CN108239609A

CN108239609A - 重组酵母及其应用

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Publication number: CN108239609A
Application number: CN201711268925.4A
Authority: CN
Inventors: R·A·克里普沃尔; W·H·范兹尔; S·H·罗斯
Original assignee: Stellenbosch University
Current assignee: Stellenbosch University
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2018-07-03
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN108239609B; ZA201708218B; US20180155744A1; US10253337B2; GB201620658D0

Abstract

本发明涉及重组酵母及其应用。具体而言，本发明提供一种重组酵母，其表达来自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii，最近重命名为埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii))的α‑淀粉酶(SEQ ID NO:1)和葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:2)。还公开了所述重组酵母在从淀粉或糖生产醇(特别是生物燃料)的方法中的应用。

Description

重组酵母及其应用

技术领域

本发明涉及用于将可溶性生淀粉转化成如乙醇等醇的重组酵母，特别是用作生物燃料的醇。

背景技术

经济有效、可再生和可持续的能源是全球关注的问题，其增加了对替代燃料来源的研究力度。富含淀粉的生物质与甘蔗共同代表着生产生物乙醇的主要底物(Bai等，2008)。它由植物作为能量储存库生产，由α-1,4连接的葡萄糖单元和α-1,6分支点组成。直链淀粉和支链淀粉聚合物密集堆积在淀粉颗粒中，形成具有分子间键和分子内键的半结晶结构。

淀粉的完全水解需要α淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合。淀粉颗粒不溶于冷水，通常耐酶水解(Uthumporn等，2010)。将淀粉转化为乙醇的常规方法需要热密集液化步骤以使淀粉和热稳定的α-淀粉酶糊化，接着用葡糖淀粉酶进行糖化。初始工艺所需的高温通常占乙醇生产所需总能量的约30％至40％(Szymanowska-等，2012)。

其替代方法是在低于淀粉开始糊化的温度(对于玉米为65℃)的冷水解法(Robertson等，2006)。该过程的优点包括能源需求减少和干酒糟谷物及可溶物(DDGS)的营养含量更高(Nkomba等，2016)。DDGS在生物乙醇生产过程中大量生产，是家畜饲料的有价值成分(Brehmer等，2008)。

联合生物处理(CBP)将酶的生产、水解和发酵组合成在低温下生产生物乙醇的一步法。该技术代表了从木质纤维素和淀粉原料经济地生产生物燃料的有希望的替代方法。CBP可以简化操作过程(例如控制步骤和反应容器的数量)，从而降低维护和生产成本。CBP系统使用能够在低温下产生淀粉水解所需酶的单一生物体，即冷水解，并将所得糖转化为乙醇。冷过程需要能够在发酵条件下有效消化生淀粉的淀粉酶。迄今为止报道了几种生淀粉水解淀粉酶(Mamo和Gessesse，1999；Robertson等，2006；Celińska等，2015)。这些淀粉酶与常规淀粉酶在其与淀粉颗粒的微晶结构的亲和力和相互作用方面不同。淀粉结合结构域(SBD)是这些酶的关键特征，并使其能够有效地结合到生淀粉颗粒的表面。

Salehi Jouzani和Taherzadeh(2015年)对联合生物处理系统的全面综述强调了不同的CBP策略、底物类型的多样性以及参与将糖类发酵的生物体。主要挑战之一仍然是同时生产具有高底物亲和力和比活性的淀粉酶(den Haan等，2013)。此外，发酵要求在48～72小时内乙醇浓度超过10％～12％(w.v^-1)(Bothast和Schlicher，2005)。例如，来自橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)(Eksteen等，2003；Knox等，2004)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)(Yang等，2011)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)(Viktor等，2013)和疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginoses)和扣囊复膜酵母(S.fibuligera)或橘林油脂酵母(L.kononenenae)(LKA1)蛋白(US 9,243,256)的生淀粉淀粉酶编码基因，已经在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达，酿酒酵母是有效的乙醇生产者，但其自身缺乏降解淀粉的能力。

然而，这些经转化的酵母中都没有产生足够量的淀粉酶来支持在工业规模的单一步骤中将生淀粉有效地转化成乙醇。尽管分泌葡糖淀粉酶的生物工程化酿酒酵母菌株可商购(来自Lallemand(www.ethanoltech.com/transferm)的)，但其缺乏淀粉液化所需的α淀粉酶(den Haan等，2015)，因此只是半CBP酵母。所以，酵母菌株仅适用于常规(热)过程，因为它仅在淀粉液化后联合糖化和发酵过程。因此，CBP尚未在商业水平上实施，其主要挑战在于获得可表达合适的酶并具有高发酵能力的微生物。

已经开发了其它冷同步糖化和发酵(SSF)方法，用于从淀粉底物生产乙醇(Balcerek和Pielech-Przybylska，2013；Szymanowska-等，2014；Nkomba等，2016)。在这些方法中，除了酵母之外，将颗粒淀粉水解酶(GSHE)混合物加入到原料中。Genencor的STARGEN 001^TM和STARGEN 002^TM混合物(Dupont-Danisco，Itasca，Itasca)在低温(对于SSF推荐48℃)水解生淀粉，而POET(Sioux Falls,South Dekota,美国)在SSF方法中使用Novozymes酶的专利混合物(POET BPX技术)(等，2015)。然而，这些冷淀粉水解方法需要高的酶加载量，并且例如STARGEN^TM(Genencor International,California,美国)等商业酶的成本高。

因此，仍然需要一种酵母，其可用于从生淀粉生产乙醇的CBP方法中，而无需从除酵母以外的来源添加淀粉酶。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供一种重组酵母，其已经转化有下述基因：

a)第一异源基因，其编码包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶，其中第一基因的核酸序列是未经密码子优化的；和

b)第二异源基因，其编码包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其中第二基因的核酸序列是可选地经密码子优化的。

α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性；α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性；或者α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQID NO:1相同。

葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性；葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性；或者葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2相同。

第一异源基因的核酸序列可以与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性，与SEQ IDNO:3具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，或可以与SEQ IDNO:3相同。

第二异源基因的核酸序列可以与SEQ ID NO:4和5中任一个具有至少70％同一性，这取决于所述序列是否已经进行了密码子优化；以及可以与SEQ ID NO:4和5中任一个具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:4和5中任一个具有至少90％同一性，或者可以与SEQ IDNO:4和5中任一个相同。

酵母可以是酵母菌属(Saccharomyces)物种，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

酵母可以是能够将诸如葡萄糖等糖转化成醇的酵母。

醇可以是丁醇或乙醇，特别是乙醇。

重组酵母能够在不存在来自除重组酵母之外的来源的酶时水解生淀粉。生淀粉可以在约40℃以下进行水解。

根据本发明的第二实施方式，提供一种用于从糖生产醇的方法，所述方法包括使用上述重组酵母将糖转化成醇的步骤。

所述糖可以包含葡萄糖。

醇可以是乙醇或丁醇，通常是乙醇。

根据本发明的第三实施方式，提供了一种用于从淀粉生产醇的方法，所述方法包括使用上述重组酵母将淀粉转化成醇的步骤。

重组酵母可以添加至包含淀粉或糖的组合物，并且可以使其表达和分泌：(i)包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶；和(ii)包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，从而发生糖化和/或发酵以生产醇。

淀粉可以是谷物淀粉。

淀粉可以是生(颗粒状的)淀粉或可以是可溶性(熟化)淀粉。

生淀粉可以被重组酵母水解而无需熟化淀粉。例如，生淀粉可以在约40℃以下被重组酵母水解。

醇可以是乙醇或丁醇，通常是乙醇。

所述方法可以是用于生产生物燃料的联合生物处理(CBP)法。

还可以向所述组合物添加对于所述重组酵母而言外源的酶。外源酶的添加量比不使用本发明的重组酵母的冷水解过程中的酶添加量小至少50％。

根据本发明的又一实施方式，提供上述重组酵母在从淀粉或糖生产醇的方法中的应用。

所述醇可以是生物燃料。

附图说明

图1实施例1中所用的载体构建体的示意图。使用PCR扩增淀粉酶编码基因，并分别克隆到yBBH1和yBBH4载体上(a、b和c)。将ENO1_P-α-淀粉酶s-ENO1_T盒克隆到yBBH1-葡糖淀粉酶质粒(d)上，以使基因能够共表达。使用BamHI和BglII限制酶位点以进行酵母介导的连接(YML)。

图2分别表达(a)ateA,amyA、(b)apuA和(c)temA基因衍生物的酿酒酵母Y294菌株展示的胞外α-淀粉酶活性。将酿酒酵母Y294[AmyA]菌株用于基准α-淀粉酶的生产。数值表示三次重复的平均值，误差棒表示标准偏差。来自酿酒酵母Y294菌株的上清液(72小时后)进行SDS-PAGE，然后进行银染色。箭头分别表示存在重组(d)AmyA，AteA、(e)ApuA和(f)TemA蛋白物质。将酿酒酵母Y294[BBH1]菌株用作参照菌株，而蛋白质尺寸标记(M)描绘在左手侧。

图3分别表达(a)ateG和(b)temG基因衍生物的酿酒酵母Y294菌株展示的胞外葡糖淀粉酶活性。将酿酒酵母Y294[GlaA]菌株用于基准葡糖淀粉酶的生产。数值表示三次重复的平均值，误差棒表示标准偏差。来自酿酒酵母Y294菌株的上清液(72小时后)进行SDS-PAGE，然后进行银染色。箭头分别表示存在重组(c)AteG和(d)TemG蛋白物质。将酿酒酵母Y294[BBH1]菌株用作参照菌株，而蛋白质尺寸标记(M)描绘在左手侧。

图4在作为唯一碳水化合物来源的200g.l^-1生玉米淀粉和5g.l^-1葡萄糖上评估淀粉分解性酿酒酵母Y294菌株。监视随时间的(a和b)乙醇和(c和d)葡萄糖生产。来自最佳表现菌株(左图)和次优菌株(右图)的结果来自同一发酵。数值表示三次重复的平均值，误差棒表示标准偏差。

图5酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]在2升生物反应器中的表现。分别是(a)在26℃(-●-)和30℃(-■-)的乙醇浓度以及在26℃(-○-)和在30℃(-□-)的残留葡萄糖浓度；和(b)在26℃(-●-)和30℃(-■-)的碳转化率(％)，利用补充有5g.l^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的2×SC^-URA液。数值表示一式三份重复的平均值，误差棒表示标准偏差。

图6在该研究中使用的最终载体和基因盒的示意图。将TEF_P-amdSYM-TEF_T盒(a)克隆至yBBH1以产生yBBH1-amdSYM表达载体。ENO1temA_Nat and temG_Opt基因盒(b)使用PCR扩增，并使其含有与δ整合位点同源的侧翼区。

图7temA和temG基因盒整合后的工业转化体的比较。在30℃的发酵温度于200g.l^-1生玉米淀粉上由酿酒酵母Ethanol Red^TM(-□-)和M2n(-◇-)亲本菌株以及酿酒酵母Ethanol Red ^TM T1(-▲-)、T12(-■-)、M2n T1(-◆-)和Mn2 T2(-●-)淀粉分解性转化体产生的乙醇(a)和展示的碳转化率(％)(b)。SC-Ac(c)和SC-Acr(d)平板测定确认了重组酿酒酵母Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株分别利用乙酰胺和丙烯酰胺的能力，而亲本酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n菌株未显示生长。

图8实验室酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株(-●-)和工业淀粉分解性酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株在30℃(-■-)和37℃(-▲-)的比较。使用含有5g.1^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的2X SC-URA发酵培养基比较乙醇(a)、葡萄糖(b)、麦芽糖(c)和甘油(d)的生产。数据是显示出标准偏差的3次重复的平均值。

图9在37℃在200g.l^-1生玉米淀粉上发酵期间的不同发酵液条件。在YP中的酿酒酵母Ethanol Red^TM T12(-◆-)、pH 5的YP柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液(-■-)、pH 5的SC柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液(-●-)和pH 5并且具有10g.l^-1额外(NH₄)₂SO₄的SC柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液(-▲-)。比较乙醇(a)、葡萄糖(b)、甘油浓度(c)和碳转化率(基于摩尔碳的玉米转化百分比)(d)。数据是显示出标准偏差的3次重复的平均值。

图10在30℃(a)、37℃(b)于使用200g.l^-1玉米淀粉的发酵期间由酿酒酵母EthanolRed^TM菌株产生的乙醇浓度、在30℃的碳转化率(基于摩尔碳的玉米转化百分比)(c)和在37℃的碳转化率(基于摩尔碳的玉米转化百分比)(d)。未转化的Ethanol Red^TM+28μlSTARGEN^TM(-▲-)、Ethanol Red^TM T12(-■-)、Ethanol Red^TM T12+2.8μl STARGEN^TM(-◆-)、Ethanol Red^TM T12+4.6μl STARGEN^TM(-●-)和Ethanol Red^TM T12+14μl STARGEN^TM 数据是显示出标准偏差的3次重复的平均值。

图11在30℃(a)、37℃(b)于使用200g.l^-1的发酵期间由酿酒酵母M2n菌株产生的乙醇浓度、在30℃的碳转化率(基于摩尔碳的玉米转化百分比)(c)和在37℃的碳转化率(基于摩尔碳的玉米转化百分比)(d)。未转化的酿酒酵母M2n菌株+28μlSTARGEN^TM(-▲-)、M2n T1(-■-)、M2n T1+2.8μl STARGEN^TM(-◆-)和M2n T1+4.6μl STARGEN^TM(-●-)。数据是显示出标准偏差的3次重复的平均值。

图12在30℃在含有5g.1^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的YP培养基中发酵期间由重组工业酿酒酵母菌株产生的乙醇浓度。Ethanol Red^TM T12(-■-)、M2n T1(-●-)和M2n[TLG1-SFA1]

图13在含有5g.l^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的YP培养基中在不同发酵温度下酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株的表现。在5升生物反应器中于30℃(-◆-)、34℃(-●-)、37℃(-■-)产生的乙醇(a)和碳转化率(％)(b)，以及在100ml血清瓶中于30℃的产生的乙醇和碳转化率(％)。

图14在含有5g.l^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的YP培养基中在发酵期间酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株的表现。在30℃的乙醇(a)和碳转化率(％)(b)(总接种体积为10％(v.v^-1))。10ml Ethanol Red^TM T12(-●-)、10ml Ethanol Red^TM T12+5μl商业葡糖淀粉酶(-■-)、5ml Ethanol Red^TM T12+5ml未转化的Ethanol Red^TM 5ml EthanolRed^TM T12+5ml未转化的Ethanol Red^TM+5μl商业葡糖淀粉酶(-◆-)。

图15在30℃的发酵温度利用不同的酶比例由酿酒酵母Ethanol Red^TM菌株产生的乙醇浓度(总接种体积为10％(v.v^-1))。分别是未转化的Ethanol Red^TM+28μlSTARGEN^TM(-▲-)、Ethanol Red^TM TemA_Nat+28μl STARGEN^TM(-◆-)、Ethanol Red^TM TemA_Nat+5μl(-●-),10μl和20μl(-■-)商业葡糖淀粉酶，未转化的Ethanol Red^TM+10μl商业葡糖淀粉酶和10ml Ethanol Red^TM T12(-○-)。

图16SEQ ID NO:1:-TemA蛋白。埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)的α-淀粉酶的蛋白序列。[埃默森罗萨氏菌CBS 393.64]序列ID：GenBank编号XP_013324946。

图17SEQ ID NO:2:-TemG蛋白。埃默森罗萨氏菌的葡糖淀粉酶的蛋白序列(分泌信号加下划线)。序列ID:CAC28076.1。

图18SEQ ID NO:3:-temA_Nat基因。用于生产TemA_Nat的编码埃默森罗萨氏菌的α-淀粉酶的合成DNA序列(推定的分泌信号加下划线)。其与埃默森罗萨氏菌CBS 393.64α-淀粉酶mRNA NCBI参考序列：Genbank no.XM_013469492具有99％同一性(与原始GenBank序列相比，1个核苷酸改变，而不影响蛋白序列)。

