CN108192900A - 烟草烟碱去甲基化酶基因cyp82e4的编辑失活载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体及其应用，所述编辑失活载体含有编辑CYP82E4的sgRNA，烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将烟碱去甲基化酶基因CYP82E4编辑失活后有害物质降烟碱含量明显下降，但并不影响烟草农艺性状，因此可用于制备降烟碱含量低的烟草品种，对提高烟草品质具有重要意义。

Description

烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，还涉及该载体的应用。

背景技术

烟草(Tobacco)是管状花目茄科烟草属的一年或有限多年生草本植物。农业生产中的栽培烟草主要是指普通烟草，又称红花烟草(Nicotiana tabacum)。按照烟叶品质特点、生物学性状及栽培调制方法可以将栽培烟草划分为六个类型：烤烟、白肋烟、晒烟、晾烟、香料烟和黄花烟。烟草是一种嗜好作物，也是一种重要的经济作物。我国的烟草生产面积和总产量均为世界第一位，烟叶的生产主要集中在长江以南的南方烟区，以烤烟为主，白肋烟和香料烟仅有小面积种植，烤烟的主要栽培品种有K326、NC98、云烟85及红花大金元等。普通烟草是异源四倍体，起源于林烟草(N.sylvestris)和绒毛状烟草(N.tomentosiformis)杂交后代，经过染色体自然加倍而形成，即普通烟草的两个染色体基组分别来源于林烟草(S染色体基组)和绒毛状烟草(T染色体基组)。

生物碱(Alkaloids)是存在于动植物体内、含有氮杂环的碱性有机化合物，是动植物次生代谢的产物。生物碱是烟草的核心化学成分，其组成和含量直接影响烟叶及其制品的品质和安全性。烟草中的生物碱的类型主要有烟碱(Nicotine)、降烟碱(Nornicotine)、新烟碱(Anabasine)和假木贼碱(Anatabine)四种。栽培烟草的各种生物碱含量在品种内相对比较稳定，但是不同品种的生物碱的含量差异比较大，造成这些差异的主要原因是遗传基因的不同。

烟碱又称为尼古丁，在烟草的根中合成，经由木质部运输到叶片，并且在叶片中进行积累。人们吸食烟草主要是为了获取烟碱，生物碱对人体的作用也主要体现在烟碱上。烟碱可以使人的神经系统兴奋，具有提神醒脑镇静的作用，但是过量的烟碱具有毒副作用，且容易成瘾。对于植物体本身，烟碱可以帮助其抵御虫害。烟碱含量也是栽培烟草的重要品质要素，主要影响烟叶的生理强度、吃味和刺激性。

降烟碱是N-亚硝基降烟碱(N’-nitrosonornicotine,NNN)的前体物质，而N-亚硝基降烟碱是烟碱特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosonornicotines,TSNAs)的一种。在动物实验中，N-亚硝基降烟碱具有很强的致癌性。另一方面，降烟碱本身也是烟草中的毒性成分，它是实验动物(白鼠、大鼠等)的致癌剂，可对人体健康产生直接的负面影响，如催化人体蛋白的异常糖化反应，与人们常用的类固醇类药物(如强的松)发生反应，引起牙周炎等疾病以及引起与年龄有关的肌肉退化等。同时降烟碱含量过高还会影响烟叶的香吃味品质。

一定条件下，烟草中的烟碱在烟碱去甲基化酶(Nicotine demethylase，NND)的作用下脱去碱基形成降烟碱，这一过程称为烟碱转化(Nicotine conversion)。在烟草生物碱中，降烟碱含量占烟碱与降烟碱含量总和的百分比称为烟碱转化率(Conversion)。烟碱转化是一个酶促氧化去甲基化反应，即在烟碱去甲基化酶和P450氧化酶的共同作用下，烟碱分子上的N’-甲基发生氧化反应被去掉，生成不稳定的衍生物羟基化烟碱，然后自然分解成去甲基烟碱和甲醛。Wernsman和Matzinger在1968年的研究表明，降烟碱的积累主要发生在叶片的衰老过程中。在烟草植株个体水平上，烟碱占生物碱含量绝大部分的植株称为非转化株(Nonconverts)，而部分烟碱转化为降烟碱的个体则称为转化株(Converters)。初期的研究中，没有区分烟草转化株与非转化株的确切的烟碱转化率标准。通常认为非转化株的烟碱转化率低于5％，转化株的烟碱转化率高于5％，其中低转化株的烟碱转化率在5％-20％，高转化株的烟碱转化率高于20％。20世纪50年代，人们在烤烟中发现转化株。Jeffery和Tso在1955年发现烤烟中调制后出现的“樱红”(cherry red)烟叶品质、香味较差，是由于其生物碱含量在调制后发生了很大的变化：烟碱的含量大幅度下降，而降烟碱含量则显著增加，表明在此类烟中发生了烟碱转化。Weybrew等在1960年证明了“樱红”色素的积累与降烟碱含量显著提高相关。大多数烤烟栽培品种中都有烟碱转化现象，烟碱转化问题在20世纪90年代后期成为研究热点。

