CN108186651A - 磷铂及其在治疗癌症中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供稳定的单体性磷铂，即，含有顺‑环己二胺配位体或对映体富集或对映纯的反‑环己二胺配位体的(焦磷酸合)铂(II)或铂(IV)络合物，以及这些络合物的合成。针对多种癌症确定了磷铂化合物的效力和毒性，包括敏感和抗药性的卵巢癌、头颈癌和结肠癌。公开了包含铂络合物的组合物以及借助于所述络合物或包含所述络合物的组合物治疗增生性疾病或病症的方法。
Description
本申请是申请日为2011年6月2日、国际申请号为PCT/US2011/038948、国家申请号为201180038716.5、发明名称为“磷铂及其在治疗癌症中的用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119(e)款要求2010年6月4日提交的申请号为61/351,514的美国临时专利申请的优先权，该申请的全文通过引用并入本文。
技术领域
本申请一般地涉及焦磷酸铂络合物(pyrophosphato platinum complexes)；所提供的络合物的合成方法；包含所提供的络合物的组合物；以及使用所提供的络合物、包含所提供的络合物的组合物或其组合治疗增生性疾(proliferative disease)的方法。
背景技术
在2008年，全球有超过1200万人被诊断出患有癌症，并且有超过700万人死于癌症。事实上，癌症是发达国家中主要的死亡原因，并且是发展中国家中死亡的第二大主要原因(仅次于HIV/AIDS)。一旦患者被诊断出患有癌症，其预后(prognosis)在很大程度上取决于诸如以下因素，如是否癌症在早期被诊断出，癌症是否已经扩散到全身，以及癌症是否或已经对已知的化疗方案产生耐药性(become resistant to)。
基于铂的抗癌药物顺铂、卡铂和奥沙利铂被广泛地用于治疗各种癌症，如卵巢癌、睾丸癌、小细胞肺癌和结肠直肠癌。这些化合物可以与包括放射治疗在内的其它治疗方案联合(in combination with)使用，以治疗广泛系列(expanded array)的癌症。目前来说，利用铂化合物的辅助治疗模式中有超过600种临床试验强调(underscore)铂化合物可有效治疗多种其它癌症的潜力。例如，最近的研究结果突破性表明，将糖尿病药物罗格列酮与卡铂联合使用可有效地治疗多种形式的癌症。现在，本申请已经对不断增长的铂(platinum-based)抗癌药物的应用增加了新的层面(new dimension)，因为大多数的辅助治疗已主要局限于癌症药物或放射药物与其它癌症药物的联合用药上。因此，仍然需要不断发展新的铂基抗癌药物以及铂基抗癌药物的新应用。
诸如顺铂的常规铂化疗药物主要通过转录抑制和通过复制抑制过程(transcription inhibition and through replication inhibition processes)在细胞周期(cell cycle)的G2期引发细胞凋亡(initiate apoptosis)，特别是在高剂量情况下。以链内和链间两种模式通过鸟嘌呤和腺嘌呤碱基的N7位点与DNA共价结合被认为是触发导致细胞凋亡(程序性细胞死亡)的细胞反应级联(cascade of cellular response)的关键性分子事件。在了解顺铂的细胞和分子金属合-生物化学(metallo-biochemistry)的复杂性及细胞毒性的分子机制后，许多挑战性问题已被确定。简言之，人们已经注意到，铂化DNA(platinated DNA)是引发细胞毒性的关键。高迁移率蛋白(HMG)将铂结合的DNA(platinum-bound)与由核苷酸切除修复(NER)酶进行的修复隔离。此外，据信这些铂–DNA加合物激活p53转录因子以诱导组蛋白磷酸化并触发染色质凝聚。
虽然基于铂的化疗药物被广泛用于治疗癌症，但它们在大量患者中的应用是有限的，因为存在着严重的副作用，如肾毒性、神经毒性、耳毒性、骨髓抑制和对铂-金属药物的获得性抗药性。例如，有显著百分比的患者变成对顺铂治疗具有抗药性。虽然卡铂与顺铂相比降低了一些毒性，但其并没有减轻抗药性。目前来说，奥沙利铂被批准用于治疗结肠直肠癌，但其抗药性在很大程度上是未知的。
本领域中缺乏对常规铂基化疗药物的分子水平的抗药性发展的了解并且缺乏克服这种抗药性的方式的了解。虽然这些了解尚不完全，但据信通过主要由从DNA中切除结合铂(bound platinum)的方式以修复DNA损伤的能力促成了抗药性机制。牵涉到促成抗药性的其它机制包括：由与铜转运蛋白CTR1的表达下调有关的吸收降低所致的减少的顺铂细胞内积累；由cMOAT、ATP7A和ATP7B的过度表达所致的增加的流出(efflux)；削弱的促凋亡基因下调和抗凋亡基因上调。另一方面，CTR1蛋白质的上调与增加的耳毒性有关。还已经假设MAPK的交替和由谷胱甘肽及其它小分子和蛋白质(特别是金属硫蛋白)导致的铂去活是导致对铂药物的抗药性的作用因素。鉴于上述情况，人们需要有克服对铂药物的抗药性的方法，包括开发不易受DNA修复机制影响的药物。
在各种实施方案中，专利号为7,700,649(Bose)的美国专利和专利申请号为12/722,189(Bose)的美国专利申请通过公开了涉及新一类铂络合物的合成路线及癌症治疗方法而满足了本领域中的一些需求，这类铂络合物即是具有铂(II)或铂(IV)金属中心(metalcenters)的焦磷酸合络合物。所公开的化合物及其方法为药物开发策略的一部分，所述药物开发策略是基于生成一类不共价结合DNA的铂抗肿瘤剂，从而使得基于DNA修复的抗药性无效(nullify)。这一策略是对常规铂药物开发方法的模式转变，而在常规的铂药物开发方法中，DNA结合是开发更有效的铂抗癌剂的核心主题。
在专利号为7,700,649(Bose)的美国专利和专利申请号为12/722,189(Bose)的美国专利申请中公开的焦磷酸合铂络合物当中有外消旋反-(±)-1,2-环己二胺(焦磷酸)合铂(II)和外消旋反-(±)-1,2-环己二胺-反-二羟基(焦磷酸)合铂(IV)。虽然已经发现这些外消旋络合物对于治疗某些癌症是有效的，但仍然需要改进的药物开发方法，包括但不限于提高焦磷酸合铂治疗剂的有效性、降低这种治疗剂的毒性和通过改进参与杀灭癌细胞的基因的靶向来抑制癌细胞的生长。
发明内容
在各实施方案中，本申请通过公开了基于对映纯(enantiopure)和富对映体(enantioenriched)的单体性焦磷酸铂络合物的药物开发策略而满足前述的需求。因此，本发明提供焦磷酸合铂络合物的最有效形式并且披露了识别参与杀灭癌细胞和抑制癌细胞生长的靶基因。所提供的络合物是稳定的，与常规的抗癌剂相比显示出增强的细胞毒性和更高的有效性。这一药物开发策略也是对常规的铂药物开发方法的模式转变，而在常规的铂药物开发方法中，DNA结合仍然是核心主题。
在各种实施方案当中，本申请提供分离的单体性((顺或反)-1,2-环己二胺)(二氢焦磷酸合)铂(II)和((顺或反)-1,2-环己二胺)-反-二羟基合(二氢焦磷酸合)铂(IV)络合物，其中所述络合物是对映纯的，或者包含对映体过量(enantiomeric excess)的基于顺-1,2-环己二胺的络合物或两种可区别的基于反-1,2-环己二胺的络合物中的一种。因此，本发明提供选自以下的铂(II)和铂(IV)络合物：(i)((1R,2R)-1,2-环己二胺)(二氢焦磷酸合)铂(II)(本文中称为“(1R,2R)-焦dach-2”)；(ii)((1S,2S)-1,2-环己二胺)(二氢焦磷酸合)铂(II)(本文中称为“(1S,2S)-焦dach-2”)；(iii)((1R,2S)-1,2-环己二胺)(二氢焦磷酸合)铂(II)或((1S,2R)-1,2-环己二胺)(二氢焦磷酸合)铂(II)(它们是可重叠的镜像化合物，并且本文中统称为“顺-焦dach-2”)；(iv)((1R,2R)-1,2-环己二胺)-反-二羟基合(二氢焦磷酸合)铂(IV)(本文中称为“(1R,2R)-焦dach-4”)；(v)((1S,2S)-1,2-环己二胺)-反-二羟基合(二氢焦磷酸合)铂(IV)(本文中称为“(1S,2S)-焦dach-4”)；和(vi)((1R,2S)-1,2-环己二胺)-反-二羟基合(二氢焦磷酸合)铂(IV)或((1S,2R)-1,2-环己二胺)-反-二羟基合(二氢焦磷酸合)铂(IV)(它们是可重叠的镜像化合物，并且本文中统称为“顺-焦dach-4”)；以及(i)-(vi)中任一种的药学上可接受的盐或溶剂化物。参考1,2-环己二胺配位体上的氨基基团，在化合物(i)、(ii)、(iv)和(v)中，(1R,2R)和(1S,2S)立体化学代表呈反式构型的氨基基团，而在化合物(iii)和(vi)中，(1R,2S)和(1S,2R)立体化学代表呈顺式构型的氨基基团。
