CN108226482A - 用于检测分析物的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本文对用于从多重反应检测分析物的检测装置和相关系统以及方法进行了描述。具体而言，本文描述了采用改进的ELISA方法进行至少一个检测反应的装置，其包括含有检测区和参照区的表面、检测传感器和光源。该检测装置可以包括互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。该装置可用于测量和报告离散分析物的离散量或组合，提供信息以助于在脊椎动物中改变的健康状态的预后和/或诊断。

Description

用于检测分析物的装置和方法
本申请是2013年3月26日提交的题为“用于检测分析物的装置和方法”的国家申请号为201380030197.7(PCT/US2013/033916)的发明专利申请的分案申请。
通过引用的结合
本申请要求美国临时专利申请序列号61/615,599(于2012年3月26日提交)和美国临时专利申请序列号61/790,686，(于2013年3月15日提交)的权益，以上两个专利申请各自通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明通常会涉及及用于在体液样品中检测分析物的装置、系统以方法。
背景技术
现有的用于确定样品中分析物的浓度的系统和装置，或者适合于测量每个样品的单个分析物，或者使用不适合于便携的、电池运作的应用的设备。为了最有效地利用可从生物标记中收集的信息，需要一种快速、方便携带并且能够同时检测超过一种分析物的系统。这样的系统可结合不同的生物标记用于提供精确的预后和诊断所需的信息。
因此，需要这样的装置，其能够利用环境光或低水平光，能够由电池或其它便携式电源运作，并且能够在小于一个小时内提供关于单个生物样品的多于一种生物标记的信息。
发明内容
在一个实施方案中，用于检测样品中一个或多个分析物和诊断病况的系统，包括装置、有一个或多个处理器的计算装置、存储器、用分析物检测应用编码的CRM以及显示器。
该装置包括具有检测区和参照区的能够进行至少一个检测反应的表面；用以传感与检测区相关的光的一个或多个检测传感器；用以传感与参照区相关的光的一个或多个参照传感器；和照亮检测区和参照区的至少一个光源。
所述存储器包括校准数据库和诊断数据库，该校准数据库包括一个或多个校准集，每个校准集包括组合的传感器读数和分析物浓度之间的转换，该诊断数据库包括一个或多个阈值以及一个或多个诊断规则。
用分析物检测应用编码的CRM包括多个可由一个或多个处理器执行的模块。该模块包括控制模块，其用以控制装置的操作和协调多个模块的功能的控制模块；平衡检测模块，其用以控制装置的一个或多个传感器和/或的光源的操作；分析物检测模块，其用以处理从平衡检测模块接收到的组合输出信号；后处理模块，其用以进一步分析由分析物检测模块计算出的分析物浓度；诊断模块，其用以比较诊断阵列的条目，并根据存储在存储器中的诊断数据库内限定的一个或多个诊断规则来确定患者的病况；和GUI模块，其用以生成一个或多个表单来接收输入至系统和/或显示来自系统的输出。
在另一个实施方案中，用于检测从患者获得的样品中的一个或多个分析物的装置包括进行至少一个检测反应的表面；用以传感与检测区相关的光的一个或多个检测传感器；用以传感与参照区相关的光的一个或多个参照传感器；和照亮检测区和参照区的至少一个光源。
进行至少一个检测反应的表面包括检测区(包含一种或多种表位捕获剂，其中每一种表位捕获剂被配置成唯一地结合所述至少一个分析物之一)和参照区。
利用平衡传感器方法操作一个或多个检测传感器和一个或多个参照传感器。
本发明的其它方面在下面进行详细描述。
附图说明
图1描述了具有不稳定心绞痛的稳定型和难治型患者的各种趋化因子的血浆水平。CCL5和CCL18水平通过具有不稳定心绞痛的稳定型和难治型患者在t＝0的多重分析(multiplex)来确定(图A)。t＝0、t＝2和t＝180(天)的时间模式使用了ELISA方法。CCL5水平在t＝2时显著下降，并且在t＝180处于同一水平(图B)，而CCL18水平在t＝2时仍然升高，并在t＝180时跌回(图C)。可溶性CD40配体(sCD40L)水平在t＝0时达到峰值，在t＝2和t＝180时降低(图D)。CRP水平在t＝2时出现峰值，在t＝180时降低到亚基线值(t＝0)(图E)。数值表示平均值±SEM，*P＜0.05，**P＜0.001，N.S.＝不显著。
图2描绘了CCL5和CCL18的上四分位数血浆水平。CCL5和CCL18的上四分位数血浆水平与不稳定心绞痛中的难治性缺血症状的发生显著相关，而sCD40L和CRP的四分位数水平没有显示出任何显著的相关性(图A)。第0天的CCL5的上四分位数水平预测今后的血运重建手术的必要性(图B)，而CCL18的上四分位数水平预测在未来18个月内的急性冠状动脉综合征(图C)或不稳定心绞痛复发症状(图D，UAP)(图C，D)。*P＝0.02，**P＝0.01，#P＜0.01，N.S.＝不显著。
图3描述了CCL5和CCL18表达的PCR分析。定量PCR分析表明，和PBMC在t＝180相比，t＝0时，在有缺血症状的患者的未刺激PBMC中CCL5和CCL18表达显著下调(图A)。相对于PBMC中的趋化因子受体表面蛋白质表达，在基线上，CCL5和CCL18的受体CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的mRNA表达也大约至少2倍下调，(图B)。数值表示平均值±SEM，*P＜0.05，**P＜0.001。
图4描绘了CCR3和CCR5在PBMC中的蛋白质表达。在基线上，CCR3和CCR5在PBMC中的蛋白表达显示CD14+细胞(图A，B)和CD330细胞(图C，D)中的两种受体明显上调。CD14、CD3和CCR3/5的三重门控揭示相同的趋势，尽管相比于CD3+细胞，CD14+细胞显示CCR3和CCR5表达更为明显的上调(图E，F)。在全部PBMC中，总CCR3和CCR5的表面表达分析，也显示CCR3和CCR5表达的显著上调，表明CCR3和CCR5表达的增加只是部分地由CD3+和CD14+阳性细胞引起的(图G，H，I)。*P＜0.05，**P＜0.01，#P＜0.001。
图5描述了用rCCL5和sCCL18刺激PBMC对CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达的影响。用rCCL5和sCCL18刺激PBMC 6小时显示在CCR1(图A)、CCR4(图C)和CCR5(图D)mRNA表达方面没有明显不同。用sCCL18刺激后CCR3表达显著下降，但用rCCL5刺激则没有显著下降(图B)。数值表示平均值±SEM，*P＜0.01，N.S.＝不显著，rCCL5＝重组CCL5，sCCL18＝合成CCL18。
图6描述在PAGE(18％)上对CCL5和CCL18之间的嗜异性相互作用进行的评估。泳道1和泳道2显示rCCL5(7851 kDa)和sCCL18(7855kDa)的参考迁移率，两种趋化因子显示形成15.6kDa的同二聚体的差趋势。泳道3和泳道4中分别上样了比例为1∶1和1∶5(重量∶重量)的rCCL5和sCCL18的混合物，已以该比例通过在室温下用25mM的多聚甲醛孵育30分钟交联二聚体。注意略更高的电泳迁移率和稍微更偏黄的CCL18单体和二聚体染色。在共孵育和随后的CCL5和CCL18的关联后，二聚体的形成程度不变，这表明甚至在超生理浓度下，CCL5和CCL18也有可能不参与任何显著嗜异性交叉相互反应。每个泳道的总蛋白上样是恒定的(2pg)。
图7描绘了MALDI-TOF MS的分析结果。MALDI-TOF MS分析确证了PAGE分析：CCL5和CCL18(10pmol/μl)的质量峰值出现在大约7860Da处(M+；CCL5和CCL18的理论质量分别是7851和7855Da)，仅微小的峰出现在大约15730Da处，这表明形成同二聚体(M2+)的趋势低(图A，B)。已以1∶1和1∶5(重量∶重量)比例(总浓度10pmol/μl)与CCL5在含有多聚甲醛的50mMHEPES/0.1mM EDTA中预先孵育的CCL18的MALDI-TOF质谱，得到基本上类似的图案，在两个比例下二聚体形成均同样是边缘的(图C，D)。
图8图绘了CD14+细胞的总水平。CD14+细胞(单核细胞和嗜中性粒细胞)的总水平在t＝0和t＝180之间没有差异，然而CD3+细胞表现出小的差异(11.8％)，尽管在基线处显著的降低(图A)。在mRNA水平，观察到HNP-3+嗜中性粒细胞增加，表明缺血后嗜中性粒细胞释放增强。然而，CCR2：CX3CR1表达比率(单核细胞亚类分布的量度)，并没有显著受到调节(图B)。数值表示平均值±SEM，*P＝0.01，**P＜0.001，N.S.＝不显著。
图9给出的曲线图显示，小鼠短暂暴露给循环中升高水平的CCL18(如通过重组CCL18蛋白”反复给药实现)将加剧动脉粥样硬化的形成，从而增加了心血管疾病的风险。
图10给出的曲线图显示，在CCL3缺乏的高脂血(LDLr-/-)小鼠的主动脉窦中的动脉粥样硬化斑块形成急剧减少。WT＝野生型；CCL3-/-＝高脂血小鼠。Y轴＝动脉粥样硬化斑块形成，报道为主动脉根部面积(μm2)。
图11图示描述了循环CCL3水平(y轴)。APRAIS中的循环CCL3水平可与来自MISSION！群组的患者中所到的水平相比拟(图A)。在具有不稳定心绞痛的患者的APRAIS群组中实施的CCL3时间监测，清楚地表明CCL3在缺血期间短暂增加，因为相比于t＝0，水平在t＝180时显著下降(图B)。*P＝0.03，**P＜0.001。
图12图示描绘CCL3的上四分位水平。在基线上的CCL3的上四分位水平预测在随访期间急性冠脉综合征的发生(图A)。此外，上四分位水平也指示在住院期间或刚刚出院的复发性缺血症状(图B)。*P＝0.01，**P＜0.01。
图13图示描述了各种趋化因子的水平。相对于对照(○)，AMI患者(·)的CCL3(图A)、CCL5(图B)、CXCL8(图C)血浆水平显著升高，然而CXCL10(图D)表现出相反的模式。*P＝0.025，**P＝0.006，***P＝0.02，#P＝0.004。
图14图示描述了在LAD结扎或假手术小鼠中的IL-6、CCL3、CXCL10水平的评估。心肌缺血引起IL-6和CCL3水平显著升高(图A，B)。另一方面，CXCL10表现出相反的模式(图C)。*P＝0.007，**P＝0.02.***P＝0.03。
图15描绘的图表证明结扎的小鼠循环T-细胞的百分比显著增加，伴随着CCR5+和CXCR3+亚类富集(图A-C)。循环T细胞的增加是伴随着CCR5+脾T细胞的下降(图E)，而显然对总T细胞(图D)或CXCR3+脾T细胞(图F)没有影响。*P＝0.04，**P＝0.02，***P＝0.04，#P＝0.004。
图16描述了CCL3、CD86、CD36表达在颈圈(collar)诱发颈动脉斑块模型中的时间概括分析。颈圈诱发颈动脉斑块表明，颈圈放置2周后CCL3生成增加(图A)。观察到巨噬细胞标记CD68快速稳定的诱发(图B)，而CD36诱发略有推迟(图C)。相对于基线(t＝0)，**p＜0.01。
图17描述了在巨噬细胞中CCL3表达在LPS(50ng/ml)刺激时强烈上调(图A)，但在ox-LDL(10μg/ml)刺激时不强烈上调(图B)。在CCL3-/-嵌合体内消除LPS在体内诱导的CCL3反应(图C，黑色柱))***P＜0.001。
图18描述了与WT对照相比，在CCL3-/-嵌合体中，动脉粥样硬化病变显著较小(图A，具有代表性的图片)。在WT和CCL3-/-嵌合体之间的巨噬细胞(图B)、胶原(图C)和T细胞含量(图D)相似。嗜中性粒细胞流入(图E)和粘连(图F)在CCL3-/-嵌合体中显著减弱。白色柱代表WT对照，黑色柱代表CCL3-/-嵌合体。*P＜0.05，**P＜0.01。
图19描绘在CCL3-/-小鼠中，白血细胞总数(图A；WBC)和单核细胞的百分比(图B)没有不同，然而嗜中性粒细胞数(图C)显著降低。白色柱代表WT，黑色柱代表CCL3-/-嵌合体。**P＜0.01，***P＜0.001。
图20描绘对照(白色柱)和CCL3-/-小鼠(黑色柱)内的环磷酰胺诱导的瞬时白细胞减少症(图A；y轴上的WBC)和嗜中性粒细胞(图B；y轴上的嗜中性粒细胞计数)的动力学。CCL3-/-嵌合体中，嗜中性粒细胞消除被加速(图C)，而再增殖是相似的(图D)。黑色柱代表WT小鼠，白色柱表示CCL3-/-小鼠。*P＜0.05，**P＜0.01。
图21描绘腹腔内注射KC并不影响WT和CCL3-/-小鼠的循环CD11b+CD71-Gr1高嗜中性粒细胞数(图A)。CCL3-/-小鼠中KC引起的嗜中性粒细胞流入到腹膜腔的诱导是WT小鼠的约1/2.5(图B)。白柱代表WT小鼠，黑色柱代表CCL3-/-小鼠。**p＝0.003。
图22是装置示意图。
图23是阐明系统的元件的框图。
图24是阐明平衡检测模块的操作的流程图。
图25是阐明分析物检测模块的操作的流程图。
图26是阐明后处理模块的操作的流程图。
图27是阐明诊断模块的操作的流程图。
图28是表面的俯视图的示意图。
图29是一个实施方案中的装置的示意图。(A)描绘处于初始状态的实施方案，(B)描绘了在酶反应期间的实施方案。
图30是分析物校准曲线的一个说明性例子。
相应的参考字符和标记表示在附图的各视图中相应的元件。在图中使用的标题不应被解释为限制权利要求的范围。
详细说明
本文提供的是用于从多重反应中检测分析物的装置、系统和方法。检测装置可包括互补金属-氧化物-半导体(CMOS)图像传感器。在一方面，可设计CMOS传感器以捕获/测量因选定微阵列分析物的多路反应所产生的平衡图像检测，从而报告因检测反应所产生的单个和/或组合的目标分析物的离散量。可以使用装置进行多重微阵列分析物的检测反应，期望该装置测量和报告离散分析物的离散量或组合，提供信息以助于脊椎动物中改变的健康状态的预后和/或诊断。表明与特别设计以测量检测方法的结果的平衡图像检测结合的用于检测在体液里的目标分析物数量的多重分析方法的灵敏度，证明了使基于CMOS的技术能够作为用于在流体介质中选择分析物的平衡图像传感检测和量化系统的科学原理。
另外，设计以通过多重分析蛋白质和/或核酸检测疾病的生物标记的这种新颖、重量轻、方便携带和低能的装置，能够利用低水平环境光和环境温度检测脊椎动物体液中存在的目标分析物/生物标记。本专利的范围之内的权利要求包括：多重分析分析物的微阵列的新颖方法，结果的组合提供预后或诊断改变的健康状况的信息。测量所述分析物的方法通过调适能够利用由低能量源支持的低水平光的平衡检测的原理来实现。该检测方法能够区分1个目标分析物的个别浓度，或多个目标分析物的各个值，并且通过使用软件报告出多个分析物彼此的比值和与标准值的比值。平衡检测方法使便携式、低成本、重量轻的装置能够迅速报告多个分析物，这在一些实施方案中通过调适ELISA反应或类似的检测反应来进行。平衡检测方法可以利用CMOS芯片适于成像像素组之间的低光差，所述像素组监测指定的反应孔和非反应孔(参照孔)。CMOS图像传感系统结合了改进的ELISA反应和低水平光照系统，检测单个或者多个分析物，并且使用新的算法报告，以提供目标分析物的图形形式的输出或离散的测量结果。
适于捕获和报告蛋白质、核酸材料、多糖类或可以通过酶促方法测量或检测的其它物质的ELISA反应的平衡检测的验证原型表明基材、ELISA反应孔、低水平光、便携性、稳定性及低能耗。原型系统掺入以下方法，它能够利用最低限度的光，与标准的实验室方法相比降低酶促反应的时间，并能够调节环境光，使得能够在不同环境中根据需要标准化对照。所有的反应都能够在环境温度下进行。
下文提供快速检测装置以及使用该装置的相关系统和方法的各个方面的详述。
I.装置
在各种实施方案中，提供了从体液样品中快速检测一个或多个分析物的装置。该装置可被配置成接收体液样品和进一步使样品经受检测反应来检测所述样品中的一个或多个分析物。如下文详细描述的检测反应包括多个步骤，例如分析物捕获和捕获的分析物的标记，但并不需要其它步骤比如洗涤，从而减少检测各分析物所需的时间。此外，在某些实施方案中，检测反应掺入高度选择性的单克隆抗体，从而提供对来自单一体液样品的多于一个分析物的多路检测，进一步降低检测一个或多个分析物所需的总时间。
在各种实施方案中，该装置可以使用平衡传感器检测方法来检测和/或定量一个或多个分析物，该检测和/或定量利用自一对或多对的光传感器测得的读数差：第一个光传感器位于分析物检测区附近，第二个光传感器位于对照或标准区附近。平衡传感器检测方法提高装置的灵敏度，提供在各种光照条件(包括但不限于低光或环境光条件)下检测一个或多个分析物的能力。
各种实施方案中的装置掺入多重分析物检测，并以及时的方式提供有价值的诊断信息，以告知由对象或对象的医师在各种临床、护理点和/或家庭环境中作出的决策。这种装置的方法和元件能够在最少的对环境控制的需要下在室温发挥功能。此外，即使在最弱的光线下，该装置能够通过调节环境光以使得能够在不同的环境中根据需要标准化对照来获得测量结果。
