CN108191710A - 一种快速响应的新型一氧化氮的探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速响应的新型一氧化氮的探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针技术领域。NO在不同生理过程中的参与机制尚未被充分掲示且存在其供体释放不可控、在细胞及活体内的释放动力学复杂。因此，有必要开发快速响应的NO探针。我们设计的XNO系列探针最大的特点就是反应速度快、反应后荧光有较大的增加。该探针具有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现细胞水平NO含量的检测，并进一步应用帕金森疾病的前期检测研究，具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速响应的新型一氧化氮的探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针技术领域。
背景技术
一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是体内重要的内源性小分子，在各种生命活动中发挥着重要作用。NO在不同生理过程中的参与机制尚未被充分掲示。一氧化氮供体是在此类研究中被广泛使用的一类小分子化学生物学工具。既有一氧化氮供体释放不可控、在细胞及活体内的释放动力学复杂。近年研究表明:在心血管中，一氧化氮对维持血管张力的恒定和调节血压稳定起着重要作用；硝酸甘油治疗心绞痛正是由于其在体内转化成NO，扩张血管；在免疫系统中，NO起杀伤细菌、病毒、肿瘤细胞的作用；在神经系统中，一氧化氮促进学习、记忆过程，并可调节脑血流。除此之外，NO还与皮肤正常生理功能的维护、性激素的调节、妊娠维持及分娩有关。
另外，NO是气体自由基，能够快速在细胞和组织中扩散且能和生物日标发生反应，因此，在生物体内检测一氧化氮的形成和迁移是十分困难的。目前，检测NO的方法主要有化学发光法、电化学法、荧光法、电子自旋共振光谱法和紫外一可见光谱法等，其中荧光法以其高选择性、高灵敏性、易于操作、实时性的优点，成为目前主要的研究方法。和其它方法相比，荧光检测可以和显微镜连用实现对细胞内和细胞外NO的成像，达到高的时空分辨率。
目前报道的NO荧光探针主要有两种不同的类型，分别是Nagano课题组开发的基于邻苯几胺结构的反应型一氧化氮探针和Lippard课题组报道的金属离子络合物一氧化氮探针邻苯二胺类反应型NO探针是基于PET(photoinduced electron transfer)原理，如2,3一二氨基蔡(DAN)、二氨基荧光素衍生物(DAFs)、二氨基罗丹明衍生物(DARs).氟硼毗咯甲基衍生物(BODIPY)和三碳著衍生物(DAC)等，这一类型探针具有灵敏度高、pH稳定并且可用于生物体内外的NO成像等优点。最近，Anslyn课题组开发出一类新型NO探针，探针设计原理为利用N一亚硝化成环反应构造新荧光团，并成功应用于细胞内外的NO荧光成像。但是，以上两类反应型NO探针必须在有氧条件下进行，实际参与反应的是NO的氧化产物NO+，因此不能准确定量检测细胞内一氧化氮浓度。
除此之外，含金属离子的NO探针是基于金属离子的顺磁效应，淬灭化合物的荧光，如Co(II),Fe(II)、Ru(II)、Rh(II)和Cu(II)配合物作为荧光打开的NO分子探针。其中基于Co(II)、Fe(II)、Ru(II)、Rh(II)的小分子探针普遍具有灵敏度不高、水溶性不好的缺点，因此限制了其在生物体内的应用。而铜离子络合物荧光探针成功解决了以上缺陷，具有检测限低、水溶性好，并应用到了生理环境中NO的检测，但是在生物体内，NO含量较低，这类探针在生物体内运用的时候，也会出现解离铜离子与结合铜离子的过程，并不能得到NO的准确含量。因此，为了解决以上问题，有必要开发新型一氧化氮探针。我们基于双光子萘酚荧光团，设计合成了一类快速响应的且有较大的斯托克斯位移的一氧化氮探针。该系列探针最大的特点就是反应速度快，利用反应后脱去苯酚的过程使得荧光有较大的增加。除此之外，探针吸收为特点是结合NO后脱去苯酚结构同时伴随巧光増强，方便对一氧化氮检测的动力学进行快速准确的监控，以及避免其他细胞内干扰具有很大的意义。另外，该探针具有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现细胞水平NO含量的检测，并进一步应用帕金森疾病的前期检测研究。
发明内容
为了解决以上的问题，本发明提供一种基于大斯托克斯位移的萘酚荧光团，快速响应的新型一氧化氮探针的探针及其制备方法和应用，可以快速定量的检测生物体内的NO的含量。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种快速响应的新型一氧化氮的探针，具有如下结构式：
