CN105565796A - 表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法,所述方法包括:将羟基磷灰石粉体、粘结剂均匀混合后,置于表面垫有有机网筛的模板中,依次经干压成型、高温煅烧得到所述表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有促成骨活性功能的表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法与应用,属生物医用材料领域。
背景技术
人工合成的HAp材料因其与人骨/牙的无机成分相似,且具有无毒、安全、良好的生物活性和生物相容性的特点,在体液作用下,会发生部分降解,释放出钙和磷参与成骨,从而具有骨传导作用。因此受到生物材料领域和骨科临床医生的极大关注,并在临床骨修复材料领域得到广泛应用。但是,传统方法烧结制备得到的HAp生物陶瓷材料的诱导成骨活性仍然较差,在植入骨缺损部位时时有纤维组织包埋植入体的现象,进而导致HAp植入体与新生骨组织之间不能形成良好的骨性结合,因此缺乏良好的诱导成骨活性[Biomaterials.2003;24:2161]。研究发现,在HAp材料表面构筑微/纳米结构可以明显提高细胞粘附、增殖和成骨分化性能,进而改善这类材料的骨诱导活性[ActaBiomaterialia.2012;8:3794]。
二十世纪90年代末,图案化技术(patterningtechnique)被大量应用于生物材料的制备。1997年美国哈佛大学的Whitesides教授课题组和哈佛医学院的Ingber教授课题组采用微接触技术和分子自组装技术在抗细胞黏附的材料表面上构筑了不同尺寸的微米图案,并对图案的尺寸与细胞响应之间的关系进行了研究[Science.1997;276:1425]。研究结果表明微米图案结构可以促进细胞黏附和生长,并实现对细胞的黏附位置、尺寸、形状、爬行方向等的精确控制。自此,多种技术被发展并应用于表面图案化生物材料的制备领域。近年来的研究发现:表面简单的微米柱或凹坑构筑的“脊一槽”状拓扑状微米图案化结构即能良好的促进细胞黏附、增殖、迁移、及分化等生物学性能[Biomaterials.2012;33:1730.;Biomaterials.2006;27:2558.;TissueEngPartA.2009;15:1427]。McNamara等人的研究还还发现细胞在沟槽拓扑结构表面的力学信号传导伴随着细胞骨架、细胞核形态和染色体位置的变化,揭示了图案化结构下细胞对力学信号的响应、以及图案化结构与亚细胞结构之间的关联[Biomaterials.2012;33:2835]。总之,微米图案结构可以有效促进细胞的黏附、增殖、以及分化等性能,进而提高提高材料的诱导成骨活性和骨整合性能。
目前微米图案制备方法主要有光刻[MaterialsScienceandEngineering:C.2009;29:1855]、软光刻技术[Biomaterials.1999;20:2363.;ElsevierScience.2006;161]、微流体图形化[AnalyticalChemistry.2011;84:1012]、微接触压印[JBiomedMaterRes.2001;55:487]、模板掩盖喷涂技术[JBiomedMaterResA.2008;85A:530]、自组装方法[SoftMatter.2011;7:6811]、扫描探针显微加工技术[JournalofLaserMicro/Nanoengineering.2011;6:180]、纳米压印技术[MaterialsScienceandEngineering:C.2009;29:]、浸蘸笔纳米加工刻蚀技术(dip-pennanolithography,DPN)[LabChip.2010;10:1662]、胶体光刻方法[NanoToday.2011;6:608]、离子束加工技术[MaterialsSciencewithIonBeams.2010;116:345]等。虽然利用这些技术可以实现图案化结构的制备和尺寸调控,但需要以昂贵的设备和复杂的操作为代价。而对于陶瓷材料,由于其脆性大,目前基本只能采用机械打磨、激光加工(刻槽、挖坑)、直接打印等方法。这些方法都各有缺点:如机械打磨易损坏样品,激光加工会造成热损伤。
因此,发展一种简单易行、成本低廉且无需特殊设备的制备表面有序微米图案化结构生物陶瓷材料的制备方法具有重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明旨在克服现有表面有序微米图案化结构生物陶瓷材料的制备方法的缺陷,本发明提供了一种具有促成骨活性功能的表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法。
本发明提供了一种表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法,所述方法包括:
