CN108165511B - 一种筛选培养基及制备方法和应用与微生物的筛选培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种筛选培养基及制备方法和应用与微生物的筛选培养方法，属于微生物技术领域。本发明提供的所选培养基，成分简单易得；通过简单的加热融化的制备方法，省去高压蒸汽灭菌的步骤，极大的节约制备时间，提高制备效率；将制备得的培养基用于筛选微生物，通过简单的筛选培养步骤，能精确的筛选出目的菌种，具有较好的筛选效果。

Description

一种筛选培养基及制备方法和应用与微生物的筛选培养方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种筛选培养基及制备方法和应用与微生物的筛选培养方法。

背景技术

屎肠球菌属于肠道菌群之一，时下国内外研究较热，目前国内市场上没有屎肠球菌选择培养基，仅存在Pfizer选择性肠球菌琼脂培养基、肠球菌选择培养基，但是Pfizer选择性肠球菌琼脂培养基、肠球菌选择培养基的选择培养工作量大、筛选盲目，针对性不强；粪肠球菌选择培养基、KF链球菌选择培养基仅仅针对粪肠球菌，适用性较差；HiCrome屎肠球菌显色培养基则完全依靠抗生素筛选，特异性差，如果遇到耐药菌株时，容易出现假阳性的情况；因此适用性也不太好。

目前需要一款针对屎肠球菌具有较好的特异性的筛选培养基。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种筛选培养基，该筛选培养基具有较好的选择和筛选培养的效果。

本发明的第二目的在于提供上述的筛选培养基在微生物筛选培养中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种筛选培养基的制备方法，通过简单的制备方法可以较好的保证培养基的成分，且免去灭菌步骤，制备方法简化、可以快速的制备大量的筛选培养基。

本发明的第四目的在于提供一种微生物的筛选培养方法，通过本筛选方法能快速、精确的筛选出目的菌种。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种筛选培养基，筛选培养基包括基础培养组分和添加剂；基础培养组分包括蛋白胨、氯化钠、叠氮化钠、牛胆粉、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；添加剂包括无菌血清和抗生素。

上述的筛选培养基在微生物筛选培养中的应用。

一种筛选培养基的制备方法，称取12-18g胰蛋白胨、2-7g大豆蛋白胨、3-9g氯化钠、0.3-0.7g叠氮化钠、1.2-1.7g牛胆粉、2-5g葡萄糖和16-22g琼脂；溶解于950mL去离子水中，以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.3-7.7，定容至1000mL；加热煮沸后冷却至45-55℃，加入48-53mL无菌血清和242-263μg盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基

一种微生物的筛选培养方法，利用上述的制备方法，制得筛选培养基，将待分离的样本接种于筛选培养基，得到样本培养基，培养样本培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的所选培养基，成分简单易得；通过简单的加热融化的制备方法，省去高压蒸汽灭菌的步骤，极大的节约制备时间，提高制备效率；将制备得的培养基用于筛选微生物，通过简单的筛选培养步骤，能精确的筛选出目的菌种，具有较好的筛选效果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种筛选培养基及制备方法和应用与微生物的筛选培养方法进行具体说明。

一种筛选培养基，筛选培养基包括基础培养组分和添加剂；基础培养组分包括蛋白胨、氯化钠、叠氮化钠、牛胆粉、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；添加剂包括无菌血清和抗生素。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，蛋白胨包括胰蛋白胨和大豆蛋白胨。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，抗生素为盐酸头孢吡肟。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，每升筛选培养基含有12-18g胰蛋白胨、2-7g大豆蛋白胨、3-9g氯化钠、0.3-0.7g叠氮化钠、1.2-1.7g牛胆粉、2-5g葡萄糖和16-22g琼脂；并以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.3-7.7；还包括48-53mL无菌血清和242-263μg盐酸头孢吡肟。

胰蛋白胨、大豆蛋白胨作为氮源物质，提供微生物的生长所需的氮源；葡萄糖作为碳源，为微生物提供生长所需的碳源；氯化钠为微生物提供生长所需的无机盐；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾作为缓冲溶液，可以较好的调节培养基pH，保证培养基的pH值的稳定；琼脂作为固化成分，作为固体培养基的基本组分；叠氮化钠可以有效的抑制非肠球菌属的其它细菌生长；牛胆粉可以有效的抑制非肠道菌的其它细菌生长；无菌血清可以提供屎肠球菌生长所需的生长因子；盐酸头孢吡肟可以较好的抑制非肠球菌的所有其它细菌生长。

盐酸头孢吡肟通过抑制细菌细胞壁的生物合成而达到杀菌作用。体外试验表明，本品对革兰氏阳性菌和阴性菌均有作用。本品对细菌染色体编码的β-内酰胺酶的亲和力低，可高度耐受多数β-内酰胺酶的水解，并可迅速渗入革兰阴性菌的细胞内。在菌体细胞内，其靶分子为青霉素结合蛋白(PBP)。