所述的荧光探针XNO的制备方法包括如下步骤：
2.1 XNO1：将50-200mg双光子萘酚衍生物XH00C、80-200mg 2-氨基苯酚、5-16μL哌啶，依次加入到3-8mL无水乙醇中，在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤3-6次，得到纯度较高的橙红色目标产物XNO1荧光探针，反应式如下：
2.2 XNO2：将50-200mg双光子萘酚衍生物XH00C、80-200mg 4-氨基苯酚、5-16μL哌啶依次加入到3-8mL无水乙醇中，在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤3-6次，得到纯度较高的暗红色目标产物XNO2荧光探针，反应式如下：
优选的，所述的双光子萘酚衍生物XH00C和氨基苯酚的摩尔比均为1：1.5。
优选的，所述的双光子萘酚衍生化合物XH00C的制备方法如下：
(1)XH3：在冰浴条件下，将0.5-2.0g XH2溶于DCM中,将0.4-2.5mL TiCl4后搅拌20-60min，然后将0.2-0.81mLCH3CHCl2缓慢加入到上述混合液中，25℃搅拌8-12小时，使用NH4Cl水溶液萃取，有机层被萃取后旋干，柱层析得到黄色固体XH3；
(2)XH00C：在冰浴条件下，将0.5-1.5g XH3溶于DCM中,缓慢加入0.5-2.5mL BBr3,25℃搅拌1-4小时,加入碳酸氢钠水溶液至无汽包产生，常温搅拌30min，然后用DCM萃取，有机层旋干，柱层析得到黄色固体XH00C，反应试如下：
优选的：所述步骤(1)中XH2、CH3CHCl2的摩尔比为1:3，条件为冰盐浴投料，后处理用1M的NH4Cl水溶液萃取。
优选的：所述步骤(2)中粗产物XH3可以直接进行下一步，且加料条件为冰盐浴，后处理在冰浴中进行。
所述的快速响应的新型一氧化氮的探针的应用，所述的荧光探针XNO1，XNO2均可应用于生理体系中精确检测细胞内的一氧化氮(Nitric Oxide,NO)。
本发明的有益效果：
所述的双光子萘酚衍生物XH00C和氨基苯酚的摩尔比均为为1：1.5，反应过程中，氨基苯酚量不能太多，否则会产生过的副产物，大大的降低产率。其次反应一定要保持惰性气体保护环境。
所述步骤(1)中XH2、CH3CHCl2的摩尔比为1:3，条件为冰盐浴投料，否则产生过多杂点。
所述步骤(2)中粗产物XH3可以直接进行下一步，且加料条件为冰盐浴，后处理在冰浴中进行，否则容易产生危险，且影响产率。
本发明的荧光探针具有较大的斯托克斯位移，能避免背景干扰；对NO有非常快的响应速度；有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用和一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的选择性。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
本发明的荧光探针在可应用于细胞体系中通过外加一氧化氮诱导剂进行培养癌细胞群，使细自身产生大量的一氧化氮，而避免来自外界氧气将NO氧化后的其他物质的干扰，可以用于快速定量的检测生物体内的NO的含量。
本发明为精确测定外加一氧化氮诱导剂使癌细胞细胞自身产生的NO的荧光探针，可用于活细胞内NO的精确检测，主要用的活细胞为SH-SY5细胞株。
附图说明
下面结合附图对本发明的作进一步说明。
图1-a,1-b,1-c分别是萘酚双光子荧光团XH00C的氢谱、碳谱、质谱数数据
图2-a,2-b,2-c分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO1的氢谱、碳谱、质谱数数据
图3-a,3-b,3-c分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO2的氢谱、碳谱、质谱数数据
图4-a,4-b分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO1核对NO的特异性响应的吸收图，发射图。
图5为探针XNO1在细胞中常见为26种10当量的干扰性能测试。
图6是XNO1探针最佳pH条件。
图7是XNO1探针最佳pH条件时间响应曲线。
图8是XNO1探针的细胞毒性(XTT)图。
图9是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO1,在外源性NO的细胞成像图。
具体实施方式
实施例1
