CN108226319A - 一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法，色谱条件为采用直链淀粉类手性柱，以烷烃‑低级醇‑有机碱溶液为流动相，对卡巴拉汀及其光学异构体进行分离测定，本发明对卡巴拉汀中光学异构体检测上具有明显的优势，经方法学验证，其专属性强，灵敏度高，准确度好，可以有效用于控制卡巴拉汀贴剂及原料中光学异构体的质量。

Description

一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法

发明领域

本发明涉及药物分析化学领域，具体涉及一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法。

背景技术

卡巴拉汀(Rivastigmine)又名利凡斯的明，是由瑞士诺华公司首次研制成功的一种氨基甲酸类脑选择胆碱酯酶抑制剂，它通过抑制乙酰和丁酰胆碱酯酶，延缓胆碱能神经元对释放的乙酰胆碱的降解来促进胆碱能神经传导，改善胆碱能介导的认知功能障碍，治疗轻、中度阿尔茨海默型痴呆的症状。

卡巴拉汀属第二代中枢AChE抑制药，美国FDA于2013年6月27日批准扩大Exelon贴片(Rivastigmine transdermal system，卡巴拉汀透皮系统，国内有重酒石酸卡巴拉汀胶囊，即艾斯能)适应症，包括以13.3mg/24h这种Exelon贴片治疗重度阿尔茨海默病(AD)。Exelon贴片是获准的首个和唯一的治疗轻、中和重度AD患者的透皮贴片。卡巴拉汀的化学结构式如下：

卡巴拉汀母核中含有1个手性碳原子，主要是由工艺引入，在终产品中可能会残留R型光学异构体杂质，为了保证药物的安全性及有效性，需采用适合的手性柱分离其光学异构体，并对其质量进行严格地控制。

中国专利申请20140699941.9中公开了一种高效液相色谱法检测胶囊剂中重酒石酸卡巴拉汀光学异构体的方法，描述了采用α₁-酸性糖蛋白键合硅胶(Chiral-AGP)手性色谱柱，在反相色谱条件下，以磷酸缓冲盐和乙腈作为流动相，检测原料及胶囊剂中的光学异构体。该专利的创新点在于采用反相体系可提高胶囊内容物中主药的提取率，从而便于异构体的准确检测，然而卡巴拉汀贴剂中的主药为重酒石酸卡巴拉汀的游离碱，亲水性较成盐药物差别较大；其次，贴剂中常用的辅料为硅酮或丙烯酸酯聚合物之类的压敏胶，还有一定量的有机溶剂和抗氧化剂等，这些成分相比胶囊剂中的水溶性辅料，是不易在反相体系中溶解的，若要提取贴剂中的主药或杂质，通常需先经过有机溶剂萃取，氮气流吹干，最后再用反相流动相复溶等步骤，操作上非常繁琐。所以，该专利的色谱条件虽也可用于卡巴拉汀贴剂中光学异构体的检测，但反相体系的流动相是不适合作为直接提取溶剂的。

因此，针对如何更有效简便的从贴剂中提取卡巴拉汀及其光学异构体的问题，直接采用正相体系分离，正相溶剂作为提取溶剂是比较合理的。我们按照正相色谱法，采用现有技术中的手性色谱柱ChiralPak OD-H，及流动相正己烷-异丙醇-三氟乙酸-二乙胺等常规参数，考察了卡巴拉汀与其光学异构体的分离情况，但结果表明，虽然其分离度较高，峰型却很宽，灵敏度较低，不能满足当前美国药典(USP36-NF31)和欧洲药典(EP8.0)标准中的限度要求。

因此，目前亟待需要开发一个快速、准确、灵敏地检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的有效方法，同时该方法也可用于检测卡巴拉汀原料中的光学异构体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法，该方法也可用于检测卡巴拉汀原料中的光学异构体。通过本发明的方法可以实现异构体的有效分离，其专属性强，灵敏度高，准确度好。从而确保了卡巴拉汀原料及卡巴拉汀贴剂中光学异构体的质量可控。为了达到上述目的，本发明采用高效液相色谱法(HPLC)，其通过如下技术方案实现：

一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法，其特征在于该方法色谱条件为采用直链淀粉类手性柱，以烷烃-低级醇-有机碱溶液为流动相，所述有机碱为乙二胺、二乙胺、三乙胺中的一种，对卡巴拉汀及其光学异构体进行分离测定。

