CN108251411A - 一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，包括：橡木片的预处理、蒸汽加热、葡萄酒酵母菌的活化、海藻酸钠‑橡木‑酵母菌混合溶液的制备、固定化酵母的制备；本发明提供使用橡木作为载体制备固定化酵母，不仅能够降低固定化载体成本、同时大大延长橡木与葡萄酒的接触时间，提高酒对于橡木色香味的吸收，缩短制酒的周期；用本发明方法制得的酒具有更好的色香味。

Description

一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法
技术领域
本发明涉及葡萄酒加工技术领域，尤其涉及一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法。
背景技术
橡木可以提升葡萄酒中的香气，软化口感上的变化。通常是把葡萄酒存放在橡木桶中长期贮存，也有的厂家是把橡木片泡在酒里，使葡萄酒萃取橡木中的单宁，使酒体柔和，赋予酒陈酿的香气。
微生物固定化技术，是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适应条件下能够快速、大量增殖的生物技术，能够弥补悬浮微生物发酵处理效率低、固液分离困难、抗毒性差等缺点。因此，近年来，微生物固定化技术的研究非常活跃，发展较快，已应用到许多工业部门如食品发酵工业，环境保护，新能源开发以及生物传感器等，并取得了深入发展，显示出了强大的优越性；
在酒精和啤酒生产发酵过程中，使用固定化酵母技术。固定化酵母可使发酵系统的细胞密度成倍甚至数十倍地增加，而且适于高稀释率下操作，因而可以提高发酵速度，缩短发酵周期，提高设备生产能力和生产效率，简化生产工序,减轻劳动强度，使生产过程更稳定和易于控制，由于上述优点，固定化酵母技术已经成为酒精和啤酒行业发酵技术的重要发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，本发明提供使用橡木作为载体制备固定化酵母，不仅能够降低固定化载体成本、同时大大延长橡木与葡萄酒的接触时间，提高酒对于橡木色香味的吸收，缩短制酒的周期；用本发明方法制得的酒具有更好的色香味。
本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为55~65℃，干燥时间为7~9h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为220~240℃，压力为4.5~5.5MPa，加热时间为2~5min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2~3％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为3:1~5:1的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4～5％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4~5％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍40~60min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-3~-2℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-30~-20℃条件下冷冻24~48h，然后在20~30℃解冻24~48h。
进一步的，每个固定化酵母包埋的菌数为105~106cfu。
本发明的有益效果主要表现如下：本发明利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母，酒与橡木颗粒的接触面积远大于橡木桶，酒能够更好的吸收橡木的色香味以及橡木中的单宁酸等成分。与橡木颗粒表面接触，能够提高酒对于橡木色香味的吸收，缩短制酒的周期；用本发明方法制得的酒具有更好的色香味；
本发明对橡木块采取蒸汽加热爆破，利用高温高压水蒸汽处理橡木块，并通过瞬间泄压过程实现橡木块的组分分离和结构变化，通过汽加热爆破将橡木块中的半纤维素部分降解，木素软化，当充满压力蒸汽的物料骤然减压时，孔隙中的气剧膨胀从而产生的"爆破"效果，可部分剥离木素，并将原料撕裂为细小纤维，其内部有较大的空隙，有利于葡萄酒酵母吸附并在其内部生长。
具体实施方式
结合实施例对本发明加以详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为60℃，干燥时间为8h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为230℃，压力为5MPa，加热时间为3min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2.5％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为4:1的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4.5％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4.5％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍50min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-3~-2℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-30~-20℃条件下冷冻24~48h，然后在20~30℃解冻24~48h。
进一步的，每个固定化酵母的小球中包埋的葡萄酒酵母菌的菌数为105~106cfu。
在固定化酵母的制备过程中对交联后的小球经过3次冻融循环，在冻融循环过程中会因为固液界面推进时产生推挤、穿刺、破碎撕裂、包陷等作用，从而使作为载体的海藻酸钠和橡木粒内部具有很大的内表面积；这样有利于葡萄酒酵母吸附在其内部生长繁殖。
实施例二
一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为53℃，干燥时间为7.5h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为225℃，压力为4.8MPa，加热时间为2.5min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2.5％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为5:1.5的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4.3％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4.3％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍45min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-3~-2℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-30~-20℃条件下冷冻24~48h，然后在20~30℃解冻24~48h。
进一步的，每个固定化酵母的小球中包埋的葡萄酒酵母菌的菌数为105~106cfu。
实施例三
一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为63℃，干燥时间为8.5h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为235℃，压力为5.3MPa，加热时间为4min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2.8％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为9:2的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4.8％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4.8％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍55min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-3~-2℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-30~-20℃条件下冷冻24~48h，然后在20~30℃解冻24~48h。
进一步的，每个固定化酵母的小球中包埋的葡萄酒酵母菌的菌数为105~106cfu。
实施例四
一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为60℃，干燥时间为8h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为230℃，压力为5MPa，加热时间为2~5min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2.5％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为4:1的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4.5％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4.5％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍50min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-3℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-30℃条件下冷冻48h，然后在25℃解冻48h。
进一步的，每个固定化酵母的小球中包埋的葡萄酒酵母菌的的菌数为105~106cfu。
实施例五
一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为60℃，干燥时间为8h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为230℃，压力为5MPa，加热时间为2~5min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2.5％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为4:1的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4.5％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4.5％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍50min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-2℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-20℃条件下冷冻24h，然后在30℃解冻24h。
进一步的，每个固定化酵母的小球中包埋的葡萄酒酵母菌的菌数为105~106cfu。
实施例六
一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为60℃，干燥时间为8h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为230℃，压力为5MPa，加热时间为2~5min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2.5％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为4:1的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4.5％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4.5％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍50min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
进一步的，所述步骤3）中的培养基为YEPD。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
进一步的，所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
进一步的，所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
进一步的，所述步骤5）的冷藏条件为-3~-2℃。
进一步的，所述步骤5）的冻融条件为在-30~-20℃条件下冷冻24~48h，然后在20~30℃解冻24~48h。
进一步的，每个固定化酵母的小球中包埋的葡萄酒酵母菌的菌数为105~106cfu。
现将本发明制备出的固定化酵母和目前市场上的葡萄酒酵母用于酿造葡萄酒，将两者酿造出的葡萄酒进行感官评价效果比较，其测评表如表1所示。
表1 测评表
由表1可知，对比本发明的的固定化酵母和市场上的葡萄酒酵母酿造的葡萄酒可知，本发明制备出的固定化酵母酿造出的葡萄酒顺滑柔和、醇香度较高，且发酵时间较短，储藏时间可达到10~12年；本发明的固定化酵母酿造葡萄酒通过橡木粒直接和葡萄酒接触可以不断向酒液中释放橡木单宁，橡木单宁与葡萄酒液中的天然单宁相结合，使葡萄酒的酒体更加柔和、精细，口感更加顺滑；同时橡木粒的单宁慢慢地渗透到葡萄酒中，坚固了葡萄酒的骨架，使其更具结构感，增强葡萄酒的抗氧化能力，提高了它的储藏时间。
还需要说明的是，在本文中，诸如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