图22是一个实施方案中的装置100的示意图。如图22所示，装置100可以包括用于进行检测反应(包括但不限于改进的ELISA方法)的表面102。表面102可以提供有检测区104和参照区106。检测区104和参照区106可以各种形式提供，所述形式在不限制的情况下包括但不局限于如图22所示的凹陷或孔。检测区104和参照区106均可包含一种或多种表位结合剂108，用于捕获来自样品中的一个或多个分析物110。
在使用中，可将含有一个或多个分析物110的样品112引入到检测区104，可将不含有一个或多个分析物110的参照物114引入到参照区106。或者，参照物114可以包含已知量的分析物。再或者，参照区106可以包括能被吸收至参照区的已知量的分析物。在还其它实施方案中，参照区106可包括已知量的在特定的已知位置(例如，模式)吸收到参照区的分析物。在检测区内，一个或多个分析物110可以参与检测反应，该反应可改变检测区104的光学特性。例如，检测反应可使用一种或多种表位结合剂108捕获一个或多个分析物110，并且可以进一步结合一种或多种标记的检测表位(tagged detection epitopes)116来捕获分析物110，由此引起不透明反应产物的形成，该反应产物减少检测区104的光透射特性。
装置100可以进一步包括光源122、检测光传感器118和参照光传感器120。光源122为检测区104和参照区106提供非相干和/或相干光。检测光传感器118和参照光传感器120配置以分别检测与检测区104和参照区106相关的光。例如，如图22所示，检测光传感器118可以位于检测区104相对于光源122的一侧附近，并且可检测透过检测区104的光。参照光传感器120可以类似地位于参照区106相对于光源122的一侧附近，并且可检测透过参照区106的光。光源122、检测光传感器118和参照光传感器120的其他安排是可能的，如下文进一步描述的。
在该实施方案中，由检测光传感器118产生的检测信号122可利用信号比较装置126与由参照光传感器120产生的参照信号124进行比较，信号比较装置126例如如图22所示的运算放大器或差动放大器。组合的信号128(可以是检测信号122和参照信号124之间的差值)可与预定的校准规则比较，从而确定在样品112内一个或多个分析物110的存在和/或浓度。
在各种实施方案中，与装置100相关联的系统(未显示)可用于控制装置100的操作；可用于采集一个或多个组合的信号128；可用于处理一个或多个组合的信号128，从而检测和/或定量样品112中的一个或多个分析物110；可用于确定受试者的一个或多个情况，和/或通讯一个或多个结果给系统用户(包括但不限于一个或多个分析物110的浓度或浓度比和/或受试者的一个或多个情况)。该系统的各种实施方案在下文进行详细说明。
在各种其它实施方案中，该装置可以通过在检测区104内掺入两种或更多种表位结合剂108实现一个或多个分析物110的多重检测，其中每种表位结合剂经选择以唯一结合单个分析物110，其与被每种其它表位结合剂108结合的分析物110不同。在另一个实施方案中，该装置和用于ELISA反应的平衡传感器检测方法可与互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片装置一起使用，CMOS芯片装置携带方便，迅速离散或在一组目标分析物中读取多个目标分析物各自的多重响应，从而产生疾病比率。
a)用于检测反应的表面
在实施方案中，该装置包括用于检测反应的表面。这样的表面应当允许检测参照位置和包含检测反应的位置之间的光差。通过非限制性实例的方式，表面可以是玻璃，塑料，硝化纤维素，铟，锡，镉，二氧化硅，聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯接枝聚合物，或它们的变体。可选择表面材料以与待分析样品的特定组成或类型兼容。另外，表面材料可经选择以与特定检测反应和/或传感器配置兼容。例如，如果传感器被配置为检测透过其中发生检测反应的各个点或区域的光，可选择透明材料。在另一个例子中，比如聚苯乙烯等材料可用作表面，以促进表位结合剂在用于进行检测反应的区域内固定。表面可形成为孔、点、凹面、空隙、峰或其他允许检测参照位置和包含检测反应的位置之间的光差的构造。
一般而言，设计用于检测反应的表面以容纳或支持体液样品。适合的体液样品可包括血液(包括全血、血浆、血清、或它们的组合)、尿、痰、泪液、脑脊液、淋巴液、唾液、汗液、或其它体液。本领域已知收集体液样品的方法。通常体液样品的体积应为从约0.2微升到约100微升或者更多。
用于检测反应的表面还可包括用于检测反应的工具。一般来说，用于检测反应的工具包括一种或多种表位结合剂(即分析物结合剂)，以及产生光变化的工具。光的变化可以是可检测光的减少或增加。在一个实施方案中，可通过不透光从而减少可检测光的不溶性产物的形成引起光的变化。例如，该不溶性产物可以是表位结合剂/分析物复合物、表位结合剂/分析物/标记的检测剂复合物、或表位结合剂/分析物/检测剂/特异于检测剂的标记复合物。在其它实施方案中，光的变化可以通过能产生光从而导致增加可检测光的物体产物的形成来引起。适合的光变化可包括化学发光反应和荧光反应。
术语“表位结合剂”是指能够和分析物结合的物质。合适的表位结合剂可以包括抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段等)、适体、双链DNA序列、配体和配体片段、受体和受体的片段、多核苷酸、辅酶、共调节剂、变构分子或离子。在一个示例性的实施方案中，表位结合剂是抗体。
表位结合剂可以使用本领域已知的方法吸收或以其它方式结合在用于检测反应的表面上。
术语“检测剂”是指能够结合分析物的物质。适合的检测剂等同于表位结合剂，例外是对于给定的分析物，表位结合剂和检测剂不会结合分析物的相同表位。在一个示例性实施方案中，表位结合剂是抗体。一般来说，检测剂不会被吸收到表面上。术语“标记的检测剂”是指包含可检测标记的检测剂。如本文使用的可检测标记是如上所述引起光的变化的标记。例如，可检测标记可以是比色物。
在一些实施方案中，多于一种表位结合剂被使用。例如，两种表位结合剂可以用于单个分析物。一般而言，如果两种表位结合剂被使用，每种表位结合剂应该识别分析物的不同的表位。在示例性实施方案中，一种或多种抗体被用作表位结合剂。
本文所使用的分析物指的是在体液样品中的物质，其可测量为受试者的健康/疾病状态的指示。本文所使用的“分析物”等同于“生物标记”。例如，分析物可以是蛋白质(例如，趋化因子、抗体、或其他蛋白)、碳水化合物或碳水化合物部分(例如，糖、淀粉、或蛋白聚糖)、脂质或脂质部分、核苷酸或核苷酸序列、或其它生物分子。分析物可以是细胞外的，或可利用本领域已知的方法处理体液样品以释放细胞内分析物。或者，分析物可以存在于体液样品的细胞的表面上。此类样品可利用本领域已知的方法处理以从细胞膜或细胞表面释放分析物。
本发明的装置可以用来测量多于一个的分析物。在这种情况下，用于检测反应的表面可以包括多种表位结合剂，不同表位结合剂针对不同分析物。在一些实施方案中，多于一种抗体对可被使用，每种抗体对特异于特定的分析物。在示例性实施方案中，装置可以以多重形式测量多于一个的分析物。即，所有的所述多于一个的分析物可以在单个孔内进行测定。在进一步的示例性实施方案中，多于一个的分析物可以用多重微阵列式的反应来测。例如，在各种实施方案中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或大于13个分析物可在多重反应中检测。如本文使用的多路意味着分析物在单个体液样品中同时被检测，这与在几个不同的样品中检测各个分析物或用单个样品在不同的时间检测各种分析物相对。
举例来说，对于掺入CMOS传感器的装置实施方案，a)可以包括多种检测抗体或预先点样的底物以和目标分析物结合，或者可使用CMOS芯片各空隙的凹陷。参照位置或对照可以发生在使用平衡差分法的相同反应位置，并且可以通过识别软件来实现。在CMOS中的分析物之间的信号差保持通过比较对照同时识别离散的目标分析物的能力。
在另一个例子中，使用掺入CMOS传感器(或者可能另一种多重分析孔方法)的装置，可能存在位于CMOS凹孔处中并且一起检测的多个分析物(比如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、或大于13个分析物)，从而多重分析蛋白质微阵列。比较而言，在本例子中可能存在含有每个目标分析物的对照的CMOS的另一凹陷。在另一个实施方案中，CMOS图像传感器的每个凹陷可用于在目标分析物孔内的单个分析物和其在紧邻的孔内的所述目标的对照。
此外，利用已知浓度对照的竞争ELISA方法可在本例子中进行。在反应过程中，检测区中的每个分析物的位置可以和各个对照的位置内的相应对照进行比较，每个位置在相同的环境条件内。例如，这个比较可以是在检测区的单个分析物和含有多个对照的标准孔之间的比较。
在孔/位置里面的单个分析物通过在该孔/位置内的微阵列的标准化点位置来区分。分析物的空间取向将产生由电压读出识别的式样(pattern)。包括分析软件的系统可以被用来分析该式样，以确定在样品中每种分析物的浓度。
图28是一个实施方案中的表面700的俯视图。该表面可包括一个或多个区域702，在此区域内可能发生检测反应。例如，在图28中标记为“1”的区域702可包含适合于第一个分析物的检测反应的试剂)，标记为“2”的区域702可含有适合第二个分析物的检测反应的试剂，依次类推。在另一个实施方案中，区域702的一个子集可以是用于进行分析物的检测反应的检测区，区域702的另一子集可以是对应于检测区的参照区并用于实现平衡传感器检测法。例如，标记为“1”的区域702可以是第一个分析物的检测区，标记为“9”的区域702可以是标记为“1”的检测区702相对应的参照区。类似地，标记为“2”和“10”的区域可以是第二个分析物的检测区和对应的参照区，并依此类推。
表面700的形状和区域702的空间排列没有限制，可以是任何已知的形状和排列。适合的表面形状的非限制性实例包括圆形、正方形和长方形。区域702适合的排列的非限制性实例包括圆形或环形、行和列以及线性。
此外，检测区和对应的参照区的式样没有限制，可以是任何已知的式样。在一个实施方案中，如图28所示，在区域702的圆形排列中，检测区可以与其相应的参照区径向相对。在另一个实施方案中，检测区和参照区可以彼此紧邻。例如，图28中标记为“1”和“2”的区域702可以是第一个分析物的检测区和参照区。如果已知量的分析物加入到参照区，检测区和参照区需要单独的孔(或等同物)。然而，如果参照区包括“预先点样”在参照区的已知分析物，参照区可以和检测区在相同的孔(或等同物)内。换句话说，在一个孔(或等同物)，本发明的装置可包含特异于分析物的吸收表位结合剂，在同一个孔内(但在该孔内的不同的位置)，该装置还可以包括已知量的讨论中的分析物。这允许检测反应和参照区暴露域同一个样品，并省去分割样品的需要。
再次参看图28，表面700可进一步包括样品导入口704，用于引入样品到表面700。样品导入口可以是如图28所示的洞或导管。或者，样品导入口704可以是表面700的区域，样品液滴放置在其上面。在一个实施方案中，样品可通过任何已知方法从样品导入口704移动到区域702。在一个实施方案中，样品可以通过扩散或毛细作用沿径向方向向外跨越表面扩散向区域702。在另一个实施方案中，表面可以包括微流体通道706以把样品从样品导入口704运送到各个区域702。在又另一个实施方案中，表面700可以进一步包括调适区708，其含有用于从样品形成流体底物的试剂，该底物适合在区域702内进行多重检测反应。
b)传感器
该装置在各种实施方案中还包括一个或多个传感器。一般而言，使用一个或多个传感器来测量透过其中进行分析物和相应对照的检测反应的点或区域或者自该点或区域反射的光差。典型地，一个或多个传感器与平衡传感器检测方法的使用兼容，以检测像素组之间的光差，所述像素组监测用于检测反应的表面上的指定反应位置和每个指定反应位置的对应参照位置。
在装置的各种实施方案中，任何的光传感装置都可用作传感器而没有限制。在一个实施方案中传感器可为CMOS图像传感器。在另一个实施方案中传感器可为光电二极管对。在又其它备选方案中传感器可为任何本领域已知能够成像像素组之间的低光差的传感器，所述像素组监测用于检测反应的表面上的指定反应位置和参照位置。
在各种实施方案中，装置的一个或多个传感器可用于平衡检测方法，此方法通过与装置操作相关的系统所包括的相关传感器电路和软件实现。一般而言，“平衡检测方法”是其中自参照位置产生的信号和自相应的反应位置产生的信号之间的差别设定为零作为初始条件(例如，在加入分析物之前)的方法。例如，当使用光电二极管时，光电二极管对可以被配置为“平衡检测器”，使得来自光电二极管的电流相减，并设为零作为初始条件，如图29A所示。
在各种实施方案中，传感器的平衡可以至少两种方式实现。参考回说明一个实施方案的图29A，参照光源122B(例如LED或激光二极管光源)可以是专用于参照区106，独立的检测光源122A可以专用于检测区104。如果不存在初始均衡，光源122A/122B各自的光强都可以经调整，使得检测光传感器118测量的检测光强和参照光传感器120测量的检测光强彼此基本上相等。在第二个实施方案(未显示)中一个或多个光源的输出被固定在预选强度，传感器的平衡通过控制与各传感器相关的对照回路的可变电阻器或其它元件的值来实现。在一个实施方案中，如果传感器是CMOS成像器，可调节与检测区104的成像像素和/或参照区域106的成像像素相关联的一个或多个可变电阻以平衡传感器。
参考图29B，随着酶促反应在检测区104内进行，检测传感器118捕获的光可被检测反应产物改变。例如，检测反应可产生光学上不透明的沉淀物，其可降低由检测传感器118传感的光强。因为在反应区104的检测反应期间参照区106内的条件基本保持不变，所以参照传感器120可继续传感相同的光强，因此产生与其初始读数相同的读数124。检测传感器118的读数122的这种差异改变了传感器的初始“平衡”，导致产生非零的组合信号128。
利用校准曲线，组合读数128的变化随后可翻译成分析物的浓度。图30描述分析物校准曲线900的说明性例子。在一个实施方案中，可通过使用图29A和图29B所示的装置100对多个包含在校准的范围内变化的多已知浓度的分析物的样品进行重复测量902，形成校准曲线900。在一个实施方案中，校准曲线可以用于把编码由一个或多个传感器检测到的光差的组合信号输出转换为目标分析物浓度的0.01pg/ml之内的分析物浓度测量结果。
在各种实施方案中，CMOS传感器可用于检测装置的一个或更多个检测区和参照区的光强。在一个实施方案中，CMOS传感器可以得到含有像素阵列的图像，所述像素编码由CMOS传感器检测到的所测光强的空间映像。CMOS传感器图像可在整个图像中的不同空间位置含有多个子区域，其中每个子区域对应从装置的表面的检测区或参照区之一测量得到的光强。每个子区域可以包含来自图像的一个或多个像素；每个像素与空间位置和编码在该空间位置测得的光强的像素强度相关联。在实施方案中，基于在装置表面上的检测区和参照区的已知空间排列，每个子区域内的像素强度可以被归类为特定分析物的检测区或参照区。
在各种实施方案中，可以按不同的方式进行分配给每个生物标记/分析物的像素或像素组的平衡。在一个实施方案中，每个生物标记/分析物的像素或像素组可以单独平衡。在另一实施方案中，可选择参照区的参照像素和检测位置的检测像素，而不考虑它们和任何特定分析物的关联性，而且它们的差异信号可被用于平衡传感器。在该第二个实施方案中，人们不必平衡分配给每个要被检测的生物标记/分析物的反应像素和参照像素。
在另一个例子中，在使用CMOS传感器时，对于每个预先点样在微阵列上待多重分析和检测的生物标记/分析物，将有两组像素，每组像素具有相同的与各个待分配的一个或多个分析物相关联的指数集。像素组之一将监测反应位置，而另一组像素将被用作参照并监测其中没有反应发生的参照位置。作为初始条件，使各生物标记/分析物的两组像素所检测的强度差(比如，在感兴趣区域内的像素-像素或者平均值)平衡至尽可能接近零，类似于由一对光电二极管建立的平衡检测器。检测到的光强差的变化经处理输出关于发生的反应的信息以捕获为电压差。装置比较电压输出，放大电压输出以产生一组与一个或多个分析物的浓度相关联的组合信号。
在各种实施方案中采用装置的传感器实施平衡传感器方法，可提高在大范围的光照条件(包括低光条件，比如环境光)下分析物浓度测量的灵敏度。因此，无论光照条件，分析物浓度测量的灵敏度可保持在适当高水平。在一个实施方案中，该装置可以利用环境光照作为光源，导致产生具有相对低能需求和增强的便携性的装置。
c)光源
在各种实施方案中，光源照亮检测区和参照区。在一个实施方案中，环境光或低水平光可以被用作光源，从而省去了在装置中包含动力光源的要求。或者，其他相干或非相干光源可以结合到装置中当作光源。合适的光源的非限制实例包括白炽光源、激光二极管、及发光二极管(LED)。
光源可以位于相对于装置的一个或多个传感器的任何位置而没有限制。在各种实施方案中，光源可以位于装置/表面的与传感器相同的一侧，传感器被配置成检测从检测区和参照区反射的光。在各种其它实施方案中，光源可以位于相对于传感器的表面的相对侧，传感器被配置为测量透过检测区和参照区的光。