烟叶减害是目前国际烟草科学界的共识以及烟草消费者的普遍要求。烟碱向降烟碱转化是导致烟叶NNN和总TSNA含量增高的主要因素之一。通过何种方法降低烟叶中的降烟碱并随之降低TSNA的含量就必然会成为研究的热点。目前已报道的在烟碱转化中发挥重要作用的烟碱去甲基化酶基因共有6个：CYP82E2、CYP82E3、CYP82E4、CYP82E5v2、CYP82E10及CYP82E21。它们均为细胞色素P450家族CYP82E亚家族的基因，编码有活性的烟碱去甲基化酶，催化烟碱转变为降烟碱。其中，CYP82E4基因的表达受叶片衰老的诱导，是栽培烟草烟碱转化过程的关键基因；CYP82E5v2基因在绿色叶片中特异表达，CYP82E10基因在根中特异表达，在栽培烟草烟碱转化的过程中发挥的作用较小；CYP82E21基因在叶片中不表达，在花中特异表达，造成栽培烟草花尤其是子房中的烟碱转化。CYP82E2的表达受衰老诱导，而CYP82E3优先在绿色叶片中表达，它们分别来自栽培烟草祖先林烟草和绒毛状烟草，在林烟草或绒毛状烟草中可以编码烟碱去甲基化酶催化烟碱转变为降烟碱，但是在栽培烟草中由于碱基替换发生突变而失去功能。

通过生物技术手段，在特定的生产用烟草品种中，对在烟碱转化过程中发挥重要作用的烟碱去甲基化酶基因进行定点失活，制作低降烟碱含量的烟草种质素材，对于培育低危害烟草品种具有重要的理论和应用价值。然而，在现有的烟草研究报道中，有关对烟碱去甲基化酶基因进行精准定点失活进而获得低降烟碱的烟草种质的工作未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体；本发明的目的之二在于提供敲除烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4在降低烟草降烟碱含量中的应用；本发明的目的之三在于提供所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体在降低烟草降烟碱含量中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，所述编辑失活载体含有编辑CYP82E4的sgRNA，所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述编辑CYP82E4的sgRNA针对的靶序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述编辑CYP82E4的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

更优选的，所述编辑失活载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2、敲除烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4在降低烟草降烟碱含量中的应用，所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3、所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体在降低烟草降烟碱含量中的应用。

本发明的有益效果在于：一种烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，该载体含有CYP82E4基因的sgRNA，能够靶向编辑CYP82E4基因失活，并且CYP82E4基因编辑失活后，获得对烟草农艺性状无不良影响而有害物质降烟碱含量明显下降的种质资源，对提高烟草品质具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为重叠PCR构建CYP82E4基因敲除载体示意图(AtU6-26为拟兰芥U6-26启动子，Target为基因编辑打靶序列，sgRNA scaffold为引导Cas9蛋白发挥作用的序列信息，TTTTTT为多聚胸腺嘧啶终止信号；HindIII-U26-F1、CYP82E4-1-R1、CYP82E4-1-F2和NheI-U26-R2表示对应的引物名称)。

图2为转基因植株Cas9基因序列检测(WT表示非转基因白肋烟TN90,1-10表示白肋烟转基因植株)。

图3为白肋烟基因敲除植株突变位点(蓝色背景显示序列为编辑靶序列位置，红色“-”表示在转基因植株中靶序列位置对应碱基的缺失情况)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、烟草CYP82E4基因片段的获得

以白肋烟TN90的基因组DNA为模板，设计如下引物进行PCR扩增；

CYP82E4-fragment-F：5’-tggaattatgcccatcctaca-3’(SEQ ID NO.1)；

CYP82E4-fragment-R：5’-cattagtggttgcacctgagg-3’(SEQ ID NO.2)；

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min10s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，取4μL PCR产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并对所获片段进行序列测定。