将羟基磷灰石粉体、粘结剂均匀混合后,置于表面垫有有机网筛的模板中,依次经干压成型、高温煅烧得到所述表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷。
较佳地,粘结剂的含量为羟基磷灰石粉体质量的1-5%,粘结剂包括质量百分比浓度为1—10%的聚乙烯醇、质量百分比浓度为1-5%的羟丙基甲基纤维素。
较佳地,所述有机网筛为经高温煅烧能够去除的尼龙网筛,所述有机网筛的目数为50—500目。
较佳地,干压成型的工艺参数包括:成型压力为2—10MPa。
较佳地,高温烧结的参数包括:在900-1300℃温度下煅烧1-5小时。
较佳地,所述表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的凸起高度、凸起宽度、相邻凸起间距分别在5-100微米、15-200微米、15-300微米范围内。
本发明的有益效果:
(1)表面图案化结构评价
采用扫描电镜(SEM)观察本发明制备得到的表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷的表面形貌;采用三维(3D)激光显微镜观察样品的表面三维结构,以测试图案化结构中凸起宽度、高度及其间距;
(2)生物学评价
有序微米结构对大鼠来源的骨髓间充质干细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCs)的黏附作用研究:将BMSCs细胞接种在表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷上,以平板结构HAp生物陶瓷为对照组样品,于接种后6小时后进行细胞肌动蛋白染色,培养1天后进行扫描电镜观察细胞的粘附及生长情况;
有序微米结构对BMSCs的增殖、成骨分化的作用研究:将细胞接种在表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷上,以平板结构HAp生物陶瓷作为对照组样品,研究有序微米图案化结构促BMSCs的增殖、成骨基因表达等功能。
附图说明
图1示出了本发明的一个实施方式中表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷的制备工艺流程图;
图2示出了未采用尼龙网筛制备的HAp生物陶瓷(对照组)、以及本发明的一个实施方式中制备的表面有序微米结构的HAp生物陶瓷的SEM照片;
图3示出了未采用尼龙网筛制备的HAp生物陶瓷(对照组)、以及本发明的一个实施方式中制备的HAp生物陶瓷进行细胞培养所得细胞的形态SEM扫描图;
图4示出了BMSCs在未采用尼龙网筛制备的HAp生物陶瓷(对照组)、以及在本发明的一个实施方式中制备的HAp陶瓷表面培养1、3、7天后的增殖情况;
图5示出了骨髓间充质干细胞在未采用尼龙网筛制备的HAp生物陶瓷(对照组)、以及在本发明的一个实施方式中制备的HAp陶瓷表面培养4、7天后的分化结果。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明,应理解,附图及下述实施方式仅用于说明本发明,而非限制本发明。
本发明涉及一种具有促进成骨的表面有序微米图案化结构羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2,HAp)生物陶瓷的制备与应用,属生物医用材料领域。
本发明的目的在于提供一种表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷的制备方法,制备得到的表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷较传统平板结构材料具有更好的促进成骨细胞、骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化等功能,从而提高HAp材料的成骨活性。此方法可以根据实际需要,选择不同筛目的尼龙网筛以调控微米图案化结构的尺寸大小以及凹坑结构的深度。
所述制备方法包括:
以HAp陶瓷粉体为原料采用有机网筛为模板压制成型后、经烧结即可获得表面有序微米尺度凹凸状图案化结构的HAp生物陶瓷材料,而其表面结构的尺寸可以通过调控模板的尺度加以调控。
具体来说,以HAp粉体为原料、以尼龙网筛为模板,经干压成型和高温煅烧而获得。
在干压成型过程中,在医用不锈钢的模具内先垫上一层与模具尺寸一致的尼龙网筛,然后加入HAp粉体,经干压成型获得素坯,而后素坯经高温煅烧后即可获得本发明的具有表面有序微米图案化结构的HAp陶瓷。
在HAp粉体中加入1-5%(质量百分比)的浓度为1-10%的PVA(聚乙烯醇)作黏结剂,搅拌均匀。在接下来的压制成型过程中,首先将尼龙网筛裁剪成与医用模具相同的尺寸,在医用模具内垫上一层与模具相同尺寸的尼龙网筛,然后在网筛上方加入一定质量的经PVA(聚乙烯醇)黏结剂调好后的HAp粉体,以2-10MPa的压力干压成型获得本发明的陶瓷素坯;将素坯在900-1300℃温度下煅烧1-5小时,即可制备得到表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷。
