CN108220341A - 一种生态海藻生物刺激素的制备方法 - Google Patents

一种生态海藻生物刺激素的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生态海藻生物刺激素的制备方法，将洗净破碎后的海藻加入到搅拌罐中，加入一定的水，在一定温度下灭菌，加入酶，在一定温度下酶解一定时间，灭酶，分离得海藻滤液和海藻渣，将海藻渣加入到发酵罐中，并加入一定水，在一定温度下灭菌后，接入酵母菌发酵，发酵一段时间经灭菌后与海藻滤液混合，得混合液，向混合液中接入产氨棒杆菌，发酵一定时间后，即得生态海藻生物刺激素。本发明工艺简单，产品活性好，具有调理土壤，促进作物生长的作用。

Description

一种生态海藻生物刺激素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生态海藻生物刺激素的制备方法。
背景技术
海藻中含有刺激作物生长的的天然刺激素。生长于大海深处的海藻，由于所处环境寒冷且高盐分，因此海藻中又含有抗逆性物质。将海藻中这些物质无破坏的提取出来，是当前研究的方向。
目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放，此方法提取不完全造成很多浪费。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法相对提取较完全。
目前采用酶法降解和微生物发酵方法提取海藻提取物，存在提取不完全的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种生态海藻生物刺激素的制备方法，具有调理土壤，促进作物生长的作用。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的海藻破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在60～120℃条件下灭菌5～40min，冷却至27～45℃接入酶，酶解30～60min，海藻破碎物、水和酶的质量比5～30:70～95:0.02～1,得酶解海藻；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为50～70％，在70～150℃条件下灭菌5～40min，冷却至27～36℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.1～2:98～99.9,在温度为27～36℃，发酵罐中氧气浓度为8～21％，发酵6～144h，在温度为70～150℃条件下灭菌20～40min，冷却至20～40℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为95～99.8:0.2～5，在温度为25～35℃，含氧量为1～8mg/L条件下，发酵1～6天，压滤后所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
所述海藻是浒苔、海带、马尾藻、裙带和昆布中的一种或任意比例两种以上。
融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法至少重复一次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物，其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，至少匀质一次，匀质温度为30～60℃，匀质压力为2～40MPa，匀质时间为10～40min，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为15000～30000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:3～8，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.001～0.5mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为2000～10000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶；
所述树脂是所述树脂为阳离子交换树脂或大孔吸附树脂；阳离子交换树脂的型号为001*7、732、AmberliteIR-120、Dowex-50、Lewatit-100、Diaion SK-1、AllassionCS、Duolite C-20、SDB-3中的一种或多种，大孔吸附树脂为AB-8、D101、D3520、X-5、NKA-II、NKA-9、S-8、XDA-1、H-20、H-30、H-40中的一种或多种。
步骤3)所述分离包括压滤、过滤和离心分离中的一种或两种以上。
步骤4)所述混合培养基至含水量为60％，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min。
步骤5)混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天。
所述胶红酵母和产氨棒杆菌均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号分别为CICC 31192和CICC 10168。
步骤A)中所述匀质为匀质2次，匀质温度为40℃，匀质时间为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa。
本发明具有以下有益技术效果：
1、本发明采用溶菌酶和果胶酶对海藻进行预处理，溶菌酶使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出，方便后续提取。
2、本发明采用好氧兼厌氧的产氨棒杆菌在缺氧条件下发酵，生产ATP，ATP是一种高能磷酸化合物，在细胞中，它能与ADP的相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应，促进作物生长。由于长期施肥的不合理，造成土壤酸化，产氨棒杆菌可还原N03--和尿素，产生氨使发酵产物呈弱碱性，可以改善酸化土壤。
3、本发明对重金属有一定的固定作用。本发明发酵物中含有多肽、海藻酸及其它蛋白类，重金属可以使蛋白、海藻酸和多肽类失活，同时重金属也会被蛋白、海藻酸和多肽固定，从而防止作物吸收。
