CN108169289A - 一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片及其检测方法 - Google Patents

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杜耀华
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Abstract

本发明公开了一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片及其检测方法，包括小于或等于单个细胞悬浮时投影面积的中央电极(1)；在同一基底上设置的围绕所述中央电极(1)的组合式圈电极；所述中央电极与组合式圈电极构成一对测量电极；组合式圈电极构成随着贴壁单细胞在生长情况下所需的逐渐增大的测量面积。多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，构成随着贴壁单细胞阵列在生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积。随着细胞分裂增殖，细胞贴壁面积逐渐扩大，电极的组合方式随之改变，可实现检测单细胞形成的单克隆细胞群的阻抗变化，从电阻抗的变化过程分析细胞的周期、增殖等行为。

Description

一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物细胞阻抗检测、微电极的设计技术等多种领域，特别是涉及一种细胞电阻抗检测电极芯片设计。
背景技术
由于细胞之间存在着异质性，很多生物学研究从群体细胞的平均效应获得的结果，并不能给出足够有用的信息，因此，单细胞研究成为近年来的热点。
在许多癌症的诊断中，我们可以发现，病变组织中的“关键细胞”的增殖、分化能力较强，而且有些还会转移，这是造成病情恶化的重要原因之一，所以，从单细胞水平对细胞状态的增殖、分化、迁徙等生物学特征进行研究具有重要意义。有研究者证明，采用细胞电阻抗技术，可以从单细胞水平对细胞状态进行监测和研究(Kurz et al.)。由于技术本身的无损伤、非标记，且可以进行长时间的状态监测，因而采用细胞电阻抗技术进行单细胞研究具有独特的优势。
实现单细胞电阻抗检测一般要对单个细胞精确操作，高效地把单个活细胞无损地捕获在电极上，让细胞在电极上粘附生长(即贴壁)，才能通过对细胞电阻抗进行检测，实现细胞状态的监测。这不仅需要高效地捕获细胞，更重要的是，要检测贴壁单细胞的电阻抗，电极的设计是关键。已有电极设计能够实现对细胞贴壁等短期行为的检测，但难以实现长时间监测。
如何让电极具备足够的灵敏度能检测到贴壁单细胞的状态变化，并且进一步监测长时间内单细胞的生长、分裂增殖、细胞周期等生物学行为，同时又能满足一般微加工工艺对玻璃电极的要求，在有限的单个层面上布局足够多的电极数目，实现阵列式单细胞检测，这是电极设计的重点也是难点，是本发明解决的问题。
发明内容
本发明目的是提出一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片及其检测方法，利用组合式圈电极构成随着贴壁单细胞在生长情况下所需的逐渐增大的测量面积，并且可以利用该电极系统构建出电极阵列芯片，实现贴壁细胞及其生长过程中的电阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片，包括小于或等于单个细胞悬浮时投影面积中央电极1；在同一基底上设置的围绕所述中央电极1的组合式圈电极；所述中央电极与组合式圈电极构成一对测量电极；所述中央电极、组合式圈电极上分别设置电极引线将电极和芯片边缘的焊盘连接起来；电极引线上均覆盖一层绝缘层；组合式圈电极构成随着贴壁的单个细胞在生长情况下所需的逐渐增大的测量面积，所述组合式圈电极至少包括内圈电极2和外圈电极3，对单个细胞刚贴壁时，选择中央电极1和内圈电极2作为一对测量电极，而单个细胞分裂之后面积增大到完全覆盖内圈电极2要超出内圈电极2的范围时，选择中央电极1、内圈电极2短接作为一个电极，外圈电极3作为另一个电极来进行阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极阵列芯片，包括多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，构成随着群体的贴壁细胞在生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片，包括小于或等于单个细胞悬浮时投影面积的中央电极1；在同一基底上设置的围绕所述中央电极1的组合式圈电极；所述中央电极、组合式圈电极上分别设置电极引线；电极引线上覆盖的一层绝缘层；组合式圈电极构成随着贴壁的单个细胞在捕获之后，生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积；所述组合式圈电极至少包括内圈电极2和外圈电极3，对单个细胞刚贴壁时，选择中央电极1和内圈电极2作为一对电极，而单个细胞分裂之后面积增大到完全覆盖内圈电极2要超出内圈电极2的范围时，选择中央电极1、内圈电极2短接作为一个电极，外圈电极3作为另一个电极来进行阻抗检测，还包括所述中央电极1和组合式圈电极之间施加的交流电场，用于吸引悬浮的单个细胞到中央电极1上，捕获悬浮的单个细胞。