图22显示了在一个实施方案中，光源122相对于装置100其它组件的布局。在本实施方案中，光源122位于基底/托盘102上面，检测/参照传感器118/120位于托盘102下面，以便传感透过检测区104和参照区106的光。在另一实施方案中，图22所示的装置100的光源122可以被省略，传感器118/120可以检测透过检测区104和参照区106的环境光。
d)其他装置特征
本发明的装置旨在便携式。因此，该装置应轻便，在环境温度下能工作，在小于40分钟(优选30分钟或更少时间)内得出结果，使用低能源(例如，一个或多个电池)，并在环境光或低水平光下工作。
II.使用方法
一种检测方法可使用检测装置来测量样品中的一个或多个分析物。在一个示例性实施方案中，本发明的装置可用于测量下文第三节详述的分析物或分析物的组合。该检测方法可包括，但不限于，改进的ELISA法和多重分析分析物检测。改进的ELISA可包括含有体液样品、标记的检测剂及改进的ELISA方法所需要的任何其他试剂的组合溶液。组合溶液可包括用于在体液样品中的多个分析物的多种标记的检测剂。
基于来自装置的信号，可将分析物的多重检测用于疾病判定。使用检测装置获得的测量结果可用于作出关于提供体液样品的受试者的治疗决断。例如参见下文表C。
a)改进的ELISA方法
在一个实施方案中，检测反应是改进的ELISA。一般来说，ELISA包括：在基材上涂覆特异于分析物的捕获抗体、通过添加样品将分析物固定、加入检测抗体以形成与分析物的复合物和通过连接酶的第二抗体检测复合物。在各步骤之间，基材用温和洗涤剂洗涤，除去非特异性结合的任何蛋白质或抗体。洗涤步骤可能需要重复几次，以确保所有过量的抗体和蛋白质被除去。然后加入酶底物，这将产生和该样品中的分析物浓度相关的可见信号。来自样品的信号可以和已知的标准梯度进行比较，以确定浓度。典型的ELISA可能需要5至24小时来完成，这是因为每个步骤的孵育时间以及每个孵育步骤之间的洗涤步骤。
或者，本发明的检测反应可包括改进的ELISA方法。改进的ELISA方法可包括：在一种组合溶液中组合包含一个或多个分析物的体液样品、标记的检测剂(或检测抗体和指示试剂)并一起孵育。一方面，加入组合溶液之前，可以用一种或多种表位结合剂(捕获抗体)将基材预处理。
改进的ELISA法中使用的表位结合剂和检测剂可以是抗体。在一个方面中，表位结合剂可以是单克隆抗体。另一方面，标记的检测剂可以是单克隆抗体。使用单克隆抗体的优点在于，所述试剂可以同时混合在一起、洗涤和放在基材上，从而降低了检测反应时间。一方面，多种单克隆抗体可以用于改进的ELISA方法来检测体液样品中的多个分析物。
在一些实施方案中，单克隆抗体表位结合剂和单克隆抗体检测剂可以与样品共孵育。样品与检测剂或标记的检测剂和指示试剂的组合可通过除去独立的孵育时间和之间的洗涤步骤，减少标准ELISA步骤。除了减少反应时间外，改进的ELISA方法可通过选择和修改进行中的试剂得到提升。
为了采用平衡检测检测方案，改进了ELISA标准方法，需时约30分钟，而不是通常的5小时至24小时。例如，使用单一单克隆抗体的改进的ELISA方法可以在分析物引至抗体的约10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100分钟内提供精确的结果。单克隆抗体检测方法的该方面可以测量目标分析物的组合，可以采用适于具有平衡检测方法的便携的CMOS图像传感器。在一个优选的实施方案中，本发明的装置可以在将分析物引至表位结合剂后的不到35分钟的时间内提供准确的结果。
在一个方面，改进的ELISA法染色程序(BCIP/NBT)可以使用平衡检测系统和环境光进行检测。不溶性底物可允许对独立的微阵列点的不同的生物标记进行实时监控，而不停止底物的显色。
在另外的方面，本发明的装置仅检测来自表位结合剂/分析物/检测剂复合物的光的变化，而使用比色物。
一旦在检测区中，缩短的ELISA反应就可用来降低检测目标分析物的浓度所需要的时间。在体液中的多个分析物可以暴露给装置的室。该反应可以改变样品中的分析物以使得能够报告光检测。在一个方面，简化的检测方法可以符合CMOS图像传感器多重分析装置的规范。
b)分析物的多重检测
组合溶液可用来检测一个样品中的多个分析物。如上文所述，包含含分析物的样品、多种不同的标记或未标记的检测剂和/或指示试剂的组合溶液可放在装置上。改进的ELISA方法连同抗体的多重分析可允许相对快速的在单个样品中检测多个分析物的方法。
在一个实施方案中，表位结合剂和/或标记的检测剂可以是单克隆抗体。这可允许与分析物的特异性结合，而无显著的交叉反应。使用单克隆抗体允许各分析物特异性结合到其特异性单克隆捕获和/或检测抗体(表位结合剂和/或标记的检测剂)。不必应用独立的溶液(每个溶液包含期望被检测的每个分析物的不同检测剂)，这减少了测定时间，并简化了过程。
具有最小交叉反应的新颖且独特抗体对的多重分析可以用来唯一标识各目标分析物。含有多种抗体的组合溶液可以被放置在反应孔基材上。一方面，组合溶液可含有范围约2至约20种抗体的多种抗体。另一个方面，该溶液可包含以下范围的多种抗体：约2至约6种抗体、约4至约8种抗体、约6至约10种抗体、约8至约12种抗体、约10至约14种抗体、约12至约16种抗体、约14至约18种抗体、约16至约20种抗体。一方面，该溶液可包含至少13种组合的抗体。
一方面，涂覆的玻璃可以用作基材。那么载玻片可以使用标准ELISA显微镜、ELISA板读数器或者经图像处理的显微镜照片读取。
平衡检测方法被证明适应于标准ELISA测定法以适应多重分析抗体对。
在便携式检测系统，所选择的和经过测试的单克隆抗体对可用于目标分析物。特别是在装置的一个实施方案中，5个目标分析物：CCL3、CCL5、CCL18、hsCRP和心脏TnI被反复试验，以鉴定理想的抗体对组合，其能够在反应室内单独地检测每一个特定的目标分析物而与其它的单克隆抗体对没有交叉反应。检测的灵敏度与报告人的正常限内的水平以具有检测特异性抗体的升高水平的范围的需要一致。
在其它实施方案中，下表A中的每个分析物都可使用本发明的装置检测。具体地，在一个示例性实施方案中，该装置包括单一的孔(或等同物)，该孔包含至少一种特异于表A所列的各个分析物的表位结合剂。然后，使用在组合溶液中包含的检测剂检测表A中的分析物。这些实施方案中，参照区可以和检测区位于同一个孔，或在单独的孔里。在又其它实施方案中，本发明的装置被用于检测表A中列出的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个分析物。在具体的实施方案中，发明的装置可用于检测在表B或C中指出的分析物的组合。
然后，多个分析物的组合信号可通过如上文所述的差分比较与标准进行比较。该结果然后可用于给出疾病比率，并提供回答给医生或患者。
另一方面，由于使用具有光学不透明的(BCIP/NBT)基材的平衡比较器的独特方面，各个分析物的单个标准和参照对可以被实时监测，因为位置显色其不透明度。这允许随着它们显色独立地测量每个分析物，而且避免了同时读出所有分析物的需要。
c)检测样品中的分析物
检测方法可包括：将样品引入检测装置，加入组合溶液，并从检测装置中获得读数。引入样品之前，检测装置的基材可以预先用表位结合剂处理。该表位结合剂可特异于希望被检测的目标分析物。
该体液样品可以被引入到反应室或基材。引入机制可起因于手指刺穿采血、取痰、或其他体液的任何其它捕获。体液样品可以引入到酶、缓冲液和/或试剂以使得能够进行酶促反应。在一方面，体液可以使用外部移液方法引入。
体液样品可与多种标记的检测剂和用于改进ELISA方法的任何其他所需试剂组合。一旦在反应室中，改进的ELISA方法可用于减少检测目标分析物的浓度所需的时间。体液样品中的多个分析物可以暴露给装置内的室。
反应可改变体液样品中的分析物，使得能够报告光检测。然后，装置可检测该信号。简化方案可以符合CMOS图像传感器多重分析装置的规范。一方面，该装置可以基于检测的每个分析物的水平报告患者的情况。
在各种实施方案中，该装置可以利用平衡传感器检测方法以利用从一对或多对光传感器测得的读数差检测和/或定量一个或多个分析物：第一光传感器位于分析物检测区附近，第二光传感器位于对照或标准区附近。平衡传感器检测方法提高了装置的灵敏度，提供了在各种光照条件(包括但不仅限于低光或环境光条件)下检测一个或多个分析物的能力。经过评估/评估中的比较器能随着底物显色和沉淀在适当的地点报告一个比较器对。
本发明的另一个实施方案，CMOS图像传感器可扫描一系列过反应/不足反应，产生结果阵列，其然后被转换为电压输出，再转换为意图测量的每个未知或目标分析物的特定衡量。
III.特定的生物标记/分析物结合
已经发现，一组生物标记可被用于预测心力衰竭和/或伤口闭合——举例本装置的几个应用。特别地，检测方法可以被用来预测受试者即将发生的心力衰竭，即使其他的诊断方法未能指出心力衰竭失败。有利的是，本发明的检测方法可以预测约180天内的即将发生的心力衰竭。在示例性实施方案中，本发明的方法可以预测使用该方法后约72小时至2周内即将发生的心力衰竭。或者，检测方法可用来确定受试者的伤口愈合的过程和/或阶段。一般来说，该方法部分地包括确定取自受试者的生物样品中生物标记的水平。该方法的组成和生物标记将在下文中更详细地描述。
a.受试者
对于本发明的方面和实施方案的目的，受试者可以是人或任何其他动物。在具体的实施方案中，受试者选自灵长类动物、马、牛、绵羊、山羊、野兔、禽类、猫科动物、啮齿动物或犬科动物。在一个实施方案中，受试者是啮齿动物。啮齿动物的例子包括小鼠、大鼠和豚鼠。在另一个实施方案中，受试者是灵长类动物。灵长类动物的例子包括猴，猿和人类。在一个示例性实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者可抱怨不适，其可指示或暗示心力衰竭。可指示心力衰竭的不适的非限制性例子可包括胸痛或胸闷、胸口的奇怪的感觉、出汗、气短、恶心或呕吐、疼痛、压力、或在背部、颈部、下巴或上腹或在一个或两个肩膀或手臂的奇怪的感觉、头晕或突然虚弱、沉重感或下肢虚弱，或快速或不规则的心跳。本领域技术人员会认识到，不适的这种例子可能并且最可能会在不同的受试者和男性和女性之间不同。
在其他实施方案中，受试者可有开放的伤口。一般而言，伤口愈合的经典模型被分成三个或四个连续的但重叠的阶段：(1)止血(有些作者认为这不是一个阶段)，(2)的炎症，(3)增殖和(4)重构。本发明适合的受试者可具有处于这四个阶段中的任一个阶段的伤口。受试者可以有正在经历愈合过程的伤口，或者可以有不进展(不愈合)的伤口。
b.生物样品
生物标记的水平在取自受试者的生物样品中确定。如本文所定义的生物样品可以是从受试者采取的一定量的体液。体液的非限制性实例可包括：血浆、血清、全血、脑脊液(CSF)、滑液、组织液、器官流体(如胆汁、精液等)、体液(如玻璃体液)、灌洗液(如鼻灌洗液和支气管肺泡灌洗液)、分泌物(如粘液性流体)、渗出物、唾液、汗液和泪液、废物、和其他非人类动物情况下的生物流体。在一个示例性实施方案中，生物样品是血液。
在一个实施方案，生物样品选自全血、血清和血浆。在另一个实施方案，生物样品是全血。在另一个实施方案，生物样品是血清。在又一个实施方案，生物样品是血浆。在另一个实施方案，生物样品是人血清。在一个示例性实施方案中，生物样品是人全血。
从受试者收集体液的方法可以且会根据体液的性质变化。本领域通常已知的多种方法中的任一种可用于从受试者收集体液。测试样品的体液可以使用任何已知的装置或方法从受试者采取。适于从哺乳动物采取体液的装置或方法的非限制性实例包括：尿样品杯、尿道导管、拭子、皮下注射针、细针活检、空心针活检、穿刺活检、代谢笼和抽吸。在优选的实施方案中，所收集的体液是血液。采集血液或其部分的方法在本领域是周知的。例如，参见美国专利号5286262，该专利通过引用使其整体并入本文。一般来说，不管用于收集体液的方法，所述方法优选保持生物标记的完整性，使得它们可以在体液中精确地量化。
c.生物标记/分析物
本发明的一个实施方案测量在生物样品中的生物标记的水平。如本文所用的“生物标记的水平”指的是编码样品中存在的生物标记/分析物的RNA的量、生物标记的转录速率、样品中生物标记蛋白的量、蛋白合成的速率、或生物标记的酶活性的水平。
适合的生物标记包括但不限于：CCL2、CCL3、CCL11、CCL17、CCL18、CCL22、CCL5、肌钙蛋白、HS-肌钙蛋白、肌钙蛋白骨同种型、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-18、TNF/TNFα、MMP9、MMP2、MMP3、CK-MB、GDF-15、H-FABP/FABP3、HS-CRP、LpPLA2、MPO、肌红蛋白、NT-proBNP、妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、可溶性FAS、TIMP-1、IL-33、IL-34、IL-23、IL-17、CXCR4/CXCL12(SDF-1)、CX3CL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10(IP-10)、CXCL16、CCL25、热休克蛋白27(HSP27)、CCR9、sCD40L、趋化因子样因子MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)、OSM(制瘤素M)、干扰素、骨保护素(OPG)、sRANKL(核因子KB配体的可溶性受体激活剂)、sVCAM(可溶性血管细胞粘附分子)、sICAM(可溶性细胞间粘附分子)、β-连环蛋白(β-连环蛋白是在人中由CTNNB1基因编码的蛋白)、VEGF、CSF2/GM-CSF、Myc(c-Myc，是编码转录因子的调节基因)、脑信号蛋白-4D(SEMA4D，也被称为分化簇100(CD100)，是脑信号蛋白家族在人中由SEMA4D基因编码的蛋白)和胎盘生长因子(PIGF)。在一些实施方案中，生物标记可以包括产生、分泌、合成或表达的上面列出的标记细胞和/或组织。在一个备选实施方案中，生物标记可以包括循环内皮细胞(CEC)。三种趋化因子生物标记，CCL3、CCL5和CCL18，是互补的，因为它们可能覆盖发炎、上皮形成和组织重建过程中的不同过程，但抗体没有交叉反应。这些生物标记和其他可用于检测方法的生物标记在下面进一步阐述。
CCL3生物标记是趋化因子(C-C基序)配体3(CCL3)蛋白质，也称为巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。CCL3是细胞因子，属于CC趋化因子家族(参与急性炎症状态的多形核白细胞的募集和激活)。
CCL18生物标记是趋化因子(C-C基序)配体18细胞因子，属于CC趋化因子家族。它以前被称为PARC(肺和激活调节的趋化因子)。
CCL5生物标记是趋化因子(C-C基序)配体5。它也被称为RANTES(激活时调节的、正常T-细胞表达的且分泌的)。
肌钙蛋白是三种调节蛋白(肌钙蛋白C，肌钙蛋白I和肌钙蛋白T)的复合物，其对骨骼肌和心肌而非平滑肌的肌肉收缩必不可少。在一些实施方案中，肌钙蛋白生物标记是肌钙蛋白C。在其他实施方案中，肌钙蛋白生物标记是肌钙蛋白I。在又其它实施方案中，肌钙蛋白生物标记是肌钙蛋白T。在其它实施方案中，肌钙蛋白生物标记是包含肌钙蛋白C、钙蛋白I和钙蛋白T的复合物。心脏肌钙蛋白(hs cTnI)生物标记可与心肌梗死相关联，并且高浓度的这种蛋白可以是心肌梗死的证据。
NT-proBNP——脑钠肽(BNP)的76个氨基酸的N-末端片段，是一种分泌蛋白，其充当心脏激素。该蛋白质经历两个切割事件，第一个在细胞内，第二个在分泌后到血液中后。如本文使用的术语“NT-proBNP”指的是全长的NT-proBNP蛋白质或该蛋白质的任一种或多种裂解产物。该蛋白质的生物学作用包括尿钠排泄、利尿、血管舒张、抑制肾素和醛甾酮的分泌，并在心血管稳态中发挥关键作用。在血液中高浓度的此蛋白指示无症状或有症状心力衰竭。表1提供了脑钠肽的Entrez基因ID号。据此可确定NT-proBNP的核苷酸和氨基酸序列。
HFABP(心脏型脂肪酸结合蛋白)生物标记是缺血事件后从心肌细胞释放的蛋白质。该蛋白质参与脂肪酸氧化代谢。高浓度的该蛋白质指示恶化中的心脏功能，并且可以在心肌梗死的疼痛之后1至3小时检测到。
PAPPA(妊娠相关血浆蛋白A)是与怀孕相关的蛋白质，低血浆水平可与唐氏综合征相关。
C-反应蛋白(CRP)生物标记是响应于炎症时在血压中增加的蛋白质。高灵敏度的CRP试验可以测量低水平的CRP。在血液中，高浓度的CRP可指示恶化中的冠状动脉疾病，可与发展中风、心肌梗死或严重的周围血管疾病的增加可能性相关。
胎盘生长因子(PIGF)生物标记是参与血管生成的蛋白，尤其是在孕期，并且是VEGF家族的部分。低浓度PIGF可与先兆子痫有关。
干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)，也被称为C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)生物标记，是响应于干扰素分泌的趋化因子。IP-10和包括单核细胞/巨噬细胞的趋化和血管生成的若干角色有关。
巨噬细胞抑制细胞因子-1(MIC-1)生物标记是在巨噬细胞中的自分泌调节分子。高浓度的这种蛋白质可提供心肌梗死的附加预测值。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或半胱氨酸蛋白酶抑制剂3生物标记是与肾功能相关的蛋白质。这种蛋白质高的浓度可和心肌梗死、中风和心力衰竭相关。