4、目前土壤板结严重，施入地中的微生物常处于缺氧状态，采用好氧兼氧菌更能适应现在土壤环境。
5、通过融冻法提高产氨棒杆菌细胞的通透性，可以使产氨棒杆菌产生的ATP更容易从细胞膜中渗透到细胞外，产物效果明显好于未经处理的产氨棒杆菌的产物。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在100℃条件下灭菌15min，冷却至30℃接入酶，酶解40min，海藻破碎物、水和酶的质量比20:79.94:0.06,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为60％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至30℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质2次，匀质温度均为40℃，匀质时间均为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为28000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:5，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.003mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为8000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶。
实施例2
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在100℃条件下灭菌15min，冷却至30℃接入酶，酶解40min，海藻破碎物、水和酶的质量比20:79.94:0.06,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为60％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至30℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质2次，匀质温度均为35℃，匀质时间均为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为28000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:5，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.003mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为8000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶。
实施例3
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在100℃条件下灭菌15min，冷却至30℃接入酶，酶解40min，海藻破碎物、水和酶的质量比20:79.94:0.06,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为60％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至30℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质2次，匀质温度均为45℃，匀质时间均为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为28000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:5，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.003mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为8000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶。
实施例4
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在100℃条件下灭菌15min，冷却至30℃接入酶，酶解40min，海藻破碎物、水和酶的质量比20:79.94:0.06,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为60％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至30℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质1次，匀质温度均为40℃，匀质时间为30min，匀质压力为25MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为28000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:5，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.003mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为8000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶。
实施例5