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极阵列芯片，包括多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，所述各个中央电极1和各个组合式圈电极之间施加的交流电场，用于吸引悬浮的单个细胞到各个中央电极1上，捕获多个悬浮的单个细胞；构成随着贴壁的单个细胞在捕获之后，生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，该方法具体步骤如下：
悬浮的单个细胞在中央电极表面贴壁后，由中央电极1和组合时圈电极组成一对电极，对生长情况下的贴壁的单个细胞的电阻抗检测，当单个细胞刚贴壁时，选择中央电极1和内圈电极2作为一对电极，而单个细胞分裂之后面积增大到完全覆盖内圈电极2要超出内圈电极2的范围时，选择中央电极1、内圈电极2短接作为一个电极，外圈电极3作为另一个电极来进行阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，该方法具体步骤如下：
将悬浮的单个细胞捕获到中央电极表面贴壁后，由中央电极1和组合时圈电极组成一对电极，对捕获之后、生长情况下的贴壁的单个细胞进行电阻抗检测，当单个细胞刚贴壁时，选择中央电极1和内圈电极2作为一对电极，而单个细胞分裂之后面积增大到完全覆盖内圈电极2要超出内圈电极2的范围时，选择中央电极1、内圈电极2短接作为一个电极，外圈电极3作为另一个电极来进行阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，该方法具体步骤如下：
悬浮的单个细胞在中央电极表面贴壁后，对生长情况下的贴壁的单个细胞及单个细胞克隆的电阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，该方法具体步骤如下：
将悬浮的单个细胞捕获到中央电极表面贴壁后，由中央电极1和组合时圈(圆环)电极组成一对电极，对捕获之后、生长情况下的贴壁的单个细胞及单个细胞克隆进行电阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，该方法具体步骤如下：
悬浮的单个细胞在中央电极表面贴壁后，由多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，同时对生长情况下的单个细胞、单个细胞阵列或群体细胞进行电阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，该方法具体步骤如下：
将悬浮的单个细胞捕获到中央电极表面贴壁后，由多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，同时对捕获之后、生长、分裂增殖情况下的每一单个细胞、单个细胞阵列或群体细胞进行电阻抗检测。
与现有技术相比，本发明设计方案的优势在于当单个细胞捕获在中央电极并贴壁生长时，内圈电极与中央电极工作，检测单个细胞的阻抗，随着细胞分裂，细胞贴壁面积逐渐扩大，到接近内圈电极面积时，外圈电极和内圈电极工作，检测单个细胞形成的单克隆阻抗变化，从电阻抗的变化过程分析细胞的周期、增殖等行为；
通过设置扩展外圈电极，能够实现当一个细胞分裂增殖出来更多细胞情形下的细胞阻抗检测。
利用电极阵列可以同时实现待测区域中的阵列式排布的多个单细胞贴壁后，生长以及分裂增殖情形下的电阻抗检测。
附图说明
图1为一种用于贴壁细胞的电阻抗检测电极结构示意图；
图2为一种用于贴壁细胞的电阻抗检测电极的绝缘层结构示意图；
图3为一种用于贴壁细胞的电阻抗检测电极芯片结构剖面图；
图4为本发明实施例的多个单细胞检测单元的电极阵列芯片全貌示意图；方框内的部分是与图1对应的结构；
附图标记：
1、中央电极，2、内圈电极，3、外圈电极，4、电极引线；5、绝缘层(与图1对应)，6、无绝缘层结构，7、芯片基底，8、焊盘。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步的详细描述。
面将结合附图对本发明的实施方式作进一步的详细描述。
以如图1至图2所示的用于贴壁细胞的电阻抗检测电极结构为实施例。其中，包括位于最中间的小电极为中央电极1，另外设置了内圈电极2和外圈电极3，从外围包围中央电极1，内圈电极2和外圈电极3的面积逐渐增大；在中央电极1、第一外围电极2和第二外围电极3分别设置电极引线；悬浮细胞与中央电极1尺寸接近，因此中央电极1与电极2或电极3配合可将单个细胞捕获到电极1上，细胞贴壁后与电极2的尺寸接近，此时电极1和内圈电极2用于检测；贴壁细胞进一步分裂增殖，面积逐渐扩大到外圈电极3的面积，此时电极1和电极2短接作为一个电极与电极3一起用于检测。