脂蛋白相关磷脂酶A2(LP PLA2，也可被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH))生物标记是与低密度蛋白相关的酶，并参与动脉粥样硬化发展。高浓度的这种蛋白质可增加斑块不稳定性测量。
基质金属蛋白酶-1(MMP-1，也被称为间质胶原酶和成纤维细胞胶原酶)是一种在人类中由MMP1基因编码的酶。该基因是MMP基因簇的一部分，MMP基因位于染色体11q22.3。MMP-1是第一个既作为蛋白提纯至均一又克隆为cDNA的脊椎动物胶原酶。
白介素-8(IL-8)是由巨噬细胞和其它细胞类型如上皮细胞产生的趋化因子。IL-8也由内皮细胞(其在其存储囊泡Weibel-Palade体中存储IL-8)合成。在人中，白介素-8蛋白质由IL8基因编码。
TIMP金属肽酶抑制剂1，也被称为TIMP1，是金属蛋白酶的组织抑制剂，是自几种组织表达的糖蛋白。
对于许多这些生物标记的Entrez基因ID号可以在表1中找到。
一方面，可测量选自CCL3、CCL5、CCL18、HFABP、PaPPa、hsCRP、hs cTnI、PIGF、Nt-proBNP、IP-10、MIC-1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、LP PLA2以及其任意组合的生物标记的水平。在另一个方面，生物标记IL-8、MMP1和TIMP1可以加入到待测量的生物标记小组。表A将生物标记的浓度作为下范围(其中生物标记可以被排除)和上(阳性)范围(其中生物标记可与心肌梗死、心脏功能恶化或任何其它预测或预后事件相关)列出。
表A
多重标记 下范围 阳性范围
MIP 1α(CCL3) 8pg/ml 17.2-42.2pg/ml
RANTES(CCL5) 10ng/ml 14.2ng/ml-55ng/ml
CCL18 10ng/ml 43.3-110ng/ml
HFABP 1.0pg/I ＞6.25ug/l
PaPPa 5.0plU/ml ＞6.0plU/mI至50
hsCRP 1mg/ml 1.89-20mg/L
hs cTnI 20pg/ml ＞.03ng/nl 100ng/ml
PIGF胎盘生长因子 10ng/l ＞7.5pg/mL-＞25pg/mL
Nt-proBNP 20pg/ml 305-5549pg/mL
IP-10 150pg/ml 65-140pg/ml
MIC-1 800ng/l ＞1000ng/L-2200ng/l
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 0.3mg/I ＞0.3mg/I-4.0mg/l
LP PLA2 100ng/ml ＞400ng/ml
在一些实施方案中，可以测量肌钙蛋白和选自CCL3、CCL18、CCL5和NT-proBNP的一个、两个、三个或四个生物标记的水平。表B列出了优选的可以被测量的生物标记组合。在某些实施方案中，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于10个的额外生物标记可以与表B中列出的组合结合使用。
表B
一方面，表A的上范围或阳性范围内的生物标记的阳性测量可指示与疾病或状况变化的关联。一方面，使用提供离散测量的快速、便携系统进行的选定分析物的阳性范围可以被用来创建疾病比率和报告一个特殊的发现。阳性数和诊断疾病相关。该系统报告个体患者相比于对照的比量度，而不是基于多重分析技术的珠粒的中值或平均值。参照表A，范围测量值代表筛选群体的方法。一方面，对于诊断特定的患者的疾病，该装置可以是特异性的。
已经报道预后趋化因子标记能够帮助临床决策，以对最有可能经历致命急性心肌梗死(AMI)的突发的患者进行风险分层。具有表A的表C表示具有其检测灵敏度范围和指示临床疾病的范围的多重蛋白质。例如，如果单独或组合在其最高范围的趋化因子CCL3、CCL5和CCL18全都升高，那么患者可能经历未来的致命AMI。
各目标分析物升高和降低的时间变化指示不同的临床信息。分析物水平随时间变化，因为患者的病情改变。变化可发生在几天时间内，而不是几小时时间内。将与关于患者的症状和体征的数据组合的这个信息输入到医疗决策支持软件系统，从而提供决定性的疾病预后或诊断。
已经证明，具有所有3个趋化因子(CCL3，CCL5，CCL18)在最高三分位(tertile)升高的患者有未来致命事件的风险增加，2.5至5.65的危害比(P＜0.011)。已经进一步证明，对于正在经历一事件的那些，心肌钙蛋白T(TnT)值为0.29ng/ml绝不能表明患者心脏健康恶化，也在180天内与未来致命事件没有任何关联。因此，当心肌钙蛋白为阴性，然而在其最高三分位检测到单独或总计的CCL3、CCL5、CCL18时，使用应用平衡检测方法的CMOS图像传感器可报告处于未来致命AMI的风险之中的患者，所述平衡检测方法用于捕获在低光条件中的相对变化，然后利用软件算法转变为输出。
表C列出了一些阳性生物标记组合和发现结果，其由可与疾病或健康改善相关的多重标记的新颖多重复用产生。表C中，“阳性/-”表示轻微升高的低阳性范围。
表C报告了使用涂覆的载玻片作为基材的试剂盒的多重分析设计。在列表中包含了单独或组合与致命心脏事件相关的最早的报道的趋化因子CCL3、CCL5、CCL18、CXCL10(IP-10)。此外，还有指示活性AMI的标记(cTnI，Hs CRP)。PaPPa、PIGF、HFABP用于在心脏组织坏死之后但在cTnI升高之前报告AMI。Mic 1α和GDF15用于结合升高的CCL18和NT-proBNP报告经历了AMI并需要进一步诊断以考虑治疗选项的患者的恶化中的心脏状况。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是肾小球滤过率(GFR)的量度。与CCL3、CCL5、CCL18、CXCL10相结合的该标记增强对患者进展到致命AMI的总体可能性的测量。将报道为与易损斑块关联的Lp PLA 2包括为比较其可靠性与即将发生的致命事件的经证明预测剂(由于其应答于冠状血管改变的关键方面)的测试量度。
例如，在其中CCL3、CCL18，cTnI、PaPPa、PIGF、Mic 1α、HFABP、NT-proBNP略微升高，Hs CRP升高，CCL5高度升高，而且患者有明显的创伤性损伤的创伤患者中，在其伤员鉴别分类期间，临床医生可以排除心脏受累。
多重分析系统将各分析物或蛋白质报告为数字。根据以前定义临床阳性范围的经证明的临床信息(参见例如表A)，提供给临床医生信息以帮助作出临床决策。如果心肌钙蛋白I升高到阳性范围，然而由于标记组合的多重分析，CCL3没有升高或CCL18不在阳性范围的最高三分位内，那么这可能表明该患者正在经历AMI并需要适当的治疗。研究已经证明了趋化因子CCL3、CCL5、CCL18和CXCL-10(IP-10)是将要发生AMI的最早标记。CCL3在AMI患者群体可能不会显著升高，但是在发展到心脏事件的不稳定心绞痛患者群体，CCL3可具有更高的升高。因此，用于报告一系列相关心脏标记的多重分析装置和方法是新颖和医学上指示性的，这是由于每个标记对于冠状血管损伤、重建的变化的新瞬时表达和与所述变化的关系以及这些标记在响应于心脏组织坏死时升高。
从受试者采集的生物样品中的生物标记水平可以与健康个体的生物标记的参照水平进行比较，以确定所述生物标记的水平是否显著不同。可以使用已知的统计分析技术来计算显著差异。可用于计算风险分数的统计分析技术的非限制性实例包括：交叉相关法、主成分分析(PCA)、因子旋转、逻辑回归(LogReg)、线性判别分析(LDA)、Eigengene线性判别分析(ELDA)、支持向量机(SVM)、随机森林(RF)、递归分割树(RPART)、相关的决策树分类技术、萎缩形心法(Shrunken Centroid，SC)、StepAIC、第K最近邻、Boosting、决策树、神经网络、贝叶斯网络、支持向量机和隐马尔可夫模型、线性回归或分类算法、非线性回归或分类算法、变量分析(ANOVA)、分层分析或聚类算法；利用决策树的分层算法；基于核的机器算法，例如核偏最小二乘算法、核匹配追踪算法、核Fisher判别分析算法、核主成分分析算法或者斯氏t检验统计假设检验。在一个示例性实施方案中，用斯氏t检验统计假设检验计算P值。在一些实施方案中，P值低于约0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01表明统计学显著差异。在一些实施方案中，可使用三分位分析法。
d.心力衰竭
该检测方法可预测心力衰竭。如本文中所使用的，“心力衰竭”可以被定义为如果未给予立即紧急医疗干预的话导致死亡或者可导致死亡的任何心力衰竭。心力衰竭的非限制性实例可包括：心肌梗死、急性心肌梗死、ST升高心肌梗死(STEMI)、非ST升高心肌梗死(NSTEMI)、任何冠状血管的急性斑块破裂(acute plaque rupture)、稳定心绞痛和不稳定心绞痛。在优选的实施方案中，心力衰竭是心肌梗死。在其它优选的实施方案中，心力衰竭是急性心肌梗死。在还其它优选实施方案中，心力衰竭是在任何的冠状血管的急性斑块破裂。在一些实施方案中，心力衰竭是ST升高心肌梗死。在某些实施方案案中，心力衰竭是非ST升高心肌梗死。在某些实施方案中，心力衰竭是受损心脏组织的不愈合或重建。
本发明方法可以预测即将发生的心力衰竭。如本文所使用的，“即将发生的心力衰竭”是可在对受试者测量本发明的一种或多种生物标记后大约180天内出现的心力衰竭。在示例性实施方案中，即将发生的心力衰竭是可在对受试者测量本发明的一种或多种生物标记后大约两周内出现的心力衰竭。在一些实施方案中，即将发生的心力衰竭可以是可在对受试者测量本发明的一种或多种生物标记后以下时间出现的心力衰竭：大约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，或180天。在其它实施方案中，即将发生的心力衰竭可以是可在对受试者测量本发明的一种或多种生物标记后约1，2，3，4，5，或6天出现的心力衰竭。在又其它实施方案中，即将发生心力衰竭可以是可在对受试者测量本发明的一种或多种生物标记后约4，5，6，7，8，后9天或10天出现的心力衰竭。在其它实施方案中，即将发生的心力衰竭可以是可在对受试者测量本发明的一种或多种生物标记后约11，12，13，14，15，16，或17天出现的心力衰竭。
e.测量生物标记
在上述章节(c)中所述，生物标记水平可指编码存在于样品中的生物标记的RNA的量、生物标记的转录速率、样品中生物标记蛋白的量、蛋白合成的速率、或生物标记的酶活性水平。在每种情况下，水平被量化，使得确定值、平均值、或值的范围。在一个实施方案中，定量蛋白质的量。
在一些实施方案中，用于测量生物标记浓度的方法是适用于多重蛋白质微阵列浓度测定的方法。本文所定义的多重测定装置是使用单一的装置和/或方法能够同时确定三个或更多个不同样品分析物的浓度的测定。测定蛋白质包括来自流体样品的浓度的离散测量，而不是报告来自同一流体源的多个样品的平均值或中值。
适合的检测方法可包括使生物标记与表位结合剂接触。术语“表位结合剂”是指一种能够结合生物分子的特定表位的试剂。表位结合剂的非限制性实例可以包括：适体、双链DNA序列、配体和配体片段、受体与受体片段、抗体和抗体片段、辅酶、共调节剂、变构分子和离子。在一个示例性实施方案中，生物标记与抗体或抗体片段接触。例如，非限制性举例而言，生物标记可以与一种或多种特异于生物标记的单克隆抗体接触。
示例性检测工具可以被用做护理装置点。典型地，这样的检测工具是便携的，并且在示例性实施方案中，可以是一次性的。在一个示例性实施方案中，检测工具可以采用光电检测系统。例如，检测工具可能能够利用环境光来产生基于生物样品中的生物标记水平的可检测的信号。
为了调整在测试样品中样品分析物的预期浓度以落入测定的动态范围内，可稀释测试样品，以在分析之前降低样品分析物的浓度。稀释的程度可取决于多种因素，包括但不限于：用于测量分析物的测定类型、在测定中使用的试剂、在测试样品中所含的体液的类型。
在一个备选实施方案中，为了调整在测试样品中样品分析物的预期浓度以落入测定的动态范围内，测试样品可以被浓缩，以在分析之前增加样品分析物的浓度。
在一个示例性实施方案中，如果测试样品是人血清，并且多重分析的测定是采用特异性识别的单克隆抗体对或有对检测感兴趣的生物标记独特的特定电荷的纳米颗粒的基于抗体的捕获-夹心测定，那么在分析前，通过添加大约5倍于原始测试样品体积的稀释剂体积来稀释测试样品。在另一个示例性实施方案中，如果测试样品是人的血浆，并且多重分析的测定是基于抗体的捕获-夹心测定，那么在分析前，通过添加大约2000倍于原始测试样品体积的稀释剂体积来稀释测试样品。
稀释剂可以是不干扰用于测量测试样品中的分析物浓度的测定功能的任何流体。合适的稀释剂的非限制性实例包括：去离子水、蒸馏水、盐溶液、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、TRIS缓冲盐溶液、标准的柠檬酸盐水和HEPES缓冲盐水。
在一个备选实施方案中，在某些方法中生物样品可浓缩至允许检测生物标记。
f.预测心力衰竭
本发明的方法可使用便携式的一次性测试装置预测受试者的心力衰竭。例如，受试者可抱怨不适，描述的症状与如上文章节(a)中所描述的心力衰竭症状类似。然而，在不适时对受试者进行的普通诊断测试可能没有证据显示心力衰竭。尽管如此，在诊断测试进行之后的约两个星期内，受试者后来发生心力衰竭。在这种情况下，本发明的方法可以用来预测心力衰竭，尽管缺乏基于普通诊断测试的心力衰竭的证据。
如本文所用的“普通诊断测试”可以是本领域中已知的任何用于诊断心力衰竭的临床试验。通常用于诊断心力衰竭的临床试验可以包括心电描记术、超声心动描记术、胸部X射线、心脏负荷测试、超声心动描记术、闪烁扫描术、心脏指数、临床试验的生物标记、心脏导管、血管内超声、计算机断层扫描或它们的组合。
在一些实施方案中，普通诊断测试是胸部X射线。进行胸部X-射线的方法在本领域是已知的，可采用X射线形式的电离辐射，产生胸部的图像。
在其它实施方案中，普通诊断测试是心脏负荷测试。进行心脏负荷测试的方法在本领域是已知的。简言之，心脏负荷测试或心脏的诊断测试测量心脏在受控的临床环境下对外部应激响应的能力。可通过上跑步机、蹬固定的锻炼自行车测力计或静脉内药物刺激引起应激反应。然后，心脏对应激的响应可以使用心动扫描测量。
在又其它实施方案中，普通诊断测试是心脏指数。心脏指数是和心脏向身体表面积的输出相关的、使心脏性能与个体大小关联的血管动态参数。心脏指数可通过直接关联心脏泵送的血液量与个体身体表面积而用作心脏如何良好地作为泵运行的标记。
在其它实施方案中，普通诊断测试是确定临床上已知的生物标记(例如肌钙蛋白)的水平。
在一些优选的实施方案中，普通诊断测试是心动扫描。可用于诊断心力衰竭的心动扫描的非限制性实例可包括：超声心动描记术，心电描记术和闪烁扫描术。超声心动描记术是心脏声波图，也被称为心脏超声。超声心动描记术使用标准的超声技术对心脏成像。在一些优选的实施方案中，心动扫描可以是闪烁扫描术。进行闪烁扫描术的方法在本领域是已知的，可使用放射性示踪剂，接着成像受试者的放射性示踪剂的分布。在其它优选的实施方案中，心动扫描是超声心动描记术。进行超声心动描记术的方法在本领域是已知的，是心脏声波图，也被称为心脏超声。超声心动描记术使用标准的超声技术对心脏成像。
在一个优选的实施方案中，普通诊断测试是心电描记术。进行心电描记术的方法在本领域是已知的。心电描记术是通过贴在皮肤外表面上的电极检测并由体外的装置记录的在一段时间内心脏的电活动的经胸解释。这种非侵入性程序所进行的记录被称为心电图(ECG或EKG)。ECG可被用于测量心跳率和心跳规律，以及心室的尺寸和位置，展现心脏的任何损害，和用于调节心脏的药物或装置(如起搏器)的影响。
在一个示例性实施方案中，普通诊断测试是心电描记术，并确定肌钙蛋白水平。
当和正常比较，选自CCL3、CCL18、CCL5、hs、肌钙蛋白、PaPPA和NTproB(例如)的生物标记水平升高时，本发明的方法可预测受试者即将发生的心力衰竭。选择的标记的范围在生物样品中可为正常的1.5～10倍，与健康对照个体中的参考水平显著不同，普通诊断测试结果为阴性。在一些实施方案中，阴性的普通诊断结果为阴性的心电图结果。在其它实施方案中，阴性的普通诊断结果为当和健康对照个体生物样品中的肌钙蛋白水平进行比较时肌钙蛋白水平没有显著不同。在优选的实施方案中，阴性的普通诊断结果为当和健康对照个体生物样品中的肌钙蛋白水平进行比较时生物样品的肌钙蛋白水平没有显著不同而且心电图结果也是阴性的心电图结果。
在优选的实施方案中，当受试者生物样品中选自CCL3、CCL18、CCL5和NTproB的生物标记的水平与健康对照个体的生物样品中所述生物标记的参考水平明显不同，生物样品中肌钙蛋白的水平与健康的对照个体的生物样品中所述生物标记的参考水平没有显著不同，并且普通诊断测试结果为阴性时，本发明的方法可以预测即将发生的严重心力衰竭。此外，未来不良事件的风险随着生物标记在上三分位的数目增加而增加；与CCL3、CCL5和CCL18浓度在最高三分位的患者未来不良事件的风险是没有在最高三分位的单一生物标记的患者的四倍高。