一种基于大斯托克斯位移的萘酚荧光团，快速响应的新型一氧化氮探针XNO的制备方法如下：
XH3在冰浴条件下，将XH2(1.27g,6.31mmol)溶于DCM中,,将TiCl4(1.4mL,13mmol)后搅拌30min，然后将CH3CHCl2(0.61mL,6.94mmol)缓慢加入到上述混合液中，25℃搅拌12小时，然后用NH4Cl水溶液和DCM萃取后旋干，柱层析得到纯度较高的黄色固体XH3。1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ10.87(s,1H)，δ8.62(s,1H)，δ7.89(d,J＝9Hz,1H),δ7.63(d,J＝9Hz,1H),δ7.10(t,J＝10.5Hz,1H),δ6.95(d,J＝9Hz,1H),δ4.01(s,3H),δ3.13(s,6H)。
XH00C：将XH3(1.08g,4.71mmol)在冰浴条件加溶到DCM溶液中，缓慢加入BBr3(7.1mL,7.1mmol,in DCM 1.0M),25℃搅拌2小时,加入碳酸氢钠水溶液，至无气泡，冰浴搅拌30分钟，然后用DCM萃取，旋干，柱层析得到黄色固体XH00C，1H-NMR(300MHz,CDCl3)：δ13.22(s,1H),δ10.72(S,1H)，δ7.79(d,J＝4.5Hz,1H)，δ7.62(d,J＝4.5Hz,1H),δ7.36(S,1H),δ6.97(d,J＝4.5Hz,1H)，δ6.80(d,J＝3Hz,1H)，δ3.12(s,1H),13C NMR(75MHz,CDCl3)δ192.61，δ165.96，δ150.44,139.14，δ135.21，δ120.66，δ113.89，δ112.96，δ110.34，δ97.24，δ40.54.[M+H]+for C13H13NO2:215.09；found,215.02。
XNO1：将萘酚衍生物XH00C(100mg,0.46mmol)、2-氨基苯酚(52mg,0.48mmol)、TsOH(1.72mg,0.01mmol)依次加入到无水乙醇(5mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次，得到纯度较高的橙红色目标产物XNO1荧光探针，1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ15.70(s,1H),δ10.21(s,1H),δ9.35(s,1H),7.84(d,J＝5Hz,1H),7.60(d,J＝10Hz,1H),7.47(d,J＝10Hz,1H),7.33(d,J＝5Hz,1H),7.06-7.10(m,1H),6.92-6.99(m,1H),6.79-6.81(d d,J1＝10Hz,J2＝5Hz,2H).6.44(d,J＝10Hz,1H),δ3.07(s,6H).13C NMR(125MHz,DMSO-d 6).δ177.90,δ150.49,δ149.32,δ148.43,δ138.09,δ135.60,δ130.08,δ126.29,δ119.75,δ117.75,δ115.87,δ110.59,δ107.46,δ100.06,δ40.32.MS(m/z):calcd[M+H]+for C13H13NO2:306.14；found,307.06
XNO2：将萘酚衍生物XH00C(100mg,0.46mmol)、4-氨基苯酚(52mg,0.48mmol)、TsOH(1.72mg,0.01mmol)依次加入到无水乙醇(5mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次,得到纯度较高的暗红色目标产物XNO2荧光探针。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ16.06(s,1H)，δ9.64(s,1H),δ9.47(s,1H),δ7.67(d,J＝10Hz,1H),δ7.58(d,J＝10Hz,1H),δ7.45(d,J＝10Hz,2H),δ7.35(s,1H),δ6.93(d,J＝5Hz,1H),δ6.88(d,J＝10Hz,2H),δ6.64(d,J＝10Hz,1H).3.07(s,6H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6).δ169.35,δ156.30,δ154.02,δ150.13,δ136.33,δ135.76,δ134.86,δ129.97,δ121.92,δ116.42,δ116.06,δ111.76,δ107.60,δ99.35,δ40.31.MS(m/z):calcd[M+H]+forC13H13NO2:306.14；found,307.06.
