CN108148828A - 一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法，包括以下步骤：1)将包埋剂与营养液混合，在20‑100℃下搅拌均匀，得到交联浆液；2)将保护剂与硝化类细菌菌液混合，搅拌均匀，得到硝化类细菌浆液；3)将交联浆液冷却到45℃以下，将交联浆液与硝化类细菌浆液混合，搅拌均匀，再与石膏粉混合，继续搅拌均匀，得到含有硝化类细菌菌剂的载体基质；4)将含有硝化类细菌菌剂的载体基质造粒，干燥得到以石膏为载体的固定化硝化类细菌菌剂。通过本发明方法制备固定化硝化类细菌解决了传统方法成本高或硝化类细菌活性低的问题。

Description

一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法

技术领域

本发明涉及固定化细菌技术领域，特别是涉及一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法。

背景技术

固定化菌剂是利用物理或化学的方法，将游离的微生物细胞及其代谢产物定位在一定空间范围内，使微生物活性得以长期保存，且能够被重复和连续使用的现代生物工程技术。

硝化类细菌是水处理中氮循环过程中关键微生物群体，经优选的硝化类细菌如何在水处理使用中增殖并发挥作用，是硝化类细菌使用过程中的一大难题。一方面，常规的固体菌剂生产工艺多包含高温流程，如采用喷雾干燥等工艺进行固体菌剂生产，通常需要100℃以上的温度，由于硝化类细菌不产孢子，不耐高温，因此高温流程会破坏硝化类细菌的活性；另一方面，冷冻干燥成本较高，不适合大规模生产。

发明内容

石膏是五大凝胶材料之一，其储量丰富、价格低廉，是一种重要的工业原材料，广泛用于建筑、建材、工业模具和艺术模型、化学工业及农业等众多应用领域。石膏具有生物亲和性，且安全环保，不会引起环境的二次污染，且石膏粉具有丰富的孔隙度，易与微生物结合。基于此，本发明提供一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法，以解决现有技术成本高或细菌活性低的问题。具体技术方案如下：

本发明提供了一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法，包括以下步骤：

1)将包埋剂与营养液混合，在20-100℃下搅拌均匀，得到交联浆液，所述包埋剂和所述营养液的质量比为1：(5-50),优选为1：(5-20)，更优选为1：10；

2)将保护剂与硝化类细菌菌液混合，搅拌均匀，得到硝化类细菌浆液，所述保护剂和硝化类细菌菌液的质量比为1：(5-20)，优选为1：10；

3)将交联浆液冷却到45℃以下，优选为10-30℃，更优选为20-25℃，将交联浆液与硝化类细菌浆液混合，搅拌均匀，再与石膏粉混合并搅拌均匀，得到含有硝化类细菌菌剂的载体基质，所述营养液和所述石膏粉质量比为1：(0.4-10)，优选为1:4；

4)将含有硝化类细菌菌剂的载体基质造粒，干燥后得到石膏为载体的固定化硝化类细菌菌剂。

本发明所述硝化类细菌选自硝化细菌和/或反硝化细菌。所述硝化细菌，包括亚硝酸菌及硝酸菌，其中亚硝酸菌是一类将氨氧化成亚硝酸盐的细菌，包括但不限于亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属和亚硝化叶菌属中的细菌。硝酸菌能够将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，包括但不限于硝化杆菌属、硝化球菌属和硝化囊菌属中的细菌。反硝化细菌是一类能引起反硝化作用，把硝酸盐还原成氮(N₂)的细菌，包括但不限于反硝化杆菌、斯氏杆菌、萤气极毛杆菌等。在实际应用过程中，可根据实际需要，选择所需菌种，可以使用单一菌种制备固定化细菌，也可将两种以上菌种混合后作为制备固定化细菌的菌液。

细菌固定化所用的包埋剂起到将菌体交联浓缩并限定在一定空间范围内的作用，并提供一定的机械强度。本发明所述的包埋剂包括但不限于黄原胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚乙二醇或糊精，优选为羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇和聚乙二醇中的至少一种。所述包埋剂均可购自商业途径。

本发明所述的营养液为包含锌、锰、铁、钴和硼的水溶液，所述任一种元素在营养液中的浓度为0.1-50ppm，所述单位ppm是质量比，即溶质质量占全部溶液质量的百万分比。

在本发明的一种实施方式中，将包埋剂与营养液混合，根据包埋剂种类不同，选择20-100℃下搅拌，所述包埋剂和所述营养液的质量比为1：(5-50),优选为1：(5-20)，更优选为1：10，搅拌至得到均匀的交联浆液，浆液中不存在粉状、颗粒状或块状的包埋剂，浆液中各部分成分比例相同。此为本领域常规操作，在此不做具体限定。

