CN108250322B - 水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法 - Google Patents

水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法 Download PDF

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Abstract

水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法，涉及泡沫分离。以天然表面活性剂椰子油皂苷作为起泡剂和捕集剂，确定泡沫分离采收HA的工艺条件；单因素实验步骤；正交试验步骤；溶液HA分离效果评价指标；溶液中HA的浓度的测定。以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂和捕集剂，通过单因素和正交实验，确定了泡沫分离采收HA的最佳工艺条件：常温下，透明质酸溶液pH为7、分离气速为350mL/min、加液量为200mL、收集时间为10min、椰子油起泡剂浓度为0.035g/L、透明质酸初始浓度为50mg/L。此时，HA富集比E＝6.821，回收率R＝66.425％。

Description

水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法
技术领域
本发明涉及泡沫分离，尤其是涉及以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂，分离采收水溶液中微量透明质酸的水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)又名玻璃酸、糖醛酸，是一种天然存在的生物聚合物，是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺构成的高级酸性直连粘多糖。透明质酸(HA)在保健品、化妆品及临床医疗等领域具有重要应用[1]。2015年，在世界范围内，在美容产品和医学方面，透明质酸总制售价值约达到40～60亿美元，而且有相当高的增长速度，据相关专家预估，到2020年，产值将超过100亿美元/每年。随着生活水平的提高、透明质酸应用领域的不断拓展，透明质酸需求火爆，化妆品级HA市售价2～3万元/kg，医药级HA市售价约为80～150万元/kg。目前HA的主要生产方式是微生物发酵法，产量达到4～5g/L，从发酵液中分离提纯透明质酸主要有季铵盐法、氯仿法、离子交换层析、乙醇沉淀法、大量稀释膜滤法等，然而，HA独特的生理性质，使得其传统分离提取工艺成本相对较高[8]。寻找一种适用于低浓度HA溶液，尽可能将发酵液中HA采收完全、工艺设备简单、低投入低原料耗损的提取方法意义重大。泡沫分离作为一种新兴的环保提取工艺，具有在溶液浓度低时效率更高、处理能力大、高采出率、耗损小、费用投入较低、装置简单以及可将目的产物和添加剂分离等优势，有广阔的发展前景[12]。泡沫分离法对于微量的溶质分离有显著的优势，大大弥补了目前对于HA提取方法的不足。
参考文献：
[1]Balazs E A,Laurent T C,Jeanloz R W.Nomenclature of hyaluronic acid[J].Biochemical Journal,1986,235(3):903.
[2]Necas J J,Bartosikova L,Brauner P,et al.Hyaluronic acid(hyaluronan):A review[J].VeterinárníMedicína,2008,53(8).
[3]杨素珍,阚洪玲,张天民.透明质酸在美容化妆品方面的应用[J].食品与药品,2010,(07):275-278.
[4]符移才,魏少敏,金锡鹏.透明质酸与皮肤的关系及其在化妆品中的应用[J].日用化学工业,1999,(06):27-29.
[5]张文会.透明质酸的药物载体作用(待续)[J].日用化学品科学,1998,(01):43.
[6]张文会.透明质酸的药物载体作用(续完)[J].日用化学品科学,1998,(02):43.
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[9]丁霞.透明质酸的生物合成及其纯化[D].南京理工大学,2004.
[10]倪杭生,李润,贺艳丽,et al.透明质酸的离子交换层析纯化[J].中国医药工业杂志,2001,(11):5-8.
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[12]董红星，曹庆荣，董国君.新型传质分离技术基础[J].哈尔滨:哈尔滨工程大学出版社,2005.
[13]文程,于慧敏,孙云鹏,et al.高效测定发酵液中透明质酸含量的改良CTAB浊度法[J].中国生物工程杂志,2010,(02):89-93.
[14]李云雁胡传荣.实验设计与数据处理[J].化学工业出版社,2008:90-91.
[15]兰洁,李锐,韩丽,et al.泡沫分离法分离重楼中重楼皂苷的工艺研究[J].中草药,2008,(01):44-47.
