CN108165460B - 病原真菌单孢分离装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病原真菌单孢分离装置，包括载玻片和网状机构，网状机构设在载玻片上；该网状机构由若干种不同颜色的金属丝编织构成。本发明具有以下优点：采用若干个多色方格设在载玻片上，大大提高了单孢存在的概率，可以保证有单个孢子在单个方格里，再按照方格边框颜色很快确定其位置，无需在显微镜下确定，就能快捷高效地把单孢挑取出来，减轻操作过程，缩短实验时间；另外盖玻片创造了一个封闭的孢子萌发的环境，这样可以省去其他密闭的培养装置，另一方面因为没有二次操作，不需要将培养基块放在载玻片上暴露在空气中的环节，也避免了观察时受杂菌污染的风险，对操作的要求大大降低。

Description

病原真菌单孢分离装置

技术领域

本发明涉及生化设备技术领域，尤其是一种病原真菌单孢分离装置。

背景技术

国内外真菌菌种的纯化在不断的改革和简化，截止到目前纯化菌种的方法：

1、直接挑单孢纯化法：待培养基上产孢后，在体视显微镜下观察目标菌和污染菌的产孢表型，将目标菌与污染菌区分开。然后用细的挑针在体视显微镜下挑出病原孢子。

2、稀释纯化法：将带杂菌的孢子悬浮液加适量的灭菌水，不断稀释到每一小滴悬浮液中大致只有一个孢子。由于几率的不同，有的小滴中可能没有孢子或有两个及以上，在显微镜下检查。将确实只有一个孢子的小滴孢子悬浮液移植到适当的培养基上培养。

3、琼脂平板表面单孢子挑取法：利用接种环将少量孢子悬浮液或干孢子，点或者划线和涂匀的办法加在琼脂平板表面上。如果孢子较大，可以直接将琼脂平板放在体视显微镜下，从琼脂平板正面检视，寻找目的病菌，如病菌周围没有杂菌孢子，就可以用接种环将带有小块单孢子的琼脂培养基切下，再用接种针移植到适宜的培养基上生长。如病菌孢子与杂菌孢子离得很近，可以先用尖挑针将病菌孢子拖到干净的地方再分离。另外也可以从培养皿的反面检查，用低倍镜反面检查，如发现在视野内只有一个孢子，同时附件也没有孢子存在，就用记号笔在培养基底部(孢子存在的位置)画一个小点作记号，用接种环将带有小块单孢子的琼脂培养基切下，再用接种针移植到适宜的培养基上生长。

4、邱小艳以玉米小斑病菌的单孢分离为例，并综合改进其他单孢分离方法，通过组织分离、孢悬液涂布、挑针转移三个步骤，挑取分散在清水琼脂平板上已经萌发的孢子获得单孢。这种方法通过将病斑进行分离培养，然后制成一定浓度的孢子悬液，制成悬液的时候震荡的力度不宜过大，以免菌丝跟着脱落，涂布过程要只取上清液，防止其他菌丝残体附着，然后培养一定时间再长出芽管的时候，切成小块在显微镜下镜检，这个过程因为暴露的时间太长，所以要绝对操作规范，尽量避免污染。

5、国外真菌单孢分离法用Keitt法。使用工具孢子割切器:针端有向下稍弯、上有直径约三毫米的金属小圈的孢子割切器；另一工具是针端有弯成约90度镰刀状的挑取孢子的小勺。培养基中倒入孢子液，显微镜下观察，选择单个孤立的孢子并做标记，用孢子割切器割取孢子，再用小勺挑取含有单孢子的小块，移植。

6、Lambert法设计了能安装在显微镜上的割切器，移动接物镜，使割切器正向着孢子，然后把镜管逐渐向下，切割单孢琼脂，此法割切器每次使用后需灭菌。

以上几种方法各有利弊，在解剖镜下操作的多适宜较大的真菌孢子，并且污染度较高；稀释法操作时不仅繁琐，更重要的是不能完全保证是单孢；琼脂平板挑取，在实际操作时存在解剖镜下污染问题及小孢子寻找困难问题，如使用低倍镜反面检查法，由于玻皿在镜下不能完全对焦，检视孢子时存在问题；国外技术手段较规范，但由于割切器在国内无法获得且机械操作不好掌握。因此，就单孢分离方法，寻找一个简单有效，简便易行的方法是植物病理学研究中急需解决的一个问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一种病原真菌单孢分离装置，结构简单，操作容易，不易出现污染，降低了对提单孢技术操作的要求。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种病原真菌单孢分离装置，包括载玻片和网状机构，网状机构设在载玻片上；该网状机构由若干种不同颜色的金属丝编织构成。

进一步地，该网状机构中分设四个尺寸的方格：2mm、1mm、0.5mm、0.25mm。

进一步地，该四个尺寸方格按顺时针方向布置。

进一步地，还包括设在网状机构的四周的挡条。

进一步地，该挡条的高度大于网状机构的高度。

进一步地，该挡条的高度为2mm。

进一步地，还包括盖玻片，该盖玻片盖住所述网状机构。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：采用若干个多色方格设在载玻片上，大大提高了单孢存在的概率，可以保证有单个孢子在单个方格里，再按照方格边框颜色很快确定其位置，无需在显微镜下确定，就能快捷高效地把单孢挑取出来，减轻操作过程，缩短实验时间；另外盖玻片创造了一个封闭的孢子萌发的环境，这样可以省去其他密闭的培养装置，另一方面因为没有二次操作，不需要将培养基块放在载玻片上暴露在空气中的环节，也避免了观察时受杂菌污染的风险，对操作的要求大大降低。