在制备固定化细菌及后期保藏的过程中，由于细菌所处环境的变化，造成细菌快速、大量地死亡，因此本领域技术人员在制备固定化细菌的过程中需要加入保护剂，用于维持菌体的存活率和活性。本发明所述的保护剂包含但不限于脱脂奶粉、甘油、玉米淀粉和二甲基亚砜，可单独使用也可混合使用。所述保护剂均可购自商业途径。

在本发明的一些实施方式中，所述硝化类细菌菌液选自人工培养的硝化类细菌菌液。所述人工培养的硝化类细菌菌液可从自然界取得原始菌群，经选择性培养得到所需菌株或菌群，经扩大培养得到活菌含量为1×10⁸-1×10¹¹cfu/ml，优选为1×10⁹-1×10¹⁰cfu/ml的菌液；工业化大规模生产可选择购买工业化发酵生产的硝化类细菌菌液，根据实际用途需要，选择单一菌种或选择多个菌种进行混合后，得到活菌含量为1×10⁸-1×10¹¹cfu/ml，优选为1×10⁹-1×10¹⁰cfu/ml的菌液。

在本发明的另一些实施方式中，所述硝化类细菌菌液选自活性污泥。所述活性污泥取自污水处理厂的好氧池或厌氧池，其中取自好氧池的活性污泥中主要是硝化细菌，厌氧池的活性污泥中主要为反硝化细菌，所述活性污泥中硝化类细菌含量为1×10⁷-1×10¹⁰cfu/ml，优选为1×10⁸-1×10⁹cfu/ml。

将所述保护剂与所述硝化类细菌菌液按质量比1：(5-20)，优选为1：10混合，搅拌均匀，得到硝化类细菌浆液。

将交联浆液冷却到45℃以下，优选为10-30℃，更优选为20-30℃，再优选为20-25℃，将交联浆液与硝化类细菌浆液混合，搅拌均匀，再与石膏粉混合并搅拌均匀，得到含有硝化类细菌菌剂的载体基质，所述营养液和所述石膏粉质量比为1：(0.4-10)，优选为1:4。

在本发明的一些实施方式中，所述石膏粉的细度为100-500目。

在本发明的一些实施方式中，所述石膏粉为半水熟石膏粉。

在本发明的一些实施方式中，将所述含有硝化类细菌菌剂的载体基质使用造粒设备进行造粒处理，所述造粒设备包括但不限于螺杆挤出机、滚球机或压片机。

在本发明的另一些实施方式中，将经过造粒处理初步制成的硝化类细菌固定化颗粒，放在多层架台上自然风干或采用30℃以下冷风4-12h快速风干至固定化颗粒水分含量为5％-10％，得到最终的固定化硝化类细菌菌剂，此为本领域常规操作，在此不做具体限定。

本发明实施例提供的以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法，在制备过程中，硝化类细菌所处的环境温度不超过45℃，与现有技术相比有效保护了硝化类细菌的活性，且操作方便，成本低廉，适合大规模工业生产。采用此方法得到的固定化硝化类细菌菌剂为活菌(相对于休眠菌)，使用时不需要活化，且常温下可保存6个月，相比于现有技术菌种保存时间明显延长。此外，以石膏为载体制备的固定化硝化类细菌，还可以克服传统固定化方法产生的机械强度小、易流失、引入二次污染、载体材料回收困难等因素制约，获得广阔的应用前景。当然，实施本发明的任一产品或方法必不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)硝化类细菌浆液的制备：将10g脱脂奶粉添加到50g亚硝化单胞菌菌液中(购自河北上桥生物科技有限公司)，菌液中活菌含量为8.6×10⁸cfu/ml，搅拌均匀，得到细菌浆液，备用；

(2)粒度合适的载体制备：对市面购买的半水熟石膏粉过筛，得到100目的石膏粉，备用；

(3)固定化硝化类细菌颗粒制备：分别称取10g黄原胶和10g羧甲基纤维素钠，加入到200g营养液中,所述营养液中锌、锰、铁、钴和硼的浓度分别为10ppm、2ppm、3ppm、10ppm、20ppm。于加热搅拌器中，40℃下，200rpm连续搅拌30min，制得交联浆液，待冷却到20℃，加入步骤(1)制得的硝化类细菌浆液，搅拌均匀，继续加入步骤(2)得到的石膏粉200g，搅拌均匀，使用螺杆挤出机，制成直径8-10mm，长度10-20mm的圆柱颗粒，放于多层通透架台上，自然风干24h，得到固定化硝化类细菌颗粒。