上述的筛选培养基在微生物筛选培养中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，微生物为屎肠球菌。

屎肠球菌(Enterococcus Faecium)属肠球菌属，是人及动物肠道中正常菌群的一部分，用屎肠球菌JT1701与人体肠系有害菌(大肠杆菌、产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌)和人体肠系益生菌(婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌)分别及共同培养发现，肠球球菌对这些菌均有抑制作用，属于革兰氏阳性菌。

屎肠球菌进入动物肠道后，主要通过以下四个途径产生作用：①快速黏附肠道黏膜。通过排阻效应抑制病原菌黏附肠道，形成肠道屏障、保护肠道健康、维持微生态平衡。②代谢过程中产生乳酸、细菌素和过氧化氢等物质。可以降低肠道pH值、抑制动物病原菌繁殖、维持和调整肠道微生态平衡、减少肠道内毒素与尿素酶的含量、减少血液中毒素和氨的含量、促进动物器官成熟、改善动物生理状态。③产生多种营养物质(维生素、氨基酸、促生长因子等)。营养物质可参与新陈代谢、促进动物生长。④诱导机体产生细胞因子、干扰素、白细胞介素等。可增强机体非特异性免疫、提高抗病能力、降低炎症反应、促进肠道健康。

实验证明，屎肠球菌制剂在提高幼年畜禽体增重、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高营养吸收、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果。

一种筛选培养基的制备方法，称取12-18g胰蛋白胨、2-7g大豆蛋白胨、3-9g氯化钠、0.3-0.7g叠氮化钠、1.2-1.7g牛胆粉、2-5g葡萄糖和16-22g琼脂；溶解于950mL去离子水中，以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.3-7.7，定容至1000mL；加热煮沸后冷却至45-55℃，加入48-53mL无菌血清和242-263μg盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基。

一种微生物的筛选培养方法，利用上述的制备方法，制得筛选培养基，将待分离的样本接种于筛选培养基，得到样本培养基，培养样本培养基。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，培养的温度为47-55℃。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，培养的时间为20-29h。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种筛选培养基。

该筛选培养基每升包含有12g胰蛋白胨、7g大豆蛋白胨、3g氯化钠、0.3g叠氮化钠、1.2g牛胆粉、5g葡萄糖和22g琼脂；并以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.3；还包括53mL无菌血清和242μg盐酸头孢吡肟。

本实施例还提供一种筛选培养基的制备方法。

按照上述筛选培养基的配方，称取12g胰蛋白胨、7g大豆蛋白胨、3g氯化钠、0.3g叠氮化钠、1.2g牛胆粉、5g葡萄糖和22g琼脂；加入950mL去离子水溶解混匀，并用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.3，定容至1L；加热煮沸后冷却，待冷却至45℃的，加入53mL的无菌血清和242μg的盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基。

实施例2

本实施例提供一种筛选培养基。

该筛选培养基每升包含有18g胰蛋白胨、2g大豆蛋白胨、9g氯化钠、0.7g叠氮化钠、1.7g牛胆粉、2g葡萄糖和16g琼脂；并以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.7；还包括48mL无菌血清和263μg盐酸头孢吡肟。

本实施例还提供一种筛选培养基的制备方法。

按照上述筛选培养基的配方，称取18g胰蛋白胨、2g大豆蛋白胨、9g氯化钠、0.7g叠氮化钠、1.7g牛胆粉、2g葡萄糖和16g琼脂；加入950mL去离子水溶解混匀，并用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.7，定容至1L；加热煮沸后冷却，待冷却至55℃的，加入48mL的无菌血清和263μg的盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基。

实施例3

本实施例提供一种筛选培养基。

该筛选培养基每升包含有16g胰蛋白胨、4g大豆蛋白胨、5g氯化钠、0.4g叠氮化钠、1.5g牛胆粉、3g葡萄糖和17.5g琼脂；并以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.5；还包括50mL无菌血清和250μg盐酸头孢吡肟。

本实施例还提供一种筛选培养基的制备方法。

按照上述筛选培养基的配方，称取16g胰蛋白胨、4g大豆蛋白胨、5g氯化钠、0.4g叠氮化钠、1.5g牛胆粉、3g葡萄糖和17.5g琼脂；加入950mL去离子水溶解混匀，并用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.5，定容至1L；加热煮沸后冷却，待冷却至54℃的，加入50mL的无菌血清和250μg的盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基。

实施例4

本实施例提供一种筛选培养基。

该筛选培养基每升包含有14g胰蛋白胨、6g大豆蛋白胨、7g氯化钠、0.5g叠氮化钠、1.4g牛胆粉、4g葡萄糖和20g琼脂；并以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.6；还包括51mL无菌血清和258μg盐酸头孢吡肟。