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在100℃条件下灭菌15min，冷却至30℃接入酶，酶解40min，海藻破碎物、水和酶的质量比20:79.94:0.06,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为60％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至30℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质3次，匀质温度均为40℃，匀质时间均为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa，第三次匀质压力为4MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为28000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:5，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.003mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为8000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶。
实施例6
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带晾干，采用粉碎机将干海带粉碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在100℃条件下灭菌15min，冷却至30℃接入酶，酶解40min，海藻破碎物、水和酶的质量比20:79.94:0.06,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为60％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至30℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为12％，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6)、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质2次，匀质温度均为40℃，匀质时间均为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为28000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:5，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.003mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为8000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶。
实施例7
1)、制备海藻破碎物：将洗净后的新鲜海带破碎，得到海藻破碎物；
2)、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在120℃条件下灭菌5min，冷却至30℃接入酶，酶解30min，海藻破碎物、水和酶的质量比15:84.7:0.3,得酶解海藻，所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物；
3)、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻压滤分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4)、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为65％，在120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.6:99.4,在温度为30℃，发酵罐中氧气浓度为15％，发酵200h，在温度为120℃条件下灭菌20min，冷却至35℃,得海藻发酵物；
5)、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3)得到的海藻滤液加入到步骤4)得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为99:1，在温度为28℃，含氧量为5mg/L条件下，发酵4天，压滤，所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
其中融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a)菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10％的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b)融冻法提高细胞的通透性：融冻法重复三次，其步骤为：将步骤1)得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解，再次放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g；
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，匀质3次，匀质温度均为40℃，匀质时间均为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa，第三次匀质压力为4MPa，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为10000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:6，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.02mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到含溶菌酶的超滤液，所述超滤膜的截留分子量为6000Da。
下面结合实验数据进一步说明本发明海藻液的有益效果：
实验一：
1、实验供试材料
1材料与方法：
1.1试验地点和实验对象：烟台某大学化学分析检测中心。
1.2实验检测：测溶菌酶的活性和回收率。