Claims (8)

1.一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：其步骤如下：
1）橡木片的预处理：将橡木块进行清洗，然后将清洗后的橡木块放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥温度为55~65℃，干燥时间为7~9h，将干燥后的橡木块放入粉碎机中进行机械粉碎，得到粒径为1~3mm的橡木片，备用；
2）蒸汽加热：对步骤1）中得到的橡木片进行蒸汽加热，加热温度为220~240℃，压力为4.5~5.5MPa，加热时间为2~5min，然后在0.1~1s的时间内瞬间释放压力，经过筛网筛选出粒径为250~500μm的橡木粒，备用；
3）葡萄酒酵母菌的活化：采用培养基在一定的培养条件下活化葡萄酒酵母菌，然后在无菌条件下离心浓缩得到葡萄酒酵母菌液；
4）海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液的制备：采用小火加热的方式配制质量分数为2~3％的海藻酸钠水溶液，待海藻酸钠水溶液冷却至室温，然后加入与海藻酸钠水溶液体积比为3:1~5:1的步骤2）中得到的橡木粒，然后再加入海藻酸钠水溶液和橡木粒混合溶液总体积的4～5％的所述步骤3）中活化后的葡萄酒酵母菌液，搅拌均匀，制得海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液；
5）固定化酵母的制备：采用注射器将步骤4）中的海藻酸钠-橡木-酵母菌混合溶液以恒定的速度缓慢的滴加在质量分数为4~5％的CaCl2水溶液中，将形成的小球在CaCl2水溶液中浸渍40~60min左右；然后将小球和CaCl2水溶液在冷藏条件下使小球中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的氯化钙交联，将交联后的小球经过3次冻融循环，再用无菌海水将小球冲洗干净后得到固定化酵母。
2.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：所述步骤3）中的培养基为YEPD。
3.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：所述步骤3）中葡萄酒酵母菌活化的培养条件为在YEPD培养基中，在26~28℃恒温培养室中以100~120r/min摇床培养24~36h。
4.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：所述步骤3）中葡萄酒酵母菌的接种量为培养基体积的4~6%。
5.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：所述步骤3）中离心的转速为9000~11000r/min。
6.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：所述步骤5）的冷藏条件为-3~-2℃。
7.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：所述步骤5）的冻融条件为在-30~-20℃条件下冷冻24~48h，然后在20~30℃解冻24~48h。
8.根据权利要求1所述的一种利用橡木片制备葡萄酒用固定化酵母的方法，其特征在于：每个固定化酵母包埋的菌数为105~106cfu。
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