发明内容
本发明的目的在于提供以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂，分离采收水溶液中微量透明质酸的水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法。
本发明包括以下步骤：
1)以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂和捕集剂，确定泡沫分离采收HA的工艺条件；
2)单因素实验步骤，具体步骤如下：
(1)检查实验装置，确定无漏水、漏气的现象；
(2)配制待分离的HA溶液：配制不同浓度的HA溶液，加入表面活性剂，用6mol/L和1mol/L NaOH溶液、6mol/L和1mol/L HCl溶液调节溶液pH值。
(3)在泡沫分离装置的泡沫发生管中加入HA溶液，打开气路阀门，调节压力表和气路流量计，气泡由顶端流出，收集到烧杯中，残液由排液口排出到收集瓶中；
(4)收集结束后的样品封口，静置消泡，测量泡沫液体积及残液中的HA的浓度；
(5)根据所得数据计算回收率R与富集比E的值并作图。
(6)清洗分离柱，先用自来水充分洗净，再用蒸馏水冲洗数次、干燥；
3)正交试验步骤，具体方法如下：
在单因素试验的基础上，设计并进行正交试验，对实验结果进行直观和显著性分析，确定各因素对HA回收的影响程度，确定最佳工艺条件，进行验证试验，得到最佳收集率和富集比；
4)分析方法如下：
(1)溶液HA分离效果评价指标
HA的提取效果采用富集比、收集率为评价指标，如下公式1、公式2所示。
收集率：R(％)＝CfVf/C0V0×100％ (公式1)
富集比：E＝Cf/C0 (公式2)
其中，C0、Cf为原料液、提取泡沫液中透明质酸的浓度；Vf、V0分别为原料液、提取泡沫液的体积；
(2)溶液中HA的浓度的测定
试验采用改良CTAB浊度法测定溶液中的透明质酸的浓度，具体步骤如下：
a.配制浓度为2.5g/L的CTAB溶液：称取0.25g固态CTAB溶解于100mL0.5mol/L氢氧化钠溶液，每次使用时现配现用。
b.配制乙酸缓冲液：准确称取1.640g醋酸钠固体和0.8766g氯化钠固体，加蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，配制成0.2mol/L醋酸钠，0.15mol/L氯化钠溶液，用乙酸调节pH至6.0。
c.绘制标准曲线：配制HA初始浓度为0-400mg/L的标准溶液，移液枪移取300μLHA溶液、700μL乙酸缓冲液和2mL 2.5g/L CTAB溶液。于室温下混合5min，用紫外分光江度计测其在400nm下的OD值。以HA终浓度(相当于HA初始浓度的1/10)为横坐标，OD400nm为纵坐标绘制标准曲线，改良CTAB法的拟合曲线为y＝73.73x-0.4171，线性相关系数达到R2＝0.99299，能够达到科学研究和生产过程的分析需求。
本发明以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂和捕集剂，通过单因素和正交实验，确定了泡沫分离采收HA的最佳工艺条件：常温下，透明质酸溶液pH为7、分离气速为350mL/min、加液量为200mL、收集时间为10min、椰子油起泡剂浓度为0.035g/L、透明质酸初始浓度为50mg/L。此时，HA富集比E＝6.821，回收率R＝66.425％。
附图说明
图1为泡沫分离装置示意图。
图2为溶液透明质酸的浓度标准曲线。
图3为原液pH对回收率、富集比的影响。
图4为原液CAPB浓度对回收率、富集比的影响。
图5为分离气速对回收率、富集比的影响。
图6为原液HA浓度对HA回收率、富集比的影响。
图7为加液量对回收率、富集比的影响。
图8为收集时间对回收率、富集比的影响。
