CN108250267A - 一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多肽，其结构式如下所示，

Description

一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽，具体来说是一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途。

背景技术

RNAi技术是最广泛应用的生物学技术之一，由于RNAi技术对特定基因mRNA的高度特异性和高效性表达调控。因此，RNAi技术被广泛的用于功能基因组学、遗传学、基因治疗、病毒性疾病治疗等许多领域。然而，无论在体内还是体外，siRNA都很容易被广泛存在的RNase降解，并且siRNA无法单独穿过细胞膜引发RNAi效应，因此，RNAi技术离不开高效，低毒的siRNA运载体的帮助。

常用的siRNA转染载体有病毒载体、脂质体、高聚物、无机纳米粒子、多肽生物载体等。其中病毒载体是一类以腺病毒、逆转录病毒和慢病毒为主的siRNA载体。病毒载体是已知的转染效率最高的siRNA载体之一，但是因为病毒有可能不可控的插入宿主的基因组中，因此，出于安全性和操作复杂性的考虑，病毒类载体的应用受到了很大的限制。

以脂质体和高聚物为代表的一类化学修饰载体是目前应用最广泛的一类siRNA载体。其中脂质体(如:lipo-2000)是由一个亲水性的头部和一个疏水性的尾部组成的两亲性分子，脂质体在水中可以与siRNA形成均一稳定的复合物，将siRNA包裹在有脂质体分子组成的空腔内，并通过内吞或者膜融合的方式进入细胞，并进一步释放出内部的siRNA分子，引发RNAi效应。但是，由于脂质体自身对于细胞膜有较强的细胞毒性，有脂质体介导的siRNA转染一般在较低的脂质体浓度下进行，并且主要限制在体外和细胞水平的转染。

以聚乙烯亚胺PEI和PLL等阳离子聚合物为代表的高聚物是另一类广泛应用的siRNA运载体，PEI分子利用静电作用负载包裹siRNA，通过内吞作用进入细胞后，利用质子海绵效应使内吞体破裂，促进siRNA的释放。随着PEI分子量的增大，能够负载的siRNA的含量也越多，但同时细胞毒性也越大。因此对于PEI分子，再未进一步优化之前，一般只用于低剂量的细胞水平的转染。

无极金属纳米粒子是一种以纳米金为代表的新型siRNA载体。其主要通过静电相互作用与siRNA结合，通过内吞作用进入细胞内，并成功释放，引发RNAi效应。其转染效率较高，并且对细胞没有急性毒性作用，但是由于无机金属纳米粒子太过稳定，很难被生物体清除，易导致金属纳米粒子在体内的堆集，引发潜在的毒性反应，从而极大的限制其应用。

这些载体虽然都可以实现siRNA的有效的转染，但同时也存在着各自的问题，对于复杂体系内的siRNA运载，依然有许多限制和无法实现的困难。方便，简单，高效，安全的siRNA运载方式依然是科研工作者关注的方向。

多肽作为生物体内的一种内源性分子，具有非常高的生物相容性和低细胞毒性。目前，通过合理设计多肽的序列及其结构，我们可以得到具有低毒性，可降解，高转染效率的多肽siRNA载体。多肽载体的出现为siRNA技术的发展提供了新的方向和活力。多肽siRNA运载体主要包括穿膜肽载体和两亲性多肽载体两大类，其中穿膜肽载体主要利用多肽的正电性与穿膜性，将负点性的siRNA通过共价交联或静电吸附的方式负载，然后通过内吞作用进入细胞，引发RNAi效应。两亲性多肽是另一类广泛应用的多肽siRNA运载体，其主要利用RNA结合蛋白的序列和穿膜肽的序列来实现负载siRNA并运载入细胞的过程。然而，为了增加多肽载体的运载效率，多肽分子往往修饰有一些特殊的基团，如：对还原环境敏感的S-S键，对PH敏感的三氯喹啉等。虽然这些修饰可以提高多肽运载siRNA的效率，但是同时也带来了制备合成和纯化分离的不便，并且多肽载体的长度一般都在20个氨基酸以上，这进一步增加了合成与分离的难度，限制了多肽siRNA载体的应用。因此，开发新型简便，安全，高效的多肽siRNA载体一直是科研工作者关注的方向。