以尼龙网筛作为表面微米有序图案化结构的模板,该模板在高温烧结过程中可以被完全煅烧去除,而不会留下残留物。同时,通过改变尼龙网筛的目数可以实现本发明的HAp陶瓷表面有序微米图案化结构中凸起和凹坑的尺寸范围(如分别实现凸起高度、凸起宽度、相邻凸起间距分别在5-100微米、15-200微米、15-300微米范围)。具有有序凹凸结构、且凸起高度(或凹坑深度)、凸起宽度、相邻凸起间距等可调的微米图案化结构。
这种有序微米图案化结构能够显著促进成骨细胞、骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化,可以在硬组织缺损修复领域和体外骨组织细胞培养等方面获得应用。制备得到的微米图案化结构HAp陶瓷具有较传统平板结构HAp陶瓷材料更好的促成骨细胞、骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化特性,可以用于硬组织缺损修复材料、体外骨组织细胞的培养等。本发明具有容易调控表面有序结构及尺寸、制备工艺简单易行、成本低廉、易规模化制备等优点。
本发明专利采用具有有序孔结构的尼龙网筛作为模板,在HAp生物陶瓷表面构建有序微米图案结构。该制备方法新颖、简单易行、且无需特殊设备即可低成本、规模化制备获得一种具有促成骨活性的表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷材料。
性能评价
(1)表面图案化结构评价
采用扫描电镜(SEM)观察本发明制备得到的表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷的表面形貌;采用三维(3D)激光显微镜观察样品的表面三维结构,以测试图案化结构中凸起宽度、高度及其间距;
(2)生物学评价:
有序微米结构对大鼠来源的骨髓间充质干细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCs)的黏附作用研究:将BMSCs细胞接种在表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷上,以平板结构HAp生物陶瓷为对照组样品,于接种后6小时后进行细胞肌动蛋白染色,培养1天后进行扫描电镜观察细胞的粘附及生长情况;
有序微米结构对BMSCs的增殖、成骨分化的作用研究:将细胞接种在表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷上,以平板结构HAp生物陶瓷作为对照组样品,研究有序微米图案化结构促BMSCs的增殖、成骨基因表达等功能。
图1示出了本发明专利一个实施方式中的表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷的制备工艺流程图;
图2示出了对照组以及本发明制备的表面有序微米结构的HAp生物陶瓷的SEM照片。图2中A是指在压制成型时不采用尼龙网筛制备得到的表面平板结构HAp生物陶瓷的形貌图,并作为对照组样品用;图2中B、C和D分别为采用100目、200目和400目尼龙网筛制备得到的表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷的SEM图。由图可见,制备得到的材料表面具有有序阵列的凹凸结构,并且凸起的宽度、高度及其间距可以通过调整尼龙网筛的网眼目数予以有效调控;
图3示出了细胞形态的SEM扫描图。图3中A为BMSCs在平板结构对照组样品表面培养1天后的扫描电镜图片,图3中B、C和D则分别为细胞在100目、200目和400目尼龙网筛为模板制备得到的表面有序微米图案化结构HAp陶瓷表面的SEM图。可见,表面图案化结构较平板结构能够更好地促进BMSCs的黏附,细胞呈现完全的铺展状态、出现大量的尾足、且细胞更加饱满;
图4示出了BMSCs在HAp陶瓷表面培养1、3、7天后的增殖情况。其中,4中A是指BMSCs在压制成型时不采用尼龙网筛所得的平板结构HAp生物陶瓷上增殖,图4中B、C、D是指BMSCs在采用100目、200目、400目尼龙网筛为模板制备得到的表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷上增殖。如图可见,应用本发明方法制备得到的表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷能够明显促进细胞的增殖;
图5示出了骨髓间充质干细胞在HAp陶瓷表面培养4、7天后的分化结果。其中,图5中A是指骨髓间充质干细胞在压制成型时不采用尼龙网筛所得的平板结构HAp生物陶瓷上培养,图5中B、C、D是指骨髓间充质干细胞在采用100目、200目和400目尼龙网筛为模板制备得到的表面有序微米图案化结构HAp生物陶瓷上培养。如图可见,应用本发明方法制备得到的表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷能够明显促进细胞的成骨基因表达,即表明有序微米图案化结构能显著促进细胞的成骨分化,进而促进体内成骨和骨整合性能。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解,以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例,即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择,而并非要限定于下文示例的具体数值。