另外,本发明在一些实施方案中提供包含治疗有效量的一种或多种所提供的络合物和至少一种药学上可接受的成分(如载体、稀释剂、辅助剂或载体)的组合物。
本发明还在其它实施方案中提供通过对需要治疗的受试者施用治疗有效量的包含一种或多种所提供的络合物的组合物来治疗一种或多种增生性疾病的方法。
附图说明
虽然说明书以权利要求结尾，特别指出并清楚地要求了本发明请求保护的范围，但相信从以下的描述中结合附图可以更好地理解本发明，其中：
图1显示立体异构体(I)(1R,2R)-焦dach-2、(II)(1S,2S)-焦dach-2、(III)顺-焦dach-2、(IV)(1R,2R)-焦dach-4、(V)(1S,2S)-焦dach-4、(VI)顺-焦dach-4和反-(±)-焦dach-2的圆二色谱；
图2描述由通过将人卵巢癌细胞(A2780)暴露于各种浓度的化合物24小时所进行的克隆生成试验(clonogenic assays)所测定的(1R,2R)-焦dach-2、(1S,2S)-焦dach-2和反-(±)-焦dach-2的活性；
图3描述由通过将顺铂抗药性的人卵巢癌细胞(OVCAR-10)暴露于各种浓度的化合物24小时所进行的克隆生成试验所测定的(1R,2R)-焦dach-2、(1S,2S)-焦dach-2和反-(±)-焦dach-2的活性；
图4是在根据本文公开的实施方案对小鼠中的人卵巢癌细胞施用磷铂的六周期间当中的平均肿瘤尺寸图；
图5显示下文详述的(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4针对顺铂抗药性人卵巢癌细胞(OVCAR-10)的效力；
图6显示随时间推移的肿瘤尺寸图，比较了每隔一天施用一次达三天(“qodx3”)的对照(PBS/Bic)、按60mg/kg给药(qodx3施用)的卡铂和按40mg/kg给药[每天一次施用，连续三天(“qdx3”)]的(1R,2R)-焦dach-4的情况；且
图7显示下文详述的(1R,2R)-焦dach-2[qodx3施用和连续四天每天一次施用(“qdx4”)]和(1R,2R)-焦dach-4(qdx4施用)针对人头颈癌(UMSCC10b)的效力。
具体实施方式
现在描述本发明的具体实施方案。然而，本发明可具有不同的实施方式，并且不应当被解释为仅限于本文中给出的实施方案。相反，所提供的这些实施方案在于使本发明的公开内容详尽完整，并且对本领域技术人员充分地表达本发明的范围。
除另有定义外，本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。本发明的说明书中的术语使用仅是为了描述特定的实施方案，并非旨在限制本发明。如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种”、“一个”(a,an)及“所述”(the)也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地指示不同的情况。
要指出的是，像“优选地”、“通常”和“典型地”之类的术语在本文中不是用来限制请求保护的发明范围，也不意味着某些特征对于请求保护的本发明的结构或功能来说是关键性的、必要的或者甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出替代性的或附加的特征，这些特征可用在或不用在本发明的特定实施方案中。
术语“基本上”在本文中用来表示固有的不确定度，这种不确定度可归因于任何定量比较、数值、测量或其它表述。术语“基本上”在本文中还用来表示定量表述可能会偏离规定基准而不导致所关注的主题物质的基本功能改变的程度。如此，其在涉及元件或特征的布置时用来表示可归因于任何定量比较、数值、测量或其它表述的固有不确定度，所述元件或特征虽然在理论上可预期显示出精确的对应关系或行为，但实际上的具体实施可能略小于精确值。
除另指出外，所有在说明书和权利要求书中使用的如分子量、反应条件等表示成分、性质的量的数字均应被理解为在所有的情况下由术语“约”修饰，该术语旨在表示所示值的最多±10％。此外，说明书和权利要求书中任何范围的公开应被理解为包括该范围本身并且也包括归入其中的任何范围以及端点。除另指出外，说明书和权利要求书中给出的数值属性为近似值，其可能会根据要在本发明的实施方案中获得的所需属性情况而有所不同。尽管给出本发明的宽范围的数值范围和参数为近似值，但具体实施例中给出的数值则是尽可能精确地记录的。然而，任何数值都固有地含有一定的误差，这种误差是由于在各自的测量中存在的误差而必然产生的。
如本文中所用，术语“磷铂”通常是指与单个双齿焦磷酸合配位体(bidentatepyrophosphato ligand)配合的铂络合物。根据本文描述的实施方案的磷铂可具有如下的一般结构(A)和(B)：
其中L1和L2表示中性配位体(独立地选自NH3；取代或未取代的脂族胺；和取代或未取代的芳族胺)或单个双齿中性配位体(选自取代或未取代的脂族或芳族二胺)，端基L1和L2配合于铂金属中心；L3和L4为配合于铂金属中心的配位体(选自氢氧化物、乙酸、丁酸和α-羟基酸、胺或其带电物)。焦磷酸合配位体可以是中性的(未示出)或带电的(如所示)。当带电时，焦磷酸合配位体与由Z+表示的反离子共存。Z+的例子包括但不限于氢；碱金属，如钠和钾；及单价的有机部分。优选地，Z+是得到药学上可接受的盐的反离子。无论是带电的还是中性的，由(A)表示的铂(II)络合物的一般结构为方形平面的，而由(B)表示的铂(IV)络合物的一般结构为八面体的。
一般来说，磷铂不易经历水解，在中性pH值下可溶于水溶液，并且在中性pH值的水溶液中是稳定的。此外，磷铂在癌细胞系中显示出细胞毒性，并且在对顺铂和卡铂中的一者或两者为抗药性的细胞系中是有效的。因此，磷铂在诱导癌细胞死亡方面是有效的，并且在某些情况下与已知的铂抗癌药物相比是更有效的，并且在适合对患者施用的溶液中表现出可取的稳定性和溶解度。如本文中涉及本发明的磷铂所用，“稳定的”是指当将络合物保持在6-8pH值范围内的水溶液中时，其抗水解性达2到六天之间的一段时间。
与顺铂、卡铂及相关的基于铂的抗癌剂不同，磷铂不共价结合DNA。据信对顺铂、卡铂及相关的基于铂的抗癌剂的抗药性是源于由包括核切除修复酶(nuclear excisionrepair enzymes)在内的多种酶对DNA损伤的有效修复。然而，因为磷铂不共价结合DNA，所以对磷铂的抗药性不可能是由于DNA修复机制。数据表明磷铂引发fas及fas相关转录因子、一些促凋亡基因(如Bak和Bax)和肿瘤抑制基因(如PUMA和PTEN)的过度表达。此外，磷铂下调抗凋亡基因BCL2。处理由这些基因转录的蛋白质表达的蛋白质印迹(Western Blot)实验显示了平行趋势。此外，磷铂的细胞结合低于顺铂，但磷铂仍表现出高的细胞毒性。因此，本发明提供具有不同于本领域中的分子靶向的有效的铂抗癌剂。
术语“对映体过量”是根据其通常所理解的定义用在本文中的。也就是说，对于两种对映体A和B，所述两种对映体可分别以摩尔量MA和MB存在于混合物中，在混合物中以较高摩尔量存在的对映体的对映体过量E可表示为关系式％E＝|(MA–MB)/(MA+MB)×100|，其中E>0％。对映体A和B的“外消旋混合物”可由诸如“rac”和/或“(±)”的缩写标示(或者简单地没有任何关于对映体的提示)具有E＝0％，因为MA＝MB。作为进一步的说明，由A和B组成且其中MA＝60％且MB＝40％的混合物的A对映体过量等于20％。在替代方式中，相同的混合物可被视为是由80％的A和B的外消旋混合物与20％的对映纯A组合构成的混合物，因为每个分子B(混合物的40％)可与混合物中的分子A(混合物的40％)配对，剩下未配对的过量的分子A(混合物的20％)。
如本文中所用，关于具有两种对映体A和B的分子的术语“对映纯”是指基本上只含有对映体A或B之一而不是含有A和B两者的化合物或组合物。对于“对映纯”络合物，97％≤E≤100％。
如本文中所用，术语“富对映体的”在其最广泛的意义上是指这样的化合物或组合物，其含有具有两种对映体A和B的分子，使得该化合物或组合物具有对映体过量的一种对映体，无论是A还是B。因此，“A和B的富对映体混合物”可指A对映体过量的混合物或指B对映体过量的混合物，其中无论对于A还是B，0％<E≤100％。作为说明性的例子，A或B的对映体过量可大于0.01％、大于1％、大于10％、大于25％、大于50％、大于75％、大于90％、大于98％、大于99％、大于99.9％或甚至等于100％。