图9为效应曲线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤：
1)以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂和捕集剂，确定泡沫分离采收HA的工艺条件；
2)单因素实验步骤，具体步骤如下：
(1)检查实验装置，确定无漏水、漏气的现象；
(2)配制待分离的HA溶液：配制不同浓度的HA溶液，加入表面活性剂，用6mol/L和1mol/L NaOH溶液、6mol/L和1mol/L HCl溶液调节溶液pH值。
(3)在泡沫分离装置(参见图1)的泡沫发生管中加入HA溶液，打开气路阀门，调节压力表和气路流量计，气泡由顶端流出，收集到烧杯中，残液由排液口排出到收集瓶中；
在图1中，各标记为：空气压缩瓶1、减压阀2、压力表3、调节阀4、截止阀5、转子流量计6、空气分布器7、泡沫发生管8、收集瓶9和残液排出阀10。
(4)收集结束后的样品封口，静置消泡，测量泡沫液体积及残液中的HA的浓度；
(5)根据所得数据计算回收率R与富集比E的值并作图。
(6)清洗分离柱，先用自来水充分洗净，再用蒸馏水冲洗数次、干燥；
3)正交试验步骤，具体方法如下：
在单因素试验的基础上，设计并进行正交试验，对实验结果进行直观和显著性分析，确定各因素对HA回收的影响程度，确定最佳工艺条件，进行验证试验，得到最佳收集率和富集比；
4)分析方法如下：
(1)溶液HA分离效果评价指标
HA的提取效果采用富集比、收集率为评价指标，如下公式1、公式2所示。
收集率：R(％)＝CfVf/C0V0×100％ (公式1)
富集比：E＝Cf/C0 (公式2)
其中，C0、Cf为原料液、提取泡沫液中透明质酸的浓度；Vf、V0分别为原料液、提取泡沫液的体积；
(2)溶液中HA的浓度的测定
试验采用改良CTAB浊度法[13]测定溶液中的透明质酸的浓度，具体步骤如下：
a.配制浓度为2.5g/L的CTAB溶液：称取0.25g固态CTAB溶解于100mL0.5mol/L氢氧化钠溶液，每次使用时现配现用。
b.配制乙酸缓冲液：准确称取1.640g醋酸钠固体和0.8766g氯化钠固体，加蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，配制成0.2mol/L醋酸钠，0.15mol/L氯化钠溶液，用乙酸调节pH至6.0。
c.绘制标准曲线：配制HA初始浓度为0-400mg/L的标准溶液，移液枪移取300μLHA溶液、700μL乙酸缓冲液和2mL 2.5g/L CTAB溶液。于室温下混合5min，用紫外分光江度计测其在400nm下的OD值。以HA终浓度(相当于HA初始浓度的1/10)为横坐标，OD400nm为纵坐标绘制标准曲线(参见图2)，改良CTAB法的拟合曲线为y＝73.73x-0.4171，线性相关系数达到R2＝0.99299，能够达到科学研究和生产过程的分析需求。
以下给出具体实施例。
实施例1
本发明是改变泡沫分离体系的pH，固定其它试验因素，比较不同pH下HA的回收率和富集比，确定最佳分离采收微量HA的pH。
步骤：
HA浓度为0.1g/L、CAPB浓度为0.035g/L、加液量为200mL，调节pH分别为1、3、5、7、9、11、13、分离气速为200mL/min、进行泡沫分离采收微量HA实验，收集时间为8min，实验结果如图3所示。
