CN108147806A - 锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法 - Google Patents

锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，包括以下步骤：(1)制备锶掺杂的羟基磷灰石粉体；(2)将锶掺杂的羟基磷灰石粉体与粘结剂混合均匀，置于底部垫有有机塑料网筛的模具中，经干压成型、高温烧结，冷却后得到锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷。与现有技术相比，本发明采用干压成型技术，以网眼孔径尺寸为25‑75μm的有机塑料网筛作为调控有序结构的模板，在锶掺杂羟基磷灰石的基础上制备表面具有有序微米图案结构，使其具有更好的成骨细胞的黏附、增殖及分化，制备方法新颖、简单易行、且无需特殊设备即可低成本、规模化制备获得具有协同成骨分化作用的锶掺杂表面有序微米结构羟基磷灰石生物陶瓷。

Description

锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法。
背景技术
羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAp)与人骨磷灰石组成结构相似，且具有无毒、安全、良好的生物相容性。在体内，羟基磷灰石在体液的作用下，会部分降解，释放出钙和磷并参与成骨，从而具有骨传导作用。但是，作为骨组织工程细胞外基质替代物的HAp相对亲水性差、细胞吸附力弱以及骨诱导性差，需要进行必要的表面修饰和化学修饰，以提高表面生物活性、利于细胞在材料上的粘附、促进细胞增殖分化以及骨诱导性。近年来研究表明，植入体化学改性和表面形貌修饰可有效提高成骨活性及成骨速率。
锶(Strontium，Sr)作为人体内必需的微量元素，是骨骼和牙齿的重要组成部分，在元素周期表中与钙(Calcium，Ca)同族，化学结构和极性具有相似性，Sr具有刺激骨基质形成，抑制骨吸收的功能。研究表明，Sr掺入HAp后，Sr离子可置换HAp中的Ca离子，成为锶掺杂羟基磷灰石(Sr-HAp)，而且由于Sr离子和Ca离子之间半径和性质的差异，会使原有HAp晶格发生改变，改变HAp的晶体结构和生物降解性，从而使其具有更好的生物相容性和骨传导性。但任何一种元素在体内都存在最佳生物学浓度范围，超过这一范围就会存在毒性风险，Sr-HAp的生物学性能的改变与掺锶量密切相关。
成骨细胞在材料表面的粘附、增殖及分化等生物行为是骨组织再生修复的基础，通过对材料表面结构进行修饰可更好的模拟细胞生存微环境，最大限度地提高细胞的附着和组织整合，有利于骨组织的修复与再生。图案化技术(patterning technique)为材料表面修饰的重要方法，其在微电子、光学、化学等领域已有广泛的研究与应用，而90年代末美国哈佛大学的两位教授所领导的课题组合作完成了材料图案化与细胞响应之间的关系研究，为此技术在生命科学领域的应用开辟了新的道路(Piccolo et al.1997)。2004年，McBeath R等首次研究了材料图案化技术修饰对干细胞的作用。目前，各种类型的图案化技术被应用于制备生物材料的研究，使表面修饰的材料可以对细胞外基质进行细胞水平和分子水平的仿生与模拟，对细胞黏附、增殖、迁移、及分化等生物学行为起到促进作用。近年来研究表明，细胞自身及其形成的黏着结构的尺寸都在微米尺度，微米图案修饰不仅能够精确控制细胞位置、尺寸、形状等多方面，还可以有效促进细胞的黏附、增殖、以及分化等性能，因此微米图案修饰被用于细胞黏附及凋亡行为的研究。进一步，近年来科学家逐渐揭示了表面修饰的一些因素对于干细胞例如骨髓间充质干细胞等的分化、增殖行为也有显著影响，例如细胞间的接触程度和细胞的铺展面积等。综上，微米图案表面修饰对于提高骨组织工程生物材料的性能具有重要作用。