在各种实施方案中，本文提供的是稳定的单体性磷铂络合物(以及包含治疗有效量的一种或多种所述络合物的组合物)。在一些实施方案中，所述络合物和组合物可用在治疗癌症的方法中，所述癌症包括但不限于对顺铂、卡铂和奥沙利铂中的一种或多种的治疗具有抗药性的癌症。
络合物
在各种实施方案中提供了选自以下的磷铂络合物：
(i)式(I)的对映纯(1R,2R)-焦dach-2；
(ii)式(II)的对映纯(1S,2S)-焦dach-2；
(iii)具有对映体过量的式(I)的(1R,2R)-焦dach-2或式(II)的(1S,2S)-焦dach-2的富对映体焦dach-2；
(iv)式(III)的顺-焦dach-2；
(v)式(IV)的对映纯(1R,2R)-焦dach-4；
(vi)式(V)的对映纯(1S,2S)-焦dach-4；
(vii)具有对映体过量的式(IV)的(1R,2R)-焦dach-4或式(V)的(1S,2S)-焦dach-4的富对映体焦dach-4；和
(viii)式(VI)的顺-焦dach-4
在根据式(I)–(VI)的络合物中，简化符号“焦dach”(pyrodach)是指1,2-环己二胺(焦磷酸合)铂络合物(其中，“焦”(pyro)是指双齿焦磷酸合配位体，而“dach”(dach)是指双齿1,2-环己二胺配位体(根据IUPAC惯例命名)，也被称为1,2-二氨基环己烷。术语“焦dach”前面的符号(1R,2R)、(1S,2S)或顺是指在1,2-环己二胺配位体的1-位和2-位上的手性中心的立体化学构型。符号“焦dach”之后的数字(即，2或4)是指铂中心的氧化数。就是说“焦dach-2”是指铂(II)络合物，而“焦dach-4”是指铂(IV)络合物。
铂配合于焦磷酸根和1,2-环己二胺配位体的式(I)–(VI)磷铂可以四种立体异构体的形式存在，这是由于在二胺配位体的手性碳中心1和2上的两个氨基(-NH2)可能有顺-和反-几何形状。这些立体异构体呈现出(1R,2R)-、(1S,2S)-、(1R,2S)-和(1S,2R)-构型。反式配位体反-1,2-环己二胺得到的是分别具有(1R,2R)-和(1S,2S)-构型的两种对映体。顺式异构体原则上涵盖(1R,2S)-和(1S,2R)-对映体，但这两种顺式异构体是等价的可重叠镜像，彼此在结构上和化学上没有区别。因此，在下文中将顺式异构体的两种对映体简称为“顺式异构体”，并且用单一的式子指示。
富对映体的焦dach-2混合物(iii)和富对映体的焦dach-4混合物(vii)两者的特征在于(1R,2R)-对映体或(1S,2S)-对映体的对映体过量大于零。对映体过量可有所不同，并且在示例实施方案中可大于0.01％、大于1％、大于10％、大于25％、大于50％、大于75％、大于90％、大于98％、大于99％、大于99.9％或甚至等于100％。在示例实施方案中，对映体过量的是(1R,2R)-对映体，例如(1R,2R)-对映体的对映体过量大于90％。在进一步的示例实施方案中，对映体过量的是(1S,2S)-对映体，例如(1S,2S)-对映体的对映体过量大于90％。还在进一步的示例实施方案中，富对映体的焦dach-2混合物(i)和/或富对映体的焦dach-4混合物(ii)的(1R,2R)-对映体或(1S,2S)-对映体是对映纯的。
在本文给出的根据式(I)、(II)、(IV)和(V)的对映纯络合物与下文美国专利号为的7,700,649公开的相应外消旋混合物之间的比较数据中，(1R,2R)-焦dach-2和(1S,2S)-焦dach-2的外消旋混合物按简化符号被称为“反-(±)-焦dach-2”。同样，(1R,2R)-焦dach-4和(1S,2S)-焦dach-4的外消旋混合物被称为“反-(±)-焦dach-4”。
作为非限制性的例子，式(I)–(VI)的化合物可以由诸如顺-(1,2-环己二胺)二氯铂(II)的起始材料进行合成，后者可通过按加碘化钾的方式将K2PtCl4转化成K2PtI4来制备。然后可以使K2PtI4与具有所需立体化学的1,2-环己二胺(如顺-1,2-环己二胺、反-(1R,2R)-1,2-环己二胺、反-(1S,2S)-1,2-环己二胺或其混合物)反应。然后可以通过加两当量的硝酸银将所得到的(1,2-环己二胺)二碘铂(II)络合物原位转化成相应的(1,2-环己二胺)二水合铂(II)络合物。然后可以通过加氯化钾将二水合物[Pt(1,2-环己二胺)(H2O)2]转化成顺-二氯[Pt(1,2-环己二胺)Cl2]络合物。
要理解的是可以采用其它合适的反应条件。在非限制性实施例中，使起始的1,2-环己二胺-铂(II)络合物与过量的焦磷酸盐反应，并且温度可以为约35℃至约45℃，或者在35℃与45℃之间的任何优选的较窄范围内。已在40℃下获得了良好的结果。在一些实施例中，可以使反应进行约13小时至约16小时，或在13小时与16小时之间的任何优选的较窄范围内。已在15小时反应时间的情况下获得了良好的结果。在一些实施例中，pH值可以为约6至约7、约7至约8和约8至约9。已在pH值约8的情况下获得了良好的结果。
可浓缩含水的反应混合物，使得不形成焦磷酸盐的沉淀。要理解的是可以按任意合适的方式浓缩含水的反应混合物。例如，可以通过旋转蒸发浓缩含水的反应混合物。
于是，可以通过添加合适的酸将反应混合物的pH值快速降低到pH值小于2。在一些实施例中，可以使用硝酸降低pH值。在一些实施方案中，pH值范围在约1至约2之间。已在pH值为1的情况下获得了良好的结果。
在一些实施例中，在浓缩反应混合物后可将反应混合物冷却到温度在5℃与室温(25℃±2℃)之间。在其它实施例中，所述方法还包括在降低反应混合物的pH值后将反应混合物冷却到温度在5℃与室温之间。
为制备根据式(II)和(V)的铂(IV)络合物，需另外的步骤以连接羟配位体。因此，除了上面描述的步骤外，在约7至约9的pH值下将反应混合物在约30℃至约60℃的温度下保持约12小时至约18小时的一段时间后，可以向反应混合物中添加过氧化氢和任选选自乙酸盐、丁酸盐和α-羟基酸盐的试剂。可以在浓缩反应混合物之前与过氧化氢一起添加的任选试剂可选自乙酸钠、丁酸钠、胺和α-羟基酸的钠盐。在其它实施例中，在浓缩反应混合物之前与过氧化氢一起添加的任选试剂可选自乙酸钾、丁酸钾、任何单齿胺(如氨、异丙胺等)和α-羟基酸的钾盐。
组合物
在各种实施方案的一些中，另外提供的是包含以下中的一种或多种的组合物：(a)所提供的磷铂络合物；(b)(a)的药学上可接受的盐；和(c)(a)的药学上可接受的溶剂化物。所述组合物可另外包含至少一种选自载体、稀释剂、佐剂和媒介物的药学上可接受的成分，其通常是指惰性无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或不与磷铂反应的包封材料。这些类型的添加剂是本领域中熟知的，并且在下文中针对治疗方法有进一步的描述。根据各种实施方案，所提供的组合物包含以下中的一种或多种：
(i)式(I)的对映纯(1R,2R)-焦dach-2或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
(ii)式(II)的对映纯(1S,2S)-焦dach-2或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
(iii)具有对映体过量的式(I)的(1R,2R)-焦dach-2或式(II)的(1S,2S)-焦dach-2的富对映体焦dach-2或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
(iv)式(III)的顺-焦dach-2或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
(v)式(IV)的对映纯(1R,2R)-焦dach-4或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
(vi)式(V)的对映纯(1S,2S)-焦dach-4或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
(vii)具有对映体过量的式(IV)的(1R,2R)-焦dach-4或式(V)的(1S,2S)-焦dach-4的富对映体焦dach-4或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
和
(viii)式(VI)的顺-焦dach-4或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