图19SEQ ID NO:4：temG_Opt。编码埃默森罗萨氏菌的葡糖淀粉酶的DNA序列(推定的分泌信号加下划线)，针对在酿酒酵母中表达进行过优化(由美国GenScript进行)。

图20SEQ ID NO:5：temG_Nat基因。编码埃默森罗萨氏菌的葡糖淀粉酶的经改编天然DNA序列(TemG_Nat)。与原始GenBank序列(去除内含子)相比，该序列含有3个核苷酸变化(粗体和加下划线)，蛋白质序列是TemG。

图21SEQ ID NO:6temA–天然埃默森罗萨氏菌CBS 393.64α-淀粉酶mRNA NCBI参考序列：XM_013469492.1的原始Genbank序列。

图22SEQ ID NO:7:temG–葡糖淀粉酶的原始埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)ga基因，外显子1-5(包含内含子的Genbank序列；GenBank:AJ304803.1)。

具体实施方式

提供了表达来自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii，最近重命名为埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii))的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的重组酵母。所述α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。可以使用所述重组酵母将淀粉和糖转化为醇，特别是用作生物燃料的醇。

α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性。α-淀粉酶的氨基酸序列还可以与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性；或者α-淀粉酶的氨基酸序列还可以与SEQ ID NO:1相同。

葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性。葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性；或者葡糖淀粉酶的氨基酸序列还可以与SEQ ID NO:2相同。

酵母可以用这两种酶的天然基因或用葡糖淀粉酶的经密码子优化的基因进行转化。为了克隆目的也可以对天然基因进行核苷酸改变以干扰限制性位点，但不改变蛋白序列(例如，如图19和20所示)。

第一异源基因的核酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性，与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性，与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，或可以与SEQ ID NO:3相同。

在一个实施方式中，酵母用葡糖淀粉酶的经密码子优化的基因进行转化，所述基因与天然序列具有69％同一性。在该实施方式中，酵母用葡糖淀粉酶进行转化，所述葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：4具有至少68％相似性、至少70％相似性、至少80％相似性、至少90％相似性或者与SEQ ID NO：4相同的核酸序列。

在另一实施方式中，代替用经密码子优化的葡糖淀粉酶转化的酵母的是，其可以用未经密码子优化的葡糖淀粉酶进行转化，该葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：5具有至少70％相似性、至少80％相似性、至少90％相似性或者与SEQ ID NO：5相同的核酸序列。

宿主酵母可以选自能够将糖转化为醇的那些酵母。这样的糖可以来自水解淀粉或其它富含己糖的原料。

本发明的示例性酵母是：毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))spp.(例如异常毕赤酵母(P.anomala)、碎囊毕赤酵母(P.capsulate)和安格斯毕赤酵母(P.angusta)(之前称为多形汉逊酵母(H.polymorpha)))、酵母菌属(Saccharomyces spp.)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、意大利糖酵母(S.italicus)和鲁氏糖酵母(S.rouxii))、耶氏酵母属(Yarrowia)(例如解脂耶氏酵母(Y.lipolytica))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)(例如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、假丝酵母属(Candida spp.)(例如热带假丝酵母(C.tropicales)),球拟酵母属(Torulopsis spp.)、有孢圆酵母属(Torulaspora spp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))、固囊酵母属(Citeromycesspp.)、囊酵母属(Pachysolen spp.)、德巴利氏酵母属(Debaromyces spp.)、梅奇酵母属(Metschunikowia spp.)、红冬孢属(Rhodosporidium spp.)、白冬孢酵母属(Leucosporidium spp.)、葡状子囊菌属(Botryoascus spp.)、锁掷酵母属(Sporidiobolusspp.)、拟内孢霉属(Endomycopsis spp.)和许旺酵母属(Schwanniomyces spp.)(例如西方许旺酵母(S.occidentalis))等。

在一个实施方式中，酵母是酵母属物种，特别是酿酒酵母。

酵母可以是工业酵母，即已经开发用于工业乙醇工业的酵母。此类酵母典型地具有一种或多种以下特性：高乙醇耐受性、快速作用、高醇产量、在发酵期间高细胞活力、在广泛的发酵条件下的活性等。此类酵母的一个实例是来自Fermentis(www.fermentis.com)的Ethanol Red^TM。另一实例是酿酒酵母M2n菌株，其是一种南非酒厂酵母。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是也可以使用其它工业酵母。

通常转化酵母而不整合任何抗生素抗性基因(即无标记整合)。

可选的是，可以将多拷贝的α-淀粉酶或葡糖淀粉酶整合到酵母的基因组中，例如，酵母可以用两个或三个拷贝的α-淀粉酶和/或两个或三个拷贝的葡糖淀粉酶进行转化。在一个具体的实施方式中，重组菌株含有编码α-淀粉酶的基因的一个拷贝和编码葡糖淀粉酶的基因的两个拷贝。

重组酵母可以水解生淀粉而无需使用额外的酶(例如外源淀粉酶)。生淀粉可以在约40℃以下，例如从环境温度至约40℃的温度水解。

重组酵母可用于从淀粉生产酒精的一步法。该方法可以用于生产生物燃料，但是其也可以是用于制造诸如啤酒等酒精饮料的方法。醇可以是丁醇或乙醇。在一个实施方式中，该醇是乙醇。

由于生淀粉可以被重组酵母水解，因此其可以用作底物而不需要初始液化步骤。然而，可溶性(或蒸煮)淀粉也可以用作初始底物。

重组酵母也可以用于从糖生产醇的方法中。糖可以来自水解淀粉，来自其它富含己糖的原料(例如甘蔗)或来自纤维素衍生糖流(即加入纤维素酶)。糖可以包含葡萄糖。

虽然本发明的重组酵母能够在不存在外源淀粉酶的情况下水解生淀粉，但是在一些实施方案中，可以向发酵过程中添加额外的酶以减少发酵时间和/或增加碳转化率。这些酶可以是能够水解生淀粉的葡糖淀粉酶、淀粉葡糖苷酶(E.C.3.2.1.3)、α-淀粉酶或其混合物。例如，酶的混合物(在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达的川地曲霉(Aspergilluskawachii)α淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶)可以从Genencor International以品牌名称STARGEN^TM获得。由于重组酵母能够连续地补充发酵液中的酶，所以当将外源酶加入到使用本发明的重组酵母的低温发酵法中时，与使用不同的酵母(例如来自Lallemand的Transferm^TM酵母)时所需的剂量相比，可以以减少的量添加它们。例如，外源酶可以以比在商业冷发酵方法中使用的剂量少约50％至约95％的量添加。特别是，申请人发现，与使用未转化的宿主菌株的常规同步糖化(SSF)方法相比，添加外源酶与本发明的重组淀粉分解性酵母的组合允许酶剂量降低90％。

一步糖化和发酵方法可以在环境温度(室温)至约40℃的温度范围内进行。更具体地说，温度可以为约30℃至约37℃。

针对在淀粉上的活性筛选出来自土曲霉(Aspergillus terreus)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、新缝匠菌(Neosartorya fischeri)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、密集踝节菌(Talaromycesstipitatus)和疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的α-淀粉酶和葡糖淀粉，并将其分别与酿酒酵母Y294[AmyA]和Y294[GlaA]基准菌株进行比较(Viktor等，2013)。其后，构建了数种不同的淀粉分解性酿酒酵母Y294菌株(ATCC201160)，并比较其与酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株(Viktor等，2013)在高底物负荷下(20g.l^-1生玉米淀粉)下水解生玉米淀粉和将所得葡萄糖发酵为乙醇的能力。

发现来自埃默森篮状菌的葡糖淀粉酶(TemG(SEQ ID NO：2))和来自埃默森篮状菌的α淀粉酶(TemA(SEQ ID NO：1))的组合在发酵条件下水解生玉米淀粉最有效。埃默森篮状菌是一种嗜热性真菌，其在工业上重要并且以生产具有特殊酶性质的糖苷水解酶(GH)、尤其是纤维素酶而广为人知(Amore和Faraco，2012；Wang等，2014)。然而，很少有研究调查其淀粉水解酶。埃默森篮状菌淀粉酶先前也未在酿酒酵母中表达。

进一步的研究显示，当这些酶在酵母中表达时，经密码子优化的葡糖淀粉酶基因(temG_Opt(SEQ ID NO:4))和天然α淀粉酶基因(temA_Nat(SEQ ID NO:3))的组合提供了甚至比当使用天然葡糖淀粉酶基因(temG_Nat(SEQ ID NO:5))时或当两个基因都经密码子优化时更好的结果。例如，表达来自埃默森篮状菌的经密码子优化的葡糖淀粉酶和天然α-淀粉酶的重组酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株，在发酵120小时后从生淀粉产生51.7g.l^-1乙醇，相比之下，酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株产生33.1g.l^-1。酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株在192小时后展示出85％的碳转化率，相比之下，基准菌株为54％。

然后将密码子优化的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶基因(temG_Opt(SEQ ID NO:4))和天然埃默森篮状菌α-淀粉酶基因(temA_Nat(SEQ ID NO:3))转化至两个商业上可获得的工业酿酒酵母菌株，即Ethanol Red^TM和M2n(MH-1000)酒精酵母(Favaro等，2015)中。EthanolRed^TM是第一代生物乙醇生产中使用最广泛的酵母菌株之一(Stovicek等，2015)。很少有研究为了基因盒的表达而对酿酒酵母Ethanol Red^TM进行工程化或为了所需的特性对其进行改造。Demeke等(2013b)开发了D-木糖发酵菌株，Wallace-Salinas和Gorwa-Grauslund(2013)开发了能够生长和发酵云杉水解物的菌株，并且Stovicek等(2015b)将木糖消耗途径引入Ethanol Red^TM。就申请人所知，本研究是首次为了同时表达α淀粉酶和葡糖淀粉酶而对酿酒酵母Ethanol Red^TM进行工程化，以有效转化生淀粉。

构建两个δ整合基因盒以允许经密码子优化的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶基因(temG_Opt)和天然埃默森篮状菌α淀粉酶基因(temA_Nat)同时多重整合到酵母的基因组中。使用δ整合DNA转化系统，埃默森篮状菌在ENO1启动子的控制下组成性表达。淀粉分解性工业菌株在高固体负载下评估，并且能够在一步中将淀粉发酵成乙醇，乙醇收率接近理论最大收率。在30℃经192小时后，酿酒酵母Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株(含有整合的temA_Nat和temG_Opt基因盒)分别产生86.45g.l-1和99.40g.l-1乙醇，相当于碳转化率83.98％和95.56％。在5升生物反应器中，酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株在37℃经192小时后产生82.6g.l^-1乙醇，这相当于理论乙醇收率的79％。

本文所述的重组酵母可实现大于70％(w/w)、优选大于80％、甚至更优选90％以上的碳转化率。理论乙醇收率大于90％。重要的是，还显示了用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因转化宿主酵母不妨碍宿主菌株的稳健性。

因此，本发明的重组酵母比已知的用于从生淀粉生产醇的基准菌株更好和更有效，并且稳健且耐热。所以，重组酵母是用于同步糖化和发酵(SSF)或联合生物处理(CBP)方法的有希望的候选者。它们代表了减少或避免生淀粉水解所需的酶剂量的新型替代方法，并且能够为连续冷发酵方法提供连续的淀粉分解活性。因此设想，本发明的重组酵母菌株可以用于乙醇生产者目前使用的商业热(蒸煮淀粉)发酵法和冷发酵法(即作为“混入候选者(drop in candidate)”)。

还设想使用本发明的重组酵母将提供从淀粉原料更经济有效的生产乙醇。

术语表

如本文所用，除非内容另外清楚地指出，否则单数形式“一种/一个(a,an)”和“所述(the)”包括复数形式。因此，例如，提及含有“一种化合物”的组合物包括提及两种以上化合物的混合物。应该注意的是，术语“或”通常以包括“和/或”的意义使用，除非上下文另有规定。

关于数值所使用的术语“约”是指例如在数值的50％(±50％)内，优选±30％、±20％、±15％、±10％、±7％、±5％或±1％。必要时，本发明的定义中可以省略单词“约”。

术语“包含”是指“包括”。因此，例如，“包含”X的组合物或多肽可以仅由X组成，或者可以包括一种或多种另外的组分。在一些实施方式中，“包含”是指“主要包括但不必仅包括”。

如本文所用，关于核酸或蛋白质的“异源”包括已经通过人为干预来操作、使得其位于除天然发现位置以外的位置的分子。例如，可以将来自一个生物体(例如来自一个菌株或物种)的核酸序列引入到另一个生物体(例如另一个菌株或物种)的基因组中。异源蛋白包括，例如，由异源编码序列表达的蛋白质，或者由不会天然表达该蛋白质的细胞中的重组基因表达的蛋白质。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。

术语“α-淀粉酶”是指催化α-1,4-糖苷键水解的EC3.2.1.1类的酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。这些酶是内切水解酶，采用水解的保留机制(Enzyme Nomenclature，1992)，属于糖苷水解酶(GH)家族13和氏族GH-H(MacGregor等，2001)。它们在含有三个以上1,4-α-连接的D葡萄糖单元的多糖中水解1,4-α-D-葡糖苷键。水解降低了淀粉的分子大小，并因此降低了淀粉溶液的粘度。α-淀粉酶具有相当低的序列相似性。

葡糖淀粉酶(葡聚糖α-1,4-葡糖苷酶，EC3.2.1.3)属于GH家族15。葡糖淀粉酶是外作用酶，其催化α-1,4-和α-1,6-糖苷键的水解，由此从淀粉的非还原末端释放倒置的β-D-葡萄糖。

关于葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的结构和功能的进一步信息可见Christiansen等，FEBS Journal 276(2009)5006–5029。

当应用于多肽序列时，短语“百分比同一性”、“％同一性”、“蛋白质同一性”、“序列同一性”等是指使用标准算法比对的至少两个多肽序列之间的相同残基匹配的百分比。此类算法可以以标准化和可再现的方式插入被比较的序列中的空位，以便优化两个序列之间的比对，并且因此实现两个序列的更有意义的比较。百分比同一性可以使用本领域已知的一个或多个计算机算法或程序来确定。例如，UWGCG软件包提供可用于计算序列同一性的BESTFIT程序(例如在其默认设置下使用)(Devereux等，(1984)Nucleic Acids Research12,387-395)。PILEUP和BLAST(基本局部比对搜索工具)算法可用于计算序列同一性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300和Altschul,S,F等，(1990)J Mol Biol 215:403中所述。用于进行BLAST分析的软件可以从多个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI)、Bethesda、MD和互联网(例如“www.ncbi.nlm.nih.gov/”)。优选的是，使用前述算法/程序的默认设置。

氨基酸是否可以完全被取代(或缺失)还是其只能被保守氨基酸取代，可以通过比较蛋白质家族的一个或多个成员的氨基酸序列来确定。蛋白质家族所有成员中相同的氨基酸通常不能被取代。保守的氨基酸通常可以被其它保守的氨基酸取代而不显著影响蛋白质的功能。家族内不保守的氨基酸通常可以自由替代。确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导也可以使用本领域公知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)找到。例如，在J.U.Bowie等，"Deciphering the Message in ProteinSequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions,"Science 247:1306-1310(1990)中提供了关于如何进行表型沉默的氨基酸取代的指导。另外，本领域技术人员将认识到，蛋白质上可能存在决定活性的关键区域，例如淀粉结合结构域(SBD)和催化结构域。本领域技术人员将会理解，当确定可以对氨基酸序列做出什么改变时可能需要考虑这些区域。有关SBD的详细综述可参见和2006。对于多肽的活性而言关键、并且因此优选不进行通过取代或缺失的改变(或者如果取代，则仅仅通过保守取代进行取代)的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见，例如Cunningham and Wells,1989,Science 244:1081-1085)。底物-酶相互作用的位点也可以通过分析三维结构来确定，如通过核磁共振分析、晶体学或光亲和标记等技术确定(参见，例如de Vos等，1992,Science 255:306-312；Smith等，1992,Journal of MolecularBiology 224:899-904；Wlodaver等，1992,FEBS Letters 309:59-64)。通常更容易耐受远离蛋白质的活性或结合位点的氨基酸缺失、取代或添加。一般而言，通常可以替换形成三级结构的残基，条件是使用进行类似功能的残基。在其它情况下，如果改变发生在蛋白质的非关键区域，则残基的类型可能是完全不重要的。