在一个示例性实施方案中，当受试者生物样品中选自CCL3、CCL18、CCL5和NTproB的生物标记的水平与健康对照个体的生物样品中所述生物标记的参考水平明显不同，生物样品中肌钙蛋白的水平与健康的对照个体的生物样品中所述生物标记的参考水平没有显著不同，并且心电图结果为阴性时，本发明的方法可以预测即将发生的心力衰竭。
IV.系统
在各个方面，提供检测在患者体液样品中的分析物并确定患者状况的系统。图23是一个框图，给出了在一个实施方案中系统200的元件。在本实施方案中，系统200可以包括如上文所述的装置100和用以控制所述装置操作、用以分析使用所述装置获得的数据以确定一个或多个分析物的浓度和进一步分析分析物的浓度以确定患者的状况的相关元件。
系统200可以包括装置100、用以通信输入到系统200的其它元件和/或来自系统200的其它元件的输出的显示器202、用以执行系统200所包含的软件的一个或多个处理器204、用分析物检测应用208软件编码的计算机可读介质206和包含用于执行在分析物检测应用208内编码的指令的储存信息的存储器210。
分析物检测的应用208包括可在一个或多个处理器204上执行的一个或多个模块，该模块包含用于执行系统200的各种功能的指令。一个或多个模块包括：用以控制装置的操作和协调分析物检测应用208的其它模块的指令的执行的控制模块212。例如，控制模块212可以控制与装置100的一个或多个传感器相关联的电路、在装置100内所包含的任何微流体控制、和/或与装置100的一个或多个光源相关联的电路。
另一个实施方案中，系统的模块可以包括平衡检测模块214，以控制装置100的一个或多个传感器和/或光源，从而执行本文前面描述的平衡检测方法。图24是流程图，展示了在一个实施方案中平衡检测模块214的操作。平衡检测模块214可在步骤302从装置100的参照传感器中获取初始传感器读数，和在步骤304从装置100的检测传感器中获取初始传感器读数。平衡检测模块214然后可以在步骤306把检测传感器的输出和参照传感器的输出相减，以计算出差分输出信号。如果在步骤308确定差分信号不等于零，平衡检测模块214可在步骤310调节一个或多个光源所产生的光强，和/或调节传感器的相关电路，比如可变电阻器设置。然后重复步骤302-308，直到在步骤308差分输出信号等于零。一旦在步骤308实现差分输出信号为零，那么就可以在步骤312无需进一步调整的情况下监测差分输出信号，以确定引入到装置100的样品中任何分析物的浓度。
该系统的模块可以进一步包括分析物检测模块216，以处理接收自平衡检测模块214的组合输出信号，以确定与引入到装置100中的样品内所包含的一个或多个分析物的存在和/或浓度。图25是流程图，显示了在一个实施方案中分析物检测模块216的操作。分析物检测模块216可在步骤402自平衡检测模块214获得一个或多个分析物各自的差分输出信号。如果在步骤404确定差分输出信号等于零，那么在步骤406分析物的浓度设定为等于零，另一个分析物的差分输出信号在步骤402接收。如果在步骤404确定差分输出信号不等于零，在步骤406从存储在系统存储器210中的校准数据库226得到分析物的校准数据(参见图23)。再参见图25，分析物的分析物浓度可以在步骤408使用本文之前所述的校准数据确定。
系统200的模块可以进一步包括后处理模块218，以进一步分析由分析物检测模块216计算出的分析物浓度，和计算组合量，比如分析物浓度的比率、总和、或分析物浓度的任何其它算术组合(不限于此)。此外，后处理模块218可以进一步研究分析物的浓度，并使用存储器210中存储的诊断数据库224内定义的分类定义把这些浓度分类为低、高或者任何其它如上文所描述的分析物浓度分类(参见图23)；这些浓度分类之前在上文比如上文表C有所描述。
图26是阐述在一个实施方案中后处理模块218的操作的流程图。分析物浓度可以在步骤502中从分析物检测模块216接收。阈值或用于对分析物浓度分类的其他值或定义，可以在步骤504中从诊断数据库224获得。如果在步骤506中分析物的浓度低于最小可检测浓度，在步骤508中可定义分析物的浓度为零或“负”。如果分析物浓度不大于步骤510中的低浓度阈值，但是大于步骤506中的最小可检测阈值，则分析物浓度可以在步骤512被分类为“亚低”或“阴性”。如果分析物的浓度小于步骤514中的高浓度阈值，那么分析物的浓度可在步骤516中被定义为“低”。如果分析物的浓度高于步骤514中的高阈值，分析物的浓度可在步骤518中被定义为“高”或“阳性”。分析物浓度的所有分类可被用于在步骤520中构成诊断阵列。该诊断阵列可包括每个分析物、分析物的浓度、分析物的诊断分类、以及前文之前描述的分析物浓度的任何其它算术组合。
系统200的模块可以进一步包括诊断模块220以比较诊断阵列的条目，并根据存储在存储器210上的诊断数据库224内定义的一个或多个诊断规则确定患者的状况(参见图23)。这些诊断规则之前在上文比如上表C有所描述。
图27是阐明在一个实施方案中诊断模块220的操作的流程图。可在步骤602中从后处理模块接收诊断阵列。诊断规则可以在步骤604从诊断数据库224中获得。如果诊断阵列与在步骤506中与患者状况相关的诊断规则中提供的值或者定义不匹配，则该状况在步骤608拒绝。如果诊断阵列与在步骤506中与患者状况相关的诊断规则中提供的值或者定义确实匹配，则在步骤610中将该状况指定给患者。
系统200的模块可以进一步包括GUI模块222，以生成一个或多个待由显示器202显示的表单。这些表单可以用来接收来自用户的输入至系统200，或从系统200向用户通信输出。例如，可显示表单以以图或表格的形式通信由系统确定的分析物的浓度。在另一个例子中，可显示表单以通信由系统确定的患者的状况。
CRM 206可以包括易失性介质、非易失性介质、可移除介质、不可移除介质和/或可以由计算装置或处理器204访问的另一种可获得介质。举例而言而非限制地，计算机可读介质206包括计算机存储介质和通信介质。计算机存储介质包括在存储信息例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据的方法或技术中执行的非临时存储器、易失性介质、非易失性介质、可移除介质和/或不可移除介质。通信介质可以包括计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据，并包括信息传递介质或系统。
前面仅仅阐述了本发明的原理。鉴于本文的教导，各种对所描述实施方案的修改和变更对本领域技术人员会是显而易见的。因此，应理解的是，本领域技术人员能够设想许多系统、布置和方法，其虽然未在本文明确显示或描述，但体现本发明的原理，因此在本发明的精神和范围内。从上面的描述和附图，普通技术人员将理解的是，所展示和描述的具体实施方案仅仅用于阐述目的，并不意图限制本发明的范围。对具体实施方案的细节的参考不意图限制本发明的范围。
实施例1：鉴定在阿尔茨海默氏病(AD)中具有诊断和预后效用的生物标记
可在检测抱怨胸痛的患者群组中进行ECG和为心电描记术进行的血液测试、胸部X光、监测心律、血氧水平和心肌标记的血液测试，所述心肌标记例如肌钙蛋白I或T、D-二聚体、缺血修饰白蛋白(IMA)、髓过氧化物酶(MPO)、C反应蛋白、糖原磷酸化酶同工酶BB-(GPBB)、肌红蛋白、CK-MB和BNP。可以每天进行同样的测试，如果且当其发生时可记录并治疗心力衰竭。对抱怨胸痛的患者的子集进行的临床测试可能不产生任何阳性结果，这表明这些测试不能诊断心力衰竭。出人意料的是，患者的该子集可发展心力衰竭。此外，患者的该子集也可具有可显著不同于健康对照CCL3、CCL18、CCL5的水平的CCL3、CCL18、CCL5水平。
实施例2 CCL5(RANTES)和CCL18(PARC)是难治性不稳定心绞痛的特异性标记，在严重缺血症状期间短暂升高。
方法
研究人群。所有的趋化因子和炎症参数都在患者群组的血浆样品中测定，该患者群组从良好限定的APRAIS(急性期反应和缺血综合征)研究得到。简单地说，将54例患者(其在1995年3月到9期间以不稳定心绞痛Braunwald IIIB类别到莱顿大学医学中心的急诊科就诊)包括在内并随访了多达18个月。将静脉血样在就诊时(t＝0天)、就诊后的2天(t＝2天)和180天(t＝180天)取得，离心并将血浆的等分试样贮存在-80℃直到进一步分析。所有患者均都接受标准药物治疗，即口服阿司匹林300mg、静脉内硝基甘油和基于对活化部分促凝血酶原激酶时间的滴定的肝素输注。APRAIS研究的临床终点是在住院期间发生难治性不稳定心绞痛。如果即使经过药物治疗在休息的时候心绞痛保持或再发生，促使侵入性冠状动脉评估以及后续的血运重建治疗，则不稳定心绞痛被认为是难治性的。虽然研究群组相对小，但是它构成有相似起点的具有明确定义的充分记录的群体。所有受试者签署知情同意书，研究方案经莱顿大学医学中心的伦理委员会同意。
细胞分离。来自患者(t＝0天和t＝180天)以及来自6名健康的年龄匹配的志愿者的PBMC，通过在Histopaque(Sigma，圣路易斯，密苏里州)的密度离心从静脉EDTA血液样品中被分离出来。从分界面收集PBMC并用培养基(由包含glutamax(Gibco，Paisly，英国)并补充有10％ FCS的Iscove改良的Dulbecco培养基组成)洗涤两次。PBMC被冷冻保存在培养基(含有20％ FCS和10％二甲亚砜)中，直到进一步使用。
多重趋化因子测定。趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL11、CCL17、CCL18、CCL22、CXCL8、CXCL9、CXCL10和趋化因子样因子MIF、细胞因子OSM、IFN-γ和OPG以及粘附分子sRankl、sVCAM和sICAM的循环水平用利用Bio-Plex Suspension Array系统(Bio-Radlaboratories，赫拉克勒斯，加州)的定制多重生物测定在t＝0样品中确定。将血浆样品进行过滤，随后用10％正常大鼠和小鼠血清(Rockland，，Gilvertsville，宾夕法尼亚州)稀释，以阻断残余的非特异性抗体结合。在总体积为60μl中，将以每个趋化因子(10μl/孔)1000个微球连同标准和空白样品加入，悬浮液在96孔过滤板上室温(RT)下孵育1小时。然后，加入10μl生物素化的抗体混合物(16.5μg/ml)并于室温孵育1小时。用PBS-1％ BSA-0.5％ Tween 20洗涤后，珠粒用50ng/孔的链霉亲和素R-藻红蛋白(BD Biosciences，圣迭戈，加利福尼亚州)孵育10分钟。最后，珠粒用PBS-1％ BSA-0.5％ Tween 20再次洗涤，在最终体积为100μl的高性能ELISA缓冲液(Sanquin，阿姆斯特丹，荷兰)中测定荧光强度。使用Bio-Plex Suspension Array系统和Bio-Plex管理软件3.0版本(Bio-Rad laboratories，Hercules，加利福尼亚州)进行测量和数据分析。(亦参见ref.NO：14)
ELISA和其他测定。对于在随访中人CCL5和CCL18血浆水平的时间分析，依据制造商方案，分别用CCL5即时ELISA试剂盒(Roche，维也纳，奥地利)和CCL18 ELISA(RayBiotech，诺克罗斯，佐治亚州)测定在t＝0、t＝2和t＝180的样品。基线炎症参数如C反应蛋白、纤维蛋白原、红细胞沉降率(ESR)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1如之前详细描述地确定13。可溶性CD40配体(sCD40L)和白介素-6(IL-6)通过高度灵感的免疫测定法(Quantakine HS，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)来测定，t＝180CRP样品通过在全自动的Modular P800装置(Roche，Almere，荷兰)的浊度测定法测定。
评估异嗜性CCL5和CCL18相互作用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用来评估重组CCL5(7.8kDa)和合成的CCL18(7.8kDa)是否参与异嗜相互作用。蛋白质(rCCL5，sCC118，以1∶1和1∶5的重量比(重量∶重量)的rCCL5/sCCL18；2μg总蛋白质/泳道)在室温条件下在50mM HEPES/0.1mM EDTA缓冲液(pH值＝7.4)中孵育一小时，之后加入25mM的多聚甲醛，交联任何形成的均二聚体或异二聚体。30分钟后，蛋白质混合物在上样缓冲液中变性，进行SDS-PAGE(18％；2μg蛋白/泳道，70毫伏进行一小时，和150毫伏进行30分钟)，蛋白质用银染色可视化。亦使用Voyager-DE Pro MALDI-TOF质谱仪(PerSeptiveBiosystems，Framingham，马萨诸塞州)分析蛋白质混合物。
RT-PCR分析。为了评估CCL5、CCL18、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CX3CR1和人嗜中性粒细胞肽-3(HNP-3)在PBMC中的表达，分离和分析了mRNA。用硫氰酸胍-苯酚从PMBC中提取总RNA，样品进行DNA酶I处理(Promega，麦迪逊，威斯康星州)，之后根据制造商方案2，采用RevertAid M-MuLV逆转录酶(Fermentas，伯灵顿，加拿大)生成cDNA。使用SYBR-Green法(Eurogentec，列日，比利时)在ABI PRISM 7700机器(Applied Biosystems，福斯特市，加利福尼亚州)上用CCL5、CCL18、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CX3CR1、CD11b和人嗜中性粒细胞肽-3(HNP-3)的引物进行半定量基因表达。亲环蛋白和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)用作持家基因。
通过从亲环蛋白(Cyclophiline)和HPRT的平均循环数(Ct)中减去目标基因的阈值Ct和使2自乘到这种差异的幂，来计算相对基因表达
流式细胞术。CD3+和CD14+PBMC的CCR3和CCR5表面表达通过流式细胞术进行评估。冷冻保存的PBMC被解冻，在RPMI 1640(含有20％ FCS)中洗涤三次，随后使用APC缀合的抗CD3和抗CD14的抗体(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)以及FITC缀合的抗CCR3和抗CCR5的抗体(R&D system)进行染色。非特异性同种型FITC缀合的大鼠IgG2a抗体和FITC缀合的小鼠IgG2b抗体(eBiosciences，圣地亚哥，加利福尼亚州)用作阴性对照。样品使用荧光激活流式细胞仪(FACSCalibur)进行分析，并随后使用CellQuest软件(BD Biosciences)进行分析，每个样品计数50，000个细胞。
PBMC刺激测定。从6名健康志愿者获得的冷冻保存的PBMC样品如上所述解冻，接种在U形圆底96孔板(Greiner Bio-one)上，并在37℃用空白培养基(对照)或补充有50ng/ml重组CCL5(Peprotech，洛矶山，新泽西州)、50ng/ml合成CCL18肽SM-1(sCCL18)或rCCL5和sCCL18(25ng/ml/肽)的组合的培养基刺激6小时3。孵育后，总RNA从细胞中分离，制备cDNA和测定趋化因子受体的表达。
统计分析。我们的研究人群和原来的群组之间的差异由Fisher精确检验和斯氏非配对t检验进行检查。检验趋化因子和炎症标记的血浆水平的正态高斯分布，并且在适当时在偏态分布的情况下对值进行对数转换。关于后者，给出的是几何而不是算术平均值。合适时通过非配对双尾斯氏t检验或Mann-Whitney U-检验对均值进行比较。为了评估发生难治性症状的CCL5和CCL18的预测值，独立于潜在的混杂因素，进行了多变量分析，校正年龄、HDL和ESR水平以及其它确立的心血管风险因子(如高血压、高胆固醇血症、使用降血脂和降血压药、糖尿病、吸烟行为、BMI和心血管疾病史)以及生物标记sCD40L和CRP。评估了四分位分布并将其用于使用Spearman氏相关系数和Pearson卡方检验来确定趋化因子血浆水平以及sCD40L和CRP的水平与发生难治性UAP的关联。生成受者工作特征曲线，来评估难治性缺血症状的趋化因子预测值。使用Spearman等级相关检验进行了多重(multiplex)值和ELISA值之间的相关性分析以及趋化因子和炎症参数之间的相关性分析。FACS结果通过配对t检验进行了分析，刺激测定通过ANOVA进行了分析。双侧P值＜0.05被认为显著。所有分析均采用SPSS 14.0版软件(SPSS，芝加哥，伊利诺伊州)进行。
结果
研究人群。趋化因子(在表1中列出)的血浆分析是使用54位连续患者(排除选择偏倚)的的先前解冻血浆样品的亚群组进行的。这种亚群组由31例具有稳定缺血症状的患者和23例具有难治性缺血症状的患者组成，匹配关于心血管危险因子、心肌梗死或PTCA/CABG史以及实验室参数的原有群组(表2A和B)。
表1.