除非另有定义或说明,本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例1:
采用400目的尼龙网筛为模板,将其裁剪成与医用模具相同的尺寸。然后称量一定质量的HAp粉体,向其中加入HAp粉体质量6%的质量百分比浓度为5%的聚乙烯醇(PVA)黏结剂,并搅拌混合均匀。准备好压制成型的模具,在模具表面先垫上一片之前准备好的尼龙网筛,然后将混合均匀的HAp粉体倒入模具内,在6MPa的压力下将其干压成型,然后将获得的HAp陶瓷压片在1100℃煅烧3小时。即可得表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷。得到的有序微米图案化结构是种凹凸结构,并且凸起的平均宽度约131μm,平均高度约70μm,平均凸起间距约110μm;
与平板结构HAp生物陶瓷相比(图2中A),这种产品培养的细胞伸展形态更好、细胞骨架也更大(图3),细胞培养1天、3天和7天后,细胞数量(OD值)较平板结构分别提高了34.5%、72.1%和80%(图4),与成骨相关的BMP-2、COL1、OCN、OPN等基因的表达较平板结构提高了53%-625%(图5)。对照组的平板结构相比,有序微米图案化结构具有更好的促细胞黏附、增殖和成骨分化的生物特性。
实施例2:
采用200目的尼龙网筛为模板,将其裁剪成与医用模具相同的尺寸。然后称量一定质量的HAp粉体,向其中加入HAp粉体质量4%的质量百分比浓度为6%的聚乙烯醇(PVA)黏结剂,并搅拌混合均匀。准备好压制成型的模具,在模具表面先垫上一片之前准备好的尼龙网筛,然后将混合均匀的HAp粉体倒入模具内,在8MPa的压力下将其干压成型,然后将获得的HAp陶瓷压片在1100℃煅烧2小时。即可得表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷。得到的有序微米图案化结构是种凹凸结构,并且凸起的平均宽度为59.02μm,平均高度为20.71μm,平均凸起间距为55.18μm;
细胞生物学实验结果也表明:获得的表面有序微米图案化结构能够显著促进BMSCs的黏附、增殖和成骨基因的高表达。
实施例3:
采用100目的尼龙网筛为模板,将其裁剪成与医用模具相同的尺寸。然后称量一定质量的HAp粉体,向其中加入HAp粉体质量8%的质量百分比浓度为8%的聚乙烯醇(PVA)黏结剂,并搅拌混合均匀。准备好压制成型的模具,在模具表面先垫上一片之前准备好的尼龙网筛,然后将混合均匀的HAp粉体倒入模具内,在10MPa的压力下将其干压成型,然后将获得的HAp陶瓷压片在1150℃煅烧3小时。即可得表面有序微米图案化结构的HAp生物陶瓷。得到的有序微米图案化结构是种凹凸结构,并且凸起的平均宽度为27.80μm,平均高度为13.79μm,平均凸起间距为23.99μm;
细胞生物学实验结果也表明:获得的表面有序微米图案化结构能够显著促进BMSCs的黏附、增殖和成骨基因的高表达。
Claims (6)
1.一种表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
将羟基磷灰石粉体、粘结剂均匀混合后,置于表面垫有有机网筛的模板中,依次经干压成型、高温煅烧得到所述表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,粘结剂的含量为羟基磷灰石粉体质量的1-5%,粘结剂包括质量百分比浓度为1—10%的聚乙烯醇、质量百分比浓度为1%-5%的羟丙基甲基纤维素。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述有机网筛为经高温煅烧能够去除的尼龙网筛,所述有机网筛的目数为50—500目。
4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法,其特征在于,干压成型的工艺参数包括:成型压力为2—10MPa。
5.根据权利要求1-4中任一所述的制备方法,其特征在于,高温烧结的参数包括:在900-1300℃温度下煅烧1-5小时。
6.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法,其特征在于,所述表面有序微米图案化结构羟基磷灰石生物陶瓷的凸起高度、凸起宽度、相邻凸起间距分别在5-100微米、15-200微米、15-300微米范围内。
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