在一些实施方案中，所提供的组合物包含一种根据式(I)-(VI)中任一式的络合物(或其药学上可接受的盐或溶剂化物)。在一些实施方案中，所提供的组合物为至少两种根据式(I)-(VI)中任一式的络合物(或其药学上可接受的盐或溶剂化物)的多络合混合物。多络合混合物可包含一种、两种、三种、四种、五种或六种根据式(I)–(VI)的化合物，条件是该多络合混合物不是(1R,2R)-焦dach-2和(1S,2S)-焦dach-2的纯外消旋混合物或(1R,2R)-焦dach-4和(1S,2S)-焦dach-4的纯外消旋混合物。
拟用方法
还在进一步的实施方案中，上述络合物、组合物或这两者可单独或与其它药学上可接受的成分一起用在治疗增生性疾病或病症(统称为“疾病”)的方法中。所提供的方法包括对需要治疗的受试者施用治疗有效量的上述络合物或组合物。受试者可以是动物，例如哺乳动物，包括人。设想可治疗的人类增生性疾病包括卵巢癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌和头颈癌、皮肤癌、胰腺癌、乳癌、结肠癌、胶质母细胞瘤癌。在一些实施方案中，预期可以在涉及同时或顺序用已知的铂-金属药物(如顺铂、卡铂和/或奥沙利铂)进行治疗的联合治疗中使用所述络合物和/或组合物。还预期所述络合物和/或组合物可用于治疗对顺铂、卡铂、奥沙利铂中的一种或多种治疗有抗药性的癌症，和/或与其它种类治疗联合使用，包括抗有丝分裂剂(如紫杉烷类)、核苷类似物(如吉西他滨)、蒽环类抗生素(如多柔比星)或靶向治疗剂(如单克隆抗体)。
如本文所述，已经表明式(I)–(VI)的络合物同顺铂和卡铂一样有效或比顺铂和卡铂更有效，因此可为此前对顺铂和卡铂治疗缺乏有效替代疗法的患者提供癌症治疗方法。然而，要用本文描述所提供的络合物、组合物和方法治疗的患者不必是先前已用顺铂或卡铂进行过治疗的。治疗施用可由医务人员在医院或其它医疗机构中进行。
式(I)–(VI)的络合物可以按良好的医疗实践进行施用和给药，考虑个别患者的临床状况、施用部位和方法、施用时间安排、患者年龄、性别、体重及医师已知的其它因素。如此通过如本领域中已知的考虑因素确定用于本文目的的药学上的“治疗有效量”。所述量必须可有效地实现改善，包括但不限于提高存活率或更快地康复，或者改善或消除症状及由本领域技术人员选作适当量度的其它指征。预期可将本发明的络合物单独或作为组合物施用于动物，包括哺乳动物和人。此外，预期可经特别宽的治疗窗施用式(I)–(VI)的络合物。作为说明性的例子，预期可以按一种或多种剂量施用一种或多种所提供的络合物，从5mg/kg至50mg/kg；或者从10mg/kg至50mg/kg；或者从20mg/kg至50mg/kg；或者从30mg/kg至50mg/kg；或者从40mg/kg至50mg/kg；或者从45mg/kg至50mg/kg。当然，本领域的技术人员会意识到，治疗剂量可根据所施用的络合物、所施用的组合物及接受所施用的络合物或组合物的受试者的情况而有所不同。因此，如同小于5mg/kg的治疗剂量，大于50mg/kg的治疗剂量也是预期的。剂量可以是几天期间当中的单次剂量或多次剂量。作为说明性的例子，预期可以在一或多天中以一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次的剂量施用式(I)-(VI)的络合物。还预期可以经一天或多天连续地施用络合物，如通过泵或点滴。作为另一说明性的例子，预期络合物可施用一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天或更多天。
在治疗方法中，可以按多种方式施用式(I)–(VI)的络合物。应指出的是，它们可以作为络合物施用，并且可以利用这些络合物的极佳溶解度在水溶液中单独施用，或者作为活性成分与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和媒介物组合。预期可口服、皮下或肠胃外施用络合物，包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、扁桃体内和鼻内施用以及鞘内和输注技术。络合物的植入物也可以是有用的。
当肠胃外施用式(I)–(VI)的络合物时，通常将它们配制成单位注射剂型(例如，溶液剂、混悬剂、乳剂)。适合注射的药物制剂包括无菌水溶液或分散液和用于重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质、其合适的混合物和植物油。
可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。还可以使用非含水的媒介物作为用于组合物的溶剂系统，如棉籽油、芝麻油、橄榄油、豆油、玉米油、葵花油或花生油和酯(如肉豆蔻酸异丙酯)。此外，可以添加提高组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的作用，例如通过对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。在许多情况下，可取的是包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。可通过使用延迟吸收剂导致可注射药物形式的持久吸收，例如使用单硬脂酸铝和明胶。然而，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂必须与磷铂络合物相容。
可以通过将所需量的适当溶剂中的磷铂络合物与根据需要的一种或多种其它成分合并来制备无菌注射溶液。
可以按可注射制剂的形式对患者施用包含磷铂的药理学制剂，所述可注射制剂含有任何相容的载体，如各种媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂；或者可以按缓释皮下植入物或靶向递送系统(如单克隆抗体、载体递送、离子电渗、聚合物基质、脂质体和微球体)的形式对患者肠胃外施用磷铂络合物。许多其它这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员熟知的。
实施例
通过参考下面的实施例可更好地理解所描述的实施方案，所述实施例是以例示的方式提供的，并且是本领域技术人员可认为并不意味着限制性的。
实施例1
(1R,2R)-焦dach-2[式(I)]的合成
作为用于形成铂(II)络合物的起始材料，通过分别使K2PtI4或更优选K2PtCl4与(1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺反应形成顺-二碘-或顺-二氯-(反-(1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺)铂(II)。然后用十水合焦磷酸钠将顺-二碘-((1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺)铂(II)或优选顺-二氯-((1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺)铂(II)溶解在pH值为8的蒸馏水中，并将所得到的混合物在40℃下温育15小时。温育期过后，通过旋转蒸发浓缩溶液并过滤以除去任何未反应的起始原料。通过添加1-N硝酸将pH值快速降低到大约1.0以沉淀产物。通过在约0℃冷却完成沉淀，并通过真空过滤分离产物，并且用冷水和丙酮洗涤。合成得到对映纯(1R,2R)-焦dach-2。
实施例2
(1S,2S)-焦dach-2[式(II)]的合成
按与合成实施例1中描述的方法类似的方式制备对映纯(1S,2S)-1,2-环己二胺(焦磷酸)合铂(II)，不同的是分别使用顺-二碘-或顺-二氯-(反-(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺)铂(II)为起始材料代替顺-二碘-或顺-二氯-(反-(1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺)铂(II)。合成得到对映纯(1S,2S)-焦dach-2。
实施例3
(1R,2R)-焦dach-4[式(IV)]的合成
将合成实施例1中的起始材料，即顺-二碘-或顺-二氯-(反-(1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺)铂(II)，和十水合焦磷酸钠溶解在pH值为8的蒸馏水中，并将所得到的混合物在40℃下温育15小时。温育期过后，将30％H2O2等份试样添加到反应混合物中，并使反应混合物再反应3小时。然后通过旋转蒸发浓缩溶液并过滤以除去任何未反应的起始原料。通过添加1-N硝酸将pH值快速降低到大约1.0以沉淀产物。通过在约0℃冷却完成沉淀，并通过真空过滤分离产物，并且用冷水和丙酮洗涤。合成得到对映纯(1R,2R)-焦dach-4。
