CN108186641B - Gsk2193874在制备抗胶质瘤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了瞬时感受器电位辣椒素4型(TRPV4)的特异性口服抑制剂GSK2193874在制备抗胶质瘤的药物中的应用，扩大了GSK2193874的应用范围，提高了其应用价值，给胶质瘤的治疗带来了新的希望，并且以GSK2193874作为先导化合物，通过结构修饰或改造提高活性或降低副作用，还有助于进一步开发新的抗胶质瘤的药物。
Description
技术领域
本发明属于含有机有效成分的医药配制品技术领域，涉及GSK2193874在药物制备领域的新用途。
背景技术
胶质瘤是颅内最常见的恶性程度较高的原发肿瘤，病死率极高，大多数患者在诊断后一年内死亡。该病的治疗最大障碍是胶质瘤本身的特征——弥漫性侵袭。这一特性使得肿瘤不能完全通过外科手术切除以及放、化疗等手段完全治愈。因而针对胶质瘤侵袭的研究众多，而且抑制胶质瘤的侵袭能够为完全切除肿瘤创造机会，很大程度地改善患者预后，延长生存时间，但目前临床上仍未有针对胶质瘤侵袭特别有效的治疗手段。
瞬时感受器电位辣椒素4型(TRPV4:transient receptor potential,vanilloidtype 4)属于TRP超家族的一员，为非选择型阳离子通道受体。GSK2193874是新发现的高效特异且口服有效的TRPV4阻滞剂，目前作为一种科学研究试剂，主要用于TRPV4的阻断后效应的研究。迄今为止，尚无文献报道TRPV4及其阻滞剂GSK2193874在胶质瘤中的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于考察TRPV4及其阻滞剂GSK2193874对胶质瘤的作用，以期开发出新的抗胶质瘤的药物，从而为胶质瘤的临床治疗提供更多有效的备选药物。
本发明研究发现，GSK2193874作为TRPV4的阻滞剂，具有明显抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的功能，主要通过降低细胞外基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性以及增加细胞间紧密连接(ZO-1和Occludin)的途径进而抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭，在进一步的胶质瘤动物模型实验中也证实了上述结论。
因此，本发明提供如下技术方案：
GSK2193874在制备抗胶质瘤的药物中的应用。
进一步，所述抗胶质瘤是抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
进一步，所述抗胶质瘤是通过抑制MMP-9的活性和增加细胞紧密连接进而抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
本发明的有益效果在于，本发明公开了TRPV4的阻滞剂GSK2193874用于制备抗胶质瘤的药物的新用途，不仅扩大了GSK2193874的应用范围，提高了其应用价值，给胶质瘤的治疗带来了新的希望，并且以GSK2193874为先导化合物，通过结构修饰或改造提高活性或降低副作用，还有助于进一步开发新的抗胶质瘤的药物。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1显示了GSK2193874能够有效抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭，其中A为划痕实验结果，B为Transwell小室穿透实验结果。
图2显示了GSK2193874在胶质瘤细胞中能够抑制MMP-9的活性和增加细胞紧密连接进而抑制细胞的迁移和侵袭，其中A为100nM的GSK2193874处理胶质瘤细胞后的免疫蛋白印记实验结果，B为100nM的GSK2193874处理胶质瘤细胞后的免疫荧光染色实验结果。
图3显示了GSK2193874在皮下接种和原位接种的鼠模型上具有抑制胶质瘤的侵袭的功能，其中A为小鼠皮下成瘤的肿瘤实体和肿瘤体积示意图，B为小鼠颅内成瘤磁共振检测结果以及体积示意图，C为颅内原位成瘤的小鼠大脑的HE染色结果，D为颅内原位成瘤的小鼠生存曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