扩增获得CYP82E4基因片段，具体序列如下SEQ ID NO.3所示：

tggaattatgcccatcctacagttacctataaaaaggaagttgccgatagttatattctcaacttcttatctaaaaatccataatgctttctcccatagaagccattgtaggactagtaaccttcacatttctcttcttcttcctatggacaaaaaaatctcaaaaaccttcaaaacccttaccaccgaaaatccccggaggatggccggtaatcggccatcttttccacttcaatgacgacggcgacgaccgtccattagctcgaaaactcggagacttagctgacaaatacggccccgttttcacttttcggctaggccttccccttgtcttagttgtaagcagttacgaagctgtaaaagactgtttctctacaaatgacgccattttttccaatcgtccagcttttctttacggcgattaccttggctacaataatgccatgctatttttggccaattacggaccttactggcgaaaaaatcgaaaattagttattcaggaagttctctccgctagtcgtctcgaaaaattcaaacacgtgagatttgcaagaattcaagcgagcattaagaatttatatactcgaattgatggaaattcgagtacgataaatttaactgattggttagaagaattgaattttggtctgatcgtgaagatgatcgctggaaaaaattatgaatccggtaaaggagatgaacaagtggagagatttaagaaagcgtttaaggattttatgattttatcaatggagtttgtgttatgggatgcatttccaattccattatttaaatgggtggattttcaagggcatgttaaggctatgaaaaggacttttaaagatatagattctgtttttcagaattggttagaggaacatattaataaaagagaaaaaatggaggttaatgcagaagggaatgaacaagatttcattgatgtggtgctttcaaaaatgagtaatgaatatcttggtgaaggttactctcgtgatactgtcattaaagcaacggtgtttgtaagttcatctgtcatttttcatttattcacttttattttgaggagcagacatgttaataataatttggagcaactgtaaagttatctatgtgtacaggttcgagcctcaggtgcaaccactaatg

实施例2、CYP82E4基因编辑靶标序列信息及基因编辑失活载体构建

在扩增出的CYP82E4基因片段序列中选择“gaaaatccccggaggatggc”(SEQ IDNO.4)作为拟编辑的靶位点。参考已发表的通过重叠PCR的方法构建该基因的编辑失活载体，具体过程见图1所示。通过两轮PCR将含有CYP82E4靶标序列的sgRNA连入Cas9基因编辑载体。第一轮PCR，以完整sgRNA表达框(SEQ ID NO.14)为模板，用HindIII-U26-F1和CYP82E4-1-R1引物，CYP82E4-1-F2和NheI-U26-R2引物分别扩增得到上游和下游片段，之后将两个扩增的片段混合作为模板，以HindIII-U26-F1和NheI-U26-R2为引物扩增得到全长的含有CYP82E4靶位点序列的sgRNA(SEQ ID NO.15)，回收产物，用HindIII和NheI双酶切sgRNA与pORE-Cas9载体(Gao,J.,G.Wang,S.Ma,X.Xie,X.Wu,X.Zhang,Y.Wu,P.Zhao andQ.Xia(2015)."CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum."Plant Mol Biol 87(1-2):99-110.)，回收并且连接酶切产物，用Plasmid-check F和Plasmid-check RPCR检测、测序得到sgRNA和Cas9共载体的阳性克隆质粒，命名为pORE-Cas9-CYP82E4editing，载体序列如SEQ ID NO.5所示。

HindIII-U26-F1：5’-cccaagcttagctttcgttttcttctttttaact-3’(SEQ ID NO.6)；

CYP82E4-1-R1：5’-gccatcctccggggattttcaatcactacttcgactct-3’(SEQ IDNO.7)；

CYP82E4-1-F2：5’-gaaaatccccggaggatggcgttttagagctagaaatagc-3’(SEQ IDNO.8)；

NheI-U26-R2：5’-ctagctagccagaaaacgaagagaaaaaccc-3’(SEQ ID NO.9)；

Plasmid-check F：5’-ttaggtttacccgccaata-3’(SEQ ID NO.10)；

Plasmid-check R：5’-gagtagacaagtgtgtcgtgct-3’(SEQ ID NO.11)；

敲除载体质粒提取：用LB/Kana的液体培养基扩大培养测序正确的菌液，参考全式金Transgen EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(目录号：EM101)提取敲除载体质粒，用于后续烟草叶片的遗传转化。

农杆菌制备：

1)用接种环从LBA4404永久菌中沾取菌液，在YEB固体培养基(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L)上划线，置于28℃，倒置暗培养2-3天；

2)挑取农杆菌LBA4404单菌落，接种于YEB液体培养基(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L)中，28℃，220rpm振荡培养过夜；

3)取1mL菌液接种于50mL YEB液体培养基(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L)中，28℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5-0.6；

4)将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30min，4℃、4000rpm离心15min，去上清，收集菌体；

5)用25mL预冷20mM的CaCl₂溶液轻轻悬浮菌体，冰浴20min，4℃、4000rpm离心15min，去上清，收集菌体；

6)加入2mL 20mM的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞；

7)将感受态细胞分装于无菌的离心管，每管200uL，液氮速冻，-80℃保存；

实施例3、工程菌制备及转基因烟草制备

敲除载体转化农杆菌制备，具体步骤如下：

1)分别吸取≦1μg测序正确的pORE-Cas9-CYP82E4editing重组质粒加入到100μL农杆菌感受态细胞中(在感受态细胞刚刚溶解时加入)，轻弹混匀，冰浴30min；