1.3供试材料：针对普通处理(溶菌酶的制备方法除搅拌均匀后，未经过匀质机匀质，其它制作方法与实施例1一致)、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5中制备的溶菌酶做效果比较。
1.4试验设计：采用高效液相色谱法对样品处理。
本实验除实验用处理不同外其他操作均一致。
2结果与分析
普通处理(搅拌均匀后，未经过匀质机匀质，其它制作方法与实施例1一致)、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5制备的溶菌酶处理相比，数据见表1
表1
回收率(％) 酶活性(U/mg)
普通处理 72.7 14567
实施例1 91.7 21101
实施例2 84.7 19831
实施例3 88.3 20790
实施例4 91.7 20903
实施例5 89.3 20737
由表1实施例1和普通处理相比，本发明无论是在溶菌酶回收率，还是酶活性方面都明显好于普通处理；由实施例1至实施例3比较可以看出匀质温度对溶菌酶的回收率和活性还是有一定影响，其中实施例1采用40℃总体效果最好；由实施例1、实施例4和实施例5比较可以看出匀质压力和次数对溶菌酶的回收率和活性也有一定影响，并非压力越大，时间越长就越好，综合比较实施例1效果最佳。
实验二：
实验室实验
1实验材料与方法
1.1实验材料：500ml烧杯、氯化铬、氯化镉、本发明和去离子水。
1.2实验设计：将取氯化铬、氯化镉各0.2g分别溶解于盛有200ml去离子水的2个500ml烧杯中，分别往二个烧杯中加入2ml本发明。
2.实验现象：氯化铬溶剂溶液为澄清透明绿色溶液，加入本发明后溶液变得浑浊，5分钟后烧杯底部一片浅蓝色絮凝；氯化镉溶剂溶液为澄清透明蓝绿色溶液，加入本发明后溶液变得浑浊，5分钟后烧杯底部一片浅蓝色絮凝。
由上述实验现象可以看出本发明对重金属有一定的固定作用，可以防止重金属被作物吸收，确保食品安全。
大田试验
1、实验供试材料
1材料与方法：
1.1试验地点和实验对象：烟台福山门楼小麦田。
1.2实验检测：测小麦中的重金属含量。
1.3供试材料：针对普通有机肥料(豆粕为主要原料)和利用本发明海藻残渣制备的有机肥做效果比较。
1.4试验设计：试验设2个处理，2次重复，分别为普通有机肥料(豆粕为主要原料)和利用本发明海藻残渣制备的有机肥。作为底肥施入，每亩施入160kg，共计4亩,1亩为一个处理单位。
本实验除实验用处理不同外其他管理均一致。
2结果与分析
普通有机肥料(豆粕为主要原料)和利用本发明海藻残渣制备的有机肥处理相比，数据见表2
表2各处理中小麦中镉、铬、铅、砷含量
镉(％) 铬(％) 铅(％) 砷(％)
普通肥料 0.00003 0 0.00001 0
本发明有机肥 0.00001 0 0 0
由上述实验数据可以看出，本发明可以防止重金属被作物吸收，确保食品安全。
实验三：
实验室实验
1实验材料与方法
1.1实验材料：500ml烧杯、1+1的盐酸、滴管、本发明和去离子水。
1.2实验设计：取4个500ml烧杯加入200ml去离子水，实验一(平行样)为烧杯中用滴管加3滴水，实验二(平行样)为烧杯用滴管加入3滴本发明(pH与水一致)，然后用滴管分别向实验一和实验二中滴入3滴1+1的盐酸，用酸度计检测两个烧杯中液体的pH。
二实验结果见表3
表3
试验一 实验二
样1pH 1.68 3.24
样2pH 1.72 3.31
由表2可以看出本发明具有缓冲pH作用，可以防止土壤酸化。
实验四
大田试验
1、实验供试材料
1材料与方法：
1.1试验地点和实验对象：烟台福山门楼大棚西红柿田。
1.2实验检测：测西红柿田施肥前pH和西红柿收获后的pH。
1.3供试材料：针对普通有机液体水溶肥(固含量和本发明一致)和本发明。
1.4试验设计：试验设2个处理，2次重复，分别为普通有机液体水溶肥(固含量和本发明一致)和本发明。滴灌施入，每亩每次滴灌5kg，每个处理滴灌三次分为移栽后15天处理一次，坐果后处理一次，采摘前15天处理一次，共计4亩,1亩为一个处理单位。
本实验除实验用处理不同外其他管理均一致。
2结果与分析
普通液体有机水溶肥(固含量和本发明一致)和本发明处理相比，数据见表2
表3各处理中ph变化
处理前pH 对比1pH 对比2pH
普通液体有机水溶肥 5.89 5.89 5.89
本发明 5.89 5.92 5.93
由表3可以看出，常用本发明可以提高土壤pH，改善目前酸化土壤；原因为产氨棒杆菌产出的氨气为弱碱性，可提高土壤pH。
实验五
1、实验供试材料
1材料与方法：
1.1试验地点和实验对象：烟台福山黄蜜大樱桃园。
1.2实验检测：测大樱桃的叶片宽度、叶片中叶绿素a含量、叶绿素b的含量、大樱桃产量和大樱桃甜度。
1.3供试材料：针对对比1(除未经酶处理外，其它制作方法均与实施例1一致)、对比2(除产氨棒杆菌未经融冻法处理直接使用外，其它制作方法均与实施例1一致)、实施例6和实施例1做效果比较。
1.4试验设计：试验设4个处理，2次重复，分别为对比1(除未经酶处理外，其它制作方法均与实施例1一致)、对比2(除产氨棒杆菌未经融冻法处理直接使用外，其它制作方法均与实施例1一致)、实施例6和实施例1。分三次处理，采用叶面喷施，每次处理稀释浓度为200mg/kg，每亩喷40kg，第一次为大樱桃开花前，于2016年3月6日处理一次，第二次处理为大樱桃坐果后，处理时间为2016年4月26，第三次处理为大樱桃采摘前，处理时间是2016年5月8日。
本实验除实验用处理不同外其他管理均一致。
2结果与分析
对比1(除未经酶处理外，其它制作方法均与实施例1一致)、对比2(除产氨棒杆菌未经融冻法处理直接使用外，其它制作方法均与实施例1一致)、实施例6和实施例1处理相比，数据见表1。
表1各处理对叶片宽度、叶绿素a、b含量、大樱桃产量和甜度的影响
对比1 对比2 实施例1处理 实施例6处理
平均叶片宽度(cm) 4.47 4.49 4.52 4.49
平均叶绿素a含量(mg/g) 0.60 0.61 0.76 0.64
平均叶绿素b含量(mg/g) 0.20 0.23 0.22 0.21
叶绿素a含量/叶绿素b含量 3 2.65 3.45 3.05
平均大樱桃产量(kg/亩) 783.7 792.4 830.5 798.7
平均甜度(％) 8.5 8.6 10.6 8.8
由表1可以看出实施例1经酶处理后明显好于对比1，实施例1产氨棒杆菌经融冻法处理后效果明显好于对比2的效果；采用新鲜海带的实施例1效果好于采用晾干海带的实施例6，本发明可以明显增加大樱桃产量并提高大樱桃品质。