一、GSK2193874能够有效抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭
通过划痕实验与Transwell小室穿透实验检测GSK2193874对胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响。
划痕实验：用0.25％的胰酶消化胶质瘤细胞(U87细胞)，计数适量的细胞数用完全培养基重悬后，加入6孔板中培养，至次日细胞完全贴壁后，PBS洗去漂浮细胞，分为两组(GSK2193874组和DMSO组)，每组3个孔，每孔作3条划痕(用10μl移液器套枪头以直倚靠作划痕)，GSK2193874组每孔加入50nM的GSK2193874(以DMSO为溶剂)，DMSO组每孔加入等体积的溶剂DMSO，两组每孔再加入无血清F12/DMEM培养基继续培养，分别于划痕后0小时和24小时于显微镜下拍照，每孔随机选取5个视野，利用Image J分析细胞划痕的愈合面积。结果见图1中A，胶质瘤细胞经50nM的GSK2193874处理24小时后，划痕面积缩小了(4.4±0.3)％；而DMSO组划痕愈合情况良好，面积缩小了(16.5±2.3)％，经GSK2193874处理后细胞的迁移能力较DMSO组明显减少(p<0.01)。
Transwell小室穿透实验：用0.25％的胰酶消化胶质瘤细胞(U87细胞)，计数适量的细胞数用无血清培养基重悬，使细胞密度达到1×105个/ml；实验分为3组：GSK(50nM)组、GSK(100nM)组和DMSO组，每组3个小室(8.0μm孔径)，每个预包被基质胶的小室的上室内加入上述细胞悬液200μl，GSK(50nM)组的下室内加入10％血清培养基600μl和50nM的GSK2193874(以DMSO为溶剂)，GSK(100nM)组的下室内加入10％血清培养基600μl和100nM的GSK2193874(以DMSO为溶剂)，DMSO组的下室内加入10％血清培养基600μl和等体积的溶剂DMSO，24小时后取出小室，用棉签将小室内的基质胶和未穿过的细胞全部擦除，将小室放入4％多聚甲醛内固定15分钟，PBS洗涤2次，甲醇通透10分钟，PBS洗涤2次，结晶紫染色5分钟，PBS洗涤2次，将小室倒扣晾干后，小心取下小室下端的膜，用中性树脂封片，于显微镜下观察，随机采取5个视野的图像，Image-pro-plus 6.0计数细胞。结果见图1中B，经过24小时后，DMSO组、GSK(50nM)组和GSK(100nM)组的胶质瘤细胞穿过Transwell微孔的细胞数量分别是411.67±24.53、83.00±5.70和12.67±1.48，可见经过GSK2193874处理后胶质瘤的侵袭能力明显降低(p<0.01)。
二、GSK2193874通过抑制MMP-9的活性和增加细胞间紧密连接进而抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭
通过western-blot免疫蛋白印记实验检测GSK2193874处理胶质瘤细胞后细胞内MMP-9和细胞连接蛋白ZO-1和Occludin的表达变化。通过免疫荧光染色实验检测GSK2193874处理胶质瘤细胞后细胞的MMP-9和细胞连接蛋白ZO-1和Occludin改变。
Western-blot免疫蛋白印记实验：分别用100nM的GSK2193874(以DMSO为溶剂)和DMSO处理胶质瘤细胞(U87细胞)，RIPA细胞裂解液加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂PMSF混匀后提取细胞总蛋白，测定浓度后电泳、转膜、封闭，分别用MMP-9、ZO-1和Occludin的抗体进行免疫杂交，孵二抗后显示条带，用Image-J软件计算条带灰度值，绘制曲线。结果见图2中A，用100nM的GSK2193874处理胶质瘤细胞后，细胞内的MMP-9的蛋白水平表达明显降低，而细胞连接蛋白ZO-1和Occludin的蛋白水平明显升高。