2)液氮速冻1min后，立即于37℃水浴热击5min；

3)加入1mL YEB液体培养基，28℃、220rpm培养4-6h(出现絮状物)。

4)4000rpm离心3min，弃掉上清，加入新鲜YEB培养基200μL，用枪头吹打混匀，均匀涂布于YEB固体平板上(Rif终浓度50mg/L，Str终浓度50mg/L，Kana终浓度50mg/L)，28℃，暗培养2-3天。

农杆菌阳性转化子筛选：分别以Plasmid-check F/R引物对农杆菌阳性转化菌进行菌液PCR鉴定。

叶盘法转化烟草：

1)农杆菌准备

将测序成功的敲除阳性农杆菌转化菌按照1：50的比例接种于50mL的YEB液体培养基(利福平、链霉素、卡那霉素的终浓度均为50mg/L)中，28℃、220rpm黑暗震荡培养25-36小时，待菌液OD值达到0.5-0.6，使用50mL无菌离心管收集菌液，3500rpm，5℃离心15min，弃上清，用30mL MS液体培养液(含有终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮)重悬菌体，28℃静置1-2小时。

2)叶盘预培养

以生长两个月野生型白肋烟TN90、红花大金元以及K326叶片组织为实验材料，用直径约0.5cm的打孔器获取植物叶盘，于预培养培养基MS1(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA)上，28℃黑暗培养3天。

3)农杆菌浸染

将预培养3天的烟草叶盘侵染于重悬的农杆菌液体中，充分浸染10分钟，然后将叶盘置于灭菌的滤纸上，吸干表面的菌液，将叶盘置于MS1(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA)培养基上，28℃黑暗培养3天。

4)抗性筛选

将共培养3天的烟草叶盘，用含有500mg/L的羧苄青霉素洗涤3-5次，再用滤纸吸干叶盘表面的水，将叶盘置于筛选培养基MS2(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+250mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素)上，28℃光照16小时，黑暗8小时筛选培养，10-15天更换一次培养基。

5)生根培养

待筛选培养的愈伤组织长出小芽1厘米左右时，将其剪下，转移至含卡那霉素的生根培养基MS上培养，待小芽生根并根系发育完全之后，洗去根部培养基，将植株置于自来水炼苗3-5天，直至长出新的根后，将植株移至土壤中，温室中生长。

6)T1代转基因植株获得

T0代转基因植株在温室中套袋自交收种子，获得T1代转基因种子，将其播种在卡那霉素抗性MS培养基中，获得T1代转基因植株，用于后续基因敲除的突变植株的筛选。

白肋烟T1代转基因敲除烟草的鉴定：提取T1代转基因幼苗的叶片基因组DNA，PCR检测基因组中是否含有Cas9基因序列，检测敲除载体是否已经插入转基因植株基因组中。Cas9检测引物为Cas9F:5’-ctcaacacaacatatacaaaacaaa-3’(SEQ ID NO.12)，Cas9R:5’-ctttggccatctcgtttga-3’(SEQ ID NO.13)。以T1代转基因幼苗叶片基因组DNA为模板，扩增CYP82E4基因的外显子1序列，结果图2所示。PCR产物送测序公司测序，测序引物为扩增外显子1的F引物。通过测序筛选基因敲除的突变体植株，检测靶位点处碱基的突变形式(图3)。

实施例4、转基因烟草分析

1)白肋烟敲除植株的农艺性状评价

对移栽后62后的白肋烟TN90CYP82E4基因纯合敲除植株及白肋烟TN90野生型植株统计植株高度、叶片数目、叶片长宽以及茎围。植株高度是茎尖到基质表面的距离，茎围利用软尺测定基质以上植株茎的周长。每株植物选取中部3片叶片测量长宽，并根据叶面积＝0.6345×叶长×叶宽的公式估算叶片面积，结果如表1所示。

表1、白肋烟基因敲除植株与野生型植株成熟期农艺性状比较

“*”表示转基因敲除系与野生型植株的t测验统计学差异(*P<0.05和**P<0.01)

结果显示，CYP82E4转基因敲除系的株高、叶片数、茎围、叶片面积均有提高。

2)白肋烟敲除植株的生物碱分析

(1)乙烯利处理诱导叶片衰老

每株烟草的3片离体叶片喷洒0.2％乙烯利溶液，置于1个自封袋中，封口后置于培养箱中，在30℃、相对湿度80％的黑暗条件下处理7天，至叶片变黄衰老。处理过程中每天观察并拍照记录叶片的变黄程度。7天后叶片分株用锡箔纸包裹后置于烘箱中，在45℃温度条件下烘干24h，研钵研磨，过40目筛，密封后4℃保存备用。