本实施例还提供一种筛选培养基的制备方法。

按照上述筛选培养基的配方，称取14g胰蛋白胨、6g大豆蛋白胨、7g氯化钠、0.5g叠氮化钠、1.4g牛胆粉、4g葡萄糖和20g琼脂；加入950mL去离子水溶解混匀，并用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.6，定容至1L；加热煮沸后冷却，待冷却至52℃的，加入51mL的无菌血清和248μg的盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基。

实施例5

本实施例提供一种微生物的筛选培养方法，具体筛选培养方法包括以下步骤：

1.1按照实施例3的所选培养基配方和筛选培养制备方法制备得到筛选培养基；

1.2将筛选培养基倒入无菌培养皿中，待筛选培养基凝固；

1.3将制备好的待分离的样本(人体肠道离体样本)接种于凝固的筛选培养基上；

1.4在47℃温度条件下恒温培养箱培养29h；

1.5筛选得到屎肠球菌。

本实施例的样本可以是多种的，本实施例中优选人体肠道离体样本，通过人体肠道离体样本筛选培养得到屎肠球菌。

实施例6

本实施例提供一种微生物的筛选培养方法，具体筛选培养方法包括以下步骤：

1.1按照实施例3的所选培养基配方和筛选培养制备方法制备得到筛选培养基；

1.2将筛选培养基倒入无菌培养皿中，待筛选培养基凝固；

1.3将制备好的待分离的样本(人体肠道离体样本)接种于凝固的筛选培养基上；

1.4在50℃温度条件下恒温培养箱培养24h；

1.5筛选得到屎肠球菌。

本实施例的样本可以是多种的，本实施例中优选人体肠道离体样本，通过人体肠道离体样本筛选培养得到屎肠球菌。

实施例7

本实施例提供一种微生物的筛选培养方法，具体筛选培养方法包括以下步骤：

1.1按照实施例3的所选培养基配方和筛选培养制备方法制备得到筛选培养基；

1.2将筛选培养基倒入无菌培养皿中，待筛选培养基凝固；

1.3将制备好的待分离的样本(人体肠道离体样本)接种于凝固的筛选培养基上；

1.4在55℃温度条件下恒温培养箱培养20h；

1.5筛选得到屎肠球菌。

本实施例的样本可以是多种的，本实施例中优选人体肠道离体样本，通过人体肠道离体样本筛选培养得到屎肠球菌。

实验例1

本实验例提供筛选培养基培养筛选的实验的验证过程；具体验证不同的培养温度、叠氮化钠、牛胆粉的浓度以及盐酸头孢吡肟对屎肠球菌、巴氏链球菌、乳酸球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌和粪肠球菌等常见的肠道菌类的生长的影响。

在普通营养培养基的基础上进行温度梯度调整，然后进行培养；添加盐酸头孢吡肟；添加不同浓度的叠氮化钠、牛胆粉培养24h，于分光光度计600nm处测培养液吸光度，进行三次读数，取平均值，结果如表1。

表1不同条件对菌类生长的影响

从表1可以看出，当温度从37℃升到50℃，巴氏链球菌、乳酸球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌和粪肠球菌等常见的肠道菌类的生长受到明显的抑制，而屎肠球菌的生长没有明显被抑制；加入盐酸头孢吡肟后，巴氏链球菌、乳酸球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌和粪肠球菌等常见的肠道菌类的生长受到明显的抑制，而屎肠球菌的生长良好；同样，当叠氮化钠浓度从0.02％升高到0.04％，屎肠球菌的生长良好，加入牛胆粉后，屎肠球菌的生长良好；其他菌类表现出生长抑制的现象；因此通过在常规培养基中添加叠氮化钠、牛胆粉和盐酸头孢吡肟并且在培养的时候提高培养温度；几种条件联合使用，可以较好的筛选出屎肠球菌，达到筛选的目的。

综上所述，本发明实施例提供的筛选培养基通过添加加叠氮化钠、牛胆粉和盐酸头孢吡肟并且在培养的时候提高培养温度；联合作用，可以达到较好的筛选目的；制备筛选培养基的方法减少高温灭菌的步骤，可以节约大量的时间，提高制备效率；将筛选培养基应用到屎肠球菌的筛选中效果较佳，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (1)

1.一种微生物的筛选培养方法，其特征在于，包括：

（1）筛选培养基的制备：称取16g胰蛋白胨、4g大豆蛋白胨、5g氯化钠、0.4g叠氮化钠、1.5g牛胆粉、3g葡萄糖和17.5g琼脂；加入950mL去离子水溶解混匀，并用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾调整pH为7.5，定容至1L；加热煮沸后冷却，待冷却至54℃的，加入50mL的无菌血清和250μg的盐酸头孢吡肟混匀，制得筛选培养基；

（2）将筛选培养基倒入无菌培养皿中，待筛选培养基凝固；

（3）将制备好的待分离的人体肠道离体样本接种于凝固的筛选培养基上；

（4）在50℃温度条件下恒温培养箱培养24h；

（5）筛选得到屎肠球菌。