“密码子优化”是指用于通过增加感兴趣基因的翻译效率来改善异源蛋白质分泌的公知技术。遗传密码的冗余性允许编码相同蛋白质的DNA序列的多种可能性。外源蛋白通常以低水平产生，因为野生型外源基因未针对在替代表达宿主中最佳表达而进化。基因的GC含量和密码子使用是识别影响基因表达的两个主要序列特征。为了有效地表达重组基因并分泌更高量的蛋白质，天然基因中的稀有密码子被宿主生物体基因中的更丰富密码子替代，而不改变蛋白质本身的氨基酸序列。密码子优化技术改变密码子使用模式，这可能导致增加的表达水平。密码子使用表可供购买或免费获取(例如www.kazusa.or.jp/codon andwww.kazusa.or.jp/codon)。

术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化合物组成的任何材料，其由具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成，其中X可以是任何数目。在一些实施方案中，含淀粉材料可以包含木聚糖。“含淀粉”材料的实例包括基于植物的基质(其可以是分级的植物材料，例如谷粒如玉米，其被分级成诸如纤维、胚芽，蛋白质和淀粉(胚乳)等组分)、块茎、根、茎、全谷物、谷物、球茎、穗轴、高草、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、买罗高梁(milo)、西米、木薯、豌豆、豆类、竹芋(arrow root)、木薯(cassava)、甘薯、谷类、含糖原料(例如糖蜜、水果材料、甘蔗或甜菜)、马铃薯、含纤维素材料(例如木材、木材残留物、木质纤维素、植物残余物)、来自农业的废物(例如玉米秸秆、稻秆、麦片(cereal)、麸皮、受损谷物、受损马铃薯、马铃薯皮)、非纤维素饲料如高粱、城市垃圾(如报纸、废纸)、肥料生物质和农业残留物等。

术语“生淀粉”是指未进行糊化的颗粒状(未改性的)未熟化的淀粉。在约25℃，淀粉颗粒开始吸水，并且随着温度的升高，颗粒开始剧烈振动。结晶度降低，并且当淀粉和水的悬浮液加热到高于临界点(指定糊状化(pasting)或糊化温度)时，颗粒崩解而形成糊状物。

术语“淀粉的水解”是指糖苷键因加入水分子而化学分解。

术语“液化”、“液状化”、“液化液”及其变体是指将淀粉转化为可溶糊精底物(例如较小的多糖)的方法或产物。液化液也可以被称为“醪液(mash)”。

术语“糊化”是指淀粉颗粒从有序的半结晶颗粒改变为非晶状态，并在水存在下发生。通常通过将经处理的淀粉(通常用α-淀粉酶处理)加热至高达100℃的温度来完成。糊化的确切温度取决于特定的淀粉，并且可以由技术人员容易地确定。

术语“糊化温度”是指含淀粉底物开始糊化的最低温度。

术语“可溶性淀粉”是指由不溶性淀粉(例如颗粒/生淀粉)的水解产生的淀粉。

术语“颗粒淀粉水解(GSH)酶”和“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶”是指能够水解未熟化的/颗粒状淀粉的酶。

术语“糖化酶”和“淀粉水解酶”是指能够将淀粉转化为单糖或寡糖(例如己糖或戊糖)的任何酶。

短语“联合生物处理”是指包括使用能够在单个发酵容器中实现淀粉的液化、水解和发酵的单一生物体的一步法。

短语“同步糖化和发酵(SSF)”是指生产最终产物的方法，其中，将诸如产乙醇微生物等发酵生物体与糖化酶等至少一种酶组合在同一容器中的同一处理步骤中。

“外源性酶”是指不是由本发明的重组酵母表达的酶。

酵母不形成确切的分类学或系统发生分组，而是真菌分裂子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的单细胞成员的俗称。芽殖酵母(“真酵母”)分类在酵母目中。大多数是通过出芽无性繁殖，但少数通过二元裂变进行繁殖。酵母是单细胞的，尽管一些具有酵母形式的物种可能通过形成被称为假菌丝(pseudohyphae)的一串连接的出芽细胞或者如在大多数霉菌中看到的假性菌丝而形成多细胞。

现在将通过以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例1:α-淀粉酶和葡糖淀粉酶及其组合的生淀粉水解的评价

材料和方法

培养基和培养条件

除非另有说明，所有的化学品都是分析级的，并且获自Merck(Darmstadt,德国)。使用大肠杆菌DH5α(Takara Bio Inc.)进行载体繁殖。大肠杆菌转化体在含有100μg.ml^-1氨苄青霉素的Luria Bertani琼脂(Sigma-Aldrich,德国)上选择，并在37℃在含有用于选择压力的100μg.ml^-1氨苄青霉素的Terrific Broth(12g.l^-1胰蛋白胨、24g.l^-1酵母提取物、4ml.l^-1甘油、0.1M磷酸盐缓冲液)中培养(Sambrook等，1989)。

将酿酒酵母Y294菌株保持在YPD平板(10g.l^-1酵母提取物、20g.l^-1蛋白胨和20g.l^-1葡萄糖和15g.l^-1琼脂)上，选择淀粉分解性转化体并将其保持在SC^-URA平板(含有6.7g.l^-1无氨基酸的酵母氮源(yeast nitrogen base)(BD-Diagnostic Systems,Sparks,MD)、20g.l^-1葡萄糖、1.5g.l^-1酵母合成省却培养基(drop-out medium)补充物(Sigma-Aldrich,德国)、2％玉米淀粉(Sigma-Aldrich,德国)和15g.l^-1琼脂)上。将酿酒酵母菌株在旋转摇床(200rpm)中于30℃在125ml Erlenmeyer烧瓶中有氧培养，所述锥形瓶含有20ml双倍强度SC^-URA培养基(2×SC^-URA，含有13.4g.l^-1无氨基酸的酵母氮源(BD-Diagnostic Systems,Sparks,MD)、20g.l^-1葡萄糖和3g.l^-1酵母合成省却培养基补充物(Sigma-Aldrich,德国)。所有培养物接种至1×10⁶个细胞.ml^-1。

菌株和质粒

本实施例中使用的细菌和真菌菌株的基因型以及质粒总结于表1中。

表1.本研究中使用的菌株和质粒

¹天然分泌信号

_Nat:天然编码序列；

_Opt:经密码子优化的编码序列(GenScript)；

-NatSS:天然分泌信号；

-XYNSEC:来自里氏木霉Xyn2基因的天然分泌信号；

-OptXYNSEC:经密码子优化的XYNSEC分泌信号

DNA操作

所有DNA操作和大肠杆菌转化都遵循标准方案(Sambrook等，1989)。基于下列核苷酸登录号，所有基因由GenScript(Piscataway,NJ,美国)合成。避开了内部的EcoRI、XhoI、BamHI和BglII限制性位点，但是氨基酸序列保持不受影响。聚合酶链反应(PCR)使用PerkinElmer Gene PCR System 2400和TaKaRa Ex Taq^TM(Takara Bio Inc,Japan)根据制造商的建议进行。淀粉酶基因使用设计用于酵母介导的连接(YML)的引物(Inqaba Biotec,南非)(表2)扩增，并在0.8％琼脂糖凝胶上可视化。用Zymoclean^TM凝胶回收试剂盒(ZymoResearch,美国)从琼脂糖凝胶中洗脱DNA。

将淀粉酶基因分别亚克隆到yBBH1或yBBH4质粒上(图1a、b和c)，以构建表1中列出的表达载体。yBBH4载体(图1c)含有编码里氏木霉xyn2的XYNSEC分泌信号的序列(Den Haan等，2007)，以用于引导淀粉酶的分泌。使用YML盒引物：ENOCASS-L:gtgcggtatttcacaccgcataggagatcgatcccaattaatgtgagttacctcactc(SEQ ID NO:35)和ENOCASS-R:cgggcctcttcgctattacgccagagcttagatct(SEQ ID NO:36)从yBBH1-α-淀粉酶载体扩增ENO1_P-α-淀粉酶-ENO1_T盒，并将其克隆在yBBH1-葡糖淀粉酶或yBBH4-葡糖淀粉酶载体的BglII位点上(图1c和d)。利用ABI PRISM^TM 3100基因分析仪(CAF,StellenboschUniversity)，通过双脱氧链终止法进行最终载体构建体的序列验证。

淀粉酶基因和GenBank登录号

在酿酒酵母Y294中克隆和表达以下淀粉酶。来自出芽短梗霉(登录号HM246718)、土曲霉(登录号XP_001213553)、灰腐质霉(登录号M89475)、埃默森篮状菌(登录号AJ304803)和疏棉状嗜热丝孢菌(登录号EF545003)的天然葡糖淀粉酶，以及来自出芽短梗霉(登录号AEH03024)、土曲霉(登录号XM_001209405)、新缝匠菌(登录号XP_001265628)、微小根毛霉(登录号AGJ52081)和埃默森篮状菌(登录号XM_013469492)的天然α-淀粉酶。对来自嗜热毛壳菌(登录号ABD96025)、密集踝节菌(登录号XP_002484948)、土曲霉和埃默森篮状菌的葡糖淀粉酶的编码序列以及来自出芽短梗霉和埃默森篮状菌α-淀粉酶的编码序列进行密码子优化以用于在酿酒酵母中表达(GenScript,Piscataway,NJ,美国)。埃默森篮状菌最近已经归类为埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)(Houbraken等，2012)。

酵母转化

酿酒酵母Y294菌株在5ml YPD肉汤中生长过夜并根据Cho等(1999)制备。电穿孔后，立即将1ml YPDS加入到比色杯中。培养物在30℃温育1小时，然后铺在含有2％淀粉的SC^-URA平板上。平板在30℃温育2至3天，然后转移到4℃经24小时，以使淀粉沉淀。

活性测定

对于定量测定，将酵母转化体培养在125ml Erlenmeyer烧瓶中的20ml 2X SC^-UR培养基中，以200rpm搅拌并以24小时间隔取样。收获上清液，利用以葡萄糖作为标准物的还原糖测定法(Miller 1959)比色测定细胞外酶活性水平(xMark^TM MicroplateSpectrophotometre,Bio-Rad,San Francisco,美国)。在37℃与在0.05M柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5)中的0.2％可溶性玉米淀粉一起温育5分钟后，确定α-淀粉酶活性。

通过在37℃将50μl上清液与在0.05M柠檬酸盐-柠檬酸酸缓冲液(pH5)中的0.2％可溶性玉米淀粉一起温育15分钟来确定葡糖淀粉酶活性。葡萄糖浓度使用D葡萄糖测定试剂盒(Megazyme，爱尔兰)确定，吸光度在510nm处测量(xMark^TM MicroplateSpectrophotometre,Bio-Rad,San Francisco,美国)。酶活性以纳开特(nano-katal)/毫升(nkat.ml^-1)表示，其中nkat定义为在所述测定条件下每秒产生1nmol葡萄糖所需的酶活性。

蛋白质分析

将重组酿造酵母Y294菌株在含有20ml 2×SC^-URA培养基的125ml Erlenmeyer烧瓶中培养3天。将20微升上清液加入蛋白加载缓冲液中，样品煮沸3分钟使蛋白质变性。使用5％浓缩凝胶和Tris-甘氨酸缓冲液，在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离重组蛋白质(Sambrook等，1989)。在环境温度下在100V下进行±90分钟的电泳，并使用银染色法(O'Connell和Stults，1997)使蛋白质物质可视化。使用广谱Page Ruler Prestained SM0671Protein Ladder(Fermentas，中国)作为分子量标记物。

生淀粉发酵

将预培养物培养在250ml锥形瓶中的60ml 2×SC^-URA培养基中，并在30℃和200rpm的搅拌下温育。用含有200g.l^-1生玉米淀粉和5g.l^-1葡萄糖的2×SC^-URA培养基进行发酵，并用10％(v.v^-1)接种物接种。加入氨苄青霉素(100μg.ml^-1)和链霉素(50μg.ml^-1)以抑制细菌污染。在30℃的磁力多级搅拌器上进行搅拌和温育，每天通过注射针穿过橡胶塞进行采样。

对于用实验室菌株进行的生物反应器实验，将预培养物在30℃于200rpm的搅拌下在500ml Erlenmeyer烧瓶中的120ml 2×SC^-URA培养基中培养。生物反应器发酵在含有补充有200g.l^-1生玉米淀粉和5g.l^-1葡萄糖作为碳水化合物源的2×SC^-URA培养基的2升MultiGenBioreactor(New Brunswick Scientific Corporation,Edison,New Jersey)中进行。在1升的总工作体积中使用10％(v.v^-1)接种物。在26℃和30℃以300rpm搅拌进行发酵，并通过指定的取样口每天取样。所有的发酵实验一式三份进行。

高效液相色谱(HPLC)分析

使用由液相色谱泵、自动取样器和折射率(RI)检测器组成的Surveyor Plus液相色谱仪(Thermo Scientific)，利用HPLC对乙醇、葡萄糖、麦芽糖、甘油和乙酸浓度进行定量。在80℃在Rezex RHM Monosaccharide 7.8×300mm柱(00H0132-K0,Phenomenex)上分离化合物，以5mM H₂SO₄作为流动相，流速0.6ml.min^-1。

分析方法和计算

理论CO₂浓度根据Favaro等(2015)计算。葡萄糖当量定义为淀粉完全水解产生的葡萄糖质量，即每克淀粉1.11克葡萄糖。基于可用的葡萄糖当量计算可用碳(100％水解底物中的mol C)，并且将碳转化率定义为基于摩尔碳转化成可发酵产物的淀粉百分比。该碳转化率从乙醇、葡萄糖、麦芽糖、甘油、乙酸和CO₂浓度计算。将乙醇收率(理论收率的％)计算为为每克消耗的葡萄糖产生的乙醇的量。基于每小时产生的乙醇滴度(g.l^-1.h^-1)计算乙醇生产速率。

统计分析

使用学生t检验分析数据。

结果

重组淀粉酶的功能性表达

使用酿酒酵母Y294菌株作为重组淀粉酶的异源基因表达的宿主。构建重组菌株以表达α-淀粉酶或葡糖淀粉酶编码基因(表1)，并分别使用酿酒酵母Y294[AmyA]和Y294[GlaA]菌株作为基准菌株，评估它们水解玉米淀粉的能力(Viktor等，2013)。在该研究中评估的所有重组菌株都能够水解可溶性淀粉(在平板测定期间通过水解区域证明-数据未显示)。然而，当与表达amyA和glaA基因的基准酿酒酵母Y294菌株相比时，数种淀粉酶候选物显示出显著更低水平的胞外活性(nkat.ml^-1)(数据未显示)。因此，在进一步评估中省略以下基因：来自出芽短梗霉、灰腐质霉和疏棉状嗜热丝孢菌的天然葡糖淀粉酶，以及来自新缝匠菌、微小根毛霉的经密码子优化的α-淀粉酶，和来自嗜热毛壳菌和密集踝节菌的经密码子优化的葡糖淀粉酶。ateA、apuA、temA、ateG和temG基因的不同基因变体含有不同的DNA序列，但编码相同的氨基酸序列(对于成熟蛋白质而言)。