(2)生物碱提取

称取0.3g烟叶粉末置于50mL离心管中，加入3.5mL 5％NaOH溶液，湿润试样并静置15min，加入20mL 0.01％的三乙胺/叔丁基甲基醚溶液(含内标)，加盖密封后置于超声波振荡器内室温条件下超声萃取15min。随后，在6000rpm/min条件下离心5min，取2mL有机相进行GC/MS分析，检测烟碱的含量；准确移取10mL有机相浓缩至1mL，进行GC/MS分析，检测降烟碱、假木贼碱、新烟草碱及麦斯明的含量。

(3)生物碱含量测定

烟碱与降烟碱、假木贼碱及新烟草碱的检测分两次进样来完成，采用选择离子(SIM)模式和保留时间定性，双内标定量。

气相色谱条件：色谱柱采用DB-35MS(30m×0.25mm i.d.×0.25μm d.f.)；程序升温过程，100℃保持3min，每分钟升温8℃至260℃并保持10min；载气为氦气；柱流速1.0mL/min；进样口温度250℃；烟碱的检测：进样量1μL，分流进样，分流比40:1；其它生物碱的检测：进样量2μL，分流进样，分流比10:1。

质谱条件：溶剂延迟8min，电离电压70ev，传输线温度280℃，离子源温度230℃，扫描方式为选择离子模式(SIM)。

烟碱转化率(％)＝降烟碱含量(mg/g)/(烟碱含量(mg/g)+降烟碱含量(mg/g))，检测结果如表2所示。

表2、白肋烟基因敲除植株及野生型对照成熟期生物碱含量

“*”表示转基因敲除系与野生型植株的t测验统计学差异(*P<0.05和**P<0.01)

结果显示，CYP82E4转基因敲除系降烟碱和麦斯明含量降低，而盐碱，假木贼碱，新烟碱含量均升高。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggaattatg cccatcctac a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattagtggt tgcacctgag g 21

<210> 3

<211> 1149

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 3

tggaattatg cccatcctac agttacctat aaaaaggaag ttgccgatag ttatattctc 60

aacttcttat ctaaaaatcc ataatgcttt ctcccataga agccattgta ggactagtaa 120

ccttcacatt tctcttcttc ttcctatgga caaaaaaatc tcaaaaacct tcaaaaccct 180

taccaccgaa aatccccgga ggatggccgg taatcggcca tcttttccac ttcaatgacg 240

acggcgacga ccgtccatta gctcgaaaac tcggagactt agctgacaaa tacggccccg 300

ttttcacttt tcggctaggc cttccccttg tcttagttgt aagcagttac gaagctgtaa 360

aagactgttt ctctacaaat gacgccattt tttccaatcg tccagctttt ctttacggcg 420

attaccttgg ctacaataat gccatgctat ttttggccaa ttacggacct tactggcgaa 480

aaaatcgaaa attagttatt caggaagttc tctccgctag tcgtctcgaa aaattcaaac 540

acgtgagatt tgcaagaatt caagcgagca ttaagaattt atatactcga attgatggaa 600

attcgagtac gataaattta actgattggt tagaagaatt gaattttggt ctgatcgtga 660

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agaaagcgtt taaggatttt atgattttat caatggagtt tgtgttatgg gatgcatttc 780

caattccatt atttaaatgg gtggattttc aagggcatgt taaggctatg aaaaggactt 840

ttaaagatat agattctgtt tttcagaatt ggttagagga acatattaat aaaagagaaa 900

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ccactaatg 1149

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaaatcccc ggaggatggc 20

<210> 5

<211> 12130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atccctaggg aagttcctat tccgaagttc ctattctctg aaaagtatag 300

gaacttcttt gcgtattggg cgctcttggc ctttttggcc accggtcgta cggttaaaac 360

caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 420

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caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccacta gacgctcacc gggctggttg 540

ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga 600

agccgtgtgc gagacaccgc agccgccggc gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc 660

tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt 720

tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa 780

tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat gatgtggaca agcctgggga 840

taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat 900

ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc gcacctattg acatttgagg 960

ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc 1020

gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg 1080

gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc 1140

tcccggcccg ctctcgcgtt ggcagcatca cccataattg tggtttcaaa atcggctccg 1200

tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt 1260

taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt 1320

ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa taaatggcta aaatgagaat 1380

atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat 1440

gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac 1500

ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg 1560

gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag 1620

caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca 1680

aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga 1740

catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt 1800

actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa 1860

agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt 1920

ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt 1980

tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg 2040

gtcgatcagg gaggatattg gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg 2100

gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta 2160

cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg caccgacttc ttccgcatca 2220

agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt gggcaagggg tcgctggtat 2280

tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg gtctacggga 2340

ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc 2400

aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga 2460

atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg 2520

aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt 2580

ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg 2640

ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg 2700

aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga 2760

agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag caagccgcgt 2820

tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc 2880

cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca 2940

cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca 3000

aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt 3060

ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt 3120

tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg 3180

aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc 3240

acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt 3300

cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca 3360

cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact 3420

atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga aaccttccgc ctcatgtgcg 3480

gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt 3540

tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg cattgcaaac 3600

gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct ttactgagat 3660

cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4440

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4500

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttggatctc ctgtggttgg 4560

catgcacata caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta 4620

ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat 4680

agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgctagtgga tctcccagtc acgacgttgt 4740

aaaacgggcg ccccgcggaa agcttagctt tcgttttctt ctttttaact ttccattcgg 4800

agtttttgta tcttgtttca tagtttgtcc caggattaga atgattaggc atcgaacctt 4860

caagaatttg attgaataaa acatcttcat tcttaagata tgaagataat cttcaaaagg 4920

cccctgggaa tctgaaagaa gagaagcagg cccatttata tgggaaagaa caatagtatt 4980

tcttatatag gcccatttaa gttgaaaaca atcttcaaaa gtcccacatc gcttagataa 5040

gaaaacgaag ctgagtttat atacagctag agtcgaagta gtgattgaaa atccccggag 5100

gatggcgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 5160

aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg caaaattttc cagatcgatt tcttcttcct 5220

ctgttcttcg gcgttcaatt tctgggtttt tctcttcgtt ttctggctag cgtttaaact 5280

taagctgatc cactagtcct gcaggtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc 5340

aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg 5400

gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag 5460

atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc 5520

gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 5580

gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgataacatg 5640

gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa 5700

agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 5760

ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 5820

catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 5880

gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 5940

aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat 6000

ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacctcgacc 6060

tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta cttctattgc 6120

agcaatttaa atcatttctt ttaaagcaaa agcaattttc tgaaaatttt caccatttac 6180

gaacgatacc atggccccaa agaaaaagag aaaggttgat tacaaagacc acgacggaga 6240

ctacaaagac cacgacattg attataaaga tgatgatgat aaaggaacga tggacaaaaa 6300

gtatagcatc ggtctggata ttggaactaa ctccgtcggc tgggctgtaa tcaccgacga 6360

atacaaggtc ccgtcaaaaa agttcaaggt attgggtaac acagatcgtc actctatcaa 6420

aaagaatctc attggagctc tgttgttcga cagcggcgaa acagctgagg ccactagact 6480

gaagcgcacc gccagacgcc gttacacgag gagaaagaac agaatctgct acttgcaaga 6540

aatattctca aacgagatgg ccaaagtgga cgattcgttc tttcataggt tagaagagag 6600

tttccttgtt gaagaggata aaaagcacga aagacatccg atatttggaa acatcgtgga 6660

cgaagttgct tatcacgaga agtaccccac gatctatcat ctgcgtaaaa agttggtgga 6720

ctcgacagat aaggccgacc tcaggttaat ataccttgca ctggcgcaca tgatcaaatt 6780

cagaggccat tttctgattg aaggtgacct gaaccctgac aatagtgatg tggacaaact 6840

cttcattcaa ttagttcaga cctacaatca actgtttgaa gagaacccta tcaacgcttc 6900

aggagttgac gctaaggcca tccttagtgc gagactgagc aaatcccgcc gtctcgaaaa 6960

cttaatcgca cagttgcctg gagagaaaaa gaacggtttg ttcggaaatc tcattgcgtt 7020

gtcactcgga ctcacgccaa acttcaagtc taacttcgat ttggcagaag acgcgaaact 7080

gcaactgagc aaagacacat atgacgatga cctcgataac ctcttagctc agatcggcga 7140

tcaatacgcc gacttgttcc tcgctgccaa aaatctgtcg gacgctatac ttctgagtga 7200

tatcttgcgc gtcaacacag aaattactaa ggctcctctg tcggccagta tgataaaacg 7260

ctatgacgaa caccatcagg atttgacatt gctcaaagcc ctcgtgcgtc aacagctccc 7320

agaaaagtac aaggagattt tctttgatca gtccaagaat ggctacgcag gttatataga 7380

cggtggagcg tcgcaagaag agttctacaa gttcatcaag ccaatattag aaaagatgga 7440

cggcacggaa gagttacttg ttaagctgaa tcgtgaggac ctgttgcgta aacagaggac 7500

attcgataac ggatcaattc cgcaccaaat acatcttggc gaactgcacg ctatcctcag 7560

gagacaagag gacttctacc cctttttaaa ggataaccgt gaaaagatcg agaaaatcct 7620

gactttcagg attccttact atgtcggccc actggctcgt ggtaatagca ggtttgcctg 7680

gatgaccagg aagtccgaag agacaattac tccgtggaac ttcgaagagg tggttgataa 7740

aggagcatca gcgcagtctt tcatagaacg catgacaaat tttgacaaga acttaccgaa 7800

tgagaaggtc cttcccaaac actcactcct ctacgaatac ttcacagtat acaacgagct 7860

cactaaagtc aagtacgtaa ccgagggtat gcgcaaaccc gctttcctgt ctggagagca 7920

gaaaaaggcc atcgtggacc ttctgttcaa gacaaaccgt aaggtcactg taaagcaact 7980

caaggaagac tacttcaaaa agatagagtg tttcgattca gtggaaatct ctggcgttga 8040

ggacagattt aacgcttcct tgggtactta ccacgatttg ctcaagatca ttaaagataa 8100

ggacttcctc gacaacgaag agaacgaaga tatcttagag gacatagttc tcacccttac 8160

gctgtttgaa gatagagaga tgattgaaga gcgcctgaag acttatgctc atttgttcga 8220

tgacaaagtc atgaagcaac tgaaacgccg taggtacacc ggctggggta gattatcgcg 8280

caaacttatt aatggtataa gggacaagca gtcgggaaaa acgatattgg actttctcaa 8340

gagtgatggt ttcgccaaca gaaattttat gcaactcata cacgatgaca gcttaacatt 8400

caaggaagat atccaaaaag cacaggtgtc gggacagggc gacagtttgc acgaacatat 8460

tgctaacctc gccggctccc cggcgataaa aaagggtatc cttcagactg tgaaagtcgt 8520

agatgaactg gtgaaggtta tgggtcgtca taaacccgag aacatagtta tcgaaatggc 8580

tagggagaat caaacaactc agaagggaca gaaaaactca agagaacgca tgaagcgcat 8640

tgaagagggt atcaaagagc ttggcagtca aatcctgaag gaacaccctg tcgagaacac 8700

gcaacttcag aacgaaaaat tgtacctcta ctatctgcag aatggtagag atatgtacgt 8760

agaccaagaa ttggatatta accgcctctc agattacgac gtggatcata tagttccgca 8820

gtcattcttg aaggatgact ctatcgacaa caaagtcctc acaagatcag acaagaaccg 8880

cggaaaatca gataatgtac cctctgaaga ggtggttaaa aagatgaaaa actactggag 8940

acagttactt aacgctaagt tgatcacgca aagaaagttc gataacctca caaaggctga 9000

acgcggcggt ttaagcgagc ttgacaaggc cggtttcata aaacgtcagt tagtcgaaac 9060

caggcaaatt acgaaacacg tagcccaaat attggattcc cgcatgaaca ctaaatacga 9120

tgaaaatgac aagctcatcc gtgaggtcaa agtaattacc ctgaaaagca agttggtgtc 9180

cgacttcaga aaggatttcc agttctacaa agttcgcgaa atcaacaact accaccatgc 9240

acatgacgct tacctgaacg cagtcgtagg cactgcgtta attaaaaagt accctaaact 9300

ggaatctgag ttcgtgtacg gtgactataa agtgtacgat gttagaaaga tgatcgctaa 9360

aagcgaacag gagattggaa aggctaccgc caagtatttc ttttactcca acatcatgaa 9420

tttctttaag accgaaatca cgttagcaaa tggcgagata cgtaaaaggc cacttatcga 9480

aacaaacgga gaaactggcg agatagtgtg ggacaagggt agagattttg ccactgtccg 9540

caaagtactg tcgatgccgc aagtgaatat cgttaaaaag accgaagttc aaacgggagg 9600

cttcagcaaa gagtccatcc tgcccaagcg taacagtgat aaattgatag ctaggaaaaa 9660

ggactgggat cctaaaaagt atggtggatt cgacagccca actgtcgcat actccgtatt 9720

ggtggttgcg aaagtcgaaa aaggaaagag caaaaagctc aagtccgtaa aagagctgtt 9780

gggcattacc ataatggaaa gatcatcttt cgagaagaat cctatcgatt ttctggaagc 9840