从图3上看出，溶液pH值从3增加到7，回收率和富集比都会升高；溶液pH值从7增加到11时，富集比和回收率均降低。而溶液pH值为1和13时，富集比大幅度增大。溶液pH值处于3～7时，回收率和富集比增加的原因可能是，在此期间泡沫的稳定性增加，表面吸附增强，泡沫携带的HA增多。溶液pH值从7升到11时，通气时形成的气泡更小更密、更加平稳、量更大，HA及携带的水量均降低，但由于后者增率比前者更大，使得HA富集比减小；HA溶液呈弱酸性，碱性条件下，破坏了其亲水基和疏水基的平衡，HA的回收率降低。由于HA稳定性受溶液pH值对的影响较大，pH值过高、过低均会加速HA的降解，对于HA浓度测定的影响较大，出现富集比突然增大的情况；其次溶液处于过低酸性时，导致形成的泡沫失稳，HA回收率减小，而且HA在溶液中表面显电负性，当溶液pH值在碱性时会由于形成络合物而不具有表面活性，影响最终的提取效果。综合考虑，pH值以7左右为宜。此时R＝56.067％，E＝3.5。
实施例2
本发明是改变泡沫分离体系中CAPB的浓度，固定其它实验因素，比较不同浓度CAPB下HA的回收率和富集比，确定最佳分离采收微量HA的CAPB浓度。
步骤：
HA浓度为0.1g/L、加液量200mL、加入CAPB并使其浓度分别为0.02、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.07g/L、调节pH＝9、调节气速为100mL/min、进行泡沫分离采收微量HA实验，收集时间为5min，实验结果如图4所示。
由上图数据分析，增大添加的CAPB浓度，HA的回收率和富集比有先缓慢增加而后大幅度降低的趋向，富集比尤甚。因为可能是CAPB浓度较少时，气体通入鼓起，泡沫稳定性低、量少，难以收集，随着CAPB用量的增加，分离效果逐渐变好，回收率和富集比逐渐升高；CAPB超过一定限度，气泡之间聚并成大气泡，表面张力下降，HA吸附量减少，但泡沫夹水增多，导致富集比下降，造成分离效果下降。最終综合回收率与富集比分析得出，CAPB的质量浓度为0.035g/L。此时R＝51.50％，E＝4.68。
实施例3
本发明是改变泡沫分离中的分离气速，固定其它实验因素，比较不同分离气速下HA的回收率和富集比，确定最佳分离采收微量HA的分离气速。
步骤：
HA浓度为0.1g/L、CAPB浓度为0.035g/L、加液量200mL、溶液pH＝9、调节分离气速依次为100、200、300、400、500、600、700mL/min、进行泡沫分离采收微量HA实验、收集时间为8min，实验结果如图5所示。
上图分析可知，跟着分离气速的增长，HA的富集比有较明显的下降趋势；但HA的回收效果则先增大而后少量的减少。分析原因：气体通入越快，气泡产生的速率越大，在泡沫发生柱中停滞时间越短，而气液两相的回流程度越小，液体排出速率减小，导致泡沫相中水量升高，收集液的体积增大，因此富集比慢慢降低。然而HA的回收率则先增大再缓慢下降，主要是因为增大气流速度，泡沫的产生量也随之增加，吸附的HA量也增多，回收率得到提高。当气速到达一定数值，CAPB所产生的气泡大小稳定且泡沫层紧密，可以有效地将溶质带出。但若气速继续增大，则会使气泡变形、破裂，在溶液相停留时间太短，不利于表面活性剂与HA吸附，导致无法及时被带出，收集率相对降低。综合考虑，最佳分离气速为400mL/min。此时R＝62.52％，E＝3.05。
实施例4
本发明是改变泡沫分离体系中HA的浓度，固定其它实验因素，比较不同HA浓度下HA的回收率和富集比，确定最佳分离采收微量HA的HA浓度。
步骤：
HA浓度分别为5、15、25、50、100、200、500、800mg/L、CAPB浓度为0.035g/L、加液量200mL、溶液pH＝9、分离气速为400mL/min、进行泡沫分离采收微量HA实验、收集时间为8min。实验结果如图6所示。