α-淀粉酶

ateA_Nat基因由酿酒酵母Y294[AteA_Nat]菌株有效表达，但胞外活性水平始终低于酿酒酵母Y294[AmyA]基准菌株(图2a)。用天然XYNSEC(酿酒酵母Y294[AteA_Nat-XYNSEC])替换天然分泌信号不会导致胞外活性或分泌的AteA量的显著差异(图2a和2d)。AmyA和AteA的胞外蛋白水平相似(图2d)。

酿酒酵母Y294[ApuA_Nat]和Y294[TemA_Nat]菌株对可溶性淀粉展示出比酿酒酵母Y294[AmyA]基准菌株更高的胞外α-淀粉酶活性(图2b和2c)。由于酶浓度的降低，apuA_Nat和temA_Nat基因的密码子优化导致较少的胞外活性(图2e和2f)。改变分泌信号也导致胞外酶浓度降低，对胞外活性有负面影响(图2c和2d)。

上清液的SDS-PAGE分析表明大部分这些α-淀粉酶被糖基化。ApuA和AteA蛋白质物质(计算分子量分别是65.25kDa和64.14kDa)(图2b和2d)是糖基化最低的，具有约70kDa的推定重组大小，而TemA(计算分子量是66.29kDa)具有更高的糖基化程度(图2f)和约90kDa的推定大小。AmyA蛋白在110和150kDa之间的大量异源涂片与之前的报道(Viktor等，2013)一致。

葡糖淀粉酶

用XYNSEC序列替换ateG_Nat分泌信号提高了胞外葡萄糖淀粉酶活性，但小于酿酒酵母Y294[GlaA]菌株所展示的活性(图3a)。酿酒酵母Y294[AteG_Opt-XYNSEC]和Y294[AteG_Nat-XYNSEC]菌株产生相似的活性水平，其超过了含有天然ateG分泌信号的菌株产生的活性。酿酒酵母Y294[AteG_Opt-NatSS]菌株不分泌可见的蛋白质(图3c)，证实天然ateG分泌信号负面地影响蛋白质分泌。尽管胞外活性增加，但密码子优化对产生的AteG蛋白的细胞外量没有可见的影响(图3a和3c)。

当对temG基因序列进行密码子优化时，观察到胞外葡萄糖淀粉酶活性显著增加(图3b)。在72小时，酿酒酵母Y294[TemG_Opt]菌株的胞外活性比酿酒酵母Y294[TemG_Nat]菌株高>3倍，比Y294[GlaA]基准菌株高>10倍。改变用于表达temG的分泌信号表明经优化的temG分泌信号有助于增强的蛋白质分泌和胞外活性(图3b和3d)，而替换为XYNSEC分泌信号则具有负面影响。

上清液的SDS-PAGE分析表明这些葡糖淀粉酶是糖基化的。AteG蛋白质物质(计算分子量为65.73kDa)(图3c)具有约95kDa的推定大小，而TemG蛋白质(计算分子量为63.57kDa)糖基化较低，推定大小约为85kDa(图3d)。此外，使用SDS-PAGE可视化的重组蛋白质物质的强度显示与所有淀粉酶的胞外酶活性水平相关。

生玉米淀粉发酵

然后使用在酿酒酵母Y294中表达时产生最高胞外活性水平的淀粉酶编码基因(apuA_Nat、ateA_Nat、temA_Nat、temA_Opt、ateG_Nat-XYNSEC、temG_Nat and temG_Opt)以及参照基因(amyA和glaA)来构建产生α-淀粉酶和葡糖淀粉酶组合的淀粉分解性菌株(表1)。评估重组酵母菌株在限氧(oxygen-limited)条件下在高底物负载下水解生淀粉和发酵葡萄糖的能力。

在192小时，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株产生最高的乙醇浓度(62.2g.l^-1)，这是理论值的59.7％(图4a)。120小时后，该菌株产生51.7g.l^-1乙醇，这代表相对于酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株提高1.6倍(p＝0.0013)。

酿酒酵母Y294[TemG_Opt-ApuA_Nat]和Y294[TemG_Opt-AteA_Nat]菌株分别产生的38.6g.l^-1和39.4g.l^-1的乙醇水平也高于基准菌株(在120小时)。酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株在发酵192小时后累积了46.3g.l^-1残余葡萄糖(图4c)。

与酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株相比，表达TemG_Nat-AmyA、TemG_Nat-AteA_Na、TemG_Nat-ApuA_Nat和AteG_Nat-XYNSEC-AmyA酶组合的酿酒酵母Y294菌株产生更少的乙醇(图4a和4b)，几乎没有检测到残余葡萄糖(图4d)。总之，图4c所示的结果表明，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株优于其它菌株，并且该酶组合对水解生玉米淀粉是有效的。在192小时，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株展示的碳转化率比酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株显示的碳转化率高57％，而Y294[TemG_Opt-AteA_Nat]菌株产生的结果与基准菌株相当(表3)。

表3.在具有葡萄糖(5g.l-1)和生玉米淀粉(200g.l-1)的2×SC^-URA肉汤中在30℃发酵192小时后，由酿酒酵母Y294菌株形成的产物

¹CO₂浓度是从产生的乙醇推导出的

²乙醇收率(理论收率的％)计算为每克消耗的糖产生的乙醇的量(在特定的时间点)

³基于每小时产生的乙醇滴度(g.l^-1.h^-1)计算乙醇生产速率

在2个发酵温度(26℃和30℃)在2升生物反应器(1升工作体积)中对酿造酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株进行评价(图5)。192小时后，在26℃的发酵温度的最终乙醇浓度(83.8g.l^-1)显著更高增加(图4a)，但碳转化率相似(79％～81％)。192小时后，发酵温度的降低导致乙醇浓度提高了1.8倍，并且在26℃的发酵温度没有检测到残留的葡萄糖(图4a)。在192小时后，对于两种发酵类型(100毫升瓶发酵和生物反应器)，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株(在30℃)展示的碳转化率相似，分别为85％和81％(图4a和5b)。

讨论

数个研究小组已经独立地研究了来自各种真菌的淀粉酶选择，而生淀粉水解酶有利于淀粉转化为乙醇(Robertson等，2006；Viktor等，2013；Favaro等，2015；Celińska等，2015)。所有淀粉酶中约10％含有淀粉结合结构域(SBD)(Sun等，2010)，其经典地与这些酶对生淀粉颗粒的吸附相关，由此增强淀粉分解速率和随后的水解(Santiago等，2005；Mitsuiki等，2005)。因此，对于这项研究，当选择淀粉酶以用于在酿酒酵母中表达时，SBD的存在是前提条件。

异源表达淀粉酶基因，以选择具有最高胞外酶活性的酶并研究同义密码子使用对基因表达的影响(表1)。在这项研究中，与基准菌株相比，数种淀粉酶候选物表现出显著低水平的胞外活性(数据未显示)。因此，进一步的研究省略了以下基因：来自出芽短梗霉、灰腐质霉和疏棉状嗜热丝孢菌的天然葡糖淀粉酶，以及来自新缝匠菌、微小根毛霉的经优化的α-淀粉酶，和来自嗜热毛壳菌和密集踝节菌的经密码子优化的葡糖淀粉酶。

高水平的蛋白质表达可以与密码子适应指数(CAI)相关联(Carbone等，2003)。认为1.0的CAI值是理想的，而GenScript推荐CAI>0.8被评定为在所需的表达生物体中表达良好。使用GenScript的OptimumGeneTM(www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_ analysis)分析基因的CAI值，表明所有的CAI值在对基因进行优化时增加。GenScript的基因优化算法旨在提高基因表达，因此针对在酿酒酵母中表达而对本研究中的合成淀粉酶基因密码子进行优化。然而，该研究的结果表明，密码子优化不保证基因表达和蛋白质分泌增加(图2和3)

表达apuA_Nat和temA_Nat基因的菌株优于分别表达经密码子优化的对应物apuA_Opt-NatSS/apuA_Opt-OptXYNSEC和temA_Opt的菌株(图2b和2c)，而temG编码序列的优化导致由酿酒酵母Y294[TemG_Opt]菌株分泌的TemG_Opt蛋白显著增加(图3d)。增加的重组蛋白分泌与增加的胞外活性水平相关，这表明具有相似的比活性(图2e和2f)，并且SDS-PAGE分析表明密码子优化不影响淀粉酶蛋白大小(图2和3)。基于推导的氨基酸序列，未糖基化淀粉酶的预测分子量为约64kDa～70kDa，这与之前关于类似淀粉酶的报道一致(Gupta等，2003)。

temA_Nat的CAI为0.61，相比之下，temA_Opt的CAI为0.91。然而令人意外的是，酿酒酵母Y294[TemA_Nat]菌株在72小时后产生的胞外α-淀粉酶活性比酿酒酵母Y294[TemA_Opt]菌株高59％。temG_Nat基因的CAI为0.58，相比之下，temG_Opt的CAI为0.91。酿酒酵母Y294[TemG_Nat]和Y294[TemG_Opt]菌株的胞外葡糖淀粉酶活性，与酿酒酵母Y294[GlaA]基准菌株相比，分别提高>3倍和10倍。因此，即使是源自同一物种的基因(本例中为埃默森篮状菌)，在天然基因和经密码子优化的基因之间也观察到蛋白质分泌和胞外酶活性的显着差异。因此，不能仅依赖CAI值来改善基因表达。

将重组蛋白质分泌到培养基中简化了下游纯化方法(Damasceno等，2012)。分泌信号用于将前肽引导至内质网(ER)，然后通过分泌途径分泌(Futatsumori-Sugai和Tsumoto,2010)。一旦进入ER，成熟肽折叠成其天然结构，并且有许多因素影响这种折叠过程(Tyo等，2012)。酵母分泌重组蛋白是生物技术领域的关键工业目标，并且已经在改善蛋白质分泌方面作出重大努力。该过程依赖靶蛋白、宿主菌株和分泌信号序列(Hashimoto等，1998)。因此，信号肽代表提高分泌蛋白浓度的重要因素。

来自里氏木霉β-木聚糖酶2基因的XYNSEC分泌信号已成功地用于分泌许多蛋白质(van Wyk等，2010；van Rensburg等，2012；Favaro等，2013)，并且在本研究中用于比较目的。选择用于本研究的所有天然酶使用其天然分泌肽成功地分泌，并且用XYNSEC序列替换天然ateG信号肽编码序列导致细胞外活性增强(图3a)。然而，一般来说，XYNSEC分泌信号比蛋白质的天然分泌信号效力低。

在鉴定了成功的淀粉酶候选物之后，在酿酒酵母Y294中表达新的基因组合，以获得适合于生淀粉CBP的淀粉分解性酵母。之前据报道基因工程化菌株的淀粉发酵受到葡萄糖淀粉酶活性的限制(Inlow等，1988)，但在最近的一篇综述中，生淀粉水解的限制因素归因于α-淀粉酶活性(等，2015)。淀粉类生物质(用作底物)的类型可能影响淀粉酶的比例，但是如果重组的淀粉分解性酵母能够产生高活性的酶，则确切的比例不应该是限制因素。

在200g.l^-1生玉米淀粉培养期间，酿酒酵母中α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶组合的同时表达导致不同的乙醇产量(图4a和b)。72小时后，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株展示的碳转化率比酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株高2.7倍。在发酵的早期阶段，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-ApuA_Nat]和Y294[TemG_Opt-AteA_Nat]菌株也优于酿酒酵母Y294[AmyA-GlaA]基准菌株(48小时后乙醇浓度>2.4倍)。与由Yamakawa等人(2012)构建的经修饰的淀粉分解性酵母菌株(其从200g.l^-1生玉米淀粉产生46.5g.l^-1乙醇)相比，获得了实质上更高的乙醇浓度。此外，与Salehi Jouzani和Taherzadeh最近综述(2015)中列出的淀粉分解性CBP系统相比，这些结果显示出相当大的改善。在生玉米淀粉上由酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株展示的碳转化率(表3)代表了在利用高底物负载和低接种量的发酵中对于淀粉分解性酿酒酵母Y294菌株报道的最高值。

总之，具有更高水平的葡糖淀粉酶的酿酒酵母重组菌株(即，表达temG_Opt葡糖淀粉酶的那些菌株)比具有temG_Nat葡糖淀粉酶的酿酒酵母Y294菌株更好地水解淀粉。但是，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]与表达temG_Opt葡糖淀粉酶的任何其它重组酿酒酵母Y294菌株相比，展示显著更高的碳转化率(约1.6～2.0倍)(表3)。这表明埃默森篮状菌TemG_Opt和TemA_Nat酶之间存在独特的协同效应，其优于其它TemG_Opt-α-淀粉酶组合。

对于塔宾曲霉酶组合也观察到协同作用。在192小时，酿酒酵母Y294[GlaA-AmyA]菌株(54％)展示的碳转化率比酿酒酵母Y294[TemG_Opt-AmyA]菌株(49％)展示的碳转化率高9％(表3)，虽然TemG_Opt在活性方面优于GlaA(图3)。这强调了比较所选表达宿主中不同酶组合的重要性。即使胞外淀粉酶活性不同(图2和图3)，由于它们的作用方式和对生淀粉的亲和力，源自相同宿主的酶可以具有优良的协同水解作用。等(2013)开发了数学模型来解释葡萄糖淀粉酶和两种α-淀粉酶(以不同组合)之间的协同作用，并指出淀粉酶的类型和组合影响了酶的协同作用。此外，α-淀粉酶是否被分类为“液化”或“糖化”也可归因于协同关系(Liakopoulou-Kyriakides等人，2001)。

与AteA_Nat酶相比，AmyAα-淀粉酶对可溶性淀粉展示更大的胞外活性(图2a)。然而，在发酵研究期间，AteA_Natα-淀粉酶组合与使用AmyA的酶组合相比促进了更快的生淀粉转化速率(图4)。当与TemG_Opt和TemG_Nat葡糖淀粉酶分别组合使用时，AteA_Nat也有助于更高的乙醇生产水平(与AmyA相比)(图4和表3)。这表明，与AmyA酶相比，AteA_Nat对生淀粉的表现可以更好，或者其与TemG葡糖淀粉酶具有更好的协同效应。

不同的是，酿酒酵母Y294[ApuA_Nat]菌株(表达来自出芽短梗霉的天然α-淀粉酶)产生的胞外活性比酿酒酵母Y294[AmyA]基准菌株高2.7倍(图2a和2b)，但总体上由淀粉分解性酿酒酵母Y294[TemG_Opt-ApuA_Nat]菌株展示的碳转化率比酿酒酵母Y294[TemG_Opt-AmyA]菌株(表3)低13％。因此，与ApuA_Nat相比，AmyA可能具有提高的生淀粉转化能力，或者与TemG_Opt具有更好的协同关系(图4a)。Chi等(2009)证明来自出芽短梗霉的葡糖淀粉酶对马铃薯淀粉颗粒(B型结晶度)比对生玉米淀粉颗粒(A型结晶度)的水解更好，但B型淀粉结构通常更耐酶水解(Man等人，2013)。与马铃薯淀粉相比，玉米淀粉具有更高的直链淀粉含量和更小的颗粒直径(Hii等，2012)，并且已知这些性质的组合影响淀粉水解的速率和程度(Naguleswaran等，2013)。本研究的结果(图2和图4)强调了淀粉结构影响不同淀粉分解酶的作用的一个主要实例。

已知酿酒酵母以其耐乙醇性而闻名，但Y294菌株在30℃的温育温度被发酵条件抑制，因此乙醇浓度不超过63g.l^-1(图5和6)。酿酒酵母Y294实验室菌株发酵性能差，这不是由于重组蛋白分泌不足或酶活性低，而是因为葡萄糖浓度在整个酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株发酵期间迅速增加(图4b)。