实施例4
(1S,2S)-焦dach-4[式(V)]的合成
按与合成实施例3中描述的方法类似的方式制备对映纯(1S,2S)-1,2-环己二胺-反-二羟基合(焦磷酸)合铂(IV)，不同的是分别使用合成实施例2中的起始材料，即顺-二碘-或顺-二氯-(反-(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺)铂(II)，作为起始材料代替顺-二碘-或顺-二氯-(反-(1R,2R)-(-)-1,2-环己二胺)铂(II)。合成得到对映纯(1S,2S)-焦dach-4。
实施例5
顺-焦dach-2[式(III)]的合成
在设有搅拌棒的500-mL圆底烧瓶中将十水合焦磷酸钠(0.400g)溶于蒸馏水(250mL)。然后使用2-M硝酸将溶液的pH值调节到8.0。然后将溶液置于40℃水浴中并用磁棒搅拌。然后向搅拌溶液中添加顺-二氯-(顺-1,2-环己二胺)铂(II)(0.100g,0.26mmol)。使混合物反应15小时，然后在48℃真空下蒸发溶剂到体积为5mL。然后使混合物通过滤纸，并将溶液收集在设有搅拌棒的10-mL小瓶中。将小瓶置于搅拌板之上的冰浴中，并在轻轻搅拌下使用2-N硝酸将pH值从初始的6.5调到2.0。一旦达到较低的pH值，沉淀便缓慢地产生。再继续搅拌5分钟，此后将悬浮液通过中孔的烧结玻璃过滤器进行过滤，所述过滤器在其使用前保持于冰中。然后用冷水(5mL的2份)和冷的丙酮(5mL的2份)洗涤固体，并将过滤器留在干燥器中过夜。这样产生浅黄色粉末(0.077g,0.16mmol,60％收率)。
实施例6
顺-焦dach-4[式(VI)]的合成
在设有搅拌棒的500-mL圆底烧瓶中将十水合焦磷酸钠(0.400g)溶于蒸馏水(250mL)。然后使用2M硝酸将溶液的pH值调节到8.0。然后将溶液置于40℃水浴中并用磁棒搅拌。向搅拌溶液中添加顺-二氯-(顺-1,2-环己二胺)铂(II)(0.100g,0.26mmol)。使混合物反应15小时，添加3mL的30％(w/w)H2O2，并再给予三小时的反应时间。然后在48℃真空下蒸发溶剂到体积为5mL。然后使混合物通过滤纸，并将溶液收集在设有搅拌棒的10-mL小瓶中。将小瓶置于搅拌板之上的冰浴中并轻轻搅拌，同时使用2-N硝酸将pH值从初始的6.5调到2.5。达到较低的pH值不久后便缓慢地产生沉淀。再继续搅拌5分钟，然后将悬浮液通过中孔的烧结玻璃过滤器进行过滤，所述过滤器在其使用前已保持于冰中。用冷水(5mL的2份)和冷的丙酮(5mL的2份)洗涤固体，并将过滤器留在干燥器中过夜。这样产生白色粉末(0.120g,0.23mmol,88％收率)。
实施例7
磷铂的表征
根据上述合成实施例合成的所有磷铂在PBS和碳酸氢盐缓冲剂的中性pH值水溶液中均表现出溶解度大于40mM/L。特别是(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4在中性pH值水溶液中显示出显著的稳定性。通常情况下，在将磷铂化合物溶于水并通过31P-NMR光谱观察后，七天内没有观察到分解。
通过圆二色(CD)光谱法验证异构体构型，并通过31P-NMR和质谱法验证组成，由此表征根据上面合成实施例制备的化合物。对根据美国专利号为7,700,649中所述的方法制备的反-(±)-焦dach-2外消旋混合物进行另外的CD光谱实验。
在pH值6.8的磷酸盐缓冲液(50mM)中记录CD光谱。焦dach-2和焦dach-4两者的(1R,2R)-和(1S,2S)-形式均显示出可归因于手性的光学活性，但外消旋混合物(反-(±)-焦dach-2)以及焦dach-2和焦dach-4两者的顺式异构体没有显示出任何CD峰。
CD光谱示于图1，其中括号中的数字是指对应于括号中数字的式的化合物。化合物的分析浓度是：(I),2.7mM；(II),2.5mM；(III),1.3mM；(IV),3.5mM；(V),2.9mM；(VI),2.7mM；和反-(±)-焦dach-2,3.5mM。
实施例8
体外疗效(Vitro Efficacy)和细胞存活试验(Cell Survival Assay)(克隆生成试验)(Clonogenic Assay)
为确定式(I)–(VI)的磷铂的相对活性，使用人卵巢癌细胞、人结肠癌细胞和人头颈癌细胞通过体外克隆生成试验测试每种立体异构体。人卵巢癌细胞A2780和A2780/C30(对30μM顺铂和100μM卡铂具有交叉抗药性)得自Dr.Thomas Hamilton(Fox Chase CancerCenter,宾夕法尼亚州费城)。使用在连续用5％CO2供气的37℃温育箱中补充以10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.25个单位/mL胰岛素和青霉素/链霉素(100个单位/mL)的RPMI 1640，以单层培养细胞。使用HBSS中的0.0625％胰蛋白酶对细胞进行传代培养(subcultured)以保持细胞处于指数细胞生长(exponential cell growth)。
采用克隆生成试验或细胞增殖试验(cell proliferation assay)来确定半抑制浓度(IC50)值。在克隆生成试验中，例如将来自单细胞悬浮液的500-700A2780细胞在用铂化合物处理前24小时接种(plated)到60mm皮氏培养液皿(petri plates)上以使细胞附着。在用上述合成实施例中所述的铂化合物进行处理的当天，轻轻倒出培养基，在三个不同的时间点将培养基替换成适当浓度的磷铂化合物(从50nM至75μM)，并将经处理的细胞放回37℃温育箱当中达24小时。对每一铂化合物浓度设置同样的三个平板。在处理24小时后，轻轻倒出含铂化合物的培养基并替换成新鲜的培养基。将这些平板返回37℃温育箱中达7天用于集落形成。
在CyQUANT细胞增殖试验中，通过使用细胞增殖试验试剂盒(Invitrogen)测量DNA含量来确定IC50值，所述试剂盒中含有绿色荧光染料，其在结合于细胞DNA时显示出较强的荧光强度。在这些实验中，在测量DNA含量前使所需数目的细胞暴露于不同浓度的磷铂达72小时。因为DNA含量正比于存活细胞的数目，所以该试验可提供增殖细胞的定量测量。该技术详细描述于Jones等人，“Sensitive determination of cellnumber using the CyQUANT cell proliferation assay”J.Immunol.Methods，第254卷，第85–98页(2001)。
克隆生成试验和/或CyQUANT细胞增殖试验的IC50数据汇总于表1-5中。在表1-5中，除给出实际误差值之处外，假定每一记录值的误差不大于记录值的±15％；并且除另有说明外，数据均获自克隆生成试验。
表1：磷铂化合物对人卵巢癌细胞系(lines)的IC50值：A2780，上皮人卵巢癌；和A2780/C30，对30μM顺铂和100μM卡铂具有抗药性的上皮人卵巢癌
表2：磷铂化合物对人卵巢癌细胞系的IC50值：OVCAR-10，对顺铂治疗具有抗药性的人卵巢癌；和OVCAR-5，晚期人卵巢癌细胞
表3：磷铂化合物对人头颈癌细胞系的IC50值：USMCC10b，人头颈癌细胞系；和UMSCC-10b/15s，对顺铂具有抗药性的人头颈癌细胞系
表4：磷铂化合物对人结肠癌细胞系(HT-29)的IC50值
表5：磷铂化合物对人癌细胞系的IC50值：A459，人肺腺癌细胞；U251，人成胶质细胞瘤癌细胞；PC-3，人转移性结肠癌细胞；SKMEL-2，人皮肤黑色素瘤癌细胞；MCF-7，人乳癌细胞；OVCAR-8，具有功能失调性p53的人卵巢癌细胞；和OVCAR-10，对顺铂治疗具有抗药性的人卵巢癌，均由上述的CyQUANT技术测定，该技术通过测量嵌入(intercalation)的荧光信号来直接测量DNA含量
另外还通过在以下细胞系中暴露144小时来测试这些异构化合物(isomericcompounds)：UMSCC10b、Panc-1、UMSCC15s、A2780/C30和HCC1806。当与外消旋反-(±)-焦dach-2相比时，异构体(1R,2R)-焦dach-2显示出出乎意料的优异活性。例如，与外消旋反-(±)-焦dach-2在胰细胞系Panc-1中的IC50值18.5(μM)相比，(1R,2R)-焦dach-2显示出1.7(μM)的IC50值；与外消旋反-(±)-焦dach-2在头颈癌细胞系UMSCC10b中的IC50值8.9(μM)相比，(1R,2R)-焦dach-2显示出0.3(μM)的IC50值；且与外消旋反-(±)-焦dach-2在乳癌细胞系HCC1806中的IC50值>30(μM)相比，(1R,2R)-焦dach-2显示出9.7(μM)的IC50值。