实验结果表明：原液HA浓度从5增加到50mg/L，回收率与富集比增高，从50增加到800mg/L，HA的富集比大幅下降，而回收率降低较少。且高浓度比低浓度有较大的收集率和较小的富集比。分析：溶液中HA含量较低时，装置中单个气泡的体积较大，性质易发生变化，大动量气泡间碰撞发生破裂的情况较多，泡沫相中水量较少，有较大的富集比，但与此同时吸附的总比表面积减小，HA吸附也变少，HA的回收率低。高浓度时，溶液HA收集率增加，可能和HA自身的性质有关，透明质酸分子亲水区和疏水区相互缠绕几率增大，溶液表面的粘度增大，与低浓度时相比，其表面张力发生巨大改变，浮选提取效果也因此受到限制，缓慢降低。而溶液中HA含量增加，形成大量细密稳定的泡沫，更多的HA吸附在气泡上，回收率有所上升，但不易排液，HA量和携带的液体量增加，水量携带的增率高于透明质酸的增率，富集比下降。以上分析确定溶液中HA的最佳浓度为50mg/L。此时R＝63.52％，E＝4.89。
实施例5
本实验是改变泡沫分离中的加液量，固定其它实验因素，比较不同加液量下HA的回收率和富集比，确定最佳分离采收微量HA的加液量。
步骤：
HA浓度为50mg/L、CAPB浓度为0.035g/L、加液量分别为50、100、150、200、250、300mL、溶液pH＝9、固定气速为200mL/min进行泡沫分离采收微量HA实验、收集时间为5min，实验结果如图7所示。
实验结果表明：装液体积对HA富集比有较大影响，在加液量变化范围内，富集比降低了一倍，分析原因是：装液体积变大时，气体与溶液充分接触时间长，传质效率高，使大量HA吸附在泡沫上，但泡沫高度与原液体积比就越小，排液时间减小，这会导致泡沫还没出去就破损掉使HA又返回到液相，携带大量水分，后者的增率大于前者，导致富集比下降。适当的装液体积应不仅能够促进HA进入泡沫相，而且也可以保证更适于排液的泡沫层高度/原液体积比。综合分析回收率、富集比及实际应用，最佳加液量为200mL。此时，R＝50.01％，E＝4.76。
实施例6
本发明是改变泡沫分离中的收集时间，固定其它实验因素，比较不同收集时间下HA的回收率和富集比，确定最佳分离采收微量HA的收集时间。
步骤：
HA浓度为50mg/L、CAPB浓度为0.035g/L、加液量200mL、溶液pH＝9、气速为400mL/min、进行泡沫分离采收微量HA实验、收集时间分别为3、5、8、10、14、18min，实验结果如图8所示。
由上图的数据分析可得，超过一定值过后的收集时间长短对回收率和富集比都没有太大改变。分析：收集时间的增长，泡沫产生量及泡沫层高度均逐渐增加，收集率总体呈显著的增加态势，当浮选时间大于10min后，回收率变化较缓且有稍微降低的趋势，在10min去除率达到最大。在8-10min左右，分离已经达到平衡状态，时间超过10min后，装置中的泡沫基本已完全出来，致使HA被带出量变化不会太大，分离效果下降，而富集比会因为后面泡沫夹带更多水而略有减少。所以，对吸附平衡时间和泡沫的及时移出的均衡十分重要。最后确定收集时间为10min。此时R＝64.24％，E＝4.83。
实施例7
根据单因素试验的结果，设计正交实验，通过均值和极差综合分析获得最佳泡沫分离微量HA的最佳工艺条件；通过验证性实验，得到最终的回收率和富集比。
步骤：
单因素试验表明泡沫分离法采收微量HA的最佳工艺条件：pH＝7、HA浓度为50mg/L、CAPB浓度为0.035g/L、加液量200mL、分离流速400mL/min、收集时间为10min。综合分析可得出，收集时间对分离结果的作用相对较小，收集时间为10min时，表面吸附反应基本完成，处于动态平衡状态，最终，确定HA浓度为50mg/L，收集时间为10min。在其他影响因子最佳值上下共取3个水平，通过正交助手软件，依据L9(34)[14]设计并进行正交实验，正交试验因素水平表参见表1。采取综合评分法，由于本试验分离的主要目的是对透明质酸进行提纯，定义综合评分y[15]如(公式3)，并以此作为最终的分析标准，由正交试验极差及方差分析见表2和表3，效应曲线绘制如图9所示，得出泡沫分离法提取透明质酸的最佳工艺条件。
表1
表2
表3
