLOOD》 * |
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