CN108181459A - 基于核酸适配体的微囊藻毒素lr的微悬臂梁阵列检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的方法，所述方法包括以下步骤：将能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上；使固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列与样品溶液接触；检测固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列在与所述样品溶液接触后产生的弯曲变形。本发明还提供用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的微悬臂梁阵列和系统。

Description

基于核酸适配体的微囊藻毒素LR的微悬臂梁阵列检测方法

技术领域

本发明涉及水体环境污染检测领域，特别是涉及一种基于表面应力效应微悬臂梁阵列传感器，使用适配体作为探针分子检测微囊藻毒素LR的方法。

背景技术

微囊藻毒素(microcystin，MC)是一类主要由蓝藻产生的具有生物活性的环状七肽化合物，这种化合物在水体富营养化导致水华时可由蓝藻细胞大量产生，当藻细胞衰老、死亡和破裂时，MC会被释放到水体中。人体直接接触含有毒素的水，可引起过敏和急性胃肠炎。MC是一种强烈的肝毒素，它能够强烈抑制蛋白磷酸酶活性，可以导致肝脏损伤出血和坏死。MC还是一种潜在的肿瘤促进剂，长期饮用含微量微囊藻毒素的水源会引起肝癌等疾病。动物通过接触或饮用含有MC的水会出现腹泻、呕吐、呼吸急促等症状，甚至死亡。MC可通过食物链富集，而且还表现出遗传毒性。它对水体环境和人类健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。世界卫生组织提出的饮用水中MC含量的允许标准为1ug/L。迄今已经发现了超过80种MC，其中微囊藻毒素LR(MC-LR)是最常见、毒性最强一种。

目前已有多种检测MC-LR的方法，常用的检测方法有生物检测法，高效液相色谱法，酶联免疫检测和蛋白磷酸酶抑制试验等方法。但这些方法各有缺点，如生物检测法需要具备一定的实验条件和专业知识才能进行，该方法实验周期长、灵敏度低、容易出现假阳性；液相色谱法检测灵敏度高，但是所用仪器昂贵，需专业操作知识才能使用，样品需要复杂的预处理过程；酶联免疫检测方法和蛋白磷酸酶抑制试验方法灵敏度高，但都不能分辨MC异构体。因此发展无标记、快速、灵敏度高、经济高效的MC-LR检测方法是很有必要的，对水体环境安全领域具有重要意义。

基于表面应力效应的微悬臂梁(简称微梁)传感技术是在原子力显微镜的基础上发展起来的一种技术。在实验中，探针分子被修饰在微悬臂梁的表面。当目标分子与探针分子在微悬臂梁表面发生生物或者化学反应时，其表面应力会发生变化，从而导致微悬臂梁发生弯曲变形。通过光学或者电学方法检测这种弯曲变形，可以得到反应的信息。相比于传统的传感技术，微梁传感技术不需要分子标记，灵敏度高，响应快速，可以实时监测实验的全过程。

核酸适配体是一段具有分子识别能力的DNA或者RNA的序列，通常可以通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从核酸分子库中筛选得到。其分子识别模式与抗体非常相似，能够与特定的分子结合，并且具有很高的亲和性和特异性。适配体由体外方法获得，可以结合相比于抗体更多的靶标分子，如剧毒的分子等。适配体通过化学合成和纯化，在合成过程中可以修饰需要的化学基团，化学稳定性远优于抗体，活性均一，受环境因素影响小，易存储，价格便宜，同时灵敏度也极高，是检测小分子的理想探针分子。适配体与靶目标结合时产生强烈构象变化，空间变形明显，能够与微梁传感器结合使用。

在MC-LR检测领域，悬臂梁传感技术在动态模式下使用其对应的抗体已有研究报道，但是尚未有使用适配体作为探针分子在基于应力模式下微梁传感平台进行检测的报道。

发明内容

在本发明中，发明人提出使用修饰有DNA适配体的微悬臂梁阵列对MC-LR进行检测，取得了很高的灵敏度，还能够将MC-LR从不同的异构体中区分出来，表现出极强的特异性，并且可以在实际样品自来水中进行有效检测。

本发明提供了一种基于核酸适配体的微悬臂梁阵列传感器，可以对微囊藻毒素LR进行实时定量检测，有很高的灵敏度和特异性，并且能够对实际样品进行检测，满足国家对水体中微囊藻毒素LR检测的标准。

本发明提出了基于MC-LR对应适配体的微悬臂梁阵列用于检测MC-LR的方法，利用微悬臂梁的高灵敏度和DNA适配体与MC-LR的特异性结合，进行实时快速检测，并且将此技术应用于实际样品自来水中MC-LR的检测。