在反式异构体当中，克隆生成试验表明(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4异构体的活性分别远优于外消旋混合物反-(±)-焦dach-2和反-(±)-焦dach-4。例如，当使反-(±)-焦dach-4暴露于人卵巢癌细胞(A2780)达一小时时，发现IC50值为180±15μM；而对于(1R,2R)-焦dach-4在其它方面相同的实验条件(表1)下，发现相同细胞系的IC50为40±10μM。(1R,2R)-异构体长时间暴露于多种人癌细胞系产生低得多的IC50值，表明这些化合物具有作为有效抗癌药物的潜力。例如，由克隆生成试验，(1R,2R)-焦dach-2对人卵巢细胞的IC50值为500nM(0.5μM)，对抗药性的人头颈癌为2μM。
当暴露A2780细胞至少24小时时，对映纯(1R,2R)-焦dach-2和(1S,2S)-焦dach-2化合物两者在实验误差范围内显示出相等的活性。但当暴露细胞的时间段较短(例如1小时)时，观察到(1R,2R)-与(1S,2S)-形式之间的活性差。在较短时间暴露的情况下，与(1S,2S)-异构体相比，(1R,2R)-形式显示出优异的活性，表明(1R,2R)-异构体由细胞吸收较快。与(1R,2R)-或者(1S,2S)-形式相比，对于外消旋形式的较高IC50值可表明两种形式的自缔合(self-association)，这可能由细胞以降低的速率吸收。
对于新(de novo)的对顺铂具有抗药性的人卵巢癌(OVCAR-10)，(1R,2R)-焦dach-2显示出比(1S,2S)-焦dach-2更好的体外疗效。值得注意的是，在人卵巢癌细胞系OVCAR-10(表2和5)和OVCAR-8(表5)中，(1R,2R)-焦dach-2显示出显著优于顺铂的活性。
与其它化合物相比，顺式异构体显示出针对人卵巢癌(A2780)的优异活性。例如，在暴露于A2780细胞24小时后，顺-焦dach-2和顺-焦dach-4显示出IC50值分别为300nM和4μM，相比之下相应的(1R,2R)-焦dach-2或(1R,2R)-焦dach-4形式分别为1.0μM和18μM。要注意的是，在相同的条件下，顺铂和卡铂产生高得多的IC50值，即分别为5.0μM和>60μM。
不旨在受理论的约束或限制，预期的化学原理的教导是，外消旋形式的IC50值应等于(1R,2R)-异构体和(1S,2S)-异构体的各自IC50值的算术平均值。然而，如上表中所示，基于(1R,2R)-对映体和(1S,2S)-对映体的50/50混合物，外消旋形式(例如，A2780中的焦dach-2)的IC50值远高于预期。这些数据表明，由于不明确的原因，基于对映体的分布，外消旋形式的效力低于预期。一种似乎合理的解释可能是，外消旋形式自缔合，并因此不能由细胞有效地吸收。
在进一步的测试中，将细胞用铂化合物连续处理7天。固定集落并用4％甲醛中的2％结晶紫染色。记下含有超过50个细胞的集落。将来自三个同样平板的所记集落的数目进行平均，并将此数除以接种细胞数以得到形成集落的细胞分数(fraction)值。然后校正形成集落的细胞的这些分数值，方式是用所述分数除以在没有用铂化合物处理的平板中形成集落的细胞数目，获得接种效率。用A2780的集落形成数据示于图2。注意(1R,2R)-焦dach-2和(1S,2S)-焦dach-2对映体两者产生几乎相同的IC50值，(1R,2R)为1.0±0.1μM，且(1S,2S)为1.1±0.1μM，而外消旋混合物产生高得多的IC50值，为2.4±0.2μM，表示外消旋混合物效力较低。OVCAR-10的类似数据示于图3，比较了(1R,2R)-焦dach-2(RD2)、(1R,2R)-焦dach-4(RD4)、反-(±)-焦dach-2(T-D2)和反-(±)-焦dach-4(T-D4)。
临床研究已表明，奥沙利铂的(1R,2R)-对映体，参考与存在于本文中所述的磷铂相同的奥沙利铂中的1,2-二氨基环己烷载体配位体，显示出优于奥沙利铂的其它立体异构体的效力。与奥沙利铂相反，焦dach-2和焦dach-4两者的所有三种焦磷酸合异构体(即，(1R,2R)-、(1S,2S)-和顺式)针对多种癌症都是非常具有活性的。然而似乎没有普遍性的趋势。例如，如上面详述的那样，(1R,2R)-焦dach-2和(1S,2S)-焦dach-2在人A2780癌细胞中显示出几乎相等的IC50值，这是当将这些化合物暴露于细胞24小时的情况下得到的，而对于新的对顺铂具有抗药性的人卵巢癌(OVCAR 10)，(1R,2R)-焦dach-2显示出更好的体外疗效。另一方面，在所有的人卵巢癌细胞中，(1S,2S)-焦dach-4显示出优于(1R,2R)-焦dach-4的活性。与反式异构体相比，焦dach-2和焦dach-4的顺式异构体显示出针对人卵巢癌(A2780)的优异活性。因此，所述数据整体表明，与外消旋形式相比，用特定的异构体以较低的剂量，通过避免来自外消旋形式中存在的其它异构体的毒性，由此可以治疗一些特定的癌症。
实施例9
通过免疫荧光监测Fas过度表达
在2.5mL培养基中用得自Dr.Thomas Hamilton(Fox Chase Cancer Center，宾夕法尼亚州费城)的人卵巢癌细胞A2780和A2780/C30(对30μM顺铂和100μM卡铂具有交叉抗药性)接种在具有松弛的经预处理的盖玻片的六孔板中。在连续用5％CO2供气的37℃温育箱中使用补充以10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.25个单位/mL的胰岛素和青霉素/链霉素(100个单位/mL)(Fisher Scientific，宾夕法尼亚州匹兹堡)的RPMI 1640将细胞培养为单层。
用来自上述合成实施例的磷铂化合物之一对70％融合度的细胞处理1小时。然后将板用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)小心地洗涤两次，更换成常规的培养基，并在37℃下用5％CO2再温育1小时。用PBS洗涤盖玻片两次，并用新鲜制备的1％甲醛处理细胞，然后在室温下温育5至7分钟。将固定的细胞用PBS洗涤三次，并在4℃下用2％FBS/PBS封闭30分钟，随后用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤5分钟。
在室温下取下单独的盖玻片并翻转到在表面上的100μL的FAS一级抗体(Cell Signaling Technology Inc.,Danvers,MA)在5％BSA/1％乳/PBS中的1:100稀释液之上达1小时。随即将盖玻片转回至洁净的六孔板用于各次后续的洗涤，即用PBS洗涤三次，每次5分钟。将盖玻片再次翻转到另一洁净的表面上，并在室温下用100μL在5％BSA/1％乳/PBS中以1:500稀释的二级FITC-抗体温育1小时。然后用PBS洗涤盖玻片三次，每次5分钟。然后将湿润的盖玻片安装到具有安装培养基与DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的显微镜载片之上(Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁斯)，用于鉴定细胞核。使用荧光显微镜以10×、40×和100×的放大率进行显微镜检查。
实施例10
用于蛋白质表达的蛋白质印迹/免疫染色(Immunodecoration)
按12％SDS-PAGE电泳，在4℃用100V经1.5小时将蛋白质转移至PVDF膜。将膜用0.05％TWEEN-20和Tris-缓冲盐水(TBST)溶液洗涤，并用5％无脂干乳和1％BSA封闭。在4℃下将膜用所关注蛋白质的一级抗体的1:25,000稀释液温育过夜。用0.05％TBST洗涤膜，接着在相应的HRP-偶联抗体(1:40,000稀释)中温育。使用ECL-Advance化学发光系统(Amersham-GE Healthcare Biosciences,宾夕法尼亚州匹兹堡)显现蛋白质。
