CN108139386A - 肿瘤的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肿瘤的检测方法，其为简便且廉价的肿瘤的检测方法，其作为一次性诊断，具有充分的准确度并且能够稳定利用。本发明涉及肿瘤的检测方法，其特征在于，包括将被检查者的毛发用作生物样本，测定毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的第一工序；和将上述含量与和健康者的毛发相关的正常值进行比较的第二工序，在上述含量大于正常值时，判定为有肿瘤存在的可能性。

Description

肿瘤的检测方法
技术领域
本发明涉及利用毛发的简便且廉价的肿瘤的检测方法。
背景技术
近年来，随着肿瘤诊断的需要增加，如诊察胃癌时使用X线检查、诊察乳癌时使用视触诊和X线(乳房X线照相术，Mammography)检查的组合等，一般在各诊察中使用不同的手法。
但是，使用X线等的检查不仅对被检查者造成很大负担，从费用和时间的观点考虑也存在问题。另外，能够进行检查的机构或场所受限，因此很难说受诊率高。于是，如果能够简便且廉价地对肿瘤的有无进行一次性诊断(筛选)，则能够定期确认状况，能够通过肿瘤的早期发现来飞跃性地提高治疗的可能性。
相对于此，例如专利文献1(专利第4608432号公报)中，提出了一种早期癌的检测方法，其特征为，使抗N1,N12-二乙酰基精胺抗体与生物样本发生反应，该检测方法将尿作为生物样本。
在上述专利文献1所记载的检测方法中，发现二乙酰基精胺作为肿瘤标记物有用这一点，成功制作了不与作为二乙酰基精胺类似物质的其它尿中多胺发生交差反应、而仅对二乙酰基精胺发生特异性反应的抗体。
另外，专利文献2(国际公开第WO2011/136343号)中，提出了一种肿瘤的检测方法，其特征为，测定活组织中的N1,N12-二乙酰基精胺的量，并将所得到的测定结果与肿瘤相关连，该检测方法的特征为，一同测定患部组织中的N1,N12-二乙酰基精胺的量和该患部周边的正常组织中的N1,N12-二乙酰基精胺的量。
在上述专利文献2所记载的检测方法中，对来自同一个体(同一患者等)的活组织、即患部组织与其周边的正常组织，通过比较每单位组织重量的N1,N12-二乙酰基精胺含量，能够消除因该含量的个体差所导致的影响，因此能够以极高的准确度判定癌组织的存在。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4608432号公报
专利文献2：国际公开第WO2011/136343号
发明内容
发明所要解决的技术问题
上述专利文献1所记载的检测方法中，需要被检查者自身排除污染采集尿并送到分析机构。另外，已知不仅尿的组成容易受身体状况的影响，而且由于除恶性肿瘤以外的炎症、感染、烫伤和胶原病等，也会使多胺量显示高的值。
另外，上述专利文献2所记载的检测方法中，需要通过利用外科手术的切除、内视镜下活检和针活检等从被检查者采集活组织，被检查者的身体负担增大。另外，费用和时间上的问题也依然存在。
鉴于如上的现有技术中的问题点，本发明的目的在于，提供一种肿瘤的检测方法，其为简便且廉价的肿瘤的检测方法，其作为一次性诊断，具有充分的准确度并且能够稳定利用。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明人为了达成上述目的，对肿瘤的检测方法重复进行深入研究的结果，发现测定毛发的多胺含量等极其有效，由此完成本发明。
即，本发明提供一种肿瘤的检测方法，其特征在于，
该检测方法包括：
将被检查者的毛发用作生物样本，测定上述毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的第一工序；和
将上述含量与和健康者的毛发相关的正常值进行比较的第二工序，
在上述含量大于上述正常值时，判定为有肿瘤存在的可能性。
多胺为腐胺、尸胺、亚精胺和精胺以及它们的衍生物等的总称，由作为氨基酸的一种的精氨酸或鸟氨酸在体内合成，是在生物体内广范分布的生理活性物质。已知多胺的代谢与细胞增殖相关连而活性化，与正常组织相比，在各种癌组织中的含量会增加。