caagggatat aaagaggtca aaaaggacct cataatcaag ttaccaaaat acagtctgtt 9900

cgaattggag aacggcagaa aacgcatgct tgcatcagcg ggtgaactgc aaaagggaaa 9960

tgagttagca cttccttcta aatacgtcaa cttcctgtat ttggcgtcac actacgaaaa 10020

actgaagggc tctccagaag ataacgagca aaagcagtta tttgtggaac agcacaaaca 10080

ttaccttgac gaaattatag agcaaatctc ggagttcagt aagagagtga ttttggctga 10140

cgccaatctt gataaagttc tgtctgctta caacaagcac cgtgataaac cgattaggga 10200

acaggccgag aacatcatac atctcttcac actcactaac cttggtgcac ccgcagcgtt 10260

caaatatttt gacaccacga tagatcgtaa gaggtacacc agcacgaaag aagttttgga 10320

cgcgacactc atccatcaat caatcacggg cctgtacgaa accagaatcg acctgtccca 10380

gctcggtggc gaccccaaga agaagagaaa ggtgtagcgg ccgcatcgat actgcaggag 10440

ctcggtacct tttactagtg atatccctgt gtgaaattgt tatccgctac gcgtgatcgt 10500

tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt 10560

atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg 10620

ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata 10680

gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta 10740

ctagatccca tgggaagttc ctattccgaa gttcctattc tctgaaaagt ataggaactt 10800

cagcgatcgc agacgtcggg atcttctgca agcatctcta tttcctgaag gtctaacctc 10860

gaagatttaa gatttaatta cgtttataat tacaaaattg attctagtat ctttaattta 10920

atgcttatac attattaatt aatttagtac tttcaatttg ttttcagaaa ttattttact 10980

attttttata aaataaaagg gagaaaatgg ctatttaaat actagcctat tttatttcaa 11040

ttttagctta aaatcagccc caattagccc caatttcaaa ttcaaatggt ccagcccaat 11100

tcctaaataa cccaccccta acccgcccgg tttccccttt tgatccatgc agtcaacgcc 11160

cagaatttcc ctatataatt ttttaattcc caaacacccc taactctatc ccatttctca 11220

ccaaccgcca catagatcta tcctcttatc tctcaaactc tctcgaacct tcccctaacc 11280

ctagcagcct ctcatcatcc tcacctcaaa acccaccggg gccggccatg attgaacaag 11340

atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 11400

cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggaggc 11460

cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaacttcaa gacgaggcag 11520

cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 11580

ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 11640

ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 11700

cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 11760

gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 11820

tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 11880

tcgtgactca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 11940

gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 12000

cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 12060

gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 12120

gaggcgcgcc 12130

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagctta gctttcgttt tcttcttttt aact 34

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccatcctcc ggggattttc aatcactact tcgactct 38

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaaatcccc ggaggatggc gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctagctagcc agaaaacgaa gagaaaaacc c 31

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaggtttac ccgccaata 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagtagacaa gtgtgtcgtg ct 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcaacacaa catatacaaa acaaa 25

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctttggccat ctcgtttga 19

<210> 14

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcttagct ttcgttttct tctttttaac tttccattcg gagtttttgt atcttgtttc 60

atagtttgtc ccaggattag aatgattagg catcgaacct tcaagaattt gattgaataa 120

aacatcttca ttcttaagat atgaagataa tcttcaaaag gcccctggga atctgaaaga 180

agagaagcag gcccatttat atgggaaaga acaatagtat ttcttatata ggcccattta 240

agttgaaaac aatcttcaaa agtcccacat cgcttagata agaaaacgaa gctgagttta 300

tatacagcta gagtcgaagt agtgattgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 360

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt gcaaaatttt 420

ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctgggttt ttctcttcgt 480

tttctggcta gc 492

<210> 15

<211> 512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagcttagct ttcgttttct tctttttaac tttccattcg gagtttttgt atcttgtttc 60

atagtttgtc ccaggattag aatgattagg catcgaacct tcaagaattt gattgaataa 120

aacatcttca ttcttaagat atgaagataa tcttcaaaag gcccctggga atctgaaaga 180

agagaagcag gcccatttat atgggaaaga acaatagtat ttcttatata ggcccattta 240

agttgaaaac aatcttcaaa agtcccacat cgcttagata agaaaacgaa gctgagttta 300

tatacagcta gagtcgaagt agtgattgaa aatccccgga ggatggcgtt ttagagctag 360

aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg 420

tgcttttttt gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat 480

ttctgggttt ttctcttcgt tttctggcta gc 512

Claims (6)

1.一种烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，其特征在于：所述编辑失活载体含有编辑CYP82E4的sgRNA，所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，其特征在于：

所述编辑CYP82E4的sgRNA针对的靶序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，其特征在于：

所述编辑CYP82E4的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

4.根据权利要求1所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体，其特征在于：

所述编辑失活载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.敲除烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4在降低烟草降烟碱含量中的应用，其特征在于：

所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.权利要求1～4任一项所述烟草烟碱去甲基化酶基因CYP82E4的编辑失活载体在降低烟草降烟碱含量中的应用。