为了实现该技术目标，主要的技术方案为：

1)微悬臂梁阵列的修饰

当DNA适配体和MC-LR在微梁表面发生分子结合反应时，产生的应力变化会导致微悬臂梁的弯曲，原理如图1所示。为了达到检测的目的，发明人需要将适配体固定在微梁的镀金表面。

实验中使用的能够与MC-LR特异结合的适配体序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGC GCCAAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3′(A.Ng,R.Chinnappan,S.Eissa,H.Liu,C.Tlili,M.Zourob.Selection,characterization,and biosensing application of high affinity congener-specific microcystin-targeting aptamers.Environ.Sci.Technol.46(2012)10697-703)，在合成过程中修饰巯基，可以与微悬臂梁的金层发生化学反应从而结合。将新的微梁阵列进行清洗，然后用适配体修饰微梁阵列，使适配体固定在微梁镀金表面。在下一步中，使用6-巯基-1-己醇(6-mercapto-1-hexanol，MCH)对微梁阵列镀金表面进行封闭，MCH带有巯基，也可以与金表面发生反应，填充微梁金层未修饰适配体的位置。

2)使用微梁阵列对MC-LR的检测

将修饰好的微悬臂梁阵列固定在反应池中，流入缓冲液，以固定流速流动。激光照射在微悬臂梁的尖端，微悬臂梁尖端的弯曲会导致反射光的偏转，反射光斑位置信号由光电位置敏感器(PSD)接收，如图2所示。微悬臂梁阵列检测仪器示意图见图3。当微悬臂梁阵列在缓冲液中达到平稳状态后，MC-LR溶液被加入反应池中，微梁阵列产生的偏转情况被实时监测并记录。

对微梁阵列进行适配体修饰的方法中，一个阵列梁通常包括多跟悬臂梁，对一个阵列中的其中几个悬臂梁修饰适配体作为实验梁，而将剩余其他梁只使用MCH进行封闭作为参考梁的修饰方式亦属于本发明的保护范围。

本发明使用基于表面应力效应的微悬臂梁阵列，使用适配体作为探针分子来检测微囊藻毒素MC-LR，优点有：

1)微梁传感技术不需要荧光或者分子标记，操作简便。

2)微梁光学读出技术能检测很小的位移，并且适配体和MC-LR的结合很高效，实验灵敏度高。

3)适配体与MC-LR的结合具有很高的特异性，能够区分MC-LR与其他异构体，而常用的免疫检测方法(如酶联免疫方法只能检测总量，不能区分类型)。

4)在适配体的合成过程中，可以将巯基连接在适配体一端。相比已有的抗体修饰方法，微悬臂梁表面修饰适配体的过程只需一步，简便易行。

5)相比于抗体，适配体的合成简单，价格便宜，并且稳定性好，易于存储。

6)微梁阵列传感器可以对同一阵列中的不同微梁进行区别修饰，可以在实验中同时检测实验梁和对比梁的偏转，消除实验环境造成的不利影响。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的方法，所述方法包括以下步骤：

将能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上；

使固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列与样品溶液接触；以及

检测固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列在与所述样品溶液接触后产生的弯曲变形。

2.根据1所述的方法，其中所述核酸适配体是DNA适配体。

3.根据1所述的方法，其中所述DNA适配体的序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′。

4.根据1所述的方法，其中通过微悬臂梁传感系统检测所述弯曲变形，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。

5.根据1所述的方法，所述方法还包括在将所述核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上后用封闭剂对微悬臂梁阵列表面进行封闭的步骤。

6.根据5所述的方法，其中所述封闭剂是6-巯基1-己醇。

7.一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的系统，所述系统包括表面固定有能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体的微悬臂梁阵列、反应池和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。

8.根据7所述的系统，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′。

9.一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的微悬臂梁阵列，所述微悬臂梁阵列表面固定有能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体。

10.根据9所述的微悬臂梁阵列，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′。

附图说明

图1为微梁镀金表面修饰MC-LR适配体和MC-LR结合反应导致微梁弯曲原理示意图。

图2为微梁传感器的光学读出原理。

图3是微梁阵列传感系统示意图。

图4为不同浓度MC-LR引起的微梁阵列平均偏转值。

图5为微梁阵列分别对不同MC异构体检测的平均偏转结果。

具体实施方式

实施例1、微悬臂梁阵列的修饰过程

实验1DNA适配体在微悬臂梁阵列上的修饰

1)清洗：将未使用的微梁阵列(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中，加入Piranha Dip溶液(V(H₂O₂):V(H₂SO₄)＝1:3)中浸泡数分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；

2)修饰适配体：将清洗过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入DNA适配体溶液中，室温培育3小时。然后用缓冲液(缓冲液含50mM Tris-HCl，150mM NaCl以及2mM MgCl₂，pH＝7.5)清洗；