附图说明

图1为本发明病原真菌单孢分离装置的结构示意图；

图2为网状机构的结构示意图；

图示标记说明：

1-载玻片、2-挡条、3-网状机构、4-盖玻片、5-金属丝。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

在植物病理学研究中，需要分离病原微生物并最终获得病原菌的纯培养，也即获得单孢的菌系，菌种的纯化是必要且必须的，在研究真菌的遗传与变异、性征、同宗和异宗配合现象、尤其是在真菌的分子生物学鉴定时都会用到单孢分离技术。然而，现有的单孢分离方法如背景介绍的，做起来繁琐、易污染且很难获得真正的单孢菌系。

如图1和2所示，一种病原真菌单孢分离装置，包括载玻片1和网状机构3，网状机构3设在载玻片1上；该网状机构3由若干种不同颜色的金属丝5编织构成。

将待纯化的病原菌制成孢子悬液，该过程震荡不能太用力，防止菌丝震荡下来，经过血球计数板计数，计算出孢子悬液的初始浓度，浓度过高的话需要稀释一下，保证孢子的分散程度。将水琼脂倒到该装置，保证水琼脂与隔离架平齐，用无菌移液枪定量吸取30ul孢子液滴在已倒好培养基的网状机构3的每个方格中，滴的位置在网格最大的3mm位置处，然后用小的涂布棒由上到下顺时针涂布，保证孢子浓度最低时对应网格0.5mm的方格区域，来增加单孢存在的概率。

涂完盖上盖玻片，营造一个密闭的无菌环境，进行培养12个小时左右，待长出芽管的时候直接取出来进行镜检，将设计好的整个网格玻片装置放到显微镜上，待确定好我们需要的单孢的位置后，观察单孢存在位置的四条边框的颜色，因为每个方格的四条边框颜色的组合是唯一的，所以记住上下左右的颜色，就可以将玻片从显微镜上取下来，直接用挑取针把那个颜色组合下的培养基块取下来进行单孢分离的纯培养，这样就避免了重复在显微镜下确定单孢的位置，提高了提单孢的效率，也降低了被杂菌污染的风险。该装置为被杂菌污染的病原菌进行纯培养发挥了重要作用。

在选用载玻片1作为底座的时候，就考虑到载玻片1作为常规的镜检载体，有十分好的通透性，在使用过程直接将玻片作为底座放到显微镜上，不管是固定还是观察都十分方便，可以省去很多观察时的中间环节，比如上面介绍的背景技术，大部分最后挑单孢时都需要将培养基放到玻片上进行后续的挑单孢工作，这样多一个环节就会造成菌株多一分的污染风险。

在网状机构3的四周设置四个黑颜色厚2mm的竖直挡条2，它主要起到两个方面的功效，一方面作为衡量培养基厚度的一个标尺，使培养基厚度低于2mm，为观察孢子时提高它的通透性；另一方面选用黑颜色，就是为了聚光，创造一个明亮观察的环境，为单孢顺利分离创造良好的条件。

组成网格的每个金属丝5都是有颜色，且颜色各不相同，另外构成的方格的大小有四种：2mm×2mm，1mm×1mm，0.5mm×0.5mm，0.25×0.25，这样设计的原理在于以下几点：在孢子液稀释涂布的时候，浓度由高到低，网格的大小也是由大到小，越到最后，单孢出现的概率越大，所以设计成0.5mm×0.5mm的小格，大大提高了单孢的存在概率；每个网格四条边框颜色的组合也是一大特色，每个网格上下左右颜色的组合是唯一的，等确定了有单孢的前提下，就可以根据上下左右的颜色，确定单孢的位置，在离体下就可以把单孢挑出来，进行纯培养。这样可以大大提高提单孢的效率和准确性，为以后污染菌落的纯培养提高更大的可能性。

再在网状机构3上设置了盖玻片4，这样可以保证整个装置不管是孢子在产生芽管的过程，还是在显微镜下确定单孢的位置时，都可以保证是密闭的，这样一方面可以防止杂菌的污染，另一方面也降低了对提单孢技术操作的要求。

本发明分离装置采用若干个多色方格的网状机构铺设在载玻片上，能大大提高了单孢存在的概率，即单个方格里存在单个孢子的可能性更高；再按照每个方格边框颜色进行组合，能很快确定单胞的位置，无需在显微镜下再次确认位置，快捷高效地把单孢挑取出来，减少了在显微镜下挑选的操作过程，大幅缩短实验时间；另外盖玻片创造了一个封闭的孢子萌发的环境，这样可以省去其他密闭的培养装置，另一方面因为没有二次操作，不需要将培养基块放在载玻片上暴露在空气中的环节，也避免了观察时受杂菌污染的风险，对操作的要求大大降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种病原真菌单孢分离装置，其特征在于：包括载玻片和网状机构，网状机构设在载玻片上；该网状机构由若干种不同颜色的金属丝编织构成；

该网状机构中分设四个尺寸的方格：2mm、1mm、0.5mm、0.25mm；

还包括设在网状机构的四周的挡条；

还包括盖玻片，该盖玻片盖住所述网状机构；

该四个尺寸方格按顺时针方向布置；

该挡条的高度大于网状机构的高度。

2.如权利要求1所述病原真菌单孢分离装置，其特征在于：该挡条的高度为2mm。

Images