具体的说，中央电极1的形状为圆形，直径为5～15微米，所述内圈电极2为围绕中央电极1的圆环，圆环的内外直径为7～50微米，其中内径比中央在电极1的外径大；所述外圈电极3的形状为围绕内圈电极2的圆环，圆环的内外直径为15～200微米，其中内径比内圈电极2的外径大，所述外圈电极3外围还可设置更多扩展外圈电极。
中央电极1、内圈电极2、外圈电极3各自独立、相互不连通；所有电极通过引线连接到芯片边缘并与后端阻抗检测电路连接。
电极的组合方式根据需要进行调整。作为电阻抗测量所需的一对电极，不同电极之间可以组合来进行阻抗检测，成对组合方式有中央电极1和内圈电极2、中央电极1和外圈电极3、内圈电极2与外圈电极3组合、内圈电极2和外圈电极3短接后再与中央电极1组合，中央电极1和内圈电极2短接后再与外圈电极3组合，中央电极1和外圈电极3短接后再与内圈电极2组合，这6种，外圈如果再扩展电极会相应增加更多组合方式。也就是，相邻电极或者不同电极的短接可以再和其外部或内部相邻的电极形成组合电极。
如图4所示，为本发明实施例的单细胞检测单元的电极阵列芯片全貌。
本发明的芯片制备方法，具体操作如下：
在玻璃片上优化布局，设计电极、引线及绝缘层版图：
电极引线版图设计：在玻璃电极边缘设计焊盘、引线；在玻璃芯片中央设计一个电极阵列；设计电极版图，检测部位电极面积的直径为20～40μm，为了保证加工的精度并减少电极自身阻抗，电极的最细线宽为5μm，引线最细线宽为10μm。根据电极、焊盘、引线的图案设计绝缘层版图。
根据版图在玻璃芯片上加工出金电极、绝缘层：
1、首先在干净的玻璃上先后溅射一层钛(30nm)和金(300nm)；
2、使用电极版图(图1)以光刻工艺对金属层图案化，经过涂胶、曝光、洗脱、刻蚀、去胶等步骤，得到需要的电极图案；
3、在电极表面通过PECVD工艺加工出SiO2/Si3N4/SiO2薄膜，再用绝缘层版图(图2)、光刻工艺对该薄膜层进行图案化，同样经过涂胶、曝光、洗脱、刻蚀、去胶等步骤得到图案化的绝缘层，使得电极部分露出，引线被绝缘层覆盖，以提高检测灵敏度，降低信号干扰；
设计与玻璃芯片配套的PCB接口板，将电极芯片通过焊锡接到PCB板上；
采用环氧AB胶覆盖焊接点，保证绝缘，胶晾干后在胶上覆盖一层PDMS混合物并固化，防止胶对细胞的毒性作用；
将一个围栏用PDMS固定在芯片PCB板上，形成一个培养腔体，并配上一个透明塑料盖；
器件加工完成后，先用蒸馏水浸泡过夜，PBS冲洗干净后，紫外线灭菌；
PCB板将电极引线引出后与阻抗谱分析仪相连，实现对芯片上电极间阻抗检测。
本发明的一种用于贴壁细胞的电阻抗检测电极结构的检测方法，该方法具体步骤如下：
将单个细胞捕获到电极表面后，由中央电极1和内圈电极2组成一对电极，进行电阻抗检测，从而检测此单个细胞的贴壁、生长情况；
当中央电极1和内圈电极2检测细胞检测到阻抗已经达到阈值，或显微镜观察到细胞已经完全贴壁后，将中央电极1和内圈电极2通过各自的电极引线短接变成一个电极后，再与外圈电极3构成细胞测量电极对进行阻抗检测，或者只用内圈电极2与外圈电极3组成细胞测量电极对进行阻抗检测；
在细胞进行分裂增殖、再贴壁的过程中，细胞数量越来越多时，细胞测量形成的阻抗越来越大。
当检测到一个细胞分裂增殖出来的更多的细胞增殖情况下，进一步设置外圈电极，并用中央电极1、内圈电极2和外圈电极3三者短接构成一个电极，与扩展外圈电极一起构成一对电极进行阻抗检测，也可以用内圈电极2、外圈电极3或者外圈单独3电极作为一个电极，与外圈电极构成细胞测量电极对，依此类推。
将单个细胞固定到电极检测部位的方法实施例：
(1)外加芯片辅助法
将具有单细胞捕获功能的PDMS(聚二甲基硅氧烷)管道贴合在芯片电极表面，并在显微镜下对准，将捕获细胞的结构定位在电极(1)表面；
将贴壁细胞消化并用细胞培养液悬浮为一定密度的细胞悬液；
将加工好的PDMS芯片贴在干净的培养皿底面上，经过等离子清洗处理后，先滴入不含细胞的少量培养液，从出口处用注射器小心抽吸，让培养基占满管道；
捕获细胞，从入口处滴入少量细胞悬液，从出口处用注射器抽吸，显微镜下观察捕获效果达到要求时，停止抽吸，再次滴入细胞培养液，清洗入口及管道中多余细胞；
将入口多余液体吸出，加入大量细胞培养液，将培养皿转入培养箱进行细胞培养；
待细胞贴壁之后，将PDMS层揭开，加入更多的培养基，进行单个细胞阵列培养并检测其阻抗变化，进而分析单个细胞水平的生理状态变化情况。
(2)电极介电力捕获法
在电极上滴加一定浓度的细胞悬液，然后在电极1和2、3之间施加一定频率、电压的交流电场，从而吸引单个细胞到电极1上；
施加一定的流动力，将未被吸引的多余细胞冲走；
稳定静置芯片，撤除交流电场，让细胞贴壁生长并开始电阻抗测量。

Claims (10)

1.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片，其特征在于，包括小于或等于单个细胞悬浮时投影面积的中央电极(1)；在同一基底上设置的围绕所述中央电极(1)的组合式圈电极；所述中央电极与组合式圈电极构成一对测量电极；所述中央电极、组合式圈电极上分别设置电极引线连接电极和芯片边缘焊盘；电极引线上覆盖一层绝缘层；组合式圈电极构成随着贴壁的单个细胞在生长情况下所需的逐渐增大的测量面积，所述组合式圈电极至少包括内圈电极(2)和外圈电极(3)，对单个细胞刚贴壁时，选择中央电极(1)和内圈电极(2)作为一对测量电极，而单个细胞分裂之后面积增大到完全覆盖内圈电极(2)要超出内圈电极(2)的范围时，选择中央电极(1)、内圈电极(2)短接作为一个电极，外圈电极(3)作为另一个电极来进行阻抗检测。