着眼于多胺的现有的肿瘤的检测方法中，由于生物样本为癌组织或尿，存在采集困难等的问题。相对于此，在本发明的肿瘤的检测方法中，通过将被检查者的毛发作为生物样本，能够大幅度降低被检查者的身体负担，除此之外，能够由被检查者自身容易地采集生物样本。此外，评价毛发的多胺含量的想法是由本发明的发明人首次提出的，该含量与肿瘤的存在有相关这一点是通过本发明的发明人的验证而得知的。
鸟氨酸(ORN)为氨基酸的1种、是构成尿素循环的物质之一。本发明的发明人对癌患者的毛发所含的鸟氨酸(ORN)含量进行深入研究的结果，得知癌患者的毛发中存在鸟氨酸(ORN)含量增加的倾向。即，根据该鸟氨酸(ORN)含量也能够简便并且高效地筛选肿瘤的有无。
只要不损害本发明的效果，第一工序中测定毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的方法就能够使用现有公知的测定方法，优选使用各种质谱分析。作为质谱分析，例如能够使用液相色谱质谱分析(LC/MS/MS分析)、电喷雾离子化液相色谱质谱分析(LC/ESI-MS/MS分析)。
在此，作为上述第一工序的上述测定所涉及的样本调节的前处理，优选对上述毛发实施干式粉碎。通过对在提取溶剂中进行湿式粉碎的毛发预先进行干式粉碎，能够高效进行被测定成分向溶剂中的提取，能够提高通过质谱分析得到的测定强度。
在第二工序中的毛发的多胺或鸟氨酸的含量的比较中，“和健康者的毛发相关的正常值”能够使用和被检查者自身相关的过去的测定值和/或预先取得的数据库(从各种年龄、性别和人种的健康者采集毛发并测定多胺或鸟氨酸的含量而制成的数据库)的值。
在本发明的肿瘤的检测方法中，在第一工序中测得的多胺和/或鸟氨酸的含量为正常值的标准偏差以上时，判定(阳性判定)或者警告有肿瘤存在的可能性，由此，被检查者能够以极高的准确度认知肿瘤的存在。此外，根据肿瘤的种类或位置等而需要详细的信息时，利用本发明的肿瘤的检测方法判定为阳性之后接受一般的检查即可。
在本发明的肿瘤的检测方法中，优选在上述第一工序中，测定上述鸟氨酸的上述含量，在上述第二工序中，将上述鸟氨酸的上述含量与上述正常值进行比较。如果肿瘤存在，则毛发的多胺和鸟氨酸的含量有增加的倾向，特别是在鸟氨酸中显著，通过以鸟氨酸的含量作为指标，能够简便并且高效地检测肿瘤。
另外，在本发明的肿瘤的检测方法中，上述多胺优选为选自精胺、亚精胺、腐胺和二氨基丙烷中的至少一种多胺，更优选为亚精胺。如果肿瘤存在，毛发的多胺含量有增加的倾向，特别是在精胺、亚精胺、腐胺和二氨基丙烷中显著，多数情况下，在亚精胺中最明显地出现。
另外，在本发明的肿瘤的检测方法中，优选使健康者与被检查者的年龄差为±5岁。毛发的多胺和鸟氨酸的含量受被检查者的年龄的影响，但通过使健康者与被检查者的年龄差为±5岁，能够更加正确地进行肿瘤的检测。
另外，在本发明的肿瘤的检测方法中，优选使健康者与被检查者为相同的人种和性别。毛发的多胺和鸟氨酸的含量还受人种和性别的影响，因此，通过使健康者与被检查者为相同人种和性别，能够更加正确地进行肿瘤的检测。
另外，在本发明的肿瘤的检测方法中，优选上述毛发为在美容院或理发店采集的毛发。美容院和理发店是定期去的场所，除此之外，容易采集减下来的毛发，能够不使用不必要的劳力而确保生物样本。另外，通过预先向美容师或理发师说明，能够使所采集的毛发的部位和清洗状态等保持一定。
另外，在本发明的肿瘤的检测方法中，通过利用美容院或理发店的顾客管理系统等保留毛发采集的履历，能够持续确认采集信息，能够有助于“对健康的关注”、“受诊率和发现率的提高”等。美容院或理发店不仅店铺数量多，还保存着各种顾客信息，因此能够适合活用为采集作为生物样本的毛发的场所。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种肿瘤的检测方法，其为简便且廉价的肿瘤的检测方法，作为一次性诊断，具有充分的准确度并且能够稳定利用。
附图说明
图1是本发明的肿瘤的检测方法的工序图。