光刻技术和软刻蚀技术(soft lithography)是应用最为普遍的微米图案制备技术。光刻技术的特点是利用刚性的具有精确尺寸的掩模板，根据不同分辨率的刻蚀源，制备不同尺寸、精确度的图案。光刻技术主要包括紫外光光刻(ultraviolet lithography)、极紫外光光刻(extreme ultraviolet lithography)、电子束刻蚀(electron beamlithography)、离子束刻蚀(ion beam lithography)、X线刻蚀等方法(X-raylithography)。同时，适用于细胞研究的软刻蚀技术也包括多种实用的技术方法，例如微接触打印(microcontact printing)、转移光刻技术(transfer lithography technique)、复制模塑(replica molding)、转移微模型(microtransfer molding)、毛细微模塑(micromolding in capillaries)、溶剂辅助微模塑(solvent-assisted micromolding)、近场光刻蚀(near-field photolithography)等。虽然这些技术可以制备并调控一定的图案化结构和尺寸，但具有诸多弊端，例如光刻技术的掩模板制备工艺复杂，成本高，耗时长；机械打磨和激光加工会造成生物陶瓷材料热损伤等。因此，寻找操作简单快捷、成本低、可制备大面积微米图案的表面修饰方法在生物材料研究领域具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，具体步骤为：
(1)制备锶掺杂的羟基磷灰石粉体；
(2)将步骤(1)得到的锶掺杂的羟基磷灰石粉体与粘结剂混合均匀，置于底部垫有有机塑料网筛的模具中，经干压成型、高温煅烧，冷却后即得到锶掺杂协同有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷(缩写标记为Sr-mHAp)。
锶掺杂的量对羟基磷灰石的生物学性能产生重要影响，低浓度的掺锶时，Sr-HAp随着掺Sr浓度增高能更好的促进前成骨细胞和MG63细胞的增殖和分化；高剂量的Sr会使骨组织代谢发生异常，增加骨骼中非胶原蛋白数量和骨组织中矿化结构的溶解。本发明中，通过对不同含量Sr的HAp(Sr-HAp)对细胞相容性及活性进行分析，作为优选的技术方案，羟基磷灰石中锶掺杂的摩尔百分含量为2.5-25％，进一步优选为5-10 mol.％。
上述锶掺杂的羟基磷灰石粉体的制备采用本领域常规的化学沉淀法，如可采用以下步骤：
(a)配置Sr(NO3)2和Ca(NO3)2的混合水溶液，并用氨水调节使溶液的pH>10.5，再配制(NH4)2HPO4的水溶液，并将(Ca+Sr)/P的摩尔比设定在1.67；
(b)在搅拌条件下，将(NH4)2HPO4的水溶液加到Sr(NO3)2和Ca(NO3)2的混合水溶液中，形成白色沉淀物；
(c)将白色沉淀物过滤、用水洗涤、抽干后干燥，干燥后的粉体进行煅烧，研磨过筛即得到锶掺杂的羟基磷灰石粉体。
其中，步骤(b)在搅拌条件下，将(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到Sr(NO3)2和Ca(NO3)2的混合水溶液，滴加完毕后，再搅拌24小时；步骤(c)于120℃干燥6-10小时，干燥后的粉体于800℃煅烧2小时。
作为优选的技术方案，所述的粘结剂为质量百分比浓度为8％的聚乙烯醇，粘结剂的量为羟基磷灰石粉体质量的8％。
作为优选的技术方案，所述有机塑料网筛的网眼孔径为25-75μm，使用网眼孔径为25-75μm的有机塑料筛网所制备的羟基磷灰石表面凸起高度及宽度范围为25-75μm，能使细胞铺展达到最大限度，进一步优选为38μm，其与细胞完全铺展后的尺寸相当，有利于改善细胞生物学行为。
作为优选的技术方案，所述干压成型的压力为50-200kg/cm2。
作为优选的技术方案，所述高温煅烧在1000-1200℃温度下煅烧1-5小时，锶掺杂协同有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷高温烧结在1000-1200℃温度下煅烧1-5小时，即可实现羟基磷灰石生物陶瓷的致密化，达到良好的力学强度，且不引起羟基磷灰石生物陶的相变。