发明内容

针对现有技术中siRNA运载体存在的上述技术问题，本发明提供了一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途，所述的这种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途要解决现有技术中的siRNA运载体制备和纯化繁琐、毒性高、效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种多肽，其结构式如下所示，

其中，R为精氨酸、M为甲硫氨酸、E为谷氨酸、H为组氨酸、W为色氨酸。

本发明还提供了一种多肽-siRNA诱导共组装体，由上述的多肽和siRNA组成。

本发明还提供了上述的多肽-siRNA诱导共组装体在细胞运载中的用途。

本发明还提供了上述的述的多肽-siRNA诱导共组装体在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。

本发明提供了一种基于核酸诱导共组装的短肽分子，该分子可以与siRNA在常温下发生共组装，形成稳定的纳米粒子并实现对siRNA分子的细胞内运载，引起RNAi效应，达到下调靶标基因mRNA表达量的目的。该短肽分子合成简便，只有9个氨基酸，适合大量制备，该发明有益于解决多肽siRNA运载体制备和纯化繁琐的问题，同时为开发简便，低毒，高效的多肽siRNA运载体提供了新的方向。

本发明是一种基于核酸分子(单链RNA，双链RNA，单链DNA，双链DNA，质粒，单核苷酸分子等)存在下诱导共组装的多肽分子Wpc。本发明的多肽在与siRNA形成共组装纳米粒子后将载体siRNA递送至目的细胞，引发RNAi效应，实现对靶标基因mRNA的调控的作用。

将本发明多肽与目标siRNA在常温下混合孵育5min后，即可形成稳定均一的纳米粒子，通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜可以明显观测到多肽将荧光标记的siRNA高效地运载入细胞中。通过RT-PCR分析进一步验证了共组装纳米粒子可以在细胞内引发RNAi效应，实现目的基因mRNA含量的下调。细胞毒性实验证明这种共组装纳米粒子具有较高的生物相容性，其细胞毒性和溶血毒性都很低。抗细胞增殖实验是细胞周期实验进一步证实了，多肽-siRNA(Survivin基因)纳米粒子可以有效地将宫颈癌细胞系HeLa阻断在G2期，阻滞其生长。并且人源异种宫颈癌肿瘤模型证明该多肽-siRNA(Survivin基因)能够很好的抑制宫颈癌瘤体的增殖。

本发明通过原子力显微镜(AFM)，扫描隧道显微镜(SEM)，动态光粒径散射仪(DLS)，流式细胞术，激光共聚焦显微成像，RT-PCR分析，细胞毒性实验(MTT)，人源异种宫颈癌肿瘤移植模型等实验，证实该多肽可以在核酸分子的诱导下形成稳定均一的多肽-核酸(如：siRNA)复合纳米粒子，形成的复合纳米粒子可以递送siRNA进入目的细胞，释放并进一步引发RNAi效应。可以作为一种新型简便，低毒，高效的多肽siRNA运载体。此外，基于此多肽运载体运载针对宫颈癌细胞的关键基因survivin的mRNA可以抑制小鼠人源异植宫颈癌癌肿瘤的生长。

本发明的多肽分子不需要引入任何非天然修饰，仅靠多肽序列中存在的两个Met分子，与关环试剂(双卤代烃)在水(含1％的甲酸)中反应12h，既可以增加多肽的正电性和稳定性。并且这种在侧链上的修饰可以在还原环境中消除(如：细胞内)，因此，多肽上增加的正电荷可以增强多肽与负点性siRNA的结合，有助于生成多肽-siRNA复合物，保护siRNA免受RNase降解。同时，当多肽-siRNA复合物进入细胞后，细胞内的还原环境会消除多肽的正电性修饰，减弱多肽与siRNA的相互作用，从而促进siRNA在细胞质中的释放。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明是一种将siRNA递送到目的细胞中并引发RNAi效应的简便，低毒，高效的多肽siRNA运载体系。基于此多肽运载体系的多肽-siRNA(Survivin)共组装纳米粒子在宫颈癌细胞系和人源异植宫颈癌模型的抗增殖中取得了明显的效果。本发明基于生物内源性的多肽分子开发了简便，低毒，高效的多肽siRNA运载体系，即降低了siRNA运载体的细胞毒性，又避免了繁琐复杂的多肽制备纯化步骤。为多肽siRNA运载体的开发提供了新的方向。