通过重组酿酒酵母菌株进行的生淀粉发酵通常由于足够的酶分泌所需的长培养时间而不利。然而，从酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株的发酵结果(图5)可以清楚地看出，体积生产率和淀粉转化率高。此外，26℃的培养温度缓解了酵母细胞的生理胁迫，从而允许得到提高的葡萄糖转化。192小时后，酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株展示的碳转化率与分别100ml血清瓶和生物反应器发酵相似(81％～85％)(表4.3和图4.5b)。因此表明较低的温度是有利于葡萄糖发酵的主要因素，并且胞外酶活性不受较低温度的显著影响(因为在两种发酵温度下最终的碳转化率保持相同)。因此，降低发酵温度证实有可能增加葡萄糖向乙醇的转化并提高理论乙醇收率。

Schmidt等(2006)提供了乙醇耐受性的几种定义，其中之一是乙醇浓度对细胞代谢糖的能力的影响。当酵母暴露于积累的乙醇浓度时发生生物化学和生理响应(Schmidt等，2006)，结果酿酒酵母Y294菌株可能经历膜结构和蛋白质功能受损。乙醇的存在改变了磷脂双分子层的组成，使其可渗透小分子。由于许多细胞功能依赖于膜完整性，高乙醇浓度可能对酵母细胞有许多不利影响。在本研究中，通过降低发酵温度至26℃可以避免乙醇积累的负面影响。

结论

目前，工业尚未实现同时表达α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的淀粉分解性CBP酵母。本研究集中于选择具有将生淀粉转化成葡萄糖的能力的高活性淀粉酶。这导致对用于生淀粉水解的新型淀粉酶组合的鉴定和评估。重组酿造酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株的优点在于其在192小时内在200g.l^-1生玉米淀粉发酵中转化85％的可利用碳的能力。因此，这种独特的TemG_Opt-TemA_Nat酶组合代表了未熟化淀粉的工业转化的有前景的候选物。

实施例2:淀粉分解性CBP酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n菌株的构建

材料和方法

培养基和培养条件

除非另有说明，所有的化学品都是分析级的，并且获自Merck(Darmstadt,德国)。使用大肠杆菌DH5α(Takara Bio Inc.)以用于载体繁殖。在含有100μg.ml^-1氨苄青霉素的Luria Bertani琼脂(Sigma-Aldrich,德国)上选择大肠杆菌转化体，并在37℃在含有用于选择压力的100μg.ml^-1氨苄青霉素的Terrific Broth(12g.l^-1胰蛋白胨、24g.l^-1酵母提取物、4ml.l^-1甘油、0.1M磷酸钾缓冲液)中培养。

将酿酒酵母亲本菌株保持在YPD琼脂平板(10g.l^-1酵母提取物、20g.l^-1蛋白胨、20g.l^-1葡萄糖和20g.l^-1琼脂)上。选择酿酒酵母Y294转化体并将其保持在SC^-URA琼脂平板(6.7g.l^-1无氨基酸的酵母氮源(BD-Diagnostic Systems,Sparks,MD)、20g.l^-1葡萄糖和1.5g.l^-1酵母合成省却培养基补充物(Sigma-Aldrich,德国)和20g.l^-1琼脂)上。将酿酒酵母菌株在旋转摇床(200rpm)中于30℃在125ml Erlenmeyer烧瓶中有氧培养，所述锥形瓶含有20ml双倍强度SC^-URA培养基(2×SC^-URA，含有13.4g.l^-1无氨基酸的酵母氮源(BD-Diagnostic Systems,Sparks,MD)、20g.l^-1葡萄糖和3g.l^-1酵母合成省却培养基补充物)。用于酿酒酵母Y294菌株的发酵培养基由含有5g.l^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的2×SC^-URA组成，而用于来自Fermentis的酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n菌株的培养基是含有5g.l^-1葡萄糖和200g.l^-1生玉米淀粉的YP。加入氨苄青霉素(100μg.ml^-1)和链霉素(50μg.ml^-1)以抑制细菌污染。除非另有说明，所有的培养物都接种至1×10⁶个细胞/ml的浓度。

使用含有2％淀粉的SC培养基(省略酵母合成省却培养基)来维持工业转化体。在SC-Ac平板(用0.6g.l^-1乙酰胺和6.6g.l^-1K₂SO₄代替(NH₄)₂SO₄的SC平板)上选择酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n转化体，并将其转移至SC-Acr平板(用0.71g.l^-1丙烯酰胺代替乙酰胺的SC-Ac)。对于平板测定，向SC-Ac和SC-Acr平板中加入2％可溶性淀粉。使用SC-Fac平板(含有2.3g.l^-1氟代乙酰胺的SC培养基)以从转化体中除去yBBH1-amdSYM载体。所有培养基中的pH用NAOH调节至6.0。

菌株和质粒

本研究中使用的细菌和酵母菌株的基因型以及质粒总结于表4中。

表4.本研究中使用的菌株和质粒

¹Ethanol Red^TM Version 1,称为Ethanol Red^TM

²淀粉分解性转化体(T)含有ENO1_P-temA_Nat-ENO1_T和ENO1_P-temG_Opt-ENO1_T基因盒的整合拷贝，数值是指筛选过程期间的转化体数量

³天然埃默森篮状菌α-淀粉酶的登录号XM_013469492(temG_Nat)

⁴天然埃默森篮状菌葡糖淀粉酶的登录号AJ304803(temG_Opt编码经密码子优化的基因)

⁵pUG-amdSYM质粒的登录号P30669

DNA操作

所有DNA操作和大肠杆菌转化都遵循标准方案(Sambrook等，1989)。用于限制性消化和连接的酶购自Inqaba Biotec并按照供应商的推荐使用。使用Zymoclean^TM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research,美国)从0.8％琼脂糖凝胶中洗脱消化的DNA。分别使用Delta-ENO1(表5)以及yBBH1[TemA_Nat]和yBBH1[TemG_Opt]载体(参见实施例1)作为模板，通过PCR扩增temA_Nat和temG_Opt基因盒(ENO1启动子和终止子)。

质粒构建

使用amdSYMCas引物(表5)通过PCR从pUG-amdSYM扩增TEF_P-amdSYM-TEF_T基因盒，并使用酵母介导的连接(YML)将其克隆到yBBH1中，产生质粒yBBH1-amdSYM(图6a)。棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)TEF启动子调控乙酰胺酶编码基因(amdS)的表达，以用于在SC-Ac平板上选择转化体。从酿酒酵母Y294[amdSym]菌株中回收yBBH1-amdSYM质粒并将其转化到大肠杆菌DH5α中以获得高浓度的质粒DNA。使用高纯度质粒分离试剂盒(Roche,德国)分离质粒DNA，并使用ABIPRISM^TM 3100遗传分析仪(CAF,Stellenbosch University)通过双脱氧链终止法进行序列验证。

表5.本研究中设计和使用的PCR引物，相关的限制性位点加下划线(EcoRI＝gaattc；XhoI＝ctcgag,BamHI＝ggatcc,BglII＝agatct)

酵母转化

电感受态酿酒酵母Y294、Ethanol Red^TM和M2n细胞根据Cho等(1999)制备，并通过使用BioRad系统(GenePluserXcell TM,Bio-Rad,Hercules,California)的电穿孔进行转化。为了转化工业菌株，将淀粉酶(temA_Nat和temG_Opt ENO1线性DNA盒)和含有选择标记的yBBH1-amdSYM载体(图6)同时转化到酵母的基因组中。电穿孔后，立即将1ml YPDS加入比色杯中。细胞在30℃温育3小时。通过将转化混合物铺板在含有2％淀粉的SC-Ac平板(从Solis Escalante等，2013改造)上并在30℃温育4天来选择转化体。通过使用基因特异性引物的PCR确认线性表达盒DNA整合到酵母基因组中(表5)。

标记物再循环

如Solis-Escalante等(2013)所述，在工业重组菌株上进行质粒消除(Plasmidcuring)。含有乙酰胺标记物的yBBH1-amdSYM的去除通过使细胞在5ml液体YPD中生长过夜并将20μl转移到含有10mL SC-Fac的125ml锥形瓶(Erlenmeyer flask)中来实现。通过在含有2％淀粉的SC-Fac固体培养基上铺板100μl培养物获得无标记物单集落，并通过集落PCR确认。使用ZR真菌/细菌DNA小量制备试剂盒(Zymo Research,美国)分离淀粉分解性菌株的基因组DNA，然后将其用作实时PCR的模板。

定量PCR

用于实时PCR的Oligo引物使用IDT的PrimerQuest工具(eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index)设计。特别注意引物长度(18bp～22bp)，退火温度(58℃～62℃)、碱基组成、3'端稳定性和扩增尺寸(75bp～100bp)。所有引物均由Inqaba Biotech(南非)以反相柱纯化法合成并列于表6中。所有引物的性能通过常规PCR实验证实，以确保未形成引物二聚体并确认具有正确的扩增子长度的单个区域。

表6.候选参考基因和目标基因列表(包括每个基因的引物和扩增子的细节)

使用白壁PCR板(96孔)在StepOne实时聚合酶链式反应(PCR)仪器(AppliedBiosystems)上进行实时PCR。根据制造商的说明书(KAPA Biosystems)使用A×2KAPA HRM Fast Master Mix(含有快速校读聚合酶、dNTP、稳定剂和染料)。在含有2.5mM MgCl₂、0.2μM各引物和1ng～10ng DNA的总体积20μl中准备反应。循环条件如下设定：在95℃起始模板变性30秒，然后45个循环的在95℃变性5秒、合并的引物在60℃退火/延伸20秒，并在95℃最后变性1分钟以确保所有扩增子完全融化。使用yBBH1-TemG_Opt-TemA_Nat质粒DNA来利用表6中列出的引物对建立标准曲线(从1×10⁷拷贝开始，并制备1:10连续稀释液)。对于所有样品，将基因组DNA浓度标准化为10ng。使用StepOne软件(Applied Biosystems)计算每个引物组的PCR效率。利用URA3基因作为参考基因，使用标准曲线法计算temG_Opt和temA_Nat基因的拷贝数。

生淀粉发酵

将酿酒酵母Y294预培养物在500ml Erlenmeyer烧瓶中的100ml 2×SC^-URA培养基中培养，并且酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n预培养物在YPD培养基中类似地培养。所有的预培养物在30℃以200rpm振荡温育直至静止期。酿酒酵母Y294发酵在2×SC^-URA培养基中进行，而酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n发酵在YP培养基(10g.l^-1酵母提取物和20g.l^-1蛋白胨)中进行。所有培养基补充有200g.l^-1生玉米淀粉和5g.l^-1葡萄糖作为碳水化合物源，并接种来自静止期预培养的10％(v.v^-1)接种物。加入氨苄青霉素(100μg.ml^-1)和链霉素(50μg.ml^-1)以抑制细菌污染。在30℃和37℃在磁力多级搅拌器平台(Velp Scientifica,Italy)上进行搅拌和温育，每天通过注射针穿过橡胶塞进行采样。发酵过程中使用的外源酶是从Dupont Industrial Biosciences(Palo Alto,California)获得的STARGEN^TM 002 GSHE(现称为STARGEN^TM)，活性最低为570GAU.gm^-1(www.genencor.com)，并根据制造商的说明使用。STARGEN^TM含有在里氏木霉中表达的川地曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶，它们协同作用而将颗粒淀粉水解成葡萄糖(Huang等，2015)。来自黑曲霉(Aspergillus niger)的外源淀粉葡糖苷酶(E.C.3.2.1.3)购自Sigma-Aldrich并用于用额外的葡萄糖淀粉酶(现称为商业葡糖淀粉酶)刺激发酵。

对于利用Ethanol Red^TM T12菌株的生物反应器实验，预培养物在30℃在2升Erlenmeyer烧瓶中的400ml YPD中培养。发酵在Minifors 2生物反应器(INFORS HT,Bottmingen,瑞典)中进行，所述生物反应器含有补充有200g.l^-1生玉米淀粉和5g.l^-1葡萄糖作为碳水化合物源的YP。在3升的总工作体积中使用10％(v.v^-1)接种物。加入氨苄青霉素(100μg.ml^-1)和链霉素(50μg.ml^-1)以抑制细菌污染。在30℃、34℃和37℃进行发酵，以300rpm搅拌。

HPLC和分析方法

使用由液相色谱泵、自动取样器和折射率(RI)检测器组成的Surveyor Plus液相色谱仪(Thermo Scientific)，利用高效液相色谱(HPLC)对乙醇、葡萄糖、麦芽糖、甘油和乙酸浓度进行定量。在80℃在Rezex RHM Monosaccharide 7.8×300mm column(00H0132-K0,Phenomenex)上分离化合物，以5mM H₂SO₄作为流动相，流速0.6ml.min^-1。

理论CO₂浓度根据Favaro等(2015)计算。可用碳(在100％水解底物中的mol C)基于可用的葡萄糖当量计算，并且将碳转化率定义为基于摩尔碳转化成可发酵产物的淀粉百分比。该碳转化率从乙醇、葡萄糖、麦芽糖、甘油、乙酸和CO₂浓度计算。将乙醇收率(理论收率的％)计算为每克消耗的糖产生的乙醇的量。基于每小时产生的乙醇滴度(g.l^-1.h^-1)计算乙醇生产速率。

统计分析

使用学生t检验分析数据。

结果

埃默森篮状菌temA_Nat和temG_Opt基因编码用于生产生物燃料的有价值的淀粉酶，并在生玉米淀粉培养期间产生和分泌。将侧接有δ序列的线性ENO1_P-temA_Nat-ENO1_T和ENO1_P-temG_Opt-ENO1_T DNA基因盒(图6b)扩增，并整合到酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n工业菌株基因组中的δ整合位点中，以产生多拷贝整合体(Kim等，2011)。amdS基因存在于附加型载体上(图6a)，以能够消除质粒以容易将标记再循环。

工业菌株筛选

在含有2％玉米淀粉的SC平板上筛选酿酒酵母转化体，并选择那些水解产生区以用于进一步测试。使用PCR来确认ENO1_P-temA_Nat-ENO1_T和ENO1_P-temG_Opt-ENO1_T基因盒的整合。然后在发酵条件下评估显示最高胞外淀粉酶活性的四种菌株(图7a和7b)。在发酵的早期阶段期间注意到由工业菌株展示的碳转化率的显著差异(图7b)。然而，192小时后，碳转化率开始平稳，代表玉米淀粉转化率为约80％。酿酒酵母Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株水解淀粉并比酿酒酵母Ethanol Red^TM T1和M2n T2菌株更快地发酵糖(图7b和表7)。因此选择他们以在不同的发酵条件下进一步评估。

通过将培养物铺板到含有2％可溶性玉米淀粉的SC-FAc平板上进行菌株的质粒消除。使用来自经消除的淀粉分解性酿酒酵母转化体的基因组DNA进行定量PCR测定，以分别确定temA_Nat和temG_Opt基因的整合拷贝数(图7d)。酿酒酵母Ethanol Red^TM T1、M2n T1and M2n T2菌株包含temA_Nat和temG_Opt基因盒的单拷贝，而酿酒酵母Ethanol Red^TM T12包含1个拷贝的temA_Nat和2个拷贝的temG_Opt。

表7.在30℃发酵144小时后酿酒酵母菌株的产物形成

¹CO₂浓度是从产生的乙醇推导出的

²乙醇收率(理论收率的％)计算为每克消耗的葡萄糖产生的乙醇的量

³基于每小时产生的乙醇滴度(g.l^-1.h^-1)计算乙醇生产速率

将淀粉分解性酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株在30℃和37℃的发酵活力与实验室酿酒酵母Y294[TemG_Opt-TemA_Nat]菌株在30℃的发酵活力进行比较(图8)。酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株能够在30℃的发酵温度下发酵所有可用的葡萄糖(图8b)，并且在发酵期间中产生的甘油明显较少(图8d)。这表明乙醇更有效的碳转化率(Bideaux等，2006)。然而，在37℃，144小时后乙醇水平不显著增加(图8a)，存在高水平的残余葡萄糖(264小时后>g.l^-1)。在两种发酵温度下麦芽糖浓度相似(图8c)。