磷铂激活许多促凋亡和肿瘤抑制基因，如FAS、PTEN、PUMA、BAX等。蛋白质印迹实验证实了由这些基因转录的高蛋白质表达水平。例如，经反-(±)-焦dach-4暴露1小时至12小时，用反-(±)-焦dach-4处理的小鼠显示出FAS(高达25倍)、BAX(高达4倍)、PUMA(高达5倍)的上调和VEGFR的下调(高达50％)。同样，BCL2由RR-焦dach-2和RR-焦dach-4下调多达70％。此外，FAS、FADD和铂化合物共同定位于脂筏中。这些激活也与增加的鞘磷脂酶(Smase)表达有关，如增加的SMase的蛋白质表达所证实。
Smase将鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酰胆碱。在典型的实验中，以不同的时间间隔(从5分钟到2小时)使癌细胞(1×106)暴露于(1R,2R)-焦dach-2或(1R,2R)-焦dach-4(10μM)。将细胞离心，收集细胞裂解物并用冷的PBS洗涤。使用Amplex red试剂盒(Invitrogen)监测Smase活性。基于包括在试剂盒中的推荐方案进行试验。通常情况下，将11μL细胞裂解物悬浮在96孔板上的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH值5.0)中，并向每个孔中加鞘磷脂(5.0mM)。在37℃下将样本温育1小时。温育之后向每个孔中加入含有100mM Tris-HCl(100μM)、Amplex Red(2个单位/mL)辣根过氧化物酶、0.2个单位/mL胆碱氧化酶和8个单位/mL碱性磷酸酶的100μL Amplex Red反应溶液(pH值8.0)。然后在37℃下将样本温育30分钟。使用530nm至560nm的激发波长测量590nm处的荧光强度。从每个样本测量值中减去来自含有对照样本(未处理)的孔的荧光值。
实施例11
测定脂筏中的铂
在石墨炉原子吸收光谱仪(Perkin Elmer AA-600)上由通过使用0.1％HNO3中的铂标准物(Perkin Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)建立的校正曲线定量测定铂含量。将经处理的磷铂细胞用1mL冰冷的PBS和halt蛋白酶抑制剂PI(Pierce，伊利诺州罗克福德)洗涤4次，并在各次洗涤之间通过在4℃以1000×g离心收集团状物。将细胞团在250μL PBS/PI中培养，并通过采用微BCA方法(Pierce，伊利诺州罗克福德)测量蛋白质含量。使用以不同浓度制备的牛血清白蛋白(BSA)绘制标准曲线。将定量的蛋白质样本在浓HNO3中消化4小时，接着在分析之前用30％H2O2处理1小时。
实施例12
SCID小鼠中的毒性研究
在开始进行毒性试验前使4至5周龄的雌性SCID小鼠(c.b-17/LCR-Prkdc(SCID)/Crl，Strain Code 236r，Charles River Labs，Wilmington,MA)适应一周。通过无菌的26号针头和注射器对小鼠腹膜内(i/p)注射100μL在无菌过滤的PBS中的上述合成实施例中描述的磷铂化合物之一。注射剂量范围在5mg/kg至60mg/kg，并且是在第1天进行一次、在第3天进行一次和在第5天进行一次。
为评价磷铂化合物的毒性，每天记录不良事件(即，体重减轻>20％和/或摄食量变化、偏离正常行为、其它健康问题或死亡)。将在用磷铂化合物注射的小鼠中发生不良事件的频度和严重程度与小鼠对照组中的进行比较。给予对照组的是模拟注射(作为应激反应的对照)或由PBS(媒介物)组成的注射物。
对两组小鼠用市售的铂化合物处理用于比较，与磷铂化合物相比，其剂量基于先前公布的数据(即，顺铂为12mg/kg，卡铂为60mg/kg)。在研究结束时，用358mg/kg阿佛丁使所有的小鼠麻醉，并使用26号针头和结核菌素注射器，通过心脏穿刺收集血液。由此，通过在麻醉下放血将小鼠无痛致死。无痛致死后收获包括肝、脾、心、肺、卵巢和肾在内的器官，保存在10％福尔马林中，并以石蜡封存用于组织病理学检查。由熟练的病理学家检查组织特性的变化。
以最多40mg/kg的不同剂量用反-(±)-焦dach-2和反-(±)-焦dach-4对罹患卵巢肿瘤的SCID小鼠进行治疗，并且对肿瘤生长进行长达六周的监测，或者直到肿瘤尺寸变得如此之大而将这些动物处死。然后将用磷铂治疗的小鼠的肿瘤生长或消退与用顺铂治疗的小鼠(7mg/kg)和用卡铂治疗的小鼠(60mg/kg)进行比较。当肿瘤长到至少100mm3大小的尺寸时，隔日地施用三种剂量的铂化合物。然后利用下式计算总对数细胞杀灭和净对数细胞杀灭：
总对数细胞杀灭＝((T-C))/(3.32Td)
净对数细胞杀灭＝(T-C-治疗持续时间)/3.32Td
其中T和C是以天计的使肿瘤生长到指定尺寸的中值时间，且Td是以天计的使对照动物中的肿瘤尺寸加倍的中值时间。
发现对三剂量治疗方案记录的总对数细胞杀灭值大于3，且剂量为40mg/kg时的对数净细胞杀灭值大于2。相反，用顺铂(7mg/kg)治疗的小鼠虽然显示出肿瘤消退，但在7天内死亡。与反-(±)-焦dach-4相比，用卡铂治疗的小鼠(60mg/kg剂量)显示低得多的对数细胞杀灭值(小于2)。进一步增加卡铂剂量是不可能的，因为在60mg/kg剂量下群体超过50％已死亡。基于体外数据，据信顺-焦dach-2、顺-焦dach-4、(1R,2R)-焦dach-2且特别是(1R,2R)-焦dach-4将显示出比外消旋反-(±)-焦dach-4更好的效力。
实施例13
对卵巢癌细胞系A2780的体内疗效
在细胞培养物中生长稳定的克隆卵巢癌细胞系A2780，直至达到80-90％融合。使用胰蛋白酶(GIBCO/BRL,Grand Island,NY)分离粘附的细胞。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)彻底洗涤胰蛋白酶化细胞以除去胰蛋白酶。使用人卵巢癌A2780，通过SCID Hairless OutBred,SHO-PrkdcscidHrhr,(Charles River Labs,Wilmington,MA)小鼠中的皮下异种移植评价磷铂化合物的效力。在开始进行疗效试验前使4至5周龄的雌性SCID小鼠适应一周。
将癌细胞再悬浮于PBS中，并且除了阴性对照小鼠外，使用无菌26号针头和注射器，将所有的小鼠皮下注射PBS中的1×106个细胞/0.10mL至5×106个细胞/0.10mL，并评价肿瘤随时间的变化。每天检查小鼠的肿瘤生长。使用数显卡尺测量肿瘤。由式(W2×L)/2计算肿瘤体积，其中W是在最宽点的肿瘤测量值，且L是在最长点的肿瘤尺寸，其中以mm3表示的肿瘤的体积相当于以mg表示的重量。
皮下注射癌细胞大约2周后，肿瘤已达到可辨别的肿瘤尺寸(大约100-200mm3)，开始进行磷铂化合物施用或对照注射。在第1天对小鼠腹膜内施用一次磷铂化合物，在第3天再施用一次，并在第5天再施用一次。用磷铂化合物处理每组异种移植小鼠，并且用媒介物/安慰剂(PBS溶液)和模拟注射(作为应激反应的对照)处理匹配组。此外，两组小鼠用市售的铂化合物处理，用于与磷铂化合物进行比较，市售铂化合物的剂量基于先前公布的数据(即，顺铂为12mg/kg，卡铂为60mg/kg)。
通过测量体重减轻/增加和摄食量而每天监测异种移植SCID小鼠健康的任何不良事件。当肿瘤尺寸超过3000mm3时停止测量并结束研究。在研究结束时，用358mg/kg阿佛丁麻醉小鼠，并使用26号针头和结核菌素注射器通过心脏穿刺收集血液。由此，通过在麻醉下放血将小鼠无痛致死。无痛致死后收获包括肝、脾、心、肺、卵巢和肾在内的器官，保存在10％福尔马林中，并以石蜡封存用于组织病理学检查。由熟练的病理学家检查组织特性的变化。
(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4在小鼠异种移植模型(免疫功能低下的NIHIII小鼠)中针对人卵巢癌A2780的疗效数据汇总于图4。在试验中，每隔一天对小鼠进行治疗达三天(“qodx3”)--在第1天一次，在第3天一次，且在第5天一次。特别地，用40mg/kg的(1R,2R)-焦dach-2、10mg/kg的(1R,2R)-焦dach-4或5mg/kg的顺铂处理小鼠。图4的图例中的数字N记录的是试验数，其上显示的数据点是作为平均值得出的。图4中的数据从头十天用(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4治疗清楚地显示出在治疗初始阶段期间的肿瘤消退。
实施例14
对人卵巢癌和人头颈癌的体内疗效