表2A
表2B
由于并非所有54例患者在180天后都响应献血，所以对47例患者(稳定型29例和难治型18例)进行了此时间点的ELISA分析，但是这个亚群组的基线特征和原来的群组匹配(数据未显示)。趋化因子群组的基线人口统计学比较显示，难治性患者和稳定患者之间没有显著差异，除了在性别组成上小的但显著的差异(87％对比67％的男性；P＝0.05)；所有患者的平均年龄为65岁(41～85岁)。关于基线的临床和血脂参数，在稳定型和难治型患者的总胆固醇水平没有差异(5.92对比6.16mmol/l；P＝0.56)，而后者的人群中HDL水平较低(1.23对比0.99mmol/l；P＝0.02)。这一组也显示出朝着向更严重的炎症状态的趋势增加，如ESR升高的水平(14.15对比20.7mm/hr；P＝0.03)所表明的，虽然纤维蛋白原和CRP水平基本上类似。在两组之间，未观察到基线sCD40L水平的差异。
多重分析：CCL5和CCL18的上调。由多重分析确定的所有趋化因子和细胞因子的数据(t＝0样品)在进一步统计分析之前进行对数转换，这是因为除了OPG以外它们具有偏态分布特征。大多数趋化因子和细胞因子的血浆水平在稳定型和难治型患者之间没有差异。然而，CCL5水平(23.1ng/ml对比32.7ng/ml，P＝0.018)和CCL18水平(53.7ng/ml对比104.4ng/ml，P＝0.011)似乎在难治型患者中明显增加，同时CCL3水平存在边缘(boardline)显著增加(53.6pg/ml对比73.7pg/ml；P＝0.09)(表3和图1A)。
表3
数值是几何平均值
*代表算术平均值
此外，在针对心血管危险因素以及sCD40L和CRP水平调整的多变量分析后，观察到CCL5水平的差异仍然显著(P＝0.023)，而CCL18水平边缘显著(P＝0.06)。然而，在除HDL外的全部混杂因素的多变量分析之后，CCL18水平的差异达到显著(P＝0.021)。因此，即使针对sCD40L和CRP水平调整时，CCL5和CCL18似乎也是难治性缺血症状的发生的独立的预测因子。此外，CCL5和CCL18水平没有表现出互相关(R＝0.05，P＝0.7)，这反映了这些趋化因子以独立方式进行调节或者运作。虽然仍然没有观察到CCL5和CCL18之间显著的异嗜相互作用，但是可以想象的是，共享CCR3作为共同目标受体的这两种趋化因子可在功能上相互作用(图6和图7)。在稳定型患者中，CXCL10有上升的趋势，尽管不太显著(221.6对比157.5pg/ml，P＝0.12)，这可指向这种特定的趋化因子的保护作用。IFN-γ水平仅仅是检测不到，因此没有显示。
接着，试图评估CCL5和CCL18水平是否具有诊断潜力。给定的群组大小的情况下，CCL5和CCL18水平被分类为四分位，并针对与未来难治性缺血症状的发生的相关性进行分析(表4A)。
表4A
所有数值的单位为ng/ml
在CCL5的上四分位数中，也见到难治性缺血症状的风险提高(R＝0.32，P＝0.017；线性相关卡方5.53；P＝0.019)，而CCL18的这种趋势甚至更为明显(R＝0.392，P＝0.003；线性相关卡方8.105，P＝0.004)(图2A)。如受者工作特征曲线所指出的，升高的CCL18水平稍微比CCL5更有预测性(曲线下面积0.71对比0.69)。CCL5＞40ng/ml的截止值和CCL18＞130ng/ml的截止值分别产生了73.9％和65.2％的灵敏度，以及67.7％和61.3％的特异性。针对难治性缺血症状的发生的的CCL5和CCL18上两个四分位数的组合分析显示非常显著的相关性(经过连续校正的X28.12；P＜0.01)。当灵敏度达到47.8％时，组合分析的特异性为显著高的90.3％。CCL5和CCL18水平值的组合分析的阳性预测值为78.5％，伴随着70.0％的阴性预测值。在分析中加入sCD40L或CRP水平并不能导致灵敏度、特异性或预测值的任何进一步增加(数据未显示)。
CCL5和CCL18的ELISA验征和随访分析。平均和单个的ELISA和多重CCL5水平极好地对应(P＜0.001)。此外，使用ELISA进行评估时，在第0天相比于稳定型的患者，也发现难治型患者的CCL5血浆水平增加(36.4ng/ml对比26.5ng/ml)。有趣的是，两天后，在整个群组中已观察到CCL5血浆水平显著降低(12.1ng/ml对比30.3ng/ml，P＜0.001)，在t＝180时也观察到CCL5水平减少了，这表示CCL5在不稳定心绞痛发作时瞬时升高(图1B)。征入后的第2天和第180天稳定型和难治型组之间没有观察到差异。缺血症状后，CCL18的血浆水平呈不同的时间模式。ELISA分析证实难治型和稳定型患者之间在第0天CCL18的差异表达(56.2ng/ml对比41.1ng/ml，P＝0.02)。虽然ELISA中的绝对值比多重测定略低，但是统计分析揭示了这两种测定之间有极好的相关性(Spearman检验，P＜0.001)。有趣的是，在第2天的全部群组的CCL18水平与基线水平(第0天)没有不同，这表明CCL18和CCL5水平可通过不同的机制进行调节。在第180天，和第2天的值相比，CCL18水平显著下调(48.4ng/ml对比34.5ng/ml，P＜0.001)，这表明CCL18在心肌缺血-再灌注相关的过程中的作用(图1C)。
可溶性CD40配体和CRP。相对t＝180，sCD40L和CRP两者的水平在t＝0显著升高(sCD40L：2.04ng/ml对比0.69ng/ml，P＜0.001，CRP：2.36ng/ml对比0.96ng/ml；P＜0.001)(图1D，E)。然而，在t＝2，sCD40L水平已经开始下降(1.35ng/ml，P＜0.05)，表明升高的基线水平反映了血小板活化相关的急性期反应。由于可溶性CD40L在t＝0和t＝2时的水平与CCL5在t＝0和t＝2时的水平显著相关(t＝0时，R＝0.40，P＜0.01；t＝2时，R＝0.35，P＝0.01)，所以升高的CCL5水平也可能是由血小板活化引起的。然而，在t＝0，sCD40L显示和CCL18水平显著负相关(R＝-0.36，P＝0.01)，这表明后者表示对血小板活化的反馈应答。在t＝2，CRP的水平甚至进一步增加(6.43mg/l，P＜0.001)，这和以前的报告一样，并假定指示在缺血和/或冠状动脉介入后两天这些患者中缺血后全身炎症状态增强。CRP水平显示和CCL5或CCL18水平没有相关性。sCD40L和CRP四分位水平不具有预测难治性缺血症状的任何潜力(R＝0.043和R＝-0.034；N.S.)(图2A：对于四分位数分布，参见表4B)。
表4B
所有数值的单位为ng/l
炎症和临床随访。除了CXCL10和IL-6水平之间有弱相关性以外(R＝0.29，P＝0.02，其他数据未显示)，全部趋化因子与全身炎症参数纤维蛋白原、IL-6、PAI-1和ESR的相关性分析显示没有关联。重要的是，见到由多重分析确定的CCL5的基线上四分位水平和在未来18个月内对血运重建术的需要相关(R＝0.35，P＝0.01)。此外，CCL18的基线上四分位水平与在住院期间重新发生不稳定心绞痛(UAP)相关联(R＝0.36，P＝0.007)以及与在18个月随访期间内发生急性冠脉综合征(ACS)相关联(R＝0.31，P＝0.02)(图2B-D)。sCD40L和CRP的基线水平和任何的随访参数都不相关(数据未显示)。
PMBC趋化因子和趋化因子受体表达分析。虽然CCL5与CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的相互作用已经被清晰描述，但是CCL18的实际受体迄今是未知的，这使得CCL18目前是孤儿配体17。但是，已经报道CCL18是CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子)结合CCR318的竞争性抑制剂。因此，趋化因子受体CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的mRNA表达以及PBMC中的CCL5和CCL18的mRNA表达被检测。与在t＝180的PBMC相比，观察到在基线(t＝0)全部四个涉及的趋化因子受体高度显著下调(图24B)。对CCL5和CCL18观察到类似的时间模式，在PBMC中，CCL5有大量表达，CCL18只有轻微水平(图24A)。出乎意料地，随后的用于检测CD3+T细胞和CD14+单核细胞上的CCR3和CCR5表达的FACS分析，揭示与T＝180相比，在t＝0，CD3+和CD14+中的CCR3和CCR5的蛋白表达显著升高(图4A-D)。对CD3或CD14于CCR3和CCR5的三重染色显示，在CD3+群体中，趋化因子受体表达增加(三重阳性细胞：3.1％在t＝0对比2.3％在t＝180；p＝0.007)，CD14+细胞中甚至更为突出(在t＝0和t＝180时，分别为32.1％和5.1％，P＜0.001)。在全部PBMC群体中，发现CCR3+和CCR5+细胞百分比以及组合的CCR3+/CCR5+细胞百分比的相同模式(图4G-I)。
为了评估在基线处降低的基因表达模式是否由白细胞分布特征的瞬时转变造成，对PBMC中CD14+(单核细胞)和CD3+细胞(T淋巴细胞)的总百分比进行了监测。单核细胞计数在两个时间点没有不同，然而，CD3+细胞在t＝0稍微降低(54.2对比66.6％，P＝0.01)(图8A)。进一步的研究揭示PBMC中CCR2∶CX3CR1的表达比率(单核细胞亚类分布的量度)也没有差异。然而，我们确实观察到在t＝0时HNP-3(选择性嗜中性粒细胞标记)表达水平显著升高，这表明在UAP期间嗜中性粒细胞释放增加(图8B)。可以想象，观察到的在t＝0时趋化因子受体表达的变化可至少部分归因于嗜中性粒细胞计数的增加。和趋化因子的血浆水平相反，没有观察到在t＝0稳定型和难治型患者之间的趋化因子受体的表达水平的差异(数据未显示)。
PBMC刺激测定。然而，在某种程度上趋化因子受体下调可反映出UAP后对免疫调节剂爆发的反馈响应。为了验证PMBC中CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的观察到的表达调节是否与在缺血事件中升高的CCL5和CCL18水平有关，用rCCL5和/或sCCL18刺激PMBC。刺激6小时后，未观察到对CCR1、CCR4和CCR5的mRNA表达的不同影响。然而，形成鲜明对比的是，sCCL18引起CCR3表达的急剧下调，并且这个影响通过和rCCL5共同孵育被进一步放大(P＜0.01，图5A-D)。因此，在体内观察到的PBMC中CCR3mRNA的下调可能是由CCL18水平升高引起的。CCR1、CCR4和CCR5在体内的下调可能受CCL5和CCL18以外的配体很好地调节。
讨论
在所有测试的趋化因子中，只见到CCL5和CCL18水平独立于其他炎症标记和sCD40L在难治型患者相比于稳定型患者中在基线短暂地升高，UAP症状发作后6个月内下降。这些现象伴随着在第0天与第180天，PBMC中的同源趋化因子受体CCR3和CCR5的mRNA表达的急剧减少(大概是CCL18诱导的)。伴随地发现在基线CCR3和CCR5表面表达增加，这可能反映了在缺血症状中PBMC的快速受体暴露。CCL5和CCL18都显示关于临床结果的预测特征。
多重小组包含各种趋化因子，其先前已与动脉粥样硬化或心血管疾病关联，比如CCL2、CCL5、CCL11、CXCL8和CXCL105。CCL5和CCL18是仅有的两个在基线处在难治性和稳定患者之间差异调节的趋化因子。难治型患者有严重的持续性缺血抱怨，尽管抗心绞痛药物治疗保证有或无经皮冠状动脉介入的冠状动脉造影术。因此，虽然已牵涉于CVD的其它趋化因子的水平是相对不变的，并且难治性患者与稳定型患者在普通全身性炎症的程度上通常没有不同，但是CCL5和CCL18可能是UAP患者的缺血严重症的唯一趋化因子标记
选取CCL5和CCL18用于进一步的180天随访的时间分析。如前所述，CCL5作为炎症介质在心血管疾病的作用得到广泛认可，见到CCL5水平在急性冠脉综合征患者中确实升高。然而，这些研究检查住院时的CCL5水平，并且除了一个以外并没有包括前瞻性研究设计。只有Nomura等人展示了在PCI之后UAP患者30天的CCL5水平降低至与我们研究的180天水平可比较的水平。在本实施例中的数据拓展了该观察结果，因为这些数据表明CCL5水平的降低不是PCI造成的，而是稳定型UAP患者固有的特征。虽然仍然缺乏CCL5参照水平的数据，但是在征募第2天和第180天的CCL5与Parissis等人在健康对照中报道的值非常可比拟，这表明缺血症状发病后的2天内，CCL5水平已回到基线。
为了获得进一步关于活化血小板对CCL5峰值水平的贡献的见识，进行了sCD40L22的时间评估。在基线观察到sCD40L水平显著升高，这符合之前的研究和反映了UAP中增强的血小板活化状态。然而，观察到的UAP后在t＝2和t＝180sCD40L水平的进行性下降从未被记录在UAP患者中，可能说明UAP后sCD40L稳态的迅速恢复。另外，t＝0和t＝2的水平与CCL5水平相关，这表明活化的血小板可直接或间接地是CCL5的主要来源。除了其有激活的血小板引起的大量分泌，UAP期间升高的CCL5水平也可由激活的T淋巴细胞引起以及作为阻塞远端的缺血组织的经改变的稳态的结果。因为Rothenbacher等人观察到与对照相比在稳定型冠状动脉心脏疾病患者中CCL5水平减少，所以急性炎症本身不可能是UAP27过程中CCL5的短暂升高的原因。这由在本实施例的研究结果强调，因为观察到与缺血发作后180天相比，在PBMC中CCL5mRNA的表达在基线处下调。难治型患者的响应增加是否反映更广泛的血小板(或T细胞)激活或者更高的血小板和T细胞容量以阐述CCL5仍有待确定。
有趣的是，在患者群组中，CCL18尚未与心血管疾病相关联。在血液中，CCL18以高水平存在，CCL18由抗原呈递细胞和嗜酸性粒细胞产生。它被认为在初级免疫应答中充当T细胞、B淋巴细胞和单核细胞的引诱剂17。然而，如前面提到的，虽然报道CCL18用作中性的CCR3拮抗剂，但是CCL18的受体尚未确定。CCL18在心血管疾病中的直接作用的证据不是决定性的，并且限于两个记录CCL18在动脉粥样硬化斑块和具体而言在稳定性减少的位点的表达的描述性研究。在本实施例中已表明，CCL18血浆水平在UAP患者中增加，在有难治性症状的患者中增加甚至更多。CCL18升高是持续而短暂的，但是CCL18水平在180天后会降低。UAP后CCL18持续增加的实际来源较不清楚。在基线PBMC中的CCL18的表达下调，使这些细胞的大量产生失去血浆CCL18的主要来源的资格。可以想象地，血浆水平可以反映出含有CCL18的易损斑块的释放。CCL18水平与sCD40L水平呈负相关，这可能表明在血小板活化时的负反馈响应。进一步的研究将必须澄清CCL18在急性冠脉综合征的作用。
已经提出几种趋化因子可以在非梗死缺血性心肌病的发病机制中起作用，因为缺血组织中盛行的活性氧生成和缺氧会诱导趋化因子应答。说明性地，发现MCP-1在小鼠缺血后的至少7天在心肌膜中上调，并与在心肌梗死不存在下的间质纤维化和左心室功能障碍相关。CCL18水平持续在高水平至少两天，并鉴于其激活成纤维细胞和增加胶原生成的能力，试图提出CCL18在伤口愈合中的类似作用。CCL18不仅可以调节白细胞亚类的吸引，而且还可在骨髓造血干细胞功能中起到易化作用。因此，升高的CCL18水平可促成炎症反应，而且还在心肌修复过程的预期中促成祖细胞动员向心肌缺血区域。
为了进一步强调CCL5和CCL18在心肌缺血的病理生理学中的作用，观察了通过CD3+T细胞和CD14+单核细胞在CCR3和CCR5的表面暴露方面的显著增加，和在基线CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的矛盾的mRNA下调。这是一个有趣的和反直觉的观察结果，虽然这不是第一次在UAP患者的PBMC中观察到蛋白质和mRNA趋化因子受体表达之间的矛盾。事实上，在以前报道过CXCR4的类似但是相反的作用，即与健康对照受试者相比在UAP中在蛋白质上下调，但是在mRNA水平上上调，然而其配体CXCL12水平在UAP患者中与对照相比降低。表面蛋白暴露的快速增加可能起因于响应于同源配体或者不稳定心绞痛释放的其他作用物的血浆水平增加，细胞内受体的急性动员。在PBMC中趋化因子受体的相对mRNA下调可部分反映了在UAP中改变的白细胞特征，其具有如从在t＝0PBMC mRNA的HNP-3表达增强所判定的HNP-3+嗜中性粒细胞的快速动员，和CD3+细胞的轻微减少，然而总CD14+水平保持不受影响。然而，其也可部分归因于负反馈反应以正常化暴露的受体水平，如我们的体内CCL18调节研究所显示的(图5)。转录反馈可以直接响应于表面受体对CCL18的暴露实现，因为CCR3mRNA水平在暴露于sCCL18后明显下降，从而识别CCL18在心肌缺血中新的调节作用。
CCL5和CCL18四分位分布的实验说明与难治性症状的发生的明确关系。此外，上四分位水平也与未来心血管事件和血运重建术相关，而已经在其他研究中被证明具有强的预后能力的sCD40L和CRP在此群组大小中并没有显示相关。考虑到活化的血小板和缺血组织是CCL5和CCL18的主要细胞来源，在难治的UAP中的水平提高可反映这些患者中更为明显的血栓形成和缺血相关的诱导。其在难治性疾病发展中是否是成因还有待澄清。关于CCL5和CCL18的预后能力，该趋化因子的上四分位水平的灵敏度和特异性不超过80％。结合两个趋化因子的上两个四分位得到90.3％的可行的特异性，这从前非常有效地排除了低CCL5和CCL18水平的难治性症状。然而，虽然CCL5和CCL18可以具有作为疾病的独立预期生物标记的潜力，但是这些趋化因子与症状的临床严重程度以及各种随访参数之间观察到的相关性尽管非常显著，但是目前并没有强大到足够独立。因此，血浆CCL5和CCL18水平测定结合其他临床诊断参数，可以增加评估UAP患者的预后特征。