由表2中均值和极差综合分析来看，各因素对该分离实验影响的主次关系为：A＞D＞B＞C。根据表3的方差分析可以得出溶液pH值对泡沫分离具有较大的影响，溶液CAPB浓度和空气流速有一定的影响，而加液量对泡沫分离没有显著影响。泡沫分离HA的最佳工艺条件是A2B1C2D1，即溶液pH值为7，分离气速为350mL/min，进料液CAPB浓度为0.03g/L，装液量是200mL，溶液HA浓度为50mg/L，收集时间为10min。
在最佳的操作工艺下对HA溶液进行泡沫分离的验证性实验，重复3次后取平均值，最终的回收率R＝66.425％；富集比E＝6.821。
本发明以天然表面活性剂椰子油皂苷(CAPB)作为起泡剂，泡沫分离采收HA的最佳工艺条件：常温下，透明质酸溶液pH为7、分离气速为350mL/min、加液量为200mL、收集时间为10min、椰子油起泡剂浓度为0.035g/L、透明质酸初始浓度为50mg/L。此时，HA富集比E＝6.821，回收率R＝66.425％。

Claims (1)

1.水溶液中微量透明质酸的泡沫分离方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以天然表面活性剂椰子油皂苷作为起泡剂和捕集剂，确定泡沫分离采收HA的工艺条件；
2)单因素实验步骤，具体步骤如下：
(1)检查实验装置，确定无漏水、漏气的现象；
(2)配制待分离的HA溶液：配制不同浓度的HA溶液，加入表面活性剂，用6mol/L和1mol/L NaOH溶液、6mol/L和1mol/L HCl溶液调节溶液pH值；
(3)在泡沫分离装置的泡沫发生管中加入HA溶液，打开气路阀门，调节压力表和气路流量计，气泡由顶端流出，收集到烧杯中，残液由排液口排出到收集瓶中；
(4)收集结束后的样品封口，静置消泡，测量泡沫液体积及残液中的HA的浓度；
(5)根据所得数据计算回收率R与富集比E的值并作图；
(6)清洗分离柱，先用自来水充分洗净，再用蒸馏水冲洗数次、干燥；
3)正交试验步骤，具体方法如下：
在单因素试验的基础上，设计并进行正交试验，对实验结果进行直观和显著性分析，确定各因素对HA回收的影响程度，确定最佳工艺条件，进行验证试验，得到最佳收集率和富集比；所述正交试验的因素包括溶液pH值、空气流速mL/min、加液量mL、溶液CAPB浓度g/L；
4)分析方法如下：
(1)溶液HA分离效果评价指标
HA的提取效果采用富集比、收集率为评价指标，如下公式1、公式2所示；
收集率：R(％)＝CfVf/C0V0×100％ (公式1)
富集比：E＝Cf/C0 (公式2)
其中，C0、Cf为原料液、提取泡沫液中透明质酸的浓度；Vf、V0分别为原料液、提取泡沫液的体积；
(2)溶液中HA的浓度的测定
试验采用改良CTAB浊度法测定溶液中的透明质酸的浓度，具体步骤如下：
a.配制浓度为2.5g/L的CTAB溶液：称取0.25g固态CTAB溶解于100mL0.5mol/L氢氧化钠溶液，每次使用时现配现用；
b.配制乙酸缓冲液：准确称取1.640g醋酸钠固体和0.8766g氯化钠固体，加蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，配制成0.2mol/L醋酸钠，0.15mol/L氯化钠溶液，用乙酸调节pH至6.0；
c.绘制标准曲线：配制HA初始浓度为0-400mg/L的标准溶液，移液枪移取300μLHA溶液、700μL乙酸缓冲液和2mL 2.5g/L CTAB溶液；于室温下混合5min，用紫外分光光度计测其在400nm下的OD值；以HA终浓度为横坐标，OD400nm为纵坐标绘制标准曲线，改良CTAB法的拟合曲线为y＝73.73x-0.4171，线性相关系数达到R2＝0.99299。
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