CN108265071A - 一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法。本发明利用除去信号肽的麦芽糖结合蛋白ΔMBP作为N端亲水性标签，利用截短的人类载脂蛋白ApoAI*作为C端两亲性标签，利用C端His作为纯化和检测标签，构建pET28a‑ΔMBP‑AqpZ‑ApoAI*‑His重组载体。本发明实现了原为脂溶性的水通道蛋白的水溶化，在不需要借助去污剂的条件下，将其溶解在水相中，同时显著提高了水通道蛋白的表达量，适用于工业化生产。

Description

一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法。

背景技术

水通道蛋白作为一类重要的通道蛋白，对维持细胞内外渗透压平衡起着关键作用。了解其结构能够帮助研究者更好的阐明水通道蛋白的工作机制。由于水通道蛋白的低丰度，研究者很难得到足够量的样品以供后续分析；不仅如此，水通道蛋白有着很强的疏水性，因此必须借助去污剂将其从膜环境中溶解到水环境中，而去污剂的引入在一定程度上会改变水通道蛋白的天然构象，对分析造成困难。

文献《Applied Microbiology and Biotechnology March 2009,Volume 82,Issue 3,pp 463–470》报道了利用融合表达的方法提高水通道蛋白的表达量，但其方法得到的表达量并没有数量级上的提高，且仍然需要使用去污剂将水通道蛋白从膜环境中溶解到水环境中。《Biological Chemistry Volume 390,Issue 8(Aug 2009)》报道了利用纳米磷脂盘研究膜蛋白，解决了去污剂的问题。但使用纳米磷脂盘必须要脂质的参与，引入了一定程度的不确定性。因此，如何提高水通道蛋白表达量的同时，消除去污剂对后续分析的影响，仍然是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种可溶性水通道蛋白AqpZ可溶性融合载体，所述的载体利用除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白作为亲水性标签和利用截短的人类载脂蛋白包裹水通道蛋白AqpZ，不仅能够提高水通道蛋白的表达量，而且实现了水通道蛋白AqpZ的可溶性表达。

本发明的技术解决方案如下：

一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体，为利用PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔMBP，将ΔMBP整合到pET28a质粒中得到pET28a-ΔMBP载体；PCR扩增pET28a-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a-ΔMBP载体中得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增大肠杆菌基因组DNA，得到水通道蛋白AqpZ的cDNA即AqpZ，将AqpZ整合到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体中得到pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体。

本发明进一步提供上述可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤1，先将pMBP-p质粒进行PCR，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔMBP，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔMBP和pET28a质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔMBP载体；

步骤2，将pET28a-ApoAI质粒进行PCR，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a-ΔMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a本身所带的His标签，连接反应得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体；

步骤3，对大肠杆菌基因组DNA进行PCR反应，得到水通道蛋白AqpZ的cDNA即AqpZ，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对AqpZ和pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：

(1)利用PCR得到了除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白ΔMBP，得到了截短的人类载脂蛋白ApoAI*；

(2)得到的融合水通道蛋白产量与常规表达相比，提高了近20倍，为后续研究提供了充足的样品；

(3)融合表达的水通道蛋白有72.3％位于水相中，实现了水通道蛋白的可溶性表达，消除了去污剂对后续分析的影响，对结构学研究有着重要意义。

附图说明

图1为pMBP-p PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图2为构建完成的pET28a-ΔMBP质粒图谱。

图3为pET28a-ApoAI PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图4为构建完成的pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His质粒图谱。

图5为大肠杆菌基因组PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图6为构建完成的pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His质粒图谱。

图7为Anti-His Western Blot分析融合蛋白在不同组分中的分布情况图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例中所用材料如下：