实施例2
一种基于大斯托克斯位移的萘酚荧光团，快速响应的新型一氧化氮探针XNO的制备方法如下：
XH3：在冰浴条件下，将XH2(2.54g)溶于DCM中,将TiCl4(2.8mL)后搅拌30min，然后将CH3CHCl2(1.22mL)缓慢加入到上述混合液中，25℃搅拌12小时，然后用NH4Cl水溶液和DCM萃取后旋干，柱层析得到纯度较高的黄色固体XH3。
XH00C：将XH3(2.16g)在冰浴条件加溶到DCM中，缓慢加入BBr3(14.2mL,in DCM1.0M),25℃搅拌2小时,加入碳酸氢钠水溶液，至无气泡，冰浴搅拌30分钟，然后用DCM萃取，旋干，柱层析得到黄色固体XH00C
XNO1：将萘酚衍生物XH00C(200mg)、2-氨基苯酚(104mg)、TsOH(3.54mg)依次加入到无水乙醇(10mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次，得到纯度较高的橙红色目标产物XNO1荧光探针，
XNO2：将萘酚衍生物XH00C(200mg)、4-氨基苯酚(104mg)、TsOH(3.54mg)依次加入到无水乙醇(10mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次，得到纯度较高的暗红色目标产物XNO2荧光探针。
实施例3
一种基于大斯托克斯位移的萘酚荧光团，快速响应的新型一氧化氮探针XNO的制备方法如下：
XH3：在冰浴条件下，将XH2(3.81g)溶于DCM中,,将TiCl4(4.2mL)后搅拌30min，然后将CH3CHCl2(1.83mL)缓慢加入到上述混合液中，25℃搅拌12小时，然后用NH4Cl水溶液和DCM萃取后旋干，柱层析得到纯度较高的黄色固体XH3。
XH00C：将XH3(3.24g)在冰浴条件加溶到DCM中，缓慢加入BBr3(85.2mL,in DCM1.0M),25℃搅拌2小时,加入碳酸氢钠水溶液，至无气泡，冰浴搅拌30分钟，然后用DCM萃取，旋干，柱层析得到黄色固体XH00C
XNO1：将萘酚衍生物XH00C(300mg)、2-氨基苯酚(156mg)、TsOH(5.31mg)依次加入到无水乙醇(15mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次，得到纯度较高的橙红色目标产物XNO1荧光探针，
XNO2：将萘酚衍生物XH00C(300mg)、4-氨基苯酚(156mg)、TsOH(5.31mg)依次加入到无水乙醇(15mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次，,得到纯度较高的暗红色目标产物XNO2荧光探针。
实施例4
一种基于大斯托克斯位移的萘酚荧光团，快速响应的新型一氧化氮探针XNO的制备方法如下：
XH3：在冰浴条件下，将XH2(12.7g)溶于DCM中,,将TiCl4(14mL)后搅拌30min，然后将CH3CHCl2(6.1mL)缓慢加入到上述混合液中，25℃搅拌12小时，然后用NH4Cl水溶液和DCM萃取后旋干，柱层析得到纯度较高的黄色固体XH3。
XH00C：将XH3(10.8g)在冰浴条件加溶到DCM溶液中，缓慢加入BBr3(71mL,1.0M inDCM),25℃搅拌2小时,加入碳酸氢钠水溶液，至无气泡，冰浴搅拌30分钟，然后用DCM萃取，旋干，柱层析得到黄色固体XH00C
XNO1：将萘酚衍生物XH00C(1g)、2-氨基苯酚(5.2g)、TsOH(17.2mg)依次加入到无水乙醇(50mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次，得到纯度较高的橙红色目标产物XNO1荧光探针，
XNO2：将萘酚衍生物XH00C(1g)、4-氨基苯酚(5.2g)、TsOH(17.2mg)依次加入到无水乙醇(50mL)中,在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤5次,得到纯度较高的暗红色目标产物XNO2荧光探针。
实施例5下面结合附图对本发明的作进一步说明。
图1-a,1-b,1-c分别是萘酚双光子荧光团XH00C的氢谱、碳谱、质谱数数据
图2-a,2-b,2-c分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO1的氢谱、碳谱、质谱数数据
图3-a,3-b,3-c分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO2的氢谱、碳谱、质谱数数据