随后进行不同培养基条件的评估(图9)以确定缓冲的发酵培养基(pH 5)、培养基类型(YP对SC)或添加额外的氮(以(NH₄)₂SO₄形式)是否可以增加在37℃的发酵温度的酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株的葡萄糖发酵效率。YP淀粉培养基(未缓冲的)具有低于5的pH，与缓冲的YP培养基(pH5)相比，这对于乙醇生产是有利的(图9a)。向SC缓冲的发酵液中加入额外的硫酸铵(10g.l^-1)不增加乙醇浓度或碳转化率(图9a和9d)，表明发酵液中有足够的氮含量。

当使用YP培养基时观察到增加的残余葡萄糖浓度(图9b)，而在SC培养基中进行发酵时注意到更高的甘油浓度(图9c)。与SC培养基相比，YP的营养物质更多，并且由生物合成形成的NADH形成减少，因此甘油较少。较高的甘油浓度有助于增加碳转化率值，特别是在发酵的前120小时。总之，图9中的结果显示培养基组成(SC对YP和pH)影响乙醇和甘油产生。然而，培养基类型的变化仅影响发酵的前120小时期间的碳转化率百分比。在192小时后，碳转化率值的差异较不明显(在92％～100％之间)。

用STARGEN^TM进行发酵

根据制造商的说明书，推荐的STARGEN^TM剂量计算为1.42μl.g^-1淀粉。在200g.l^-1玉米淀粉时将淀粉分解性酿酒酵母乙醇Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株与模拟常规SSF方法(亲本酿酒酵母Ethanol Red^TM/M2n菌株+STARGEN^TM)进行比较。基于推荐的酶加载百分比，评估三种不同的酶剂量：2.8μl(10％)、5.6μl(20％)和14μl(50％)，并且与具有28μlSTARGEN^TM/100毫升(占推荐剂量的100％)的SSF进行比较。在发酵的前72小时期间，外源酶的添加显著增加了乙醇浓度并提高了乙醇生产(乙醇g.l^-1.h^-1)(图10和11)。

在30℃的发酵温度，酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n亲本菌株的乙醇曲线对于相应条件是相似的(图10a和图11a)。48小时后，与利用补充有28μl STARGEN^TM的未经转化的酿酒酵母Ethanol Red^TM相比，补充有2.8ul STARGEN^TM的酿酒酵母Ethanol Red^TM T1菌株产生相同量的乙醇(52g.l^-1)，并展示出相似的碳转化率(50％)(表8)。与酿酒酵母M2n亲本菌株相比，补充有2.8μl STARGEN^TM的酿酒酵母M2n T1菌株观察到类似的趋势(图11a和c)。

96小时后，补充有2.8μl STARGEN的酿酒酵母Ethanol Red T12菌株产生的乙醇(90.4g.l^-1)与补充有5.6μl STARGEN的酿酒酵母Ethanol Red T12菌株产生的乙醇量相似(92.0g.l^-1)(图10)。在96小时，这两个菌株展示的碳转化率也相似(在88％～90％之间)(图10)。与补充有28μl STARGEN的酿酒酵母Ethanol Red对照菌株相比(在96小时后产生76.8g.l^-1乙醇并展示75％的碳转化率)，这代表乙醇的显著增加。因此，添加2.8μl STARGEN(推荐剂量的10％)足以产生与SSF对照相当的结果。

与酿酒酵母Ethanol Red^TM等效菌株相比，在30℃的发酵温度对于酿酒酵母M2n菌株观察到相似的结果和趋势(图10和图11)。然而，酿酒酵母M2n T1转化体的最终乙醇浓度在192小时后高于>10g.l^-1(p＝0.0392)。在30℃，发酵液中葡萄糖和麦芽糖的残留水平低(表8)，表明所有的淀粉分解性菌株对糖的吸收迅速。

表8.在补充有不同剂量的STARGEN^TM的YP培养基中，在30℃发酵192小时后酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n菌株的产物形成

¹CO₂浓度是从产生的乙醇推导出的

³基于每小时产生的乙醇滴度(g.l^-1.h^-1)计算乙醇生产速率

在37℃，酿酒酵母Ethanol Red T12菌株具有更高的乙醇耐受性，并且能够发酵更长时间(与酿酒酵母M2n T1菌株相比)，在192小时时乙醇浓度增加了2.3倍(图10和11)。尽管重组酿造酵母M2n T1菌株在30℃时产生了更多的乙醇，但是其在更高的发酵温度下受到严重影响(图11)。在37℃，所有酿酒酵母M2n发酵48小时后乙醇浓度平稳(图11b)。在两种发酵温度下(图10c和d)，酿酒酵母Ethanol Red T12菌株展示的碳转化率的程度相似(约83％)，而在30℃酿酒酵母M2n T1菌株展示的碳转化率比在37℃的碳转化率高13％(图11c和11d)。淀粉分解性酿酒酵母Ethanol Red T12和M2n T1菌株在37℃比在30℃时的乙醇生产力更低，37℃的残余葡萄糖水平>40g.l^-1(数据未显示)，这代表了大量的未发酵葡萄糖。总之，结果表明，温度耐受性对工业酿酒酵母Ethanol Red T12和M2n T1菌株的发酵活力起主要作用。与利用未转化菌株和推荐的酶剂量的对照相比，STARGEN的添加与淀粉分解性酵母菌株的组合减少了发酵时间并提高了碳转化率。

菌株比较

在小规模发酵中将酿酒酵母Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株与先前构建的淀粉分解性工业菌株M2n M2n[TLG1-SFA1](Favaro等，2015)进行比较。与M2n[TLG1-SFA1]菌株相比，Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株表现更好(图12)，发酵240小时后产生50gl^-1以上的乙醇，因此证明对于生淀粉水解而言TemG_Opt和TemA_Nat酶组合优良。

5L生物反应器中的发酵

总体上，小规模发酵证明，酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株在更高发酵温度表现最好。该菌株在葡萄糖测定期间也显示出最高的活性水平，因为它具有temG_Opt基因的更多整合拷贝。因此，在生物反应器研究中对Ethanol Red^TM T12进行了进一步评估。5升生物反应器的主要优点是内部温度受控。图13所示的结果显示了当发酵温度升高时对乙醇浓度和碳转化率的影响。在血清瓶发酵期间，内部发酵液温度不能控制，结果内部温度超过温育器设定温度2℃。在144小时后，在内部温度为37℃的生物反应器中和在30℃在100ml血清瓶中的平行发酵中，Ethanol Red^TM T12菌株产生约67g.l^-1乙醇。由于发酵液的温度影响淀粉水解速率，并随后葡萄糖可用于发酵成乙醇，所以菌株的发酵能力受到影响(图13a)，而乙醇浓度不相当(血清瓶与生物反应器)。

在37℃于5升生物反应器实验期间，Ethanol Red^TM T12菌株可以更快地水解淀粉(与在30℃和34℃的生物反应器发酵相比)，并且Ethanol Red^TM T12菌株将所有可用的葡萄糖发酵成乙醇。168小时后，在37℃产生81g.l^-1乙醇，相比之下，在34℃和30℃分别是64g.l^-1和35g.l^-1乙醇(图13a)。此外，在37℃的发酵温度乙醇浓度比在30℃增加至少2倍(在发酵的前7天期间)。因此，这些结果证实，Ethanol Red^TM T12菌株与酿酒酵母Y294菌株(实施例1中)相比更稳健，并且在37℃作为CBP酵母表现良好。

比率测试

协同测试已经允许改善用于底物水解和发酵的酶组合物的使用。酶协同作用是指在溶液中共同起作用的两种以上酶的作用大于其各自作用的总和。传统上，当使用常规转化将淀粉转化成乙醇时，已经使用更高剂量的葡糖淀粉酶。因此，为了确定不同的酶剂量如何影响乙醇生产速率，补充商业葡糖淀粉酶进行使用Ethanol Red^TM T12菌株的发酵(图14)。

用补充有10μl商业葡糖淀粉酶的Ethanol Red^TM T12菌株发酵显著提高了乙醇生产速率。在144小时后，补充葡糖淀粉酶导致乙醇浓度增加29g.l^-1(44％)。此外，如果重组酶的量减少一半(Ethanol Red^TM T12+5ml未转化的Ethanol Red^TM作为接种物)，则乙醇浓度在144小时下降54％(图14a)。图14b显示碳转化率的趋势与乙醇浓度趋势相似。这是因为菌株在30℃的发酵温度能够将所有可用葡萄糖发酵成乙醇。

为了进一步评估生淀粉水解的最佳酶比率，构建仅表达temA_Natα-淀粉酶的Ethanol Red^TM菌株。图15显示了在30℃的小规模发酵期间Ethanol Red^TM TemA_Nat菌株与不同剂量的商业葡糖淀粉酶组合的性能。结果显示，Ethanol Red^TM T12菌株具有次优的比例，通过增加整合基因的拷贝数或通过用小剂量商业酶补充发酵液可以增加乙醇生产。这些结果进一步表明工业乙醇生产可以通过使用重组淀粉分解性酿酒酵母菌株而改善。

讨论

基因整合

初步筛选过程后，选择4个表达temG_Opt和temA_Nat基因盒的重组菌株(酿酒酵母Ethanol Red^TM T1/T12和酿酒酵母M2n T1/T2菌株)以用于进一步评估(图7)。酿酒酵母M2nT1菌株在30℃表现优于酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株，在192小时达到最大乙醇滴度99.4g.l^-1，比酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株高15％(图10a和图11a)。然而，在37℃的血清瓶中发酵时，与酿酒酵母M2n菌株相比，显然酿酒酵母Ethanol Red^TM T12转化体具有更高的发酵活力并且更具乙醇和温度耐受性(图10b和11b)。

与工业酿酒酵母M2n[TLG1-SFA1](图12)和MEL2[TLG1-SFA1]淀粉分解性菌株(Favaro等，2015)(其从200g.l^-1生玉米淀粉产生64g.l^-1乙醇，相当于最大理论乙醇收率的55％)以及酿酒酵母Mnuα1[AmyA-GlaA]菌株(Viktor等，2013)(其产生65.83g.l^-1乙醇(10天后)，代表最大理论乙醇收率的57％)相比，本研究的结果显示淀粉水解和乙醇生产显著改善。在该研究中从重组工业菌株获得的理论乙醇收率是>90％，因此代表了对先前构建的淀粉分解性菌株的显著改善。

乙醇浓度也高于淀粉分解性酵母菌株的报道乙醇浓度(其在120小时发酵后从200g.l^-1生玉米淀粉产生46.5g.l^-1乙醇)(Yamakawa等，2012)。在本研究中表达temG_Opt和temA_Nat基因盒的淀粉分解性酵母菌株在其乙醇生产方面优异，120小时后酿酒酵母Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株分别产生>50g.l^-1和>60g.l^-1乙醇(图10a和图11a)。此外，由于淀粉酶分泌到发酵液中，与在细胞表面显示淀粉酶的重组酵母相比，它们与淀粉颗粒的物理接触增加(Yamakawa等，2012)。这消除了潜在的瓶颈，并促进了淀粉水解的改善，因为生淀粉TemA_Nat和TemG_Opt淀粉酶能够更快地渗透淀粉颗粒并形成孔隙。

STARGEN^TM添加

在用淀粉分解性酿酒酵母Ethanol Red^TM和M2n菌株发酵期间，碳转化率存在初始滞后期，直至48小时(图10c和11c)。这在预料之中，因为菌株首先必须适应发酵条件并重新产生淀粉酶。另一方面，在使用STARGEN^TM的SSF过程中(期间图10a和11a)，酶在发酵开始时是丰富的并且在添加时迅速产生葡萄糖。因此，尽管酿酒酵母Ethanol Red^TM T12和M2n T1菌株能够实现高转化率百分比(图7b)，在发酵开始时补充STARGEN^TM(图10、11和14)提高了乙醇生产性。

在用于生物乙醇生产的工业冷水解装置中，商业性淀粉酶仅在该过程开始时添加，因此其总体效率将随着时间的推移而降低。然而，本发明的淀粉分解性CBP酵母能够连续补充发酵液中的重组酶，从而促进了当用STARGEN^TM补充发酵时总碳转化率的增加(图10c、10d、11c和11d)。据估计，商业化酶添加成本为每加仑4.8美分，相当于从玉米生产乙醇总处理成本的8.3％(Wong等，2010)。因此，本文所述的重组淀粉分解性酿酒酵母EthanolRed^TMT12和M2n T1菌株代表了降低生淀粉水解所需的酶剂量以及能够为连续冷发酵过程提供连续淀粉分解活性的新型替代方法。此外，使用本发明的淀粉分解性酵母将允许简化发酵设计，因为可以绕过预处理步骤和成本((Salehi Jouzani和Taherzadeh，2015)。

发酵温度

有许多其它因素与发酵停滞有关，包括酵母菌株、氮利用率和葡萄糖浓度(Henderson和Block，2014)。然而，认为发酵温度是SSF和CBP策略中乙醇生产的主要瓶颈之一。图9显示了酿酒酵母Ethanol Red^TM T12菌株在不同发酵培养基中的性能，结果证实在37℃，额外的氮(以(NH₄)₂SO₄)形式)未增加葡萄糖至乙醇的发酵。此外，增加常规YP发酵培养基的pH(至pH 5)未改善发酵条件。因此，当使用来自埃默森篮状菌的TemG_Opt和TemA_Nat酶时，较低的pH值对淀粉转化更有利，其最佳pH为约4～4.5(Nielsen等，2002)。

在较高温度下的菌株稳定性和乙醇耐受性是生物燃料工业所期望的两个主要特征。对高温发酵的需求始于20世纪80年代(Abdel Banat，2010)。高温发酵可能有助于进行同时发酵和乙醇提取过程，更适合燃料乙醇生产。运行成本可以降低(特别是在需要冷却发酵容器的气候炎热地区)，并且水解条件得到改善(图13b)。在高温生产乙醇具有数个优点，即降低污染风险、提高乙醇回收率，以及降低冷却水-水排出物的体积(Banat等，1998)。

目前工业上使用的发酵温度为30℃～34℃(Mukhtar等，2010)。然而，乙醇浓度超过3％(w.v^-1)也加剧高温的影响，这影响酵母细胞膜从而引起蛋白质变性。因此，积极追求能够在高于37℃的温度发酵的稳健酵母。由于外生性代谢活性以及高温区域的环境温度，发酵容器的内部温度通常超过温育/外部温度。这随后降低了乙醇生产的效率。因此，重要的是具有能够在温度超过34℃时发酵的稳健酵母(图13a)。

为了证明温度控制的重要性并且研究菌株热稳定性，在血清瓶(在30℃的步入式培养箱中温育)和在温度受控的生物反应器(在30℃、34℃和37℃)中，平行地进行使用Ethanol Red^TM T12菌株的发酵(图13)。当比较30℃发酵(瓶与生物反应器)时，注意到在血清瓶发酵中温育96至168小时，乙醇浓度增加了2倍(图13a)。这证明了内部温度控制对通过CBP酵母从生玉米淀粉生产乙醇的影响。虽然在37℃在血清瓶中进行发酵时存在未发酵的葡萄糖，并由此导致乙醇水平在75g.l^-1～80g.l^-1左右达到平稳(图10b)，但是在37℃的受控温度Ethanol Red^TM T12菌株可以发酵所有的葡萄糖(图13a)。