根据本发明的实施方式之一，所述直链淀粉类手性柱可以为ChiralPak AY-H或ChiralPak AY-3，进一步可优选为ChiralPak AY-3；

根据本发明的实施方式之一，所述流动相烷烃-低级醇溶液中的有机碱，可进一步优选为二乙胺；

根据本发明的实施方式之一，所述有机碱占流动相溶液的浓度可以为0.05-0.15％；

根据本发明的实施方式之一，所述流动相烷烃-低级醇溶液的体积比可以为95:5到85:15，；

根据本发明的实施方式之一，所述流动相中烷烃可以为正庚烷或正己烷；

根据本发明的实施方式之一，所述流动相中低级醇可以为异丙醇或无水乙醇；

根据本发明的实施方式之一，所述流动相流速可以为0.5-0.7ml/min；

根据本发明的实施方式之一，所述色谱条件中检测波长可以为200-220nm；

根据本发明的实施方式之一，所述色谱条件可以进一步为：流动相为正己烷—无水乙醇——二乙胺，其中正己烷与无水乙醇的体积比为90:10，二乙胺占流动相溶液的浓度为0.1％，所述色谱条件为检测波长210nm，流动相流速为0.6mL/min。

本发明检测卡巴拉汀原料及其贴剂中光学异构体的方法，包括如下步骤：

步骤一：溶液配制

系统适用性溶液：分别取卡巴拉汀及其光学异构体对照品适量，精密称定，加无水乙醇适量，振摇使其溶解，并稀释定容制成每1mL中约含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

原料供试品溶液：精密称取卡巴拉汀20mg置10ml量瓶中，加无水乙醇适量，振摇使其溶解，并稀释定容制成每1mL中约含2mg的溶液，摇匀，即得。

贴剂供试品溶液：取本品2贴，除去防黏层，将黏贴面向内卷曲后，剪碎，置量瓶中，加入无水乙醇适量，超声30min使胶层溶解，放冷至室温，再用无水乙醇稀释定容制成每1mL中约含2mg的溶液。取上述溶液适量于干净的EP管中，室温12000rpm离心3min，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。

本发明提供的技术方案中，显示出了检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的明显优势，发明人将上述实验得出的色谱条件进行了方法学验证，具体内容如下：

1)专属性及系统适用性

精密量取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，结果如表1所示，出峰顺序依次为卡巴拉汀和光学异构体，二者分离度大于2.0，理论板数与拖尾因子均较好。

表1专属性及系统适用性结果

2)灵敏度

取光学异构体对照品溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)3:1为检测限，信噪比(S/N)10:1为定量限。检测限为10.24ng(相当于供试品溶液浓度的0.05％)，定量限为20.48ng(相当于供试品溶液浓度的0.1％)。药典标准中均规定异构体限度为0.3％，因此，该方法的灵敏度满足要求。

3)线性

以光学异构体的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在2.05～51.2μg/mL范围内，光学异构体的浓度与其峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y＝16073x-4771.3，相关系数为0.9999，表明线性关系良好。

4)精密度

精密量取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6次，结果如表2所示，卡巴拉汀与光学异构体峰面积的RSD均小于1.0％，精密度较好。

表2进样精密度结果

5)准确度

分别向原料及贴剂中加入光学异构体杂质溶液，使其加样浓度分别达到定量限及限度浓度，考察光学异构体在原料及贴剂中的准确度。结果表明，定量限浓度下，异构体杂质在原料及贴剂中的加样回收率分别为106.3％和86.0％，均在80％～120％范围内；限度浓度下，异构体杂质在原料及贴剂中的加样回收率分别为101.9％和95.1％，均在95％～105％范围内，由此证明该方法的准确度良好。

6)溶液稳定性

分别精密量取原料及贴剂供试品溶液，于0、3、6小时进样，观察异构体含量的变化，结果如表3所示，待测溶液在6小时内，异构体含量未发生明显变化，供试品溶液6小时内是稳定的。

表3溶液稳定性结果

7)耐用性

取系统适用性溶液，适当调整色谱系统中的参数，考察色谱条件变化后的分离情况，结果如表4所示，色谱条件微小变动后，卡巴拉汀与其光学异构体的分离度均大于2.0，表明该法的耐用性良好。