实施例2

(1)硝化类细菌浆液的制备：将100g脱脂奶粉添加到2000g硝化污泥中，硝化污泥中硝化类细菌活菌含量为2.1×10⁸cfu/ml，搅拌均匀，得到硝化类细菌浆液，备用；

(2)粒度合适的载体制备：对市面购买的半水熟石膏粉过筛，得到300目的石膏粉，备用；

(3)固定化硝化类细菌颗粒制备：分别称取100g聚乙烯醇和100g羧甲基纤维素钠，加入到1000g营养液中，所述营养液中锌、锰、铁、钴和硼的浓度分别为5ppm、1ppm、3ppm、5ppm、5ppm。于加热搅拌器中，60℃下120rpm连续搅拌1小时，制得交联浆液，待冷却到30℃，加入步骤(1)制得的硝化类细菌浆液，搅拌均匀，继续加入步骤(2)得到的石膏粉4000g，搅拌均匀，使用滚球机，制成直径5-10mm圆球颗粒，放于多层通透架台上，25℃冷风干燥4小时，得到固定化硝化类细菌颗粒。

实施例3

(1)硝化类细菌浆液的制备：将1kg脱脂奶粉添加到10kg硝化杆菌和反硝化杆菌的混合菌液中，所述硝化杆菌和反硝化杆菌菌液购自河北上桥生物科技有限公司，活菌含量分别为4.6×10⁹cfu/ml和5.0×10⁹cfu/ml，两种菌液按体积比1：1混合，混合后菌液中活菌含量为4.8×10⁹cfu/ml，搅拌均匀，得到硝化类细菌浆液，备用；

(2)粒度合适的载体制备：对市面购买的半水熟石膏粉过筛，得到500目的石膏粉，备用；

(3)固定化硝化类细菌颗粒制备：分别称取2kg聚乙二醇，加入到40kg营养液中，所述营养液中锌、锰、铁、钴和硼的浓度分别为1ppm、0.1ppm、0.3ppm、1ppm和0.5ppm。于加热搅拌器中，80℃下70rpm连续搅拌2小时，制得交联浆液，待冷却到25℃，加入步骤(1)制得的硝化类细菌浆液，搅拌均匀，继续加入步骤(2)得到的石膏粉400kg，搅拌均匀，使用螺杆挤出机，制成直径8-10mm，长度10-20mm的圆柱颗粒，放于多层通透架台上，25℃冷风干燥12小时，得到固定化硝化类细菌颗粒。

以上对本发明所提供的一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims (10)

1.一种以石膏为载体固定化硝化类细菌的方法，包括以下步骤：

1)将包埋剂与营养液混合，在20-100℃下搅拌均匀，得到交联浆液，所述包埋剂和所述营养液的质量比为1：(5-50),优选为1：(5-20)，更优选为1：10；

2)将保护剂与硝化类细菌菌液混合，搅拌均匀，得到硝化类细菌浆液，所述保护剂和硝化类细菌菌液的质量比为1：(5-20)，优选为1：10；

3)将交联浆液冷却到45℃以下，优选为10-30℃，更优选为20-25℃，将交联浆液与硝化类细菌浆液混合，搅拌均匀，再与石膏粉混合并搅拌均匀，得到含有硝化类细菌菌剂的载体基质，所述营养液和所述石膏粉质量比为1：(0.4-10)，优选为1:4；

4)将含有硝化类细菌菌剂的载体基质造粒，干燥得到石膏为载体的固定化硝化类细菌菌剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝化类细菌选自硝化细菌和/或反硝化细菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包埋剂选自黄原胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚乙二醇或糊精中的至少一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养液为包含锌、锰、铁、钴和硼的水溶液，所述任一种元素在营养液中的浓度为0.1-50ppm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护剂选自脱脂奶粉、甘油、玉米淀粉、二甲基亚砜中的至少一种。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝化类细菌菌液选自人工培养的硝化类细菌菌液或活性污泥。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人工培养的硝化类细菌菌液中活菌含量为1×10⁸-1×10¹¹cfu/ml，优选为1×10⁹-1×10¹⁰cfu/ml。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性污泥中硝化类细菌含量为1×10⁷-1×10¹⁰cfu/ml，优选为1×10⁸-1×10⁹cfu/ml。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石膏粉的细度为100-500目。

10.如权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述石膏粉为半水熟石膏粉。