本发明采用干压成型技术，以网眼孔径尺寸为25-75μm的有机塑料网筛作为调控有序结构的模板，在锶掺杂羟基磷灰石的基础上制备表面具有有序微米图案结构，能够缓释Sr离子，使其具有更好的成骨细胞的黏附、增殖及分化，从而提高羟基磷灰石的成骨活性。该制备方法新颖、简单易行、且无需特殊设备即可低成本、规模化制备获得具有协同成骨分化功能的锶掺杂表面有序微米结构羟基磷灰石生物陶瓷，克服了现有制备方式的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例中的SEM照片；
图2为BMSCs增殖情况；
图3为共聚焦显微镜拍摄的BMSCs细胞骨架及形态；
图4为BMSCs分别在Sr10％-mHAp、Sr10％-HAp、mHAp及HAp陶瓷表面培养后的ALP活性；
图5为BMSCs分别在Sr10％-mHAp、Sr10％-HAp、mHAp及HAp陶瓷表面培养后的成骨分化相关基因表达结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
一种锶协同表面有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法，根据实际需要，选择不同孔径的有机塑料网筛以调控材料表面的微米图案化结构，并可根据需要掺杂不同的功能性元素或离子。通过Ca离子与Sr离子的置换，使Sr离子取代部分Ca离子形成锶掺杂的羟基磷灰石(Sr-HAp)，以Sr-HAp陶瓷粉体为原料采用有机塑料网筛为模板压制成型、经高温烧结后即获得表面具有有序微米结构的Sr-HAp生物陶瓷材料。
具体过程为，首先采用化学沉淀法制备不同浓度Sr掺杂的HAp生物陶瓷粉体。在后续压制成型过程中，采用有机塑料网筛为模板，修剪尺寸使其与不锈钢模具内侧直径大小一致。将制备得到的Sr掺杂羟基磷灰石陶瓷粉体与聚乙烯醇粘结剂(质量百分比浓度为8％的水溶液)混合、搅拌均匀后备用。将修剪后的尼龙筛网放置在不锈钢的模具底部，然后加入经粘结剂调制后的Sr掺杂羟基磷灰石陶瓷粉体，以50-200kg/cm2的压力压制成型、于1000-1200℃高温煅烧1-5h，即获得本发明的具有协同成骨分化功能的锶掺杂表面有序微米结构羟基磷灰石生物陶瓷。
在Sr-mHAp制备的过程中，可根据需要调节Sr掺杂量，同时以有机塑料网筛作为表面有序微米结构的模板，该模板在高温烧结过程中可以被完全煅烧去除，不会留下残留物。同时，可通过使用不同孔径的有机塑料网筛来实现Sr-mHAp表面有序微米结构的不同尺寸大小(如凸起高度、凸起宽度、相邻凸起间距等)。因此，此Sr-mHAp具有可调节的锶离子释放，且具有表面可调节的微米结构。
该方法在Sr掺杂的基础上，采用具有有序孔径结构的有机塑料网筛作为模板，对HAp生物陶瓷进行双重改性，更好的起到促进成骨的作用。即Sr离子的释放可促进成骨细胞增殖及分化，抑制破骨细胞的吸收；而表面有序的微米结构能够促进成骨细胞、骨髓间充质干细胞的黏附及分化，因此可以在硬组织缺损修复的过程中起到协同促成骨分化用，具有可调节的离子浓度释放、可调控表面有序结构及尺寸、制备工艺简单易行、成本低廉、易规模化制备等优点。
实施例1
将10％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷粉体及粘结剂(质量百分比为8％的聚乙烯醇)混合均匀后，置于底部垫有孔径为38μm的有机塑料网筛的不锈钢模具中，于100kg/cm2压力下干压成型后；然后于1050℃高温煅烧5h，随炉冷却降温后，既可得到10％锶掺杂表面有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷(Sr10％-mHAp)。
实施例2
将5％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷粉体及粘结剂(质量百分比为8％的聚乙烯醇)混合均匀后，置于底部垫有孔径为25μm的有机塑料网筛的不锈钢模具中，于200kg/cm2压力下干压成型后；然后于1000℃高温煅烧3h，随炉冷却降温后，既可得到5％锶掺杂表面有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷(Sr5％-mHAp)。
实施例3