表4耐用性结果

本发明采用正相色谱法能有效分离贴剂及原料中的卡巴拉汀及其光学异构体，其专属性强，灵敏度高，准确度好，分离度均达到2.0以上。该方法一方面克服了蛋白手性柱耐用性差、柱效低的问题；另一方面可直接将贴剂中的主药及异构体充分溶出，避免了由氮气吹干再复溶等繁琐的前处理步骤，回收率也可达90％以上，缩短了分析时间，确保了卡巴拉汀贴剂及原料中的光学异构体的质量可控。

附图说明：

图1实施例1中卡巴拉汀贴剂中光学异构体HPLC检测谱图(色谱柱Chiral AGP)

图2实施例2中系统适用性HPLC图(色谱柱ChiralPak OD-H)

图3实施例3中色谱柱筛选结果

图4实施例3中色谱柱筛选结果中的系统适用性HPLC图(色谱柱ChiralPak AD-H)

图5实施例3中色谱柱筛选结果中的系统适用性HPLC图(色谱柱Chiralcel OZ-H)

图6实施例3中色谱柱筛选结果中的系统适用性HPLC图(色谱柱Chiralcel OJ-H)

图7实施例3中色谱柱筛选结果中的系统适用性HPLC图(色谱柱ChiralPak AY-H)

图8实施例3中色谱柱筛选结果中的系统适用性HPLC图(色谱柱ChiralPak AY-3)

图9实施例3中色谱柱筛选结果中的卡巴拉汀原料中光学异构体HPLC检测谱图(色谱柱ChiralPak AY-3)

图10实施例4中系统适用性HPLC图

图11实施例5中系统适用性HPLC图

图12实施例5中卡巴拉汀贴剂中光学异构体的HPLC检测谱图

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的发明并不限于下面的实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

实施例1专利20140699941.9方法(反相法)

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260

色谱柱：α₁-酸性糖蛋白键合硅胶(Chiral-AGP，100*4.0mm，5μm)

流动相：20mM磷酸二氢钠缓冲液(用0.1M氢氧化钠溶液调pH至5.0)-乙腈(98：2)

流速：0.5mL/min

检测波长：210nm

柱温：25℃

进样量：10μL

贴剂供试品溶液：取本品1贴，除去防黏层，将黏贴面向内卷曲后，剪碎，置量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30min使胶层溶解，放冷至室温，甲醇稀释、定容制成每1mL含卡巴拉汀180μg的溶液。取上述溶液适量于干净EP管中，室温12000rpm离心3min，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液350μL于1.5mLEP管中，氮气流中去除溶剂，加入1.0mL流动相复溶，涡旋1min，室温12000rpm离心3min，该溶液过0.22μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

由图1所示的色谱图可以看出，其出峰顺序为异构体、卡巴拉汀。卡巴拉汀主峰的峰型较宽，异构体与卡巴拉汀主峰之间也未达到基线分离。此外，蛋白柱本身须在低温保存，长时间在常温下检测其耐用性较差，柱效下降较为明显。

实施例2专利20140699941.9方法(正相法)

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1200

色谱柱：ChiralPak OD-H(250*4.6mm，5μm)

流动相：正己烷-异丙醇-三氟乙酸-二乙胺＝80:20:0.2％:0.2％

流速：0.5mL/min

检测波长：210nm

柱温：25℃

进样量：10μL

实验步骤

系统适用性：分别取卡巴拉汀与其光学异构体对照品适量，加无水乙醇溶解，并稀释定容制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为系统适用性溶液。

由图2所示的色谱图可以看出，其出峰顺序为异构体、卡巴拉汀。其中，卡巴拉汀主峰及其异构体的峰型较实施例1有较大改善，虽然两者的分离度已达到8.5，但由于其峰型仍然较宽，柱效及灵敏度均较低。

实施例3(柱筛选)

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1200

色谱柱：见图3(250*4.6mm，5μm)

流速：0.6mL/min

流动相：正己烷-无水乙醇-二乙胺＝90:10:0.1％

检测波长：210nm

柱温：35℃

进样量：10μL

实验步骤

系统适用性溶液：分别取卡巴拉汀与其光学异构体对照品适量，加无水乙醇溶解，并稀释定容制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为系统适用性溶液。

图3中供筛选的色谱柱均属于硅胶表面涂敷型填充剂，且均适用于正相体系。除实施例2中提到的OD-H柱之外，卡巴拉汀与其光学异构体仅对ChiralPak AY-H柱有良好的手性选择性。为满足分离度的要求，我们在AY-H柱的基础上，对粒径由5μm至3μm又进行了筛选，结果表明，ChiralPak AY-3(250*4.6mm，3μm)使其分离度能达到2.0以上，且峰型较尖锐，灵敏度高，较实施例2中的方法优势显著。