图2是表示多胺类的含量的平均值和标准偏差的图表。
图3是表示鸟氨酸含量的平均值的图表。
图4是实施例2的分析的工序图。
图5是实施例3的鸟氨酸的测定结果。
图6是实施例3的二氨基丙烷的测定结果。
图7是实施例3的腐胺的测定结果。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的肿瘤的检测方法的代表性实施方式进行详细说明，但本发明不仅仅限定于此。此外，以下的说明中，有时对相同或相应部分标注相同符号，省略重复的说明。
图1是本发明的肿瘤的检测方法的工序图。本发明的肿瘤的检测方法包括：测定从被检查者采集的毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的第一工序(S01)；和将多胺和/或鸟氨酸的含量进行比较的第二工序(S02)。以下，对这些各工序进行详细说明。
(1)毛发的采集(预备工序(S00))
预备工序(S00)为从被检查者采集毛发并确保生物样本的工序。采集毛发的方法只要不损害本发明的效果就没有特别限定，优选尽可能排除污染，并在定期进行检查的情况下从大致相同部位采集。
虽然也可以由被检查者自身容易地进行毛发的采集，但通过在美容院或理发店采集，能够使所采集的毛发的部位和清洗状态等保持一定。另外，美容院或理发店是定期去的场所，而且存在不计其数，因此能够很方便地持续采集用于确认肿瘤的有无的毛发。
(2)多胺和/或鸟氨酸的含量的测定(第一工序(S01))
第一工序(S01)是测定作为生物样本的毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的工序。如上所述，测定毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的方法只要不损害本发明的效果，就能够使用现有公知的测定方法，优选使用各种质谱分析。作为质谱分析，例如能够使用LC/MS/MS分析或LC/ESI-MS/MS分析。
在利用质谱分析测定毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的情况下，将细碎地裁断的毛发进行超声波清洗后，将经干燥的毛发利用微粉碎机制成微粉末，由此能够得到测定用试样。
其中，如上所述，作为样本调节的前处理，优选对毛发实施干式粉碎。通过对在提取溶剂中进行湿式粉碎的毛发预先实施干式粉碎，能够高效进行向溶剂中的被测定成分的提取，能够提高利用质谱分析得到的测定强度。
对所得到的测定用试样，例如通过使用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)法(An ultra-performance liquid chromatography-electrospray tandemmass spectrometry method)，能够将11种多胺类(精胺(SPM)、N-乙酰基精胺(N-actSPM)、亚精胺(SPD)、N,N-二乙酰基精胺(N,N-diactSPM)、N1-乙酰基亚精胺(N1-actSPD)、N8-乙酰基亚精胺(N8-actSPD)、尸胺(CAD)、腐胺(PUT)、二氨基丙烷(DAP)、N,N-二乙酰基亚精胺(N,N-diactSPD)、N-乙酰基腐胺(N-actPUT))完全分离、检测。此外，通过同样的测定还能够得知鸟氨酸(ORN)的含量。本发明的发明人还明确了癌患者的毛发具有鸟氨酸(ORN)含量增加的倾向，根据该鸟氨酸(ORN)含量也能够筛选肿瘤的有无。
(3)多胺和/或鸟氨酸的含量的比较(第二工序(S02))
第二工序(S02)为将在第一工序(S01)所得到的毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量与和健康者的毛发相关的正常值进行比较而判定肿瘤的存在的有无的工序。在第一工序(S01)中所得到的毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量大于和健康者的毛发相关的正常值时，有肿瘤存在的可能性。在此，如上所述，“和健康者的毛发相关的正常值”能够使用和被检查者自身相关的过去的测定值(在确认为没有肿瘤的状态下测得的值)和/或预先取得的数据库(从各种年龄、性别和人种的健康者采集毛发并测定多胺和/或鸟氨酸的含量而制成的数据库)的值。