应注意本研究的一些问题和限制。首先，设置主要排除了研究UAP之前这些趋化因子的对照水平。然而，认为由于预期分析都在相关同的患者中进行，因此对于CCL5和CCL18的时间特征的结论是合理的。因为所有的患者都在UAP之后的180天大部分都没有症状，可以安全地假定，后者值将接近CAD患者的UAP前的水平。第二，最近已表明，他汀类药物可影响趋化因子的血清水平，以及PBMC上的趋化因子受体表达。幸运的情况是，当他汀类药物治疗才刚开始显现时已进行群组采样，该群组只有8.2％的患者接受他汀类药物治疗。由于数据对这种轻微的他汀类药物使用进行了校正，因此相信本实施例中的结果没有被他汀类药物治疗偏置。最后，多重小组还包括之前已经和动脉粥样硬化或心肌缺血相关的趋化因子，包括CCL2、CCL3、CXCL8和CXCL1021、39、40。在这项研究中，难治型不稳定心绞痛的患者对这些趋化因子或其他已经测定的免疫调节剂没有显示显著差异。因此，这些细胞因子没有被选择用于进一步的时间分析，但是不能先验地排除这些细胞因子可能影响不稳定心绞痛和心肌缺血。
此外，在已形成颈圈诱发的颈动脉斑块的容易发生动脉粥样硬化的ApoE-/-小鼠的初步数据表明，3周腹膜内给予重组CCL18的方案加重病变进展达显著的50％(图9)，这表明CCL18可能不仅是心血管疾病的有希望标记，而且也是心血管疾病的治疗干预的有效候选者。
总而言之，CCL5以及尤其是CCL18被鉴为UAP中的相关趋化因子。它们是否在发病机制中起成因作用或通过其它机制更间接地参与其中，这些标记是否有任何进一步的诊断潜力和它们是否是适合的治疗靶标，需要在将来的研究中得到解决。
实施例3 CCL3(MIP-1α)水平在急性冠脉综合征期间升高，并且对将来的缺血性事件显示出强劲的预后能力。
方法
患者群组
MISSION。研究人群遵从MISSION！干预研究12。AMI患者组由基于EGG和临床化学参数(升高的肌钙蛋白和肌酸激酶水平)诊断为AMI的44例患者(54.5％男性，平均年龄61.8±11.6岁)组成。对照组代表22个无症状的年龄和性别匹配的不患有显现的冠状动脉疾病的受试者(54.5％男性，平均年龄61.7±12.8岁)(表5)。AMI患者的基线血样在住院后2小时内和AMI发作6小时内获取。患有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、慢性炎性疾病如类风湿性关节炎或接受免疫抑制剂或化疗的患者被排除在研究之外。本研究经当地伦理委员会批准，在招募前，所有患者和健康志愿者都签署知情同意书。研究符合Helsinki声明中概述的原则。
APRAIS。从良好限定的APRAIS(急性期反应和缺血综合征)研究得到的不稳定心绞痛患者的血浆样品，被用来确定循环CCL3水平13。简单地说，将54例患者(其在1995年3月到9期间以不稳定心绞痛Braunwald IIIB类别到莱顿大学医学中心的急诊科就诊)包括在内并随访了多达18个月。将静脉血样在就诊时(t＝O)、就诊后的2天(t＝2)和180天(t＝180)取得，离心并将血浆的等分试样贮存在-80℃直到进一步分析。所有患者均都接受标准药物治疗，即口服阿司匹林300mg、静脉内硝基甘油和基于对活化部分促凝血酶原激酶时间的滴定的肝素输注。所有受试者签署知情同意书，研究方案经莱顿大学医学中心的伦理委员会同意。
多重趋化因于测定。通过使用基于高度灵敏的荧光微球的读出确定如所述确定在MISSION！群组中的CCL2、CCL3、CCL5、CCL11、CCL17、CCL18、CCL22、CXCL8、CXCL9和CXCL10以及四个参照细胞因子的循环趋化因子水平，以及在APRAIS群组中的CCL3水平。简言之，将血浆样品进行过滤，随后用10％正常大鼠和小鼠血清(Rockland，，Gilvertsville，宾夕法尼亚州)稀释，以阻断残余的非特异性抗体结合。在总体积为60μl中，将以每个趋化因子(10μl/孔)1000个微球连同标准和空白样品加入，悬浮液在96孔过滤板上室温(RT)下孵育1小时。然后，加入10μl生物素化的抗体混合物(16.5μg/ml)并于室温孵育1小时。用PBS-1％BSA-0.5％ Tween 20洗涤后，珠粒用50ng/孔的链霉亲和素R-藻红蛋白(BD Biosciences，圣迭戈，加利福尼亚州)孵育10分钟。最后，珠粒用PBS-1％ BSA-0.5％ Tween 20再次洗涤，在最终体积为100μl的高性能ELISA缓冲液(Sanquin，阿姆斯特丹，荷兰)中测定荧光强度。使用Bio-Plex Suspension Array系统和Bio-Plex管理软件3.0版本(Bio-Radlaboratories，Hercules，加利福尼亚州)进行测量和数据分析。
鼠心肌梗死。麻醉小鼠并使用啮齿动物呼吸机(Harvard Apparatus，Holliston，马萨诸塞州)人工地用氧与N2O[1∶2(体积/体积)]的混合气进行人工呼吸，所述混合气中加入有2-2.5％异氟烷(Abbott Laboratories，霍夫多尔普，荷兰)用于麻醉。通过用无菌7/0丝线(Ethicon，Johnson&Johnson，Amersfoort，阿默斯福特，荷兰)永久缝合近端冠状动脉左前降支，诱发了心肌梗死。结扎后三小时处死小鼠，PBMC和脾脏被分离用于流式细胞术分析，并且采集血浆用于趋化因子检测。所有动物的程序通过莱顿大学动物伦理委员会批准。
ELISA和其他充当。人以及鼠CCL3水平(Biosource，Carlsbad，加利福尼亚州)、鼠CXCL10(R&D systems，Minneapolis，明尼苏达州)和鼠IL-6(eBioscience，圣迭戈，加利福尼亚州)如制造商方案所述用夹心ELISA测定来测定。在APRAIS群组中的基线炎症参数例如C反应蛋白、纤维蛋白原和红细胞沉降率(ESR)如之前描述测定13。可溶性CD40配体(sCD40L)通过高度灵敏的免疫测定法(Quantakine HS，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)测定。
流式细胞术。通过消融红细胞，将PBMC从全血中分离。通过挤压脾通过70μm的细胞过滤器(BD falcon，BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)分离脾细胞。收集后将全血细胞和脾细胞在冰上与红细胞裂解缓冲液孵育5分钟。将细胞离心5分钟，并再悬浮于裂解缓冲液中。通过在冰上孵育5分钟裂解残余的红细胞。细胞用PBS洗涤两次，并计数。随后，通过每个样品中加入0.25μg抗体，针对CD4、CCR3、CCR5(BD Biosciences)、CD8、F4/80(eBioscience)和CXCR3(US biological，Swampscott，麻州)表面标记染色细胞。在冰上孵育45分钟后，用PBS洗涤细胞，随后用流式细胞仪(FACScalibur，BD biosciences)进行分析。
统计方法。采用SPSS 13.0版本(SPSS，芝加哥，伊利诺伊州)进行统计分析。所有值都表示为平均值和平均值的标准差。对照和AMI组之间的危险因素分布差异由FishersExact概率检验分析。通过采用Kolmogorov-Smirnov统计分析，针对正态分布检验趋化因子数据。通过Mann-Whitney U检验分析非高斯分布的数据，而正态分布变量采用斯氏t检验进行分析。与炎症参数的相关性分析通过Spearma等级相关检验进行。用单变量线性回归检验进行风险因素的协变量调整。对CCL3的四分位分布进行评估，并用于卡方检验以把CCL3水平升高与未来的心血管事件相关联。P值＜0.05被认为显著。
结果
MISSION患者统计。作为一个试验性研究以2∶1的比例编制两个亚群组，其显示，AMI群体中的细胞因子水平的标准偏差评价为对照受试者的1.5倍高。AMI和对照亚群组在性别、年龄和与炎症状态(2型糖尿病，高血压和高脂血症)相关的风险因素上相匹配。AMI群组比对照群组包含更高比例的吸烟者和戒烟者(AMI的56.8％相对于对照的22.7％，P＝0.01；表5)。因此，所有的趋化因子值通过单变量分析针对吸烟进行调整。所有的蛋白质都充分地在所用测定的可检测范围内。
表5.
参照小组。作为多重测定的验证的对照，在分析中包括了一组参照细胞因子和细胞粘附标记。与之前的发现一致，在AMI患者中IL-2(对照中0.07±0.06pg/ml对比AMI中0.65±0.28；P＝0.003)、TNF-α(对照中1.05±0.32pg/ml对比AMI中2.4±0.72；P＝0.03)、sICAM-1(对照中476.1±80.7ng/ml对比AMI中713.0±49.9；P＝0.04)和IL-6(对照中9.8±4.1pg/ml对比AMI中23.7±8.0pg/ml；P＝0.04)的血浆水平显著升高(表6)。其他一般炎症标记如IL-1α、IFN-γ和sVCAM-1保持不变(数据未显示)，从而表明AMI的患者群组并不富集于具有一般超炎症状态的受试者。
表6
趋化因子。和对照患者相比，AMI中CC趋化因子CCL3血浆水平(对照中39.8pg/ml，21.3-50.3IQR，相比于AMI中47.8pg/ml，39.6-67.2IQR；P＝0.01：图13A)和CCL5血浆水平(对照中13.4ng/ml，6.4-29.2IQR，相比于AMI中33.3ng/ml，19.1-45.3；P＝0.001：图14B)显著上调(表7)。在针对心血管危险因素校正后校正后在AMI期间CCL3和CCL5仍然显著升高(分别为P＝0.025和P＝0.006)。CXC趋化因子中，只有CXCL8显著上调(对照中4.2±0.50pg/ml，相比于AMI中6.8±0.56；P＝0.01；图13C)，而与对照组相比，在AMI中CXCL10(对照中255.1±47.2pg/ml对比AMI中162.6±20.3pg/ml；P＝0.002：图13D)下调。在协变量调整后，CXCL8和CXCL10两者依然改变(分别P＝0.02和P＝0.04)。在AMI期间所有其它测定的趋化因子并未差异调节(表7)。
表7
参照(IL-2、IL-6、TNF-α和sICAM-1)和趋化因子小组的测量参数包含P值和针对吸烟调整后的校正的P值(P*)。值表示为平均值±SEM或具有IQR中值(当适当时)。
APRAIS。为了验证该观察结果，将MISSION！群组的CCL3水平与如早前参照实施例2所述的APRAIS群组的CCL3水平进行比较。研究间分析表明，和MISSION！AMI患相比，UAP患者也表现出相似的CCL3血浆水平升高(图11A)。接下来，在不稳定心绞痛患者的APRAIS群组中进行了循环CCL3水平的时间分析。通过ELISA分析的在基线(t＝0)、t＝2天和t＝180的血浆样品揭示了t＝180的CCL3水平相比于t＝0和t＝2显著下降(t＝0 7.57pg/ml；t＝26.49pg/ml；t＝180 4.31pg/ml，P＜0.001)(图11B)。虽然通过ELISA检测的CCL3血浆的绝对水平较低，但是这两种技术的比较体现了显著的相关性(R＝0.92，P＜0.001)。接下来，将设法评估CCL3血浆水平是否有任何预测临床结果的潜能。因此，给定的群组大小的情况下，多重CCL3 t＝0血浆水平被分类为四分位，并分析用于与在住院和/或急性冠脉综合征期间或之后不久的缺血症状发生的相关性(对于四分位分布，参见表6)。CCL3的上四分位水平高度预期在随访期间急性冠脉综合征的发生(似然比11.52，P＜0.01)和住院期间复发的不稳定心绞痛(似然比14.63，P＜0.01)(图12A，12B。)。虽然不太强，但是在随访期间的心源性死亡也显示显著相关(似然比7.92；P＜0.05)(数据未显示)。最后，CCL3不和任何炎症参数相关(数据未显示)。但是，sCD40L水平揭示与CCL3水平有显著的负相关性(R＝-0.44，P＝0.001)，提示了在血小板活化时的反馈响应。
不同于CCL5和CCL18，CCL3水平不能预测UAP(早期)的难治性，但是对发生在UAP后的180天内的更中期事件非常显著。
鼠心肌梗死。在人中得到的结果表明CCL3在缺血性心肌损伤中起重要作用。为了确定增加的趋化因子是否和缺血相关的心肌梗死相关，进行了小鼠的实验。由于已针对动脉粥样化血栓形成广泛研究趋化因子CCL5和CXCL8，AMI CCL3和CXCL10被进一步研究。为了诱导急性心肌梗死，C57B16小鼠的冠状动脉左前降支被结扎。CCL3水平和早期MISSION！发现一致，AMI之后显著升高(33.2±1.5pg/ml对比在结扎动物中76.4±37.4pg/ml；P＝0.02)(图14B)。作为AMI模型的对照，测量和缺血相关的细胞因子IL-6水平16、17。结扎之后，IL-6水平显著上调(假手术动物0.67±0.26ng/ml对比结扎动物1.34±0.46ng/ml，P＝0.007，图14A)。令人惊讶的是，与MISSION！的发现相对，AMI后CXCL10水平显著增加(假手术动物157.3±64.8对比结扎动物310.6±86.6pg/ml；P＝0.03)(图14C)。另外，针对不同的细胞亚类上趋化因子受体的表达，获得和分析了PBMC。正如预期的那样，结扎后，总T-细胞群体在循环中增加(对照中14.1±3.8％对比结扎小鼠中32.8±14.4％，P＝0.038)，而没有发现对脾T细胞的影响(P＝0.9，分别为图15A和15D)。另外，缺血性损伤不调节循环和脾巨噬细胞的数目(数据未显示)。对T细胞群体的更广泛的分析揭示了CCR5+T细胞的特异性富集(对照8.0±2.0％对比结扎的动物11.4±1.4％，P＝0.02)(图15B)。循环CCR5+T细胞的富集伴随着脾CCR5+T细胞减少(19.95±0.5％对比14.1±3.1％，P＝0.004)(图15E)。CCR3是已知的与CCL3相关的趋化因子CCL4的受体。由于通常CCL3和CCL4共调控，也分析了PBMC和脾细胞的CCR3表达。循环CCR3+T细胞的数量是非常低的。分析表明循环CCR3+T细胞的轻微但不显著(P＝0.24)的增加(数据未显示)。脾CCR3+T细胞无明显差异(数据未显示)。总之，这些数据表明T细胞从次级淋巴器官向缺血损伤位点的CCL3特异性迁移。另外，也确定了循环T细胞上的CXC趋化因子受体CXCR3表达。与CXCL10水平增加一致，LAD结扎后循环CXCR3+T细胞的数量显著增加(29.1±1.9％对比43.5±5.7％，P＝0.04)(图15C)。然而对CXCR3+脾T细胞的影响是不明显的(P＝0.78)(图15F)。
初步数据表明，CCL3水平不仅预测未来心血管事件的风险，而且也可在成因上牵涉于疾病发展，因为有CCL3白细胞缺乏症的高脂血症LDL受体敲除小鼠的主动脉窦上的动脉粥样硬化斑块生长显著低于(-60％)有正常CCL3白细胞生成的小鼠(图10)。
实施例4.嗜中性粒细胞在动脉粥样硬化发展中的成因作用。
材料和方法
动物。LDLr-/-小鼠购自当地动物育种厂。小鼠保持食用无菌常规食物(RM3；Special Diet Services，Essex，埃塞克斯，英国)。饮用水添加了抗生素(83mg/L的环丙沙星和67mg/L的硫酸多粘菌素B)和6.5g/l的蔗糖，并任意供应。动物实验在莱顿大学的Gorlaeus实验室动物设施进行。所有实验方案得到了莱顿大学动物实验伦理委员会的批准。
时间表达谱。手术前的两周和整个实验期间雄性LDLr-/-小鼠被喂食含0.25％胆固醇和15％可可脂(Special Diet Services，苏塞克斯，英国)的西方类型食物。为了确定小鼠斑块的基因表达水平(n＝20)，如之前所描述1通过血管周颈圈放置诱发动脉粥样硬化颈动脉病变。小鼠通过皮下注射氯胺酮(60mg/kg，Eurovet Animal Health，Bladel，荷兰)、柠檬酸芬太尼和氟阿尼酮(分别为1.26mg/kg和2mg/kg，Janssen Animal Health，Sauderton，英国)麻醉。颈圈放置后的0至8周每两周处死4只小鼠子集。将动物如上所述麻醉，用PBS灌注通过左心室，由股动脉横切放血。接着，取出双侧颈总动脉，快速冷冻在液氮中用于最佳的RNA保存。样品保存在-80℃下直到进一步使用。
RNA分离。合并每个样品的两个或三个颈动脉，通过在液氮中用杵研磨均质化。根据制造商的说明书，使用Trizol试剂(Invitrogen，布雷达，荷兰)，从组织中提取总RNA。RNA使用M-MuLV逆转录酶(RevertAid，MBI Fermentas公司，莱昂-罗斯)进行逆转录，利用鼠次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)和亲环蛋白A(CypA)作为标准持家基因，使用ABI PRISM7700Taqman装置(Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚州)如前所述用于基因表达的定量分析(表8)。
骨髓移植。为了诱导骨髓发育不全，移植前1天，雄性LDLr-/-受体小鼠利用带有6-mm的铝制过滤器的Andrex Smart 225源(YXLON International)暴露在单次剂量9Gy(0.19Gy/min，200kV，4mA)全身辐照。骨髓通过冲洗股骨和胫骨从雄性CCL3-/-小鼠或同窝仔中分离。通过尾静脉注射，辐照受体接收到0.5x107骨髓细胞，并允许恢复6周。动物食用含有0.25％胆固醇和15％可可脂(SDS)饮食的西方型饮食12周，随后被处死。在被处死的二十四小时之前，向将动物的子集腹膜内注射脂多糖(LPS)(Salmonella minnesota R595(Re)(List Biological Laboratories Inc.，坎贝尔，加利福尼亚州))。CCL3的血浆水平通过夹心ELISA(Biosource公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，根据制造商的方案)确定，以确认白细胞的受损CCL3产生。
组织学分析。收集主动脉根部(10μm)的低温恒温器切片并用油红-O染色。病变的大小用5个切片的主动脉瓣小叶面积确定。用针对巨噬细胞特异性抗原的抗体(MOMA-2，单克隆大鼠IgG2b，稀释度1∶50；Serotec，牛津，英国)，对各个载玻片的相应切片进行免疫组织化学染色。山羊抗大鼠IgG-AP(稀释度1∶100；Sigma，圣路易斯，密苏里州)用作第二抗体，NBT-BCIP(Dako公司，格洛斯卓普，丹麦)用作酶底物。Masson三色染色(Sigma，圣路易斯，密苏里州)用于可视化胶原(蓝色染色)。根据制造商的方案(Sigma)，通过萘酚AS-D氯乙酸酯酶染色使嗜中性粒细胞可视。