2.如权利要求1所述的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片，其特征在于，电极之间构成的一对电极组合进行阻抗检测，中央电极(1)、内圈电极(2)、外圈电极(3)之间总共包括了以下6种组合方式：中央电极(1)和内圈电极2组合，中央电极(1)和外圈电极(3)组合，内圈电极(2)和外圈电极(3)组合，中央电极(1)、内圈电极(2)短接再和外圈电极(3)组合，内圈电极(2)和外圈电极(3)短接后再与中央电极(1)组合，中央电极(1)和外圈电极(3)短接再和内圈电极(2)组合。
3.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极阵列芯片，其特征在于，包括多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，构成随着贴壁单个细胞阵列在生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积。
4.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片，其特征在于，包括小于或等于单个细胞悬浮时投影面积的中央电极(1)；在同一基底上设置的围绕所述中央电极(1)的组合式圈电极；所述中央电极、组合式圈电极上分别设置电极引线连接电极和芯片边缘的焊盘；电极引线上覆盖一层绝缘层；组合式圈电极构成随着贴壁单个细胞在捕获之后，生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积；所述组合式圈电极至少包括内圈电极(2)和外圈电极(3)，对单个细胞刚贴壁时，选择中央电极(1)和内圈电极(2)作为一对测量电极，而单个细胞分裂之后面积增大到完全覆盖内圈电极(2)要超出内圈电极(2)的范围时，选择中央电极(1)、内圈电极(2)短接作为一个电极，外圈电极(3)作为另一个电极来进行阻抗检测，所述中央电极(1)和组合式圈电极之间施加的交流电场，用于吸引悬浮的单个细胞到中央电极(1)上，捕获悬浮的单个细胞。
5.如权利要求4所述的一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极芯片，其特征在于，电极之间构成的一对电极组合进行阻抗检测，中央电极(1)、内圈电极(2)、外圈电极(3)之间总共包括了以下6种组合方式：中央电极(1)和内圈电极2组合，中央电极(1)和外圈电极(3)组合，内圈电极(2)和外圈电极(3)组合，中央电极(1)、内圈电极(2)短接再和外圈电极(3)组合，内圈电极(2)和外圈电极(3)短接后再与中央电极(1)组合，中央电极(1)和外圈电极(3)短接再和内圈电极(2)组合。
6.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测电极阵列芯片，其特征在于，包括多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，所述各个中央电极(1)和各个组合式圈电极之间施加的交流电场，用于吸引悬浮的单个细胞到各个中央电极(1)上，捕获多个悬浮的单个细胞；构成随着贴壁的单个细胞在捕获之后，生长、分裂增殖情况下所需的逐渐增大的测量面积。
7.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：悬浮的单个细胞在中央电极表面贴壁后，对生长情况下的贴壁的单个细胞及单个细胞克隆的电阻抗检测。
8.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：将悬浮的单个细胞捕获到中央电极表面贴壁后，由中央电极(1)和组合时圈电极组成一对电极，对捕获之后、生长情况下的贴壁的单个细胞及单个细胞克隆进行电阻抗检测。
9.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：悬浮的单个细胞在中央电极表面贴壁后，由多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，同时对生长情况下的单个细胞、单个细胞阵列或群体细胞进行电阻抗检测。
10.一种用于贴壁单细胞的电阻抗检测方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：将悬浮的单个细胞捕获到中央电极表面贴壁后，由多对中央电极与组合式圈电极构成的测量电极所组成的电极阵列，同时对捕获之后、生长、分裂增殖情况下的每一单个细胞、单个细胞阵列或群体细胞进行电阻抗检测。
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