附图说明

图1为多肽Wpc的琼脂糖胶阻滞电泳图；对于0.4μg的siRNA，10μg多肽就可以完全负载，负载度较高。

图2为多肽-siRNA共组装纳米粒子的原子力显微镜(AFM)图；多肽与siRNA在常温孵育后，形成了大小均一的纳米粒子。

图3为多肽-siRNA共组装纳米粒子的扫描电子显微镜(SEM)图。

图4为多肽-siRNA共组装纳米粒子的动态光散射(DLS)图。

图5为多肽-siRNA共组装纳米粒子的Zeta电势图。

图6为多肽-siRNA共组装纳米粒子的流式细胞图；A为纳米粒子转染后，HeLa细胞的平均荧光强度值；B为多肽-siRNA纳米粒子对HeLa细胞的转染效率图。结果表明，多肽可以高效的运载siRNA进入HeLa细胞。

图7为多肽-siRNA共组装纳米粒子的实时共聚焦显微成像图；多肽可以有效地将siRNA均一的分散在整个细胞内部，并且不影响细胞自身的形态。

图8为多肽-siRNA共组装纳米粒子对不同种类细胞系的细胞毒性(MTT)测定图和溶血毒性测定图；A为多肽对QSG7701细胞的MTT毒性测定图；B为多肽对HeLa细胞的MTT毒性测定图；C多肽对HEK-293T细胞的MTT毒性测定图；D为多肽对新鲜小鼠血细胞的溶血毒性测定图；结果表明，即便是在高浓度下，多肽载体对于不同类型的细胞都没有明显的细胞毒性和溶血毒性。

图9为多肽-siRNA共组装纳米粒子对不同细胞系的siRNA转染引发相关基因mRNA表达量变化的RT-PCR图。A为在HeLa细胞中转染Survivin基因后，反应mRNA表达水平的RT-PCR图；B为在Miapaca-2细胞中转染K-ras基因后，反应mRNA表达水平的RT-PCR图；C为在PA-1细胞中转染LSD-1基因后，反应mRNA表达水平的RT-PCR图；D为在HeLa细胞中转染Bcl-2基因后，反应mRNA表达水平的RT-PCR图；结果表明，对于不同的细胞系，多肽-siRNA复合物都能够实现相应基因mRNA水平的下调，尤其是针对HeLa细胞和Miapaca-2细胞系。表明我们的多肽可以作为简便，低毒，高效的siRNA运载体

图10为多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子对宫颈癌细胞HeLa的抗增殖抑制作用明场图；与对照组相比，HeLa细胞的生长受到了明显的抑制。

图11为多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子处理宫颈癌细胞HeLa后，将其细胞周期阻滞在G2期。

图12为多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子给药后，裸鼠肿瘤大小-时间图；结果表明多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子可以有效抑制裸鼠人源异植宫颈癌肿瘤的生长。

图13为多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子给药期间裸鼠体重-时间图；在整个给药期间，裸鼠的体重保持稳定。

图14为多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子给药满10次后，收集的小鼠各器官HE染色切片图；结果表明多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子对小鼠各器官无致畸毒害作用。

图15为多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子给药满10次后，收集小鼠肿瘤组织的免疫组化图；结果表明，多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子给药后，与对照相比肿瘤组织中的survivin蛋白下调，Tunel和caspase-3上调。

图16显示了本发明的多肽-siRNA的工作原理。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1多肽的制备及分离纯化步骤：