巨噬细胞刺激。用1Oμg/ml ox-LDL或1ng/mlLPS刺激从血清取得的RAW264.7巨噬细胞24小时。分离总RNA，用于评估CCL3表达的实时PCR。用重组CCL3(10或100ng/ml)刺激从血清取得的RAW 264.7巨噬细胞24小时。随后，加入[3H]-胸苷(1μCi/孔，比活24Ci/mmol；Amersham Biosciences，荷兰)到各孔中，允许细胞繁殖另一24小时。细胞用冷的PBS漂洗两次，随后用0.1M NaOH溶液裂解。使用液体闪烁分析仪(Tri-Card 2900R)测定[3H]-胸苷掺入的数量
环磷酰胺诱导的嗜中性白血球减少症。如前所述，雌性CCL3-/-小鼠或野生型对照接受环磷酰胺(6mg/小鼠)的腹膜内(i.p.)注射来耗尽血液嗜中性粒细胞。血液样品通过尾静脉定期采取，用Sysmex细胞分化装置(Goffin Meyvis，伊顿-勒尔，荷兰)测定血细胞分化。
体内趋化性。雌性CCL3-/-小鼠和野生型对照接受500ng重组KC(Peprotech公司，洛矶山，新泽西州)或PBS的i.p.注射。两小时后，血液和腹膜细胞被分离，并通过流式细胞术分析嗜中性粒细胞组成。
流式细胞术。腹膜白细胞通过PBS腹腔灌洗得到。未处理的外周血单核细胞(PBMC)和腹膜白细胞用红细胞裂解缓冲液(10mM Tris/HCl含有155mM NH4Cl，pH值7.2)在4℃下孵育5分钟。将细胞在1500rpm下离心5分钟，重悬于裂解缓冲液以除去残余的红细胞。细胞用PBS洗涤两次。细胞悬浮液用含1％正常小鼠血清的PBS孵育，针对表面标记CD11b、GR1和CD71(eBioscience，圣地亚哥，加利福尼亚州)以0.25μg Ab/200,000细胞的浓度进行染色。然后细胞进行流式细胞术分析(FACSCalibur，BD Biosciences公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。FACS数据用CELLQuest软件(BD Biosciences)进行分析。
统计分析。数据表示为平均值±SEM。2-尾斯氏t检验用来比较单个组，而多个组使用单向ANOVA进行比较，然后使用Student-Newman-Keuls多重比较检验进行比较。非参数数据使用Mann-Whitney U检测进行分析。P＜0.05的水平被认为显著。
结果
对LDLr-/-小鼠的动脉粥样硬化病变的时间表达分析展示了在初始斑块(颈圈放置后2周)中CCL3清晰的瞬时上调。在病变进展的更晚期，CCL3恢复到其原来水平。这种表达最初伴随着巨噬细胞标记CD68表达的增加，CD68水平在之后的时间点仍然高。和CD68和CCL3相比，CD36的表达稍微延迟(图16)该表达谱表明，CCL3可能参与炎性细胞向动脉粥样硬化病变部位的关键性募集。RAW 264.7巨噬细胞体内暴露在ox-LDL导致CCL3表达的中等诱导，而TLR4配体LPS在mRNA水平上强烈诱导MIP1α(图17)。
为了评估造血CCL3缺乏对白细胞迁移和活化以及对动脉粥样化形成的影响，我们用CCL3-/-骨髓重构了LDLr-/-小鼠。在实验过程中，CCL3缺乏不影响体重或总胆固醇水平(数据未显示)。血浆MIP1α水平在CCL3-/-嵌合体和同窝仔对照之间没有显著差异(在野生型2.4±0.8pg/ml对比在CCL3-/-嵌合体0.9±0.6pg/ml；P＝0.1，图17C)。经过LPS体内处理后，CCL3缺乏表型更为明显得多。LPS处理后24小时，循环MIP1α水平在野生型中稳健增加，但在CCL3-/-嵌合体中并没有稳健增加(在对照中14.7±0.4pg/ml，相比于在CCL3-/-嵌合体中2.1±1.0pg/ml；P＝0.00005，图18A)。
在CCL3-/-嵌合体的主动脉根部中的病变发展显著下降达31％(在CCL3-/-中135.1±76.5x103μm2，相比于对照198.4±51.4x103μm2；P＝0.04，图19A)。两组之间内膜MoMa2+巨噬细胞的百分率没有不同(在对照组中19.3±2.6％，相比于在CCL3-/-中22.9±3.0％，图18B)，这表明在动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞聚集和增殖方面仅CCL3可能不是非常关键。CD3T细胞数量不受CCL3缺乏影响(对照中2.9±1.2T细胞/mm2斑块，在CCL3-/-中2.6±1.5T细胞/mm2斑块，图18D)。相比之下，斑块嗜中性粒细胞的数量(在野生型中7.0±0.7个/mm2内膜组织，相比于CCL3-/-斑块中2.9±0.8个/mm2内膜组织；p＝0.001，图18E)以及嗜中性粒细胞粘附在CCL3-/-斑块中显著降低(图18F)。作为病变进展阶段的度量，确定了内膜胶原沉积。在CCL3-/-斑块中的胶原的百分数没有受CCL3缺乏影响(在野生型中7.5±1.4％，相比于在CCL3-/-嵌合体中5.7±1.0％，图18C)。
CCL3缺乏并不影响野生型和CCL3-/-移植动物的循环白细胞的总数(野生型中4.4±0.7x106细胞/ml对比CCL3-/-中3.9±0.6x106细胞/ml，图19A)，循环单核细胞的数目也不受CCL3缺乏影响(在野生型中7.7±1.1％对比在CCL3-/-嵌合体中8.9±1.0％，图19B)。有趣的是，在CCL3-/-嵌合体中，循环嗜中性粒细胞的百分比显著降低(在野生型中35.3±3.9％对比在CCL3-/-嵌合体中23.6±2.5％，p＝0.02，图19C)。
降低的嗜中性粒细胞数目可起因于嗜中性粒细胞的半衰期降低或受损的分化和基质出口(stromal egress)。为了研究这点，动物用单次环磷酰胺注射处理，监测了嗜中性粒细胞的消除/再增殖动力学10天。野生型对照和CCL3-/-小鼠之间的基底白血细胞数目和细胞组成没有区别。CCL3缺乏细胞对环磷酰胺处理稍微更敏感(图20A、B)，因为与野生型相比，在CCL3-/-小鼠中白血细胞的半衰期显著增强(在野生型中1.09±0.07天，相比于在CCL3-/-中0.89±0.06天；p＝0.04，图20C)，并且相对于嗜中性粒细胞和淋巴细胞亚类似乎均匀分布(图20C)。因而，CCL3缺陷小鼠表现出嗜中性粒细胞的半寿期减少，其在该品系中与循环和斑块嗜中性粒细胞数目减少同时发生。注射5天后细胞开始再增殖，并且在CCL3-/-和野生型对照之间相似(图20D)
接下来，评估了野生型和CCL3-/-嗜中性粒细胞对在嗜中性粒细胞募集(KC)中的主要趋化因子的梯度的趋化反应通过。i.p.注射KC两个小时后，WBC和腹膜白细胞被分离，并且分析了嗜中性粒细胞的含量。野生型和CCL3-/-动物之间的循环嗜中性粒细胞数目相似(野生型中6.1±1.0对比于CCL3-/-中5.3±1.0，图21A)。令人惊奇的是，考虑到减少的循环嗜中性粒细胞数，在正常条件下，CCL3-/-动物在腹膜中的嗜中性粒细胞数量略有增加(野生型中0.6±0.5％对比于CCL3-/-动物1.4±0.07，p＝0.2，数据未显示)。KC注射稳健诱导嗜中性粒细胞向对照动物的腹膜迁移。与野生型动物相比，CCL3-/-动物在KC注射后的腹膜嗜中性粒细胞计数仅略有降低(对照中12.3±0.4对比于CCL3-/-动物中10.2±1.9，数据未显示)。然而在CCL3-/-动物中，嗜中性粒细胞流入的诱导降低(野生型中20倍诱导对比于CCL3-/-中7.5倍诱导，p＝0.003；图21C)，这暗示在炎症条件下CCL3-/-嗜中性粒细胞受损的趋化性。
有趣的是，因白细胞特异性缺失CCL3所致，斑块形成减少，这可能是由于斑块中嗜中性粒细胞聚集减少造成的。总之，这些数据表明，CCL3的缺乏可以转化为嗜中性粒细胞半衰期减少，和在斑块中的嗜中性粒细胞的受损CXCR2依赖性聚集，这个随后将转化为减弱的斑块进展。
讨论
白细胞的趋化因子介导的迁移进入血管壁是在动脉粥样硬化病变形成和进展中是一个关键步骤。CC趋化因子CCL3可以与趋化因子受体CCR4、CCR1和CCR5相互作用，其中CCR1和CCR5牵涉于动脉粥样硬化形成相关。结合在动脉粥样硬化形成期间的上调的主动脉表达6以及其对T细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞TNF-α的强有效的趋化作用，这种趋化因子在动脉粥样硬化形成中的作用是可以想象的。在这里我们显示了白细胞是炎症条件下CCL3的主要来源，和白细胞CCL3缺乏通过改变嗜中性粒细胞的半衰期和降低嗜中性粒细胞聚集来减弱斑块发展。
体外实验明确建立的是，活化的巨噬细胞是CCL3的丰富来源，这和早前的数据相符。另外，在循环中CCL3的基线水平被认为仅部分地是白细胞起源的，但是在LPS诱发的炎性反应期间几乎唯一地由白细胞产生。动脉粥样硬化病变发展的表达谱表明在早期病变进展中CCL3主要上调，这表明CCL3参与斑块炎症6。CCL3-/-小鼠的动脉粥样硬化形成被显著减轻，但显然对巨噬细胞或T细胞含量没有影响。有趣的是，CCL3受体之一CCR1的造血和全身缺乏导致加速的动脉粥样硬化。CCR1缺乏的斑块含有更多的巨噬细胞和T细胞，CCR1-/-T细胞生成更多的IFNγ。相反的，显示在造血谱系或全身中的CCR5功能缺乏减弱动脉粥样硬化病变的发展，并且斑块含有较少的巨噬细胞和T细胞。通过使用Met-RANTES拮抗CCR5类似地减弱了动脉粥样硬化的发展、减少了巨噬细胞和T细胞的含量。此外Met-Rantes治疗导致较低的CCR5表达水平，但不导致其配体CCL313的较低的表达水平。显示CCL3对CCR5有更高的结合力，这暗示，在长期低等级(low rate)炎症中CCR5介导的影响是主更的，然而急性重大炎症能通过CCR1信号转导纠正这些影响。造血CCL3缺乏中见到的表型变化似乎与受损的CCR5功能更加一致，虽然我们没有看到对斑块巨噬细胞含量有任何可明显的影响。这表明，虽然CCL3可能影响炎性细胞迁移，但是CCL3对单核细胞或T细胞朝着斑块的迁移并不关键。
直到最近，嗜中性粒细胞也未牵涉动脉粥样硬化的发病机制。然而越来越多数据正在积累，其支持白血球的这种亚类在这种疾病中的积极作用。例如，已表明斑块嗜中性粒细胞渗透与急性冠脉事件相关联。实验支持显示在晚期小鼠斑块中大量存在嗜中性粒细胞并且来自在CXCR4阻断后的协作扩繁。斑块嗜中性粒细胞是在一个狭窄的时间跨度内的强有力的炎性细胞。嗜中性粒细胞与加速内膜细胞凋亡和促炎表型相关。可以想象，在动脉粥样硬化病变中的嗜中性粒细胞的聚集可因炎症增强所致引起斑块失稳，因氧化损伤所致引起坏死的核形成，以及通过释放嗜中性粒细胞弹性蛋白酶引起基质降解。已经报道，CCL3能够以CCR5依赖性方式增强通过促炎细胞因子TNFα诱导的嗜中性粒细胞趋化性。与这些发现一致，本实施例展示了在造血CCL3缺乏中削弱的嗜中性粒细胞向斑块的迁移和血细胞向斑块中的渗出。此外，在CCL3-/-小鼠中，体内嗜中性粒细胞向KC(鼠IL-8类似物)的迁移减少。这表明IL-8，类似于TNFα，可以诱导CCL3介导的嗜中性粒细胞迁移。
另一种引起兴趣的选项是，CCL3影响嗜中性粒细胞稳态。在炎症过程中，循环嗜中性粒细胞的数目在CCL3-/-小鼠中显著更低，这非常符合以下概念：嗜中性粒细胞凋亡被认为是一种保护措施以抑制急性炎症反应，并防止不必要的组织损伤。因此终末成熟的嗜中性粒细胞表现出急剧减少的半衰期。此外，他们有受损的迁移和脱粒。观察到CCL3-/-对嗜中性粒细胞消除动力学的清晰影响，因为CCL3缺乏的嗜中性粒细胞的半衰期减少。然而嗜中性粒细胞的再增殖没有受CCL3缺乏的影响，这表明嗜中性粒细胞的成熟和基质释放本身没有被影响。这些数据表明，CCL3-/-嗜中性粒细胞对环磷酰胺更敏感，或许是其他促调亡信号导致半衰期减小。
总之，本实施例的数据清楚地建立嗜中性粒细胞在动脉粥样硬化的发展中的成因作用。此外，假定在炎症条件下白细胞来源的CCL3可能与TNFα一致地改变嗜中性粒细胞问题并增强对动脉粥样硬化斑块的嗜中性粒细胞趋化性，从而加速病变形成。

Claims (26)

1.一种用于检测自患者得到的样品中的一个或多个分析物的装置，该装置包括：
a)用以进行至少一个检测反应的表面，该表面包括：
包括一种或多种表位结合剂的检测区，其中将每种表位结合剂配置以唯一地结合所述至少一个分析物之一；和
参照区；
b)用以传感与检测区相关的光的一个或多个检测传感器；
c)用以传感与参照区相关的光的一个或多个参照传感器；并且
其中，所述一个或多个检测传感器和所述一个或多个参照传感器使用平衡传感器方法进行操作。
2.权利要求1的装置，进一步包括用以照亮该检测区和该参照区的至少一个光源，其中该至少一个光源是环境光。
3.权利要求1的装置，其中该装置仅使用环境光。
4.权利要求1的装置，其中该检测区包括至少5种表位结合剂。
5.权利要求1的装置，其中该检测区包括至少7种表位结合剂。
6.权利要求1的装置，其中该检测区包括至少9种表位结合剂。
7.权利要求1的装置，其中该检测区包括至少11种表位结合剂。
8.权利要求1的装置，其中该检测区包括至少13种表位结合剂。
9.权利要求1的装置，其中该检测区包括特异于CCL3、CCL5、CCL18、hsCRP和心脏TnI的表位结合剂。
10.权利要求1的装置，其中该检测区包括特异于表A中每个分析物的表位结合剂。
11.一种用于检测样品中的一个或多个分析物和诊断病况的系统，该系统包括：
a)装置，其包括：
用以进行至少一个检测反应的表面，该表面包括检测区和参照区；
用以传感与检测区相关的光的一个或多个检测传感器；
用以传感与参照区相关的光的一个或多个参照传感器；和
用以照亮检测区和参照区的至少一个光源；
b)计算装置，其包括一个或多个处理器；
c)存储器，其包括：
校准数据库，其包括一个或多个校准集，每个校准集包含组合的传感器读数和分析物浓度之间的转换；
诊断数据库，其包括一个或多个阈值和一个或多个诊断规则；
用分析物检测应用编码的CRM，其包括多个可由一个或更多个处理器执行的模块，该模块包括：
控制模块，其用以控制装置的操作，并协调多个模块的功能；
平衡检测模块，其用以控制装置的一个或多个传感器和/或光源的操作；
分析物检测模块，其用以处理从平衡检测模块接收到的组合输出信号；
后处理模块，其用以进一步分析由分析物检测模块计算出的分析物浓度；
诊断模块，其用以比较诊断阵列的条目，并根据存储在存储器中的诊断数据库内定义的一个或多个诊断规则来确定患者病况；
GUI模块，其用以产生一个或多个表单以接收输入至系统和/或显示来自系统的输出；和
d)显示器。
12.一种用于在受试者中预测心力衰竭的方法，该方法包括：
a.从受试者中采集生物样品；和
b.将权利要求1的装置与该样品接触，其中装置的检测区包含特异于样品中的选自表A的至少四个生物标记的表位结合剂；
c.用装置检测分析物的水平是否在表A中指出的阳性范围内；
d.当生物样品中的一个或多个分析物在阳性范围内时，将受试者鉴定为处于未来心力衰竭的风险中。
13.一种用于在受试者中预测心力衰竭的方法，该方法包括：
e.从受试者采集生物样品，并使样品与特异于样品中选自表A中所列的组合的至少四个生物标记的一种或多种表位结合剂接触；
f.确定所述至少四个生物标记各自的水平；
g.将在步骤b)中所确定的所述生物标记的水平，和来自健康对照个体的生物样品的参照水平进行比较；
h.确定在步骤b)中所确定的所述生物标记的水平是否和步骤b)中的所述参照水平有显著差异；和
i.对受试者进行普通诊断测试；
其中，在步骤d)中所确定的生物标记水平的显著差异，和阴性的普通诊断测试结果，指示该心力衰竭是即将发生的心力衰竭。
14.权利要求12的方法，其中该受试者抱怨可指示心力衰竭的不适。
15.权利要求12的方法，其中该心力衰竭是急性冠脉综合征。
16.权利要求12的方法，其中该心力衰竭是心肌梗死。
17.权利要求12的方法，其中该普通诊断测试选自进行心电图、胸部X-射线、心脏负荷测试、超声心动描记术、闪烁描记术、心脏指数和确定另外的生物标记的水平。
18.权利要求12的方法，其中该普通诊断测试是心电图。
19.权利要求12的方法，其中该普通诊断测试是心电图和肌钙蛋白的水平。
20.权利要求12的方法，其中该即将发生的心力衰竭是在生物标记的水平确定后2周内发生的心力衰竭。
21.权利要求12的方法，其中该即将发生的心力衰竭是在生物标记水平确定后的72小时至2周内发生的心力衰竭。
22.权利要求12的方法，其中该心力衰竭可包括致命的或几乎致命的心力衰竭。
23.权利要求12的方法，其中该生物样品选自脑脊液、血液、尿、唾液和泪液。
24.权利要求12的方法，其中受试者是人。
25.一种在受试者中预测心力衰竭的方法，该方法包括：
a.从受试者采集生物样品，并使样品与特异于样品中选自表A中所列的组合的至少四个生物标记的一种或多种表位结合剂接触；
b.确定所述至少四个生物标记各自的水平；
c.将在步骤b)中所确定的所述生物标记的水平，和来自健康对照个体的生物样品的参照水平进行比较；
d.确定在步骤b)中所确定的所述生物标记的水平是否和步骤c)中的所述参照水平有显著差异；和
e.对受试者进行普通诊断测试；
其中，在步骤d)中所确定的生物样品中生物标记水平的显著差异、在步骤c)中所确定的生物样品中肌钙蛋白水平的无显著差异和阴性的普通诊断测试结果，指示该心力衰竭是即将发生的心力衰竭。
26.一种在受试者中预测心力衰竭的方法，该方法包括：
a.从受试者采集生物样品，并使样品与特异于样品中选自表A中所列的组合的至少四个生物标记的一种或多种表位结合剂接触；
b.确定所述至少四个生物标记各自的水平；将在步骤b)中所确定的所述生物标记的水平，和来自健康对照个体的生物样品的参照水平进行比较；
c.确定在步骤a)中所确定的所述生物标记的水平是否与步骤c)中的所述参照水平有显著差异；
d.对受试者进行心电图；
其中，在步骤c)中所确定的生物样品中生物标记水平的显著差异、在步骤c)中所确定的生物样品中肌钙蛋白水平的无显著差异和阴性的心电图结果，指示该心力衰竭是即将发生的心力衰竭。
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