温度对发酵产物的影响已经被许多不同的研究组公开(Favaro等，2013b；Woo等，2014)。虽然酿酒酵母以其高乙醇耐受性和较高的乙醇浓度而闻名，但其仍然缺乏高于常温的发酵能力(图10b)。此外，约10％(w.v^-1)的乙醇浓度将使酵母的发酵活性降低约50％(Henderson和Block，2014)，并抑制细胞生长和生存力。这导致生产率降低和乙醇收率降低(Stanley等，2010)。为了提高酵母的乙醇耐受性，需要探索乙醇毒性对细胞影响的理解。

重组酿酒酵母Y294和Ethanol Red^TM T12菌株生产乙醇的比较结果与Favaro等(2013b)的研究结果一致。结果显示，在30℃实验室酿酒酵母Y294菌株与在30℃的工业菌株相比发酵活力低。酿酒酵母Y294菌株展示的最佳培养温度为约25℃，而不是约30℃，这能够解释葡萄糖消耗能力的下降。类似地，当不控制培养基的内部温度时，淀粉分解性酵母Ethanol Red^TM T12菌株在37℃的发酵活力比30℃降低(图10b)。

甘油

当使用较低的发酵温度时，观察到降低的甘油浓度，表明在30℃的发酵温度比在37℃发生了更好的乙醇转化率(图8d)。碳源的利用对优化乙醇生产非常重要(Navarrete等，2014)，结果表明发酵培养基影响了甘油生产(图8)。商业上可获得的TransFerm^TM Yield+酵母(Mascoma and Lallemand Biofuels and Distilled Spirts)被工程化成在发酵期间产生明显更少的甘油，从而可以将更多的碳用于乙醇生产。在该研究中，积累的甘油浓度低于常规浓度(10g.l^-1)(Huang等，2015)，因此不会对酵母细胞具有显著影响。

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序列表

<110> 斯坦陵布什大学

<120> 重组酵母及其应用

<130> FAI17ZA5285

<150> GB 1 620 658.3

<151> 2016-12-05

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 622

<212> PRT

<213> 埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)

<400> 1

Met Thr Pro Phe Val Leu Thr Ala Val Leu Phe Leu Leu Gly Asn Ala

1 5 10 15

Val Leu Ala Leu Thr Pro Ala Glu Trp Arg Lys Gln Ser Ile Tyr Phe

20 25 30

Leu Leu Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asn Ser Thr Thr Ala Ala

35 40 45

Cys Asp Val Thr Glu Arg Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile

50 55 60

Ile Asn His Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp

65 70 75 80

Ile Ser Pro Val Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asn Thr Gly Glu Gly Glu

85 90 95

Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Glu Ile Tyr Thr Val Asn Ser Asn

100 105 110

Phe Gly Thr Ser Asp Asp Leu Leu Ala Leu Ser Lys Ala Leu His Asp

115 120 125

Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr

130 135 140

Asp Gly Asp Gly Asp Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Asn Pro Phe Asn

145 150 155 160

Ser Ser Ser Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Tyr Ser Asn

165 170 175

Gln Thr Asp Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Thr Thr Val Ser Leu

180 185 190

Pro Asp Leu Asn Thr Thr Glu Thr Val Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp

195 200 205

Trp Val Ala Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile

210 215 220

Asp Thr Val Lys His Val Glu Lys Ser Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Ser

225 230 235 240

Ala Ala Gly Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro Ser

245 250 255

Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asp Tyr Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro

260 265 270

Ile Tyr Tyr Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile

275 280 285

Ser Asn Leu Tyr Asn Met Ile Asn Ser Val Ala Ser Glu Cys Ser Asp

290 295 300

Pro Thr Leu Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe

305 310 315 320

Ala Ser Tyr Thr Ser Asp Tyr Ser Leu Ala Lys Asn Val Ile Ala Phe

325 330 335

Ile Phe Phe Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Gln Glu Gln

340 345 350

His Tyr Asn Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu

355 360 365

Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Ala Glu Leu Tyr Thr Phe Ile Ala Thr Thr

370 375 380

Asn Ala Ile Arg Ser Leu Ala Ile Ser Val Asp Ser Glu Tyr Leu Thr

385 390 395 400

Tyr Lys Asn Asp Pro Phe Tyr Tyr Asp Ser Asn Thr Leu Ala Met Arg

405 410 415

Lys Gly Ser Asp Gly Leu Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Leu Gly

420 425 430

Ala Asp Gly Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Ser

435 440 445

Ser Gly Thr Glu Leu Val Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Thr Val Thr Val

450 455 460

Asp Ser Asn Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Glu Ser Gly Leu Pro Arg

465 470 475 480

Val Phe Leu Pro Ala Ser Ser Phe Ser Gly Ser Ser Leu Cys Ser Ser

485 490 495

Ser Pro Ser Pro Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser

500 505 510

Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Ala Val Ala Val Leu Phe Glu Glu Leu

515 520 525

Val Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Val Tyr Leu Ser Gly Ser Ile Ser

530 535 540

Gln Leu Gly Asp Trp Asn Thr Asp Asp Ala Val Ala Leu Ser Ala Ala

545 550 555 560

Asn Tyr Thr Ser Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro

565 570 575

Val Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Glu Glu Asn Gly

580 585 590

Asp Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Thr

595 600 605

Ala Cys Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ile Val Asp Thr Trp Arg

610 615 620

<210> 2

<211> 618

<212> PRT

<213> 埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu

35 40 45

Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly

50 55 60

Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser

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115 120 125

Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe

130 135 140

Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala

145 150 155 160

Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala

165 170 175

Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser

180 185 190

Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu

195 200 205

Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu

210 215 220

Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn

225 230 235 240

Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp

245 250 255

Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile

305 310 315 320

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro

325 330 335

Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly

355 360 365

Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr

370 375 380

Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn

385 390 395 400

Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile

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420 425 430

Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr

435 440 445

Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala

450 455 460

Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala

465 470 475 480

Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro

485 490 495

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr

500 505 510

Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser

515 520 525

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Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn

545 550 555 560

Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser

565 570 575

Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp

580 585 590

Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln

595 600 605

Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln

610 615

<210> 3

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)α-淀粉酶的合成DNA序列

<400> 3

atgacgcctt tcgtcctcac ggccgtgctg ttcttgctgg ggaatgccgt gttggccttg 60

accccggccg aatggcgcaa acaatctatc tactttctcc tcacggaccg ctttggcagg 120

gcagataact cgaccactgc tgcctgcgat gtcactgaga ggatctactg tggcgggagt 180

tggcaaggaa tcatcaacca tctcgactat atccaaggca tggggttcac ggccatctgg 240

atttcaccgg tgaccgagca gctgccgcaa aatacgggtg agggagaagc ctatcatggg 300

tattggcagc aggaaatata cacggtcaac tccaactttg ggacatcaga cgatctctta 360

gccctgtcaa aggcgctcca tgaccgtggc atgtacctca tggtcgatgt ggttgcgaat 420

cacatgggat acgatggaga tggcgactcc gttgattaca gcgtcttcaa tccatttaat 480

tcctctagtt atttccatcc ctattgcctg attacagact acagcaatca gaccgatgtg 540

gaagactgtt ggctgggcga tacgactgtc tcgttgcccg atctcaacac cacggagact 600

gttgtgagga ctatatggta tgactgggtg gcggatctcg tctccaatta ctctattgat 660

gggcttcgca tcgacacggt gaaacacgta gaaaagtcat tctggcctgg ttacaacagt 720

gctgcgggtg tctactgtgt tggcgaggtc ctcgatggag atccgtctta cacttgtccc 780

taccaggatt atctggacgg tgtattaaac tatccaatat actatcaact actgtatgcg 840

tttgaatcct ctagcggcag catcagcaat ctttacaaca tgatcaactc tgtcgcctct 900

gaatgttccg atcccactct gttgggcaac tttatcgaga accatgacaa ccctagattt 960

gcctcctata caagtgatta ttctcttgct aaaaatgtga ttgctttcat cttcttctct 1020

gacggcatcc ctatcgtcta tgccggtcag gagcagcatt acaacggggg aaatgacccc 1080

tacaaccgcg aggccacctg gctgtcagga tactcgacga cggccgaact gtacacgttc 1140

attgcgacca ccaacgcgat ccgtagcttg gcgatctccg tcgactcgga gtatttgacg 1200

tacaagaatg acccattcta ctacgacagc aataccctcg ctatgcgcaa gggttcggat 1260

ggcctgcagg tcatcactgt tctgtccaat ctgggcgccg atggtagctc gtacacgttg 1320

actctgagtg gcagtggcta ttcgtcaggc acggagctgg tggaagctta cacctgcaca 1380

acggtcactg ttgactctaa tggcgatatt ccagttccca tggagtccgg actgccgcgc 1440

gttttcctac cagcatcctc attcagtggt agcagtctat gcagttcttc tcctagccct 1500

actactacaa catcgacatc gacatcgaca acgtcgacgg cctgcaccac cgccaccgct 1560

gtggcggtcc tcttcgaaga gttggtgaca acgacctacg gtgaaaatgt ctacctcagc 1620

ggatcgatca gccaactcgg ggactggaac acggacgacg ccgtggccct gtccgcagct 1680

aattacactt cttcgaatcc cctgtggtat gtgacagtca cattgccggt tgggacgtcc 1740

tttgagtaca agttcatcaa gaaggaagag aacggcgatg tcgagtggga gagcgatccc 1800

aatcggtcgt atactgtgcc gacggcctgc acgggagcga cggagacgat tgtcgacaca 1860

tggagatag 1869

<210> 4

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)葡糖淀粉酶的经优化DNA序列

<400> 4

atggcctcct tagtcgcagg tgccttatgt attttaggtt tgaccccagc agccttcgca 60

agagccccag tcgcagccag agcaacaggt tcattggatt catttttggc tacagaaact 120

ccaatcgcat tgcaaggtgt tttgaacaac atcggtccaa acggtgctga tgttgctggt 180

gcatctgctg gtattgttgt tgcatctcca tctagatcag atccaaacta cttctactct 240

tggactagag atgctgcatt gactgctaag tatttggttg atgcttttat tgcaggtaat 300

aaggatttgg aacaaactat ccaacaatac atctctgcac aagctaaggt tcaaactatc 360

tcaaacccat ctggtgactt gtctacaggt ggtttgggtg aaccaaagtt taatgttaac 420

gaaactgctt ttacaggtcc atggggtaga ccacaaagag atggtccagc attgagagca 480

actgctttga tcgcatacgc taactacttg atcgataacg gtgaagcttc tacagcagat 540

gaaatcatct ggccaatcgt tcaaaacgat ttgtcataca tcactcaata ctggaactct 600

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catagagcat tagttgaggg taatgcattg gctactagat tgaaccatac atgttcaaac 720

tgtgtttctc aagctccaca agtcttgtgt ttcttgcaat catattggac tggttcttac 780

gttttggcta attttggtgg ttcaggtaga tcaggtaaag atgttaattc aatcttgggt 840

tctattcata cttttgatcc agctggtggt tgtgatgatt ctacatttca accatgttca 900

gcaagagctt tggcaaacca taaggttgtt actgattctt ttagatcaat ctatgctatt 960

aattctggta ttgcagaagg ttcagctgtt gcagttggta gatatccaga agatgtttac 1020

caaggtggta atccatggta cttggctact gctgcagctg cagaacaatt gtacgatgca 1080

atctatcaat ggaagaaaat tggttcaatc tctatcacag atgtttcttt gccatttttc 1140

caagatatct atccatcagc tgcagttggt acttacaact caggttctac tacttttaat 1200

gatatcattt ctgctgttca aacatatggt gacggttact tgtcaatcgt tgaaaagtac 1260

actccatcag atggttcttt gacagaacaa ttttctagaa ctgatggtac accattgtca 1320

gcttctgcat taacttggtc atacgcttct ttgttaacag cttcagcaag aagacaatct 1380

gttgttccag catcatgggg tgaatcttca gcttcttcag ttccagcagt ttgttcagct 1440

acttctgcaa caggtccata ttctacagct actaatacag tttggccatc ttcaggttca 1500

ggttcttcaa ctacaacttc ttcagctcca tgtacaactc caacttctgt tgcagttaca 1560

ttcgatgaaa tcgtttcaac ttcttacggt gaaacaatat atttggctgg ttctattcca 1620

gaattgggta attggtcaac tgcttctgca attccattga gagctgatgc atacacaaat 1680

tctaatccat tgtggtatgt tactgttaat ttgccaccag gtacatcatt cgaatacaag 1740

tttttcaaga atcaaactga tggtacaatt gtttgggaag atgatccaaa tagatcctac 1800

accgttcctg cttactgtgg tcaaactacc gcaatcttgg acgactcttg gcaa 1854

<210> 5

<211> 1857

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)葡糖淀粉酶的经适应天然DNA序列

<400> 5

atggcgtccc tcgttgctgg cgctctctgc atcctgggcc tgacgcctgc tgcatttgca 60

cgagcgcccg ttgcagcgcg agccaccggt tccctggact cctttctcgc aaccgaaact 120

ccaattgccc tccaaggcgt gctgaacaac atcgggccca atggtgctga tgtggcagga 180

gcaagcgccg gcattgtggt tgccagtccg agcaggagcg acccaaatta tttctactcc 240

tggacacgtg acgcagcgct cacggccaaa tacctcgttg acgccttcat cgcgggcaac 300

aaggacctag agcagaccat ccagcagtac atcagcgcgc aggcgaaggt gcaaactatc 360

tccaatccgt ccggagattt atccaccggt ggcttaggtg agcccaagtt caatgtgaat 420

gagacggctt ttaccgggcc ctggggtcgt ccacagaggg acggaccagc gttgagagcg 480

acggccctca ttgcgtatgc gaactatctc atcgacaacg gcgaggcttc gactgccgat 540

gagatcatct ggccgattgt ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca 600

tccaccttcg acctctggga agaagtagaa ggttcctcat tcttcacaac cgccgtgcaa 660

caccgcgccc tggtcgaagg caatgcactg gcaacaaggc tgaaccacac gtgctccaac 720

tgcgtctctc aggcccctca ggtcctgtgt ttcctgcagt catactggac cggatcgtat 780

gttctggcca actttggtgg cagcggtcgt tccggcaagg acgtgaactc gattctgggc 840

agcatccaca cctttgatcc cgccggaggc tgtgacgact cgaccttcca gccgtgttcg 900

gcccgtgcct tggcaaatca caaggtggtc accgactcgt tccggagtat ctatgcgatc 960

aactcaggca tcgcagaggg atctgccgtg gcagtcggcc gctaccctga ggatgtctac 1020

cagggcggga acccctggta cctggccaca gcagcggctg cagagcagct ttacgacgcc 1080

atctaccagt ggaagaagat cggctcgata agtatcacgg acgttagtct gccatttttc 1140

caggatatct acccttctgc cgcggtgggc acctataact ctggctccac gactttcaac 1200

gacatcatct cggccgtcca gacgtatggt gatggatatc tgagtattgt cgagaaatat 1260

actccctcag acggctctct taccgaacaa ttctcccgta cagacggcac tccgctttct 1320

gcctctgccc tgacttggtc gtacgcttct ctcctaaccg cttcggcccg cagacagtcc 1380

gtcgtccctg cttcctgggg cgaaagctcc gcaagcagcg tccctgccgt ctgctctgcc 1440

acctctgcca cgggcccata cagcacggct accaacaccg tctggccaag ctctggctct 1500

ggcagctcaa caaccaccag tagcgcccca tgcaccactc ctacctctgt ggctgtgacc 1560

ttcgacgaaa tcgtcagcac cagttacggg gagacaatct acctggccgg ctcgatcccc 1620

gagctgggca actggtccac ggccagcgcg atccccctcc gcgcggatgc ttacaccaac 1680

agcaacccgc tctggtacgt gaccgtcaat ctgccccctg gcaccagctt cgagtacaag 1740

ttcttcaaga accagacgga cgggaccatc gtctgggaag acgacccgaa ccggtcgtac 1800

acggtcccag cgtactgtgg gcagactacc gccattcttg acgatagttg gcagtga 1857

<210> 6

<211> 1869

<212> DNA

<213> 埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)