在此，与和被检查者相关的值进行比较的值，优选为从与该被检查者的年龄差为±5岁的健康者采集的毛发的值。毛发的多胺或鸟氨酸的含量根据年龄会稍微发生变化，而通过使年龄差为±5岁，能够正确实现关于肿瘤的有无的筛选。
此外，与和被检查者相关的值进行比较的值，优选为从与该被检查者为相同人种和性别的健康者采集的毛发的值。毛发的多胺或鸟氨酸的含量根据人种和性别会稍微发生变化，而通过使人种和性别相同，能够正确实现关于肿瘤的有无的筛选。
和健康者的毛发相关的正常值，能够使用与被检查者的特征一致的特定的值，优选尽可能参照大量的值。通过参照与被检查者的特征(年龄差、人种和性别)一致或类似的和健康者相关的多个数据，能够更正确地实现关于肿瘤的有无的筛选。
在本发明的肿瘤的检测方法中，在第一工序中所测得的多胺或鸟氨酸的含量为正常值的标准偏差以上时，判定(阳性判定)或者警告有肿瘤存在的可能性，由此，被检查者能够以极高的准确度认知肿瘤的存在。此外，根据肿瘤的种类、位置等而需要更详细的信息时，在通过本发明的肿瘤的检测方法判定为阳性之后接受一般的检查即可。
在此，如上所述，对于有肿瘤存在的可能性的判定(阳性判定)或者警告，以和被检查者自身相关的过去的测定值(在确认为没有肿瘤的状态下测得的值)和/或预先取得的数据库(从各种年龄、性别和人种的健康者采集毛发并测定多胺和/或鸟氨酸的含量而制成的数据库)的值为基准，例如，将鸟氨酸作为指标时，能够在每1mg毛发的检测值为25pmol以上时进行阳性判定，为了更确切，能够在成为50pmol以上时进行阳性判定。
另外，在本发明的肿瘤的检测方法中，作为比较对象的多胺优选设为选自精胺、亚精胺、腐胺和二氨基丙烷中的至少一种多胺，更优选设为亚精胺。如果肿瘤存在，毛发的多胺含量有增加的倾向，特别是在精胺、亚精胺、腐胺和二氨基丙烷中显著，多数情况下，在亚精胺中最明显地出现。
以上，对本发明的代表性实施方式进行了说明，但本发明不仅仅限定于此，能够进行各种设计变更，这些设计变更全部包含在本发明的技术范围内。
实施例
《实施例1》
对于从6名健康者和5名癌患者采集的毛发，测定鸟氨酸和多胺类的含量。具体而言，将所采集的毛发细碎地裁断，利用0.1％SDS溶液进行超声波处理后，除去溶液，添加纯化水重复进行两次超声波处理，除去SDS。干燥后，利用微量天秤量取1mg左右，添加提取溶剂和I.S.的1,6-二氨基己烷(DAH)，放入钨珠，利用微粉碎机制成微粉末并且提取，过滤器过滤后分取上清液。
蒸馏除去溶剂后，添加4-(N,N-二甲氨基磺酰基)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑(4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole(DBD-F))和缓冲液进行反应，利用UPLC-ESI-MS/MS(Waters Xevo TQ-S)测定多胺类的含量。结果示于表1。
关于多胺类的含量，将利用所得到的测定值计算的平均值和标准偏差示于图2。在所测定的全部多胺类中，确认了与健康者相比癌患者的含量增大的倾向。
在此，精胺(SPM)、亚精胺(SPD)、腐胺(PUT)和二氨基丙烷(DAP)的健康者与癌患者的值相差较大，癌患者的平均值为健康者的标准偏差以上。特别是，精胺(SPM)的健康者与癌患者的差显著，能够用作灵敏性最高的指标。
将健康者和癌患者的鸟氨酸的平均含量示于图3。癌患者的鸟氨酸含量比健康者增大，该结果示出在判断肿瘤的有无的筛选中，也能够使用鸟氨酸含量。
《实施例2》
对从23名采集的毛发(从各被检查者采集约20根)，测定鸟氨酸和多胺类的含量。在此，23名中包括大肠癌转移的肝癌患者1名和食管癌患者1名，对于剩余的21名，未认知自身是否是癌患者。对于所采集的毛发，利用图4所示的分析流程测定鸟氨酸和多胺类的含量。此外，首次的粉碎为干式粉碎，之后的粉碎为湿式粉碎。