1.细胞来源

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)细胞购自武汉灵淼生物公司。

pET28a购自MERK公司

2.质粒来源

pMBP-p质粒购自武汉灵淼生物公司；pET28a、pET28a-ApoAI质粒购自MERK公司。

3.引物来源

合成引物均来自上海生工生物有限公司

4.主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均购自Sigma公司；限制性核酸内切酶购自Thermo Fisher公司；rTaq酶、T4连接酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。兔源Anti-His mAb购自CST公司，兔抗HRP标记二抗购自Jackson公司；显影液及定影液购自Tanon公司。

实施例一

1、一种除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白载体pET28a-ΔMBP构建方法：

a)根据从武汉淼灵生物所购得的pMBP-p质粒，设计1对引物。引物上游的寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物下游的寡核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。以pMBP-p质粒为模板，经PCR反应，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA。PCR反应体系配置如表1所示。

表1 PCR反应体系配制表

PCR结果如图1所示。第一道为Marker，第二道为目的片段ΔMBPcDNA，目的片段长度为1032bp。

b)回收除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA，用NcoⅠ和NdeⅠ双酶切回收产物和pET28a载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA和pET28a载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NcoⅠ和NdeⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a-ΔMBP载体。构建得到的pET28a-ΔMBP质粒图谱如图2所示。

2、一种截短的人类载脂蛋白融合载体pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His构建方法：

a)根据购自MERK的pET28a-ApoAI质粒，设计1对引物。引物上游的寡核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物下游的寡核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。根据pET28a-ΔMBP质粒的多克隆位点特点，在pET28a-ApoAI的上游设计引入HindⅢ限制性核酸内切酶位点，下游设计引入NotⅠ限制性核酸内切酶位点。在ApoAI*末端无终止子的情况下，可引入pET28a本身所带的His标签。以原有pET28a-ApoAI载体为模板，经PCR反应，得到截短的人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA。PCR结果如图3所示，第一道为Marker，第二道为ApoAI*的cDNA，目的片段长度为636bp。

b)回收截短人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA，用HindⅢ和NotⅠ双酶切回收产物和pET28a-ΔMBP载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的截短人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA和pET28a-ΔMBP载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用HindⅢ和NotⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体，构建得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His质粒图谱如图4所示。

3、一种可溶性水通道蛋白AqpZ载体构建方法：

a)检索NCBI数据库得到大肠杆菌水通道蛋白AqpZ的基因序列，根据基因序列设计1对引物。引物上游的寡核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物下游的寡核苷酸序列如SEQID No.6所示。根据pET28a-ΔMBP-ApoAI*质粒的多克隆位点特点，在AqpZ上游设计引入NdeI限制性核酸内切酶位点，下游设计引入HindⅢ限制性核酸内切酶位点。以大肠杆菌基因组DNA为模板，经PCR反应得到AqpZ的cDNA。PCR结果如图5所示，第一道为Marker，第二道为AqpZ的cDNA，目的片段长度为696bp。

b)回收AqpZ的cDNA，用NdeⅠ和HindⅢ双酶切回收产物和pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的AqpZ的cDNA和pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NdeⅠ和HindⅢ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到的pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体，构建得到的pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His质粒图谱如图6所示。

实施例二：一种可溶性水通道蛋白AqpZ载体的表达方式

将鉴定正确的pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His质粒转入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE)得到稳定转化的单菌落；接种单菌落到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在200转/分钟、37℃下培养过夜，得到过夜菌。将过夜菌接种到TB培养基中，接种比例为1:200，在230转/分钟，30℃下培养至OD₆₀₀达到0.8-1.0，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，后16℃培养18小时。4000转/分钟离心15分钟收集菌体。将菌体重悬于PBS缓冲液中，后经过4000转/分钟离心15分钟，即得到可溶性融合表达水通道蛋白ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His的菌体。

实施例三：一种可溶性水通道蛋白AqpZ载体的验证

步骤1，超声破碎实施例二得到的融合蛋白ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His菌体。超声时间为15分钟，超声2秒，间隔4秒，超声功率为60W。后将超声后的菌体在10,000g，4℃下离心45分钟，收集上清，得到全蛋白组分；将上清于100,000g，4℃下离心2小时，收集上清，即得到可溶性组分。