综上所述，可以看出本发明可以明显刺激作物生长，提高果实品质，还具有防止作物吸收重金属以及调理酸化土壤的作用，具有土壤修复和生态保护功能。采用新鲜海藻制备的生态海藻生物刺激素效果好于其海藻晾干物制备的生态海藻生物刺激素。

Claims (8)

1.一种生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1）、制备海藻破碎物：将洗净后的海藻破碎，得到海藻破碎物；
2）、制备酶解海藻：将海藻破碎物和水装入搅拌罐中，在60～120℃条件下灭菌5～40min，冷却至27～45℃接入酶，酶解30～60min，海藻破碎物、水和酶的质量比5～30:70～95:0.02～1,得酶解海藻；
3）、制备海藻滤液和海藻渣：将酶解海藻分离，所得滤液为海藻滤液，所得残渣为海藻渣；
4）、制备海藻发酵物：将海藻渣、尿素、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾和葡萄糖按照质量比95.5:1:0.5:1:1:1加入到发酵罐中混匀，用水调至含水量为50～70%，在70～150℃条件下灭菌5～40min，冷却至27～36℃，得混合培养基，接入胶红酵母，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.1～2:98～99.9,在温度为27～36℃，发酵罐中氧气浓度为8～21%，发酵6～144h，在温度为70～150℃条件下灭菌20～40min，冷却至20～40℃,得海藻发酵物；
5）、制备生态海藻液体生物刺激素和海藻残渣：将步骤3）得到的海藻滤液加入到步骤4）得到的海藻发酵物中搅拌混匀，得混合物，接入融冻法制备的产氨棒杆菌，混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为95～99.8:0.2～5，在温度为25～35℃，含氧量为1～8mg/L条件下，发酵1～6天，压滤后所得滤液即为生态海藻液体生物刺激素；滤渣即为海藻残渣；
6）、制备生态海藻生物刺激素：生态海藻液体生物刺激素经浓缩和喷雾干燥后，即得生态海藻生物刺激素；
所述海藻是浒苔、海带、马尾藻、裙带和昆布中的一种或任意比例两种以上。
2.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：融冻法产氨棒杆菌的制备按照以下步骤进行：
a）菌种的扩大再培养：将处于对数生长期的菌体作为种子，以10%的接种量接种于液体培养基中，于30℃摇床160r/min培养48h，8000r/min离心10min后，得到扩大再培养菌种；
b）融冻法提高细胞的通透性：融冻法至少重复一次，其步骤为：将步骤1）得到的扩大再培养菌种放入-20℃的冰箱中，冷冻4h，取出，在室温下溶解；
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：牛肉浸液 1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g;
其中牛肉浸液的制备方法按照以下步骤进行：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375ml水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min。
3.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：所述酶是溶菌酶和果胶酶按照质量比5:1的组合物，其中溶菌酶按照以下步骤进行：
(A)向鸡蛋清或全鸡蛋液加5倍重量的水，搅匀后加入匀质机中，至少匀质一次，匀质温度为30～60℃，匀质压力为2～40MPa，匀质时间为10～40min，匀质后过滤，所得滤液为稀释液；
(B)将步骤(A)得到的稀释液用截留分子量为15000～30000Da的超滤膜超滤，得到稀液和浓液；
(C)在步骤(B)得到的稀液中加入树脂进行吸附，所述稀液和树脂的重量比例为1:3～8，得到吸附后的树脂；
(D)将步骤(C)得到的吸附后的树脂用0.001～0.5mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，得到洗
脱液；
(E)将步骤(D)得到的洗脱液用超滤膜超滤脱盐，得到超滤液，所述超滤膜的截留分子量为2000～10000Da；
(F)将步骤(E)得到的超滤液干燥后，即得到溶菌酶；
所述树脂是所述树脂为阳离子交换树脂或大孔吸附树脂；阳离子交换树脂的型号为001*7、732、AmberliteIR-120、Dowex-50、Lewatit-100、Diaion SK-1、AllassionCS、Duolite C-20、SDB-3中的一种或多种，大孔吸附树脂为AB-8、D101、D3520、X-5、NKA-II、NKA-9、S-8、XDA-1、H-20、H-30、H-40中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：步骤3）所述分离包括压滤、过滤和离心分离中的一种或两种以上。
5.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：步骤4）所述混合培养基至含水量为60%，胶红酵母和混合培养基的质量比为0.5:99.5,在温度为30℃，氧气浓度为12%，发酵120h，在温度为120℃条件下灭菌20min。
6.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：步骤5）混合物和融冻法制备的产氨棒杆菌的质量比为98:2，在温度为28℃，含氧量为3mg/L条件下，发酵5天。
7.如权利要求1所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：所述胶红酵母和产氨棒杆菌均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号分别为CICC 31192和CICC10168。
8.如权利要求3所述的生态海藻生物刺激素的制备方法，其特征在于：步骤A）中所述匀质为匀质2次，匀质温度为40℃，匀质时间为15min，其中第一次匀质压力为25MPa，第二次匀质压力为4MPa。
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