将20％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷粉体及粘结剂(质量百分比为8％的聚乙烯醇)混合均匀后，置于底部垫有孔径为75μm的有机塑料网筛的不锈钢模具中，于150kg/cm2压力下干压成型；然后于1200℃高温煅烧2h，随炉冷却降温后，既可得到20％锶掺杂表面有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷(Sr20％-mHAp)。
实施例4
将2.5％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷粉体及粘结剂(质量百分比为8％的聚乙烯醇)混合均匀后，置于底部垫有孔径为25μm的有机塑料网筛的不锈钢模具中，于50kg/cm2压力下干压成型；然后于1000℃高温煅烧5h，随炉冷却降温后，既可得到2.5％锶掺杂表面有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷。
实施例5
将25％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷粉体及粘结剂(质量百分比为8％的聚乙烯醇)混合均匀后，置于底部垫有孔径为75μm的有机塑料网筛的不锈钢模具中，于200kg/cm2压力下干压成型；然后于1200℃高温煅烧1h，随炉冷却降温后，既可得到25％锶掺杂表面有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷。
实施例6
将15％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷粉体及粘结剂(质量百分比为8％的聚乙烯醇)混合均匀后，置于底部垫有孔径为60μm的有机塑料网筛的不锈钢模具中，于150kg/cm2压力下干压成型；然后于1100℃高温煅烧3h，随炉冷却降温后，既可得到15％锶掺杂表面有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷。
对制得的产品进行性能评价，具体为：
(1)通过SEM照片(电子扫描图)观察有序微米结构的表面
以10％的锶掺杂浓度的羟基磷灰石为例，使用网筛孔径为38μm的有机塑料网筛为模板，制备出的10％锶掺杂表面有序微米结构羟基磷灰石生物陶瓷(Sr10％-mHAp)，SEM观察Sr10％-mHAp生物陶瓷的表面形貌，以及未采用有机塑料网筛制备的掺锶羟基磷灰石生物陶瓷(Sr10％-HAp)、使用有机塑料网筛为模板制备的纯羟基磷灰石生物陶瓷(mHAp)、未采用有机塑料网筛制备的纯HAp生物陶瓷的SEM照片，如图1所示，其中A1-D1：×100倍；A2-D2：×30000倍。
(2)生物学评价
以Sr10％-mHAp为例评价其对细胞黏附的影响功能：将骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别接种Sr10％-mHAp、Sr10％-HAp、mHAp及HAp上，6小时后用鬼笔环肽对细胞肌动蛋白染色，激光共聚焦显微镜观察细胞形态及骨架。
以Sr5％-HAp、Sr10％-HAp、Sr20％-HAp生物陶瓷为例，分别研究其对BMSCs的增殖作用，如图2所示。
以Sr10％-mHAp为例评价其对细胞成骨分化的作用：分别研究Sr10％-mHAp对BMSCs碱性磷酸酶活性及成骨基因表达等的促进作用。
与10％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷(Sr10％-HAp)、以孔径为38μm的有机塑料网筛为模板制备的羟基磷灰石生物陶瓷(mHAp)、传统平板结构的纯羟基磷灰石生物陶瓷(HAp)相比，Sr10％-mHAp生物陶瓷上培养的细胞黏附效果最好，铺展状态也最好、细胞骨架形态也最为饱满(图3)。细胞培养7、10天后，细胞碱性磷酸酶活性也较高(图4)，其表面具有最佳的促成骨分化作用。同时，采用本发明的Sr10％-mHAp陶瓷样品，其细胞培养后，与成骨相关的Runx-2、OCN、OPN、BMP-2等基因的表达也均显著高于其他三种样品(图5)。可见，与Sr10％-HAp、mHAp、HAp相比，采用本发明方法制备得到的Sr10％-mHAp生物陶瓷具有更好的促细胞黏附、增殖和成骨分化的生物特性。
具体结果如图1-5所示。