已知人卵巢癌(OVCAR-10)表现出对顺铂和卡铂两者具有抗药性。分别在细胞培养物中生长稳定的人克隆卵巢癌细胞系OVCAR-10和头颈癌UMSCC10b，直至达到80-90％融合。使用胰蛋白酶(GIBCO/BRL,Grand Island,NY)以分离粘附的细胞。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)彻底洗涤胰蛋白酶化细胞以除去胰蛋白酶。通过在SCID Hairless OutBred,SHO-PrkdcscidHrhr,(Charles River Labs,Wilmington,MA)小鼠、NIH(NIH III:NIHBNX-F；NIHS-Lystbg Foxn1nu Btkxid,4周龄雌性，Taconic(Rensselaer,NY)小鼠中皮下植入人OVCAR-10和UMSCC-10b异种移植物评价磷铂化合物的效力。
在开始进行疗效试验前使4-5周龄的雌性SCID/NIH小鼠适应一周。将癌细胞再悬浮于PBS中，并且除了阴性对照小鼠外，将所有的小鼠皮下注射PBS中的1×106个细胞/0.10mL至5×106个细胞/0.10mL。评价肿瘤尺寸随时间的变化。每天检查小鼠的肿瘤生长。使用数显卡尺测量肿瘤。由式(W2×L)/2计算肿瘤体积，其中W是在最宽点的肿瘤测量值，且L是在最长点的肿瘤尺寸，其中以mm3表示的肿瘤的体积相当于以mg表示的重量。
皮下注射癌细胞大约2周后，肿瘤已达到可辨别的肿瘤尺寸(大约100mm3至200mm3)，腹膜内施用所需剂量的磷铂化合物。这些施用在第1天进行一次，在第3天进行一次，并在第5天进行一次。
用磷铂化合物处理每组异种移植小鼠，并且用媒介物/安慰剂(PBS溶液)和模拟注射(作为应激反应的对照)处理匹配组。此外，两组小鼠用市售的铂化合物处理，用于与磷铂化合物进行比较，市售铂化合物的剂量基于先前公布的数据(即，顺铂为12mg/kg，卡铂为60mg/kg)。通过测量体重减轻/增加和摄食量而每天监测异种移植SCID小鼠/NIH健康的任何不良事件。当肿瘤尺寸超过3000mm3时停止测量并结束研究。
在研究结束时，用358mg/kg阿佛丁麻醉小鼠，并使用26号针头和结核菌素注射器通过心脏穿刺收集血液。通过在麻醉下放血将小鼠无痛致死。无痛致死后收获包括肝、脾、心、肺、卵巢和肾在内的器官，保存在10％福尔马林中，并以石蜡封存用于组织病理学检查。由熟练的病理学家检查组织特性的变化。
与PBS/碳酸氢盐对照相比，(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4针对人卵巢癌细胞OVCAR-10的疗效数据汇总于图5。当肿瘤达到100–200mm3的尺寸时施用(40mg/kg体重)剂量。处理的小鼠在治疗时间期间显示出肿瘤消退。对于qodx3施用的对照(PBS/碳酸氢盐)、以60mg/kg进行qodx3施用的卡铂和以40mg/kg进行qdx3施用的(1R,2R)-焦dach-4，肿瘤尺寸随时间推移的测量值汇总于图6。虚线箭头突出平均肿瘤尺寸达到1000mm3的时间(以天表示，必要时内插)。与对照相比，尽管卡铂显示出只有约125％的增加寿命的百分比(％ILS)，但(1R,2R)-焦dach-4显示出％ILS为约209％。
(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4针对人头颈癌UMSCC10b的疗效数据汇总于图7。剂量是qodx3和/或qdx4施用的，范围从10mg/kg体重至40mg/kg体重。将这些效力与外消旋形式反-(±)-焦dach-4进行比较。当肿瘤达到100–200mm3的尺寸时施用剂量。
实施例15
(1R,2R)-焦dach-2和(1R,2R)-焦dach-4的最大耐受剂量
为确定最大耐受剂量，对(1R,2R)-焦dach-2、(1R,2R)-焦dach-4、反-(±)-焦dach-4、反-(±)-焦dach-4、顺铂和卡铂进行毒性实验。在4-5周龄雌性ICR(CD-1)小鼠，Taconic(Rensselaer,NY)中施用从10mg/kg至100mg/kg逐步增加的剂量。小鼠体重在15g与24g之间。按三剂量治疗方案每隔一天对小鼠注射磷铂之一。总体重减轻20％或更多、外观不旺、体重不增、其它可观察到的健康问题、偏离正常行为或死亡被认为是不良事件。
在10mg/kg的较低剂量下，未观察到体重减轻。对于所有的磷铂化合物，在高达40mg/kg的最高剂量下未观察到死亡或体重减轻超过20％。可将这些结果与顺铂的情况进行比较，此时在12mg/kg的剂量下100％的小鼠死亡，并与卡铂的情况进行比较，此时在60mg/kg的剂量下观察到33％死亡。在100mg/kg的较高剂量下，在施用十五天之内，所有的小鼠要么体重减轻超过20％，要么死亡。
实施例16
来自实时PCR实验的定量基因表达
进行定量实时PCR实验以评价一些靶向基因的表达。在有或没有顺铂、(1R,2R)-焦dach-4和反-(±)-焦dach-4的RPMI 1640中培养人上皮卵巢癌细胞(A2780)和对顺铂具有抗药性的细胞(A2780/C30)达0、3、12和24小时。在37℃下用5％CO2将经处理和未经处理的癌细胞两者保持在含10％胎牛血清、2μmolL-谷氨酰胺、100个单位/mL青霉素-链霉素和0.25个单位/mL胰岛素溶液的RPMI 1640培养基中。从经处理和未经处理的细胞两者中分离RNA。经处理的细胞是在将细胞按从三小时至24小时的不同时间间隔以磷铂的IC50值浓度暴露后收获的细胞。
用不含脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶(QIAGEN Sciences)处理RNA样本以除去DNA。然后根据制造商的说明使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA。通过UV光谱法(NanoDrop 2000Thermo Scientific,Wilmington,DE)确定RNA的数量和纯度。采用最小吸光度比例系数(在260nm测得的吸光度与在280nm测得的吸光度之比)为1.9作为可接受的纯度。
将分离的RNA样本保存在-80℃，并使之经历最小冻融循环以保持RNA完整性。在相同的反应孔中对靶基因和内源对照(β-肌动蛋白)采用基因表达测定进行双工实时PCR。内源对照是用于对靶mRNA进行标准化的参考。最初采用不同的cDNA浓度进行这些链反应以确定检测关注基因所需的最佳cDNA浓度。用蓝染料(FAM，吸收：494nm，发射：518nm)标记靶基因，而将参考基因用绿染料(VIC，吸收：538nm，发射：554nm)标记。选择cDNA浓度，使得对于靶基因的阈值循环(Ct)值在17和32之间，对通过用于测量的ABI StepOnePlusTM仪器的荧光检测最敏感。
确定阈值循环数(Ct)，在该点qPCR反应的荧光刚好超过检测系统的阈值荧光。这些Ct值用于比较靶基因和内源对照的水平。按根据以下关系式由ΔCt和ΔΔCt值计算的倍数变化(2-ΔΔCt)记录定量基因表达：ΔCt＝(Ct靶-Ct参考)和ΔΔCt＝(ΔCt)时间X–(ΔCt)时间零(对照)。对照样本(未经处理)的倍数表达仍然等于1，因为ΔΔCt的值＝0，且因此20＝1。
本申请不应被认为局限于本文描述的具体实施例和实施方案，而是应该被理解为涵盖本发明的所有方面。可应用于本发明的各种修改、等效过程以及诸多的结构和装置对本领域技术人员来说是显而易见的。本领域技术人员可理解的是，可以做出各种改动而不偏离本发明的范围，且本发明的范围不能被认为局限于说明书中的描述。
Claims (5)
1.一种磷铂络合物，选自：
(i)具有对映体过量大于75％的式(I)的(1R,2R)-焦dach-2或式(II)的(1S,2S)-焦dach-2的对映体富集的焦dach-2：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；和
(ii)具有对映体过量大于75％的式(IV)的(1R,2R)-焦dach-4或式(V)的(1S,2S)-焦dach-4的对映体富集的焦dach-4：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
2.根据权利要求1所述的磷铂络合物，由具有对映体过量大于90％的(1R,2R)-焦dach-2的对映体富集的焦dach-2组成。
3.根据权利要求1所述的磷铂络合物,由具有对映体过量大于90％的(1S,2S)-焦dach-2的对映体富集的焦dach-2组成。
4.根据权利要求1所述的磷铂络合物,由具有对映体过量大于90％的(1R,2R)-焦dach-4的对映体富集的焦dach-4组成。
5.根据权利要求1所述的磷铂络合物,由具有对映体过量大于90％的(1S,2S)-焦dach-4的对映体富集的焦dach-4组成。
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