3)封闭：修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入1mM MCH，培育30分钟。然后以缓冲液清洗，氮气吹干。得到修饰好的微悬臂梁阵列。

实验2无DNA适配体的微悬臂梁阵列修饰过程

1)清洗：将未使用的微悬臂梁阵列(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中，加入Piranha Dip溶液(V(H₂O₂):V(H₂SO₄)＝1:3)中浸泡数分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；

2)封闭：修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入1mM MCH溶液，室温培育30分钟。然后用缓冲液清洗，氮气吹干。得到修饰好的微悬臂梁阵列。

实施例2、使用微梁阵列传感器对MC-LR的检测

1)固定微梁阵列：将上述实施例1实验1中修饰有适配体的微梁阵列固定于系统的反应池中，加入缓冲液，流动液体排除反应池中的气泡。

2)调节系统光路：调节激光器、反应池与PSD的位置，使八根激光都能照射在微梁阵列中各梁尖端并且反射至PSD的靶面。

3)样品检测：调整注射泵，以1μL s^-1的速度流动缓冲液，实时监测微梁阵列各梁的偏转情况。当检测到的各梁实时曲线趋于稳定后，加入含一定浓度MC-LR的缓冲液，实时采集和记录微梁阵列的偏转数据。

使用购于Sigma-Aldrich的浓度为100μg mL^-1的MC-LR标准样品，与缓冲液配制成不同浓度的MC-LR溶液，分别为1、10、20、50、100和500μg L^-1。重复上述实验过程，得到不同浓度下微梁阵列平均偏转的曲线(图4)，在85min时不同浓度MC-LR对应产生的偏转量分别为：12、30、46、109、170nm，MC-LR的浓度越高，微梁的偏转量越大。使用实施例1实验2中得到的无适配体修饰的微梁阵列重复上述实验，实验中MC-LR的浓度为500μg L^-1，得到数据见图4，微梁阵列没有产生明显的偏转，说明未修饰适配体的微梁对MC-LR没有响应。以上结果表明，修饰了适配体的微梁阵列能够实现对MC-LR的特异、定量检测。

实施例3、使用微梁阵列传感器对两种MC异构体的检测

使用购于Sigma-Aldrich的浓度为100μg mL^-1的MC-LA，YR标准样品，与缓冲液配制成浓度均为100μg L^-1的各对应样品。重复实施例2中的实验过程，依次使用上述配制的浓度为100μg L^-1三种样品MC-LR，LA，YR进行检测实验，得到的数据见图5。从图5可以看出，在85min时，修饰了MC-LR适配体的微梁阵列对浓度为100μg L^-1的三种样品MC-LR，LA，YR产生的平均偏转量依次为123、49、34nm，微梁对MC-LR的偏转量明显大于对其他两种样品的偏转量，可以将微梁对MC-LR的检测结果与另两种样品的检测结果区分开来，一定程度说明了该修饰了适配体的微梁阵列具有将MC-LR从它的异构体中区分出来的能力。

实施例4、实际样品自来水中MC-LR的检测

使用自来水作为MC-LR稀释液，将100mg mL^-1的MC-LR标准样品溶于自来水中配制成浓度为20μg L^-1的MC-LR的自来水样品。使用该样品重复实施例2中的实验过程，得到修饰有MC-LR适配体的微梁阵列传感器在自来水样品中的检测结果(图4)。修饰了适配体的微梁阵列，对含浓度为20μg L^-1的MC-LR的缓冲液样品及自来水样品，产生的偏转量几乎相等，后者对应的偏转量约为前者对应偏转量的93％。该结果表明，该适配体微梁阵列传感器具有检测实际水样品中MC-LR含量的能力。

Claims (10)

1.一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的方法，所述方法包括以下步骤：

将能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上；

使固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列与样品溶液接触；以及

检测固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列在与所述样品溶液接触后产生的弯曲变形。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸适配体是DNA适配体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA适配体的序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′。

4.根据权利要求1所述的方法，其中通过微悬臂梁传感系统检测所述弯曲变形，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在将所述核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上后用封闭剂对微悬臂梁阵列表面进行封闭的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述封闭剂是6-巯基1-己醇。

7.一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的系统，所述系统包括表面固定有能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体的微悬臂梁阵列、反应池和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。

8.根据权利要求7所述的系统，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′。

9.一种用于检测样品溶液中的微囊藻毒素LR的微悬臂梁阵列，所述微悬臂梁阵列表面固定有能够特异性结合微囊藻毒素LR的核酸适配体。

10.根据权利要求9所述的微悬臂梁阵列，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5′-(SH)-(CH₂)₆-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′。