实施例4

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1200

色谱柱：ChiralPak AY-3(250*4.6mm，3μm)

流动相：正己烷-无水乙醇＝90:10

流速：0.6mL/min

检测波长：210nm

柱温：35℃

进样量：10μL

实验步骤

系统适用性溶液：分别取卡巴拉汀与其光学异构体对照品适量，加无水乙醇溶解，并稀释定容制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为系统适用性溶液。

与图8所示的系统适用性结果对比，由本实施例的图10所示，在未添加二乙胺的条件下，两者的出峰顺序及峰型未发生改变，但出峰时间却提前较多，虽灵敏度较好，但分离度却未能达到标准的最低要求。此外，卡巴拉汀的结构偏碱性，在碱性添加剂二乙胺的作用下，会对其分子状态和极性大小有一定程度的影响，因此出峰时间与未添加二乙胺的情况有所不同，但同时这种影响对其分离度也起到了作用，故在流动相中添加有机碱是很有必要的。

实施例5

仪器与条件

高效液相色谱仪：Agilent 1200

色谱柱：ChiralPak AY-3(250*4.6mm，3μm)

流动相：正己烷-无水乙醇-二乙胺＝90:10:0.1％

流速：0.6mL/min

检测波长：210nm

柱温：40℃

进样量：10μL

实验步骤

系统适用性溶液：分别取卡巴拉汀与其光学异构体对照品适量，加无水乙醇溶解，并稀释定容制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为系统适用性溶液。

贴剂供试品溶液：取本品2贴，除去防黏层，将黏贴面向内卷曲后，剪碎，置量瓶中，加入无水乙醇适量，超声30min使胶层溶解，放冷至室温，再用无水乙醇稀释定容制成每1mL中约含2mg的溶液。取上述溶液适量于干净的EP管中，室温12000rpm离心3min，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。

由图11和12所示的色谱图结果可以看出，在上述条件下，异构体可以有效地避开贴剂中的未知杂质干扰。

实施例6

为了确定流动相中各参数的影响，参照实施例4的试验条件，在不改变其它参数和步骤的条件下，分别改变烷烃、低级醇及有机碱的比例及种类，结果见下表：

由上表结果可知，在本发明所描述可行的实验条件下，其可以有效实现贴剂中卡巴拉汀与其光学异构体的分离，分离度均可达到2.0以上。

实施例7

为了确定色谱条件的影响，参照实施例4的试验条件，在不改变其它参数和步骤的条件下，分别改变流动相流速、检测波长的参数，结果见下表：

根据实施例7结果，可以说明在本发明所描述可行的色谱条件下，可以有效实现贴剂中卡巴拉汀与其光学异构体的分离，分离度均可达到2.0以上。

在本说明书的描述中，所指的“药典”、“药典标准”等均指当前美国药典(USP36-NF31)和欧洲药典(EP8.0)标准。参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种检测卡巴拉汀贴剂中光学异构体的方法，其特征在于该方法色谱条件为采用直链淀粉类手性柱，以烷烃-低级醇-有机碱溶液为流动相，所述有机碱为乙二胺、二乙胺、三乙胺中的一种，对卡巴拉汀及其光学异构体进行分离测定。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法中所述直链淀粉类手性柱为ChiralPak AY-H或ChiralPak AY-3。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于该方法中所述直链淀粉类手性柱优选ChiralPak AY-3。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述有机碱优选为二乙胺。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述有机碱占流动相溶液的浓度为0.05-0.15％。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法中所述流动相烷烃-低级醇溶液中烷烃与低级醇的体积比为95:5到85:15。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法中所述流动相中的烷烃为正庚烷或正己烷，所述流动相中的低级醇溶液为无水乙醇或异丙醇。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于流动相流速为0.5-0.7mL/min。

9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于色谱条件中检测波长为200-220nm。

10.如权利要求1-9任一所述的检测方法，其特征在于所述流动相为正己烷—无水乙醇——二乙胺，其中正己烷与无水乙醇的体积比为90:10，二乙胺占流动相溶液的浓度为0.1％，所述色谱条件为检测波长210nm，流动相流速为0.6mL/min。