图4-a,4-b分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO1核对NO的特异性响应的吸收图，发射图。(用5％DMSO+0.2％itriton x-100水溶液分别配制25uM的XNO1的探针,按照配比分别加入从0μM到25μM的NO水溶液。分别测试响应30秒后紫外吸收的光谱以及荧光发射光谱。)
图5为探针XNO1在细胞中常见为26种10当量的干扰性能测试(用5％DMSO+0.2％itriton x-100水溶液分别配制25uM的XNO1的探针,按照配比分别加入从已经配置好的各种干扰物质的溶液，加入的干扰离子终浓度均为25μM。分别测试响应30秒后荧光发射光谱，并测试照片记录。)
图6是XNO1探针最佳pH条件。(用5％DMSO+0.2％itriton x-100水溶液分别配制25uM的XNO1的探针,按照配比分别加入从已经配置好的不同pH的5％DMSO+0.2％itritonx-100水溶液溶液，分别测试响应30秒后荧光发射光谱
图7是XNO1探针最佳pH条件时间相应曲线以。(用5％DMSO+0.2％itriton x-100水溶液分别配制25uM的XNO1的探针,加入配置好的NO溶液立即进行时间动力学测试，得到最后的时间动力学结果。
图8是XNO1探针的细胞毒性(XTT)图。
图9-a,9-b分别是一氧化氮(Nitric Oxide,NO)探针XNO1,在外源性NO的细胞成像图(图9).向含有SH-SY5细胞的培养皿中分别加入XNO1的DMSO溶液，与细胞培养液混合均匀后,使XNO1在培养液中的浓度为20uM，培养1h,，然后各分为两组，一组在外加NO溶液，另外一组不外加NO，37℃条件下，均培养12小时，然后用pH＝7.45的缓冲溶液冲洗3次，将该培养皿在共聚焦显微镜下成像。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种快速响应的新型一氧化氮的探针，其特征在于：具有如下结构式：
2.根据权利要求1所述的快速响应的新型一氧化氮的探针的制备方法，其特征在于，所述的荧光探针XNO的制备方法包括如下步骤：
2.1 XNO1：将50-200mg双光子萘酚衍生物XH00C、80-200mg 2-氨基苯酚、5-16μL哌啶，依次加入到3-8mL无水乙醇中，在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤3-6次，得到纯度较高的橙红色目标产物XNO1荧光探针，反应式如下：
2.2 XNO2：将50-200mg双光子萘酚衍生物XH00C、80-200mg 4-氨基苯酚、5-16μL哌啶依次加入到3-8mL无水乙醇中，在惰性气体保护条件下95℃回流4小时，反应结束后冷却至室温，抽滤，然后用无水乙醇洗涤3-6次，得到纯度较高的暗红色目标产物XNO2荧光探针，反应式如下：
3.根据权利要求2所述的快速响应的新型一氧化氮的探针的制备方法，其特征在于，所述的双光子萘酚衍生物XH00C和氨基苯酚的摩尔比均为1：1.5。
4.根据权利要求2所述的快速响应的新型一氧化氮的探针的制备方法，其特征在于，所述的双光子萘酚衍生化合物XH00C的制备方法如下：
(1)XH3：在冰浴条件下，将0.5-2.0g XH2溶于DCM中,将0.4-2.5mL TiCl4后搅拌20-60min，然后将0.2-0.81mLCH3CHCl2缓慢加入到上述混合液中，25℃搅拌8-12小时，使用NH4Cl水溶液萃取，有机层被萃取后旋干，柱层析得到黄色固体XH3；
(2)XH00C：在冰浴条件下，将0.5-1.5g XH3溶于DCM中,缓慢加入0.5-2.5mL BBr3,25℃搅拌1-4小时,加入碳酸氢钠水溶液至无汽包产生，常温搅拌30min，然后用DCM萃取，有机层旋干，柱层析得到黄色固体XH00C，反应试如下：
5.根据权利要求4所述的快速响应的新型一氧化氮的探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中XH2、CH3CHCl2的摩尔比为1:3，条件为冰盐浴投料，后处理用1M的NH4Cl水溶液萃取。
6.根据权利要求4所述快速响应的新型一氧化氮的探针的制备与应用，其特征在于：所述步骤(2)中粗产物XH3可以直接进行下一步，且加料条件为冰盐浴，后处理在冰浴中进行。
7.一种如权利要求1所述的快速响应的新型一氧化氮的探针的应用，所述的荧光探针XNO1，XNO2均可应用于生理体系中精确检测细胞内的一氧化氮(Nitric Oxide,NO)。
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