<400> 6

atgacgcctt tcgtcctcac ggccgtgctg ttcttgctgg ggaatgccgt gttggccttg 60

accccggccg aatggcgcaa acaatctatc tactttctcc tcacggaccg ctttggcagg 120

gcagataact cgaccactgc tgcctgcgat gtcactgaga ggatctactg tggcgggagt 180

tggcaaggaa tcatcaacca tctcgactat atccaaggca tggggttcac ggccatctgg 240

atttcaccgg tgaccgagca gctgccgcaa aatacgggtg agggagaagc ctatcatggg 300

tattggcagc aggaaatata cacggtcaac tccaactttg ggacatcaga cgatctctta 360

gccctgtcaa aggcgctcca tgaccgtggc atgtacctca tggtcgatgt ggttgcgaat 420

cacatgggat acgatggaga tggcgactcc gttgattaca gcgtcttcaa tccatttaat 480

tcctcgagtt atttccatcc ctattgcctg attacagact acagcaatca gaccgatgtg 540

gaagactgtt ggctgggcga tacgactgtc tcgttgcccg atctcaacac cacggagact 600

gttgtgagga ctatatggta tgactgggtg gcggatctcg tctccaatta ctctattgat 660

gggcttcgca tcgacacggt gaaacacgta gaaaagtcat tctggcctgg ttacaacagt 720

gctgcgggtg tctactgtgt tggcgaggtc ctcgatggag atccgtctta cacttgtccc 780

taccaggatt atctggacgg tgtattaaac tatccaatat actatcaact actgtatgcg 840

tttgaatcct ctagcggcag catcagcaat ctttacaaca tgatcaactc tgtcgcctct 900

gaatgttccg atcccactct gttgggcaac tttatcgaga accatgacaa ccctagattt 960

gcctcctata caagtgatta ttctcttgct aaaaatgtga ttgctttcat cttcttctct 1020

gacggcatcc ctatcgtcta tgccggtcag gagcagcatt acaacggggg aaatgacccc 1080

tacaaccgcg aggccacctg gctgtcagga tactcgacga cggccgaact gtacacgttc 1140

attgcgacca ccaacgcgat ccgtagcttg gcgatctccg tcgactcgga gtatttgacg 1200

tacaagaatg acccattcta ctacgacagc aataccctcg ctatgcgcaa gggttcggat 1260

ggcctgcagg tcatcactgt tctgtccaat ctgggcgccg atggtagctc gtacacgttg 1320

actctgagtg gcagtggcta ttcgtcaggc acggagctgg tggaagctta cacctgcaca 1380

acggtcactg ttgactctaa tggcgatatt ccagttccca tggagtccgg actgccgcgc 1440

gttttcctac cagcatcctc attcagtggt agcagtctat gcagttcttc tcctagccct 1500

actactacaa catcgacatc gacatcgaca acgtcgacgg cctgcaccac cgccaccgct 1560

gtggcggtcc tcttcgaaga gttggtgaca acgacctacg gtgaaaatgt ctacctcagc 1620

ggatcgatca gccaactcgg ggactggaac acggacgacg ccgtggccct gtccgcagct 1680

aattacactt cttcgaatcc cctgtggtat gtgacagtca cattgccggt tgggacgtcc 1740

tttgagtaca agttcatcaa gaaggaagag aacggcgatg tcgagtggga gagcgatccc 1800

aatcggtcgt atactgtgcc gacggcctgc acgggagcga cggagacgat tgtcgacaca 1860

tggagatag 1869

<210> 7

<211> 2748

<212> DNA

<213> 埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)

<400> 7

acgagatgtg tatatactgt gaaccaaact agatgatgtc agttatgctg gtctgagaac 60

tcatagaagc ccttgaaaat accccaagct agcactccaa ccctaactct gttgctctac 120

tagatcaaga cgagtactct gattgagctg caggcttgga atatatgatt agcagaaaaa 180

gggttaaaac ttgtatgaca atcagtttgt cagtactccg tagtgatgcc atgtctatag 240

agtcgacact aaggcagcat gtgaatgagt cggaaatgac aggaagcaga ttccttaaca 300

gtcatgttct ccgtgcctgc atccccacgt cacctgcaaa gatgcgacgc tactccacac 360

cggcgccttg atgtctgctg ttcctggcct agtggagccc catgcgctgc tagctcgtgg 420

tcttcgaata aatcagaata aaaaacggag taattaattg cgcccgcaac aaactaagca 480

atgtaactca atgccaagct tccgctgatg ctcttgacat ctccgtagtg gcttctttcg 540

taatttcaga cgtatatata gtagtaatgc ccagcaggcc gggataatga tggggatttc 600

tgaactctca gcttccgtac gctgaacagt ttgcttgcgt tgtcaaccat ggcgtccctc 660

gttgctggcg ctctctgcat cctgggcctg acgcctgctg catttgcacg agcgcccgtt 720

gcagcgcgag ccaccggttc cctggactcc tttctcgcaa ccgaaactcc aattgccctc 780

caaggcgtgc tgaacaacat cgggcccaat ggtgctgatg tggcaggagc aagcgccggc 840

attgtggttg ccagtccgag caggagcgac ccaaattgta ggttctttcc caccagaaat 900

tacttattta aatcagccct ctgacaggtt gaagatttct actcctggac acgtgacgca 960

gcgctcacgg ccaaatacct cgtcgacgcc ttcatcgcgg gcaacaagga cctagagcag 1020

accatccagc agtacatcag cgcgcaggcg aaggtgcaaa ctatctccaa tccgtccgga 1080

gatttatcca ccggtggctt aggtgagccc aagttcaatg tgaatgagac ggcttttacc 1140

gggccctggg gtcgtccaca gagggacgga ccagcgttga gagcgacggc cctcattgcg 1200

tatgcgaact atctcatcgt aagcttctgc tcgctgccct tctctctgct cgtatgctaa 1260

gtagtcctgt caggacaacg gcgaggcttc gactgccgat gagatcatct ggccgattgt 1320

ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca tccaccttcg gtaggcaaat 1380

gaatattccc gacacagcgt ggtactaatt tgattcagac ctctgggaag aagtagaagg 1440

atcctcattc ttcacaaccg ccgtgcaaca ccgcgccctg gtcgaaggca atgcactggc 1500

aacaaggctg aaccacacgt gctccaactg cgtctctcag gcccctcagg tcctgtgttt 1560

cctgcagtca tactggaccg gatcgtatgt tctggccaac tttggtggca gcggtcgttc 1620

cggcaaggac gtgaattcga ttctgggcag catccacacc tttgatcccg ccggaggctg 1680

tgacgactcg accttccagc cgtgttcggc ccgtgccttg gcaaatcaca aggtggtcac 1740

cgactcgttc cggagtatct atgcgatcaa ctcaggcatc gcagagggat ctgccgtggc 1800

agtcggccgc taccctgagg atgtctacca gggcgggaac ccctggtacc tggccacagc 1860

agcggctgca gagcagcttt acgacgccat ctaccagtgg aagaagatcg gctcgataag 1920

tatcacggac gttagtctgc catttttcca ggatatctac ccttctgccg cggtgggcac 1980

ctataactct ggctccacga ctttcaacga catcatctcg gccgtccaga cgtatggtga 2040

tggatatctg agtattgtcg tacgttttgc cttagattct caggtgtaaa gaaaaaaatg 2100

gaactaactc agttctagga gaaatatact ccctcagacg gctctcttac cgaacaattc 2160

tcccgtacag acggcactcc gctttctgcc tctgccctga cttggtcgta cgcttctctc 2220

ctaaccgctt cggcccgcag acagtccgtc gtccctgctt cctggggcga aagctccgca 2280

agcagcgtcc ctgccgtctg ctctgccacc tctgccacgg gcccatacag cacggctacc 2340

aacaccgtct ggccaagctc tggctctggc agctcaacaa ccaccagtag cgccccatgc 2400

accactccta cctctgtggc tgtgaccttc gacgaaatcg tcagcaccag ttacggggag 2460

acaatctacc tggccggctc gatccccgag ctgggcaact ggtccacggc cagcgcgatc 2520

cccctccgcg cggatgctta caccaacagc aacccgctct ggtacgtgac cgtcaatctg 2580

ccccctggca ccagcttcga gtacaagttc ttcaagaacc agacggacgg gaccatcgtc 2640

tgggaagacg acccgaaccg gtcgtacacg gtcccagcgt actgtgggca gactaccgcc 2700

attcttgacg atagttggca gtgagataac atccaccctt ctgtttta 2748

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于ApuA_Nat-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 8

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatgg cagccaacta cgtttctcga 60

ttgttg 66

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于ApuA_N-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 9

gactagaagg cttaatcaaa agctctcgag tcacccctgc caagtattgc tgaccgatgc 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于ApuA_Opt-NatSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 10

tctctacttg accgggttgg tgcagtgttt gactccagct caatggagaa gtcaatctat 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于ApuA_Opt-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 11

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gctaaccttg ccatgtattg gagactgagg 60

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于ApuA_optXynSec-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 12

gaacccgtgg ctgtggagaa gcgctcgcga ttgactccag ctcaatggag aagtc 55

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于ApuA_Opt-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 13

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gctaaccttg ccatgtattg gagactgagg 60

<210> 14

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteA_Nat-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 14

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatga agtggacctc ctcgctcctc 60

ctctta 66

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteA_Nat-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 15

gactagaagg cttaatcaaa agctctcgag tcacctccaa gtatcagcaa ctgtcaccgt 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Nat-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 16

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatga cgcctttcgt cctcacggcc 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Nat-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 17

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gctatctcca tgtgtcgaca atcgtctccg 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Opt-NatOptSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 18

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatga ccccttttgt tttgacagcc 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Opt-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 19

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gctatctcca agtgtcaaca atagtttcag 60

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Nat-xynsecSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 20

gaacccgtgg ctgtggagaa gcgctcgcga ttgaccccgg ccgaatggcg caaacaat 58

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Opt-xynsecSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 21

gaacccgtgg ctgtggagaa gcgctcgcga ttgacaccag ccgaatggag aaagcaatc 59

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemA_Opt-NatSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 22

tcttgctggg gaatgccgtg ttggccttga caccagccga atggagaaag c 51

<210> 23

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteG_Nat-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 23

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatga cgcgcattct caccctcgcc 60

cttcat 66

<210> 24

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteG_Nat-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 24

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gctagcgcca agtggtgttc accaccgcgg 60

t 61

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteG_Opt-NatSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 25

gggctggctc ttgtccaaag tgttgttggg gcaccacaat tggctcctag agcaactaca 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteG_Opt-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 26

tggactagaa ggcttaatca aaagctctcg agctatctcc aggttgtgtt gacaacggcg 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于AteG_Nat-xynSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 27

gaacccgtgg ctgtggagaa gcgctcgcga gctccccaat tggcccccag agcgacaacc 60

<210> 28

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Nat-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 28

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatgg cgtccctcgt tgctggcgct 60

ctctgc 66

<210> 29

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Nat-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 29

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gtcactgcca actatcgtca agaatggcgg 60

t 61

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Nat-xynsecSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 30

gaacccgtgg ctgtggagaa gcgctcgcga cgagcgcccg ttgcagcgcg agccaccggt 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Opt-xynsecSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 31

gaacccgtgg ctgtggagaa gcgctcgcga agagccccag tcgcagccag agcaacaggt 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Opt-R的PCR寡核苷酸引物

<400> 32

gactagaagg cttaatcaaa agctctcgag tcattgccaa gagtcgtcca agattgcggt 60

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Opt-NatOptSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 33

ttatcaacac acaaacacta aatcaaagaa ttcatggcct ccttagtcgc aggtgcctta 60

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于TemG_Opt-NatSS-L的PCR寡核苷酸引物

<400> 34

atcctgggcc tgacgcctgc tgcatttgca agagccccag tcgcagccag agcaacaggt 60

<210> 35

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR寡核苷酸引物ENOCASS-L

<400> 35

gtgcggtatt tcacaccgca taggagatcg atcccaatta atgtgagtta cctcactc 58

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR寡核苷酸引物ENOCASS-R

<400> 36

cgggcctctt cgctattacg ccagagctta gatct 35

<210> 37

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物amdSYMCas-L

<400> 37

ccgcgcgttg gccgattcat taatccagga tccacatgga ggcccagaat accctccttg 60

ac 62

<210> 38

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物amdSYMCas-R

<400> 38

gggcctcttc gctattacgc cagagcttag atctcagtat agcgaccagc attcacatac 60

ttaa 64

<210> 39

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物Delta-ENO1p-L

<400> 39

tggaataaaa atccactatc gtctatcaac taatagttat attatcaata tattatcata 60

tacggtgtta agatgatgac ataagttatg agaagctgtc ggatcccaat taatgtgagt 120

tacctcac 128

<210> 40

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物Delta-ENO1t-R

<400> 40

tgagatatat gtgggtaatt agataattgt tgggattcca ttgttgataa aggctataat 60

attaggtata cagaatatac tagaagttct cctcgaggat agatctccta tgcggtgtga 120

aataccgc 128

<210> 41

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物TemG_Opt-L

<400> 41

ttatcaacac acaaacacta aatcaaagaa ttcatggcct ccttagtcgc aggtgcctta 60

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物TemG_Opt-R

<400> 42

gactagaagg cttaatcaaa agctctcgag tcattgccaa gagtcgtcca agattgcggt 60

<210> 43

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物TemA_Nat-L

<400> 43

tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa gaattcatga cgcctttcgt cctcacggcc 60

<210> 44

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物TemA_Nat-R

<400> 44

ggactagaag gcttaatcaa aagctctcga gctatctcca tgtgtcgaca atcgtctccg 60

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物URA3-L

<400> 45

cgtggatgat gtggtctcta c 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物URA3-R

<400> 46

gttcaccctc taccttagca tc 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物temA_Nat-L

<400> 47

gcgatgtcac tgagaggatc ta 22

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> temA_Nat-R

<400> 48

gaaatccaga tggccgtgaa 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物temG_Opt-L

<400> 49

tacaggtggt ttgggtgaac 20

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR引物temG_Opt-R

<400> 50

ctctcaatgc tggaccatct c 21

Claims

1.一种重组酵母，其已经转化有下述基因：

a)第一异源基因，其编码包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶，其中该第一基因的核酸序列是未经密码子优化的；和

b)第二异源基因，其编码包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其中该第二基因的核酸序列是可选地经密码子优化的。

2.如权利要求1所述的重组酵母，其中：

所述α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％或至少90％同一性；和/或

所述葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少80％或至少90％同一性。

3.如权利要求1所述的重组酵母，其中：

所述第一基因的核酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性；

所述第二基因的核酸序列是经密码子优化的，并且与SEQ ID NO:4具有至少70％同一性；和/或

所述第二基因的核酸序列是未经密码子优化的，并且与SEQ ID NO:5具有至少70％同一性。

4.如权利要求1所述的重组酵母，其中，所述酵母是酵母菌属(Saccharomyces)物种，更具体而言是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)物种。

5.一种用于从淀粉或糖生产醇的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向包含淀粉或糖的组合物添加权利要求1所述的重组酵母；

b)使所述重组酵母表达和分泌：

(i)包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶；和

(ii)包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；

c)使糖化和/或发酵发生，从而将所述淀粉或糖转化成醇。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述淀粉是生淀粉，并且其中所述生淀粉由所述重组酵母进行水解，而无需对所述淀粉进行熟化。

7.如权利要求5所述的方法，其中，所述醇选自由乙醇和丁醇组成的组。

8.如权利要求5所述的方法，其中，还向所述组合物添加对于所述重组酵母而言是外源性的酶。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述外源性酶的添加量比不使用权利要求1所述的重组酵母的冷水解过程中的酶添加量小至少50％。

10.权利要求1所述的重组酵母在从淀粉或糖生产醇的方法中的应用。