按照标准的-Fmoc的固相多肽合成技术，用MBHA树脂将多肽合成在树脂上(以多肽Wpc为例)：

具体操作步骤为：

(1)多肽固相合成：称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，鼓氮气溶胀40min。加入50％(v/v)吗啡啉的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气40min，脱去Fmoc保护基团。用DMF和DCM交替洗涤树脂3次，每次1min，将配好的Fmoc-AA-OH(5eq，0.4M，DMF)溶液，6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(4.9eq，0.38M，DMF)溶液，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(7.0eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。去除反应液，用DMF和DCM交替洗涤树脂3次，每次1min，按上述方法进行脱保护，接下一个氨基酸。

(2)接下来的氨基酸与上述方法相同。接到最后一个氨基酸Arg后，用DMF和DCM交替洗涤树脂3次，每次1min，再用甲醇洗涤，抽干树脂，等待下一步操作。

(4)分子内S盐关环：用剪切液(三氟乙酸(TFA)，三异丙基硅烷(TIPS)和H₂O(v:v:v＝9.5:0.25:0.25))将多肽从树脂上切下来(每75mg树脂加1ml剪切液，常温剪切3h)，用干燥的氮气吹干剪切液，再用H₂O和乙腈(v:v＝6:4)溶解，加入关环试剂1，2-二溴甲基苯(5.0eq)，1％的甲酸，避光反应12h。

(5)多肽纯化：将反应后的反应液过滤后，可以水和乙腈为流动相，直接用高效液相色谱进行纯化分离。

实施例2多肽在siRNA(或者其他核酸分子)的诱导下，形成共组装多肽-siRNA纳米粒子

采用琼脂糖胶阻滞电泳来判断多肽对siRNA的负载度，siRNA的量为0.4μg，将多肽的水溶液与siRNA在常温下孵育5min，即可以形成稳定的多肽-siRNA共组装纳米粒子，最终10μg的多肽就可以完全负载0.4μg的siRNA。多肽的浓度根据Trp在280nm的吸收来确定。(图1)

利用原子力显微镜(AFM)对多肽和siRNA形成的共组装纳米粒子进行了表征，证明了多肽-siRNA形成了规整均一纳米粒子。(图2)

利用扫描电子显微镜(SEM)对多肽和siRNA形成的共组装纳米粒子进行了表征，证明了多肽-siRNA形成了规整均一纳米粒子(图3)

利用动态光散射粒径仪进一步对多肽-siRNA形成的共组装纳米粒子进行了表征，证明了多肽-siRNA形成了规整均一纳米粒子(图4)

利用Zeta电势进一步对多肽-siRNA形成的共组装纳米粒子进行了表征，结果表明siRNA在与多肽形成共组装纳米粒子后，电势发生了明显的改变，有助于穿透细胞膜。(图5)

实施例3多肽-siRNA共组装纳米粒子可以作为简便，低毒的转染试剂有效地转染siRNA进入各种细胞系并引发RNAi效应

为了验证多肽-siRNA共组装纳米粒子能否作为siRNA载体实现运载siRNA的作用，最直观的是利用流式细胞术和激光共聚焦显微镜成像，来测定和实时观察转染后细胞的荧光。以HeLa细胞为模型利用流式细胞术，将多肽和荧光标记(FAM)的siRNA在常温下，按照琼脂糖凝胶电泳确定的比例孵育5min后，加入预先用OPTi培养基孵育的HeLa细胞中，在培养箱中继续培养4h后，洗涤，消化细胞，用流式细胞仪检测HeLa细胞的荧光强度。可以明显的看到多肽-siRNA纳米粒子转染后的细胞的荧光强度值很高(明显高于传统的商业化转染试剂lipo-2000和oligo)，并且细胞的峰型很正常，没有对细胞状态造成很大的影响。(图6)

利用激光共聚焦显微镜实时观察按照上述条件转染4h后的HeLa细胞，可以明显的看到荧光标记的多肽-siRNA复合物均匀的分布在整个细胞内，其转染效率(荧光强度)要明显高于传统的商业化转染试剂lipo-2000和oligo。(图7)