免疫荧光染色实验：用细胞共聚焦培养皿培养2000个胶质瘤细胞(U87细胞)，至正常生长状态后，分别给予100nM的GSK2193874(以DMSO为溶剂)和DMSO处理细胞过夜，用4％多聚甲醛固定细胞，0.3％Trixton-100通透细胞，5％BSA封闭半小时，分别用MMP-9、ZO-1和Occludin抗体(稀释度为1:100)避光4℃孵育过夜，次日去除抗体孵育液，PBS洗涤3次，用FITC标记的二抗(稀释度为1:200)室温下孵育2小时，PBS洗涤3次，用DAPI室温下避光染色5分钟，PBS洗涤3次，于共聚焦显微镜下观察拍照。结果见图2中B，用100nM的GSK2193874处理胶质瘤细胞后，细胞内的MMP-9的蛋白水平表达明显降低，而细胞连接蛋白ZO-1和Occludin的蛋白水平明显升高。
三、GSK2193874在皮下接种和原位接种的鼠模型上具有抑制胶质瘤迁移和侵袭的功能将4周龄的裸鼠随机分成三组(低剂量GSK2193874组，高剂量GSK2193874组和DMSO组)，每组2只，每只裸鼠皮下注射1×105万个胶质瘤细胞(U87细胞)，7天后开始给予荷瘤小鼠灌胃给药，低剂量GSK2193874组按0.005mg/kg/day的剂量给予GSK2193874(以DMSO为溶剂)，高剂量GSK2193874组按0.05mg/kg/day的剂量给予GSK2193874(以DMSO为溶剂)，DMSO组给予等体积的溶剂DMSO，连续给药21天，期间每日观察三组裸鼠的生活状态，每周用游标卡尺测量并记录裸鼠的皮下肿瘤体积大小，将体积大小汇总制作肿瘤体积大小变化曲线，最后处死裸鼠，解剖出皮下肿瘤拍照。结果见图3中A，低剂量GSK2193874组较DMSO组的肿瘤体积明显减小，而高剂量GSK2193874组裸鼠的肿瘤体积大小较DMSO组和低剂量GSK2193874组均明显减小。
将4周龄的裸鼠随机分成两组(GSK2193874组和DMSO组)，每组5只，每只裸鼠颅内原位注射1×106万个胶质瘤细胞(U87细胞)，3天后开始给予荷瘤小鼠灌胃给药，GSK2193874组按0.05mg/kg/day的剂量给予GSK2193874(以DMSO为溶剂)，DMSO组给予等体积的溶剂DMSO，连续给药20天，于给药后1、6、11、17天用小动物磁共振检测颅内肿瘤大小，每日观察两组裸鼠的生活状态，记录裸鼠死亡时间，至最后1只裸鼠死亡为止，绘制裸鼠生存曲线，然后将每只死亡裸鼠进行解剖，取出整块大脑，切片，再进行HE染色。磁共振检测显示，经GSK2193874处理的裸鼠颅内移植瘤的侵袭性生长的体积明显小于DMSO组(图3中B)。HE染色结果显示，GSK2193874组裸鼠大脑中，胶质瘤向正常脑组织的迁移明显受到抑制(图3中C)。生存曲线显示，GSK2193874能够明显地延长荷瘤小鼠的生存时间(P<0.01)(图3中D)。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.GSK2193874在制备抗胶质瘤的药物中的应用，其特征在于，所述GSK2193874的结构式如式I所示：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗胶质瘤是抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗胶质瘤是通过抑制基质金属蛋白酶9的活性和增加细胞紧密连接进而抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
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| TRPV4 antagonist GSK2193874 does not modulate cough response to osmotic stimuli.;Tomas Buday等;《Respiratory Physiology & Neurobiology》;20161029;第236卷;第1-4页，特别是摘要 * |
| TRPV4 participates in the establishment of trailing adhesions and directional persistence of migrating cells.;Sanela Mrkonjić等;《Pflugers Arch - Eur J Physiol 》;20151231;第467卷;第2107-2119页，特别是题目，摘要，第2111页左栏倒数第3行，第2108页左栏倒数第5行 * |
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