图1示出了本发明制备的Sr10％-mHAp以及用于对照组的10％锶掺杂的羟基磷灰石生物陶瓷(Sr10％-HAp)、孔径为38μm的有机塑料网筛为模板制备的羟基磷灰石生物陶瓷(mHAp)、无模板制备的纯羟基磷灰石生物陶瓷(HAp)的SEM照片。低倍镜下可见使用有机塑料网筛制备的HAp生物陶瓷(B1、D1)表面具有有序阵列的凹凸结构，未采用有机塑料网筛制备的HAp(A1、C1)表面为平板结构；高倍镜下可见，Sr掺杂的HAp(C2、D2)晶体结构较未掺杂HAp(A2、B2)更为致密。表明：采用本发明，可以在Sr掺杂的羟基磷灰石基础上，通过以有机塑料网筛为模板，通过干压成型及高温段受获得锶掺杂表面有序微米结构羟基磷灰石生物陶瓷。
图2示出了本发明制备的分别为5、10、20％锶掺杂羟基磷灰石生物陶瓷(Sr5％-HAp、Sr10％-HAp、Sr20％-HAp)BMSCs增殖情况，可见与普通HAp相比，在1、4、7天时，Sr5％-HAp、Sr10％-HAp、Sr20％-HAp均能促进BMSCs增殖，其中，Sr5％-HAp、Sr10％-HAp与HAp相比，其促进作用最显著。
图3示出了共聚焦显微镜拍摄的使用本发明方法制备的Sr10％-mHAp，以及Sr10％-HAp、mHAp及HAp生物陶瓷上培养的BMSCs细胞骨架及形态；可见，以孔径为38μm的有机塑料网筛为模板制备的mHAp及Sr10％-mHAp上，BMSCs的黏附效果较好，细胞骨架形态更为饱满，呈现完全的铺展状态。表明：采用本发明，获得的具有有序微米结构的羟基磷灰石生物陶瓷具备最佳的促进BMSCs细胞黏附效果。
图4为BMSCs分别在Sr10％-mHAp、Sr10％-HAp、mHAp及HAp陶瓷表面培养7、10天后的ALP活性。可见采用本发明制备得到的表面有序微米图案化结构及Sr掺杂均可促进BMSCs的ALP活性，且同时具备Sr掺杂和表面微米有序图案化结构(Sr10％-mHAp)的生物陶瓷样品的促成骨分化效果最明显，即Sr掺杂或者表面有序微米图案化结构的羟基磷灰石生物陶瓷均可促进BMSCs的ALP活性，而同时具备Sr掺杂及表面有序微米图案化结构的羟基磷灰石生物陶瓷可协同促进ALP活性。
图5为BMSCs分别在Sr10％-mHAp、Sr10％-HAp、mHAp及HAp陶瓷表面培养4、7天后的成骨分化相关基因表达结果。如图可见，应用本发明方法制备得到的表面微米图案化结构及Sr掺杂均可促进BMSCs的成骨基因的表达，而同时具备Sr掺杂和表面微米有序图案化结构(Sr10％-mHAp)的生物陶瓷样品对成骨分化相关基因的促进效果最明显，即Sr掺杂或者表面有序微米图案化结构的羟基磷灰石生物陶瓷均可促进BMSCs成骨基因的表达，同时具备Sr掺杂及表面有序微米图案化结构的羟基磷灰石生物陶瓷可协同更好的促进BMSCs成骨基因的表达。

Claims (6)

1.一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，其特征在于：将经与粘结剂均匀混合后的含锶羟基磷灰石生物陶瓷粉体置于底部垫有有机塑料网筛的不锈钢模具中，经干压成型、高温煅烧，即制备得到该产品。
2.根据权利要求1所述的一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石中锶掺杂量为摩尔百分含量2.5-25％。
3.根据权利要求2所述的一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石中锶掺杂量为摩尔百分含量5-10％。
4.根据权利要求1所述的一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，其特征在于，所述有机塑料网筛的网眼孔径为25-75μm。
5.根据权利要求1所述的一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，其特征在于，所述干压成型的压力为50-200kg/cm2。
6.根据权利要求1所述的一种锶协同有序微米结构成骨的羟基磷灰石生物陶瓷制备方法，其特征在于，所述高温煅烧在1000-1200℃温度下煅烧1-5小时。
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