步骤2，收集的融合蛋白全蛋白组分和可溶性组分，取10μL样品，加入10μL 2*上样缓冲液，于75℃孵育10分钟，冷却后于12,000g离心5分钟，点样15μL；先在90伏下跑胶30分钟，后改为150伏，跑胶50分钟。

步骤3，湿转转膜使用硝酸纤维素膜，转膜条件为恒流0.3A，时间为75分钟；转膜完成后，将硝酸纤维素膜取出，用TBST润洗10秒，后置于5％脱脂牛奶中封闭1小时。

步骤4，封闭后的硝酸纤维素膜置于抗体孵育带中，4℃孵育过夜；后将膜取出，用TBST润洗4次，每次5分钟；将润洗后的膜置于抗体孵育带中，加入HRP标记的二抗，室温下孵育1小时；后取出膜，用TBST润洗4次，每次5分钟。等量混合显影液和定影液，均匀涂布在膜上，在CCD下曝光，得到结果如图7所示，第一道为AqpZ的全蛋白组分，第二道为AqpZ的可溶性组分，第三道为ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His的全蛋白组分，第四道为ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His的可溶性组分。由此可知，本发明不仅大大提高了水通道蛋白的表达量，而且得到了可溶性的水通道蛋白AqpZ。

SEQUENCING LISTING

<110> 南京理工大学

<120> 一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> SEQ No.1

catgccatgg gccatcatca tcatcatcat catcatcatc acagcagcgg atccaaattc 60

gagaaagata ccgg 74

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> SEQ No.2

tatcatatgg ctgccgcgcg gcaccagaga accactgcca gatccctgca gattagtctg 60

cgcgtctttc 70

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> SEQ No.3

cgcaagctta tgaagctcct tgacaactgg gacagcg 37

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> SEQ No.4

atttgcggcc gcctgggtat tcagcttttt agtatattc 39

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> SEQ No.5

gggcatatgt tcagaaaatt agcagctg 28

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> SEQ No.6

gggaagctta tcacgctttt ccagca 26

<210> 7

<211> 1032

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400>ΔMBP cDNA

atgggcaaat tcgagaaaga taccggaatt aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg 60

gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca 120

cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa 180

gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg 240

attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg 300

aacccgccaa aaacctggga agagatcccg gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt 360

aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa ccgtacttca cctggccgct gattgctgct 420

gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg 480

gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac 540

atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg 600

atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt 660

gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc 720

gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat 780

ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg 840

ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa gatccacgta ttgccgccac tatggaaaac 900

gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg 960

cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac 1020

gcgcagacta at 1032

<210> 8

<211> 636

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400> ApoAI*-His cDNA

atgaagctcc ttgacaactg ggacagcgtg acctctacct tcagtaaact tcgcgaacaa 60

ctgggccccg tgacgcagga attctgggac aacctggaaa aagaaaccga gggactgcgt 120

caggaaatgt ccaaagattt agaagaggtg aaggccaagg ttcagccata tctcgatgac 180

tttcagaaaa aatggcagga agagatggaa ttatatcgtc aaaaggtgga accgctgcgt 240

gcggaactgc aagagggggc acgccaaaaa ctccatgagc tccaagagaa gctcagccca 300

ttaggcgaag aaatgcgcga tcgcgcccgt gcacatgttg atgcactccg gactcatttg 360

gcgccgtatt cggatgaact tcgccagcgt ttggccgcac gtctcgaggc gctgaaagaa 420

aacgggggtg cccgcttggc tgagtaccac gcgaaagcga cagaacacct gagcaccttg 480

agcgaaaaag cgaaaccggc gctggaagat ctacgccagg gcttattgcc tgttcttgag 540

agctttaaag tcagttttct gtcagctctg gaagaatata ctaaaaagct gaatacccag 600

gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactga 636

<210> 9

<211> 2427

<212> DNA

<213>大肠杆菌

<400>ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His cDNA

atgggcaaat tcgagaaaga taccggaatt aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg 60

gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca 120

cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa 180

gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg 240

attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg 300

aacccgccaa aaacctggga agagatcccg gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt 360

aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa ccgtacttca cctggccgct gattgctgct 420

gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg 480

gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac 540

atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg 600

atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt 660

gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc 720

gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat 780

ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg 840

ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa gatccacgta ttgccgccac tatggaaaac 900

gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg 960

cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac 1020

gcgcagacta atctgcaggg atctggcagt ggttctctgg tgccgcgcgg cagccatatg 1080

ttcagaaaat tagcagctga atgttttggt actttctggc ttgtttttgg tggctgtggt 1140

agtgctgtac tggccgcagg cttcccggaa ttaggcattg gttttgccgg cgtggcgttg 1200

gcgttcggtc tgaccgttct gacgatggcc tttgctgttg gtcatatttc tggtggtcat 1260

tttaacccgg cggtcactat tggtttatgg gctggcggac gttttccggc aaaagaagtc 1320

gttggctacg taattgccca ggttgtcggc ggtattgttg cagcggcgct gctgtattta 1380

attgccagtg gtaaaacggg ttttgacgcg gcagccagcg gttttgcttc taacggttat 1440

ggcgagcatt caccaggcgg ttattccatg ctttccgcgc tggtagttga actggtattg 1500

agtgcaggtt tcctgttggt gatccacggc gcaaccgaca aattcgcgcc ggcaggtttt 1560

gcgccgatcg ctattggtct ggccttaacc ctgattcact taattagtat tccggtgact 1620

aacacttctg ttaacccggc gcgcagcacc gcggttgcta tcttccaggg cggctgggca 1680

ttagaacaac tgtggttctt ctgggtggtg ccaattgtcg gcggcattat cggtggtctg 1740

atttaccgga ccctgctgga aaagcgtgat aagcttgatg acgacgacaa gatgaagctc 1800

cttgacaact gggacagcgt gacctctacc ttcagtaaac ttcgcgaaca actgggcccc 1860

gtgacgcagg aattctggga caacctggaa aaagaaaccg agggactgcg tcaggaaatg 1920

tccaaagatt tagaagaggt gaaggccaag gttcagccat atctcgatga ctttcagaaa 1980

aaatggcagg aagagatgga attatatcgt caaaaggtgg aaccgctgcg tgcggaactg 2040

caagaggggg cacgccaaaa actccatgag ctccaagaga agctcagccc attaggcgaa 2100

gaaatgcgcg atcgcgcccg tgcacatgtt gatgcactcc ggactcattt ggcgccgtat 2160

tcggatgaac ttcgccagcg tttggccgca cgtctcgagg cgctgaaaga aaacgggggt 2220

gcccgcttgg ctgagtacca cgcgaaagcg acagaacacc tgagcacctt gagcgaaaaa 2280

gcgaaaccgg cgctggaaga tctacgccag ggcttattgc ctgttcttga gagctttaaa 2340

gtcagttttc tgtcagctct ggaagaatat actaaaaagc tgaataccca ggcggccgca 2400

ctcgagcacc accaccacca ccactga 2427

Claims (2)

1.一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体，其特征在于，所述的融合载体为利用PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔMBP，将ΔMBP整合到pET28a质粒中得到pET28a-ΔMBP载体；PCR扩增pET28a-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a-ΔMBP载体中得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增大肠杆菌基因组DNA，得到水通道蛋白AqpZ的cDNA即AqpZ，将AqpZ整合到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体中得到pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体。

2.根据权利要求1所述的可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，先将pMBP-p质粒进行PCR，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔMBP，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔMBP和pET28a质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔMBP载体；

步骤2，将pET28a-ApoAI质粒进行PCR，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a-ΔMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a本身所带的His标签，连接反应得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体；

步骤3，对大肠杆菌基因组DNA进行PCR反应，得到水通道蛋白AqpZ的cDNA即AqpZ，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对AqpZ和pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体。