作为一种转染试剂，必须对正常细胞系无毒害作用，因此我们在不同的3种细胞系(HeLa，HEK-293T和QSG7701)中都测定了多肽的细胞毒性(MTT)，结果表明，即便在转染所用浓度的6倍条件(600μg/ml)下，多肽依然没有明显的细胞毒性。此外，我们还利用新鲜的小鼠血细胞(10⁸-10⁹个)，和不同浓度的多肽在37℃下孵育(0.1％的SDS作为正对照)，测定了多肽的溶血毒性，结果表明与正对照相比，多肽几乎没有溶血毒性。以上结果表明我们的多肽可作为简便，低毒的siRNA运载体。(图8)

随后，我们在不同的细胞系(HeLa，Miapaca-2，PA-1和A2780)中尝试了多肽-siRNA共组装纳米粒子的基因敲除效率。用2.0μg的siRNA与50μg多肽在常温下孵育5min形成稳定均一的共组装纳米粒子后，加入事先用OPTi培养基孵育的HeLa(或其他类型细胞系)中，放置于培养箱中继续培养48h后，提取RNA，反转录，用RT-PCR分析相关基因mRNA水平的变化。我们发现多肽-siRNA复合物都能够实现相应基因mRNA水平的下调，尤其是针对HeLa细胞和Miapaca-2细胞系。以上结果表明我们的多肽可以作为简便、低毒、有效的新型siRNA运载体，用于各种细胞系的转染。(图9)

表1为在不同的细胞系中转染时用到的siRNA序列，表2为在转染后，利用RT-PCR分析相关基因mRNA表达水平变化时用到的引物序列。

表一：使用的siRNA序列

表二：使用的引物序列

实施例4多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子抗宫颈癌细胞增殖和抗人源异植宫颈癌模型增殖效果

为了评估该多肽载体能否应用于基于RNAi效应的癌症治疗领域，我们以宫颈癌细胞HeLa为模型，利用细胞增殖抑制实验，在转染多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子后，48h，观察HeLa细胞的增殖情况。结果表明多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子能够抑制宫颈癌细胞HeLa的增殖。(图10)随后我们利用细胞周期分析试剂盒，进一步验证了多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子能够将HeLa细胞的细胞周期阻滞在G2期，从而抑制HeLa细胞的增殖扩散。(图11)

此外，我们进一步在裸鼠的人源异植宫颈癌模型中验证了多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子的抗肿瘤生长效果。裸鼠在接种宫颈癌肿瘤后，继续培养14天等肿瘤长大，然后开始用多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子进行瘤内注射给药，两天一次，每次0.34OD siRNA(Survivin)，每次给药前测量小鼠体重及肿瘤大小，第21天后处死小鼠，取出小鼠肿瘤以及器官，利用HE染色分析小鼠器官组织是否正常，利用免疫组化分析肿瘤组织中相应survivin基因，caspase-3和Tunel的表达情况。结果表明，多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子可以有效的抑制人源异植宫颈癌肿瘤的生长(图12)，并且在整个给药过程中，小鼠的体重没有发生明显变化(图13)，HE染色结果表明，与对照相比，小鼠的各类组织器官没有发生畸变，一起正常，(图14)免疫组化分析，与对照相比肿瘤组织中的survivin蛋白下调，Tunel和caspase-3上调(图15)。

如图16所示，加入siRNA后通过静电吸附诱导多肽自主装成纳米球，携带siRNA穿膜并且在靶标位置释放，发挥siRNA敲除靶基因的效果，抑制肿瘤细胞的生长。

上述结果表明多肽-siRNA(Survivin)纳米粒子可以有效的抑制人源异植宫颈癌肿瘤的生长，并且不会对小鼠的正常组织器官造成毒害，也验证了该多肽载体可以应用于基于RNAi效应的癌症治疗领域。

序列表

<110> 北京大学深圳研究生院

<120> 一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA/RNA

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<212> DNA/RNA

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<212> DNA/RNA

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Claims (4)

1.一种多肽，其特征在于：结构式如下所示，

2.一种多肽-siRNA诱导共组装体，其特征在于：由权利要求1所述的多肽和siRNA组成。

3.权利要求2所述的多肽-siRNA诱导共组装体在细胞运载中的用途。

4.权利要求2所述的多肽-siRNA诱导共组装体在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。