图4所示的分析流程中记载的各个试药调节如下。
1. 0.1％SDS溶液
将十二烷基硫酸钠(和光纯药，生化学用)1g和超纯水1000mL混合、溶解，在聚乙烯容器中保存。
2.提取溶剂
将甲醇(和光纯药，残留农药用)40mL和5M HCl(电子工业用)2mL混合，在玻璃容器中保存。
3. 0.1M的硼砂(Borax)(pH为9.3)
将十水合四硼酸钠(和光纯药，特级)38.137g、EDTA·2Na(同仁化学)0.0372g和超纯水100mL混合、溶解，在聚乙烯容器中保存。4.40mM的DBD-F(4-(N,N-二甲氨基磺酰基)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑(4-(N,N-dimethyaminosuluphonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole))
将DBD-F(东京化成)100mg和乙腈(和光纯药，LC/MS用)10mL混合、溶解，在褐色玻璃容器中冷藏保存。
5. 80mM的DBD-F((4-(N,N-二甲氨基磺酰基)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑(4-(N,N-dimethyaminosuluphonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole))
将DBD-F(东京化成)100mg和乙腈(和光纯药，LC/MS用)5mL混合、溶解，在褐色玻璃容器中冷藏保存。
6. 0.1％甲酸水溶液
将甲酸(和光纯药，特级)0.5mL和超纯水500mL混合，在褐色玻璃容器中保存。
7. 0.1％甲酸乙腈溶液
将甲酸(和光纯药，特级)0.5mL和乙腈(和光纯药，LC/MS用)500mL混合，在褐色玻璃容器中保存。
关于LC/MS/MS分析，分离机器使用岛津制作所制造的UFLC系统、柱使用资生堂制造的CAPCELL PAK C18 BB-H(3μm，150mm，2.1mm ID)。另外，质谱分析仪使用ABSciex制的API3200。分别将用于测定的毛发的信息示于表2，将所测量的鸟氨酸和多胺类的含量示于表3。此外，表3的数值的单位为“pmol/mg Hair”，记载了由1毫克毛发检测的量(nmol)乘以液量再除以毛发重量而得到的值。
[表2]
从确定为癌患者的试样号12和13检测的鸟氨酸(ORN)浓度均为52pmol/mg Hair，与健康者的平均值(5pmol/mg Hair)相比，增高10倍左右。如此，确认从毛发检测的鸟氨酸(ORN)量在癌患者与健康者之间有明确的差异。
此外，从确定为癌患者的试样号12和13检测的多胺类的合计分别为190pmol/mgHair和217pmol/mg Hair，比健康者的平均值(136pmol/mg Hair)明确增高。由这些结果可知，从毛发检测的鸟氨酸(ORN)和多胺类作为表示癌的有无的指标有效。
《实施例3》
对从相同的健康者采集的毛发1mg，除了粉碎工序以外，利用与实施例2同样的方法(图4所示的分析流程)测定鸟氨酸、二氨基丙烷和腐胺的含量。在此，为了确认粉碎工序对各成分的检测量造成的影响，对于实施不同时间的湿式粉碎的毛发、和在实施不同时间的干式粉碎后实施10分钟的湿式粉碎的毛发进行评价。
将鸟氨酸、二氨基丙烷和腐胺的测定结果分别示于图5、图6和图7。在任一图中，横轴均表示干式粉碎或湿式粉碎的时间。此外，纵轴为nmol/1mg Hair(纳摩尔/毛发1毫克)。
由图5～图7所示的结果可知，在作为湿式粉碎的预备处理实施了干式粉碎的毛发中，任一成分的检测量(检测灵敏度)均增加。另一方面，仅实施湿式粉碎时，延长粉碎时间对检测量(检测灵敏度)的增加没有多少帮助，没有得到比实施干式粉碎时更良好的测定值。

Claims (10)

1.一种肿瘤的检测方法，其特征在于：
所述检测方法包括：
将被检查者的毛发用作生物样本，测定所述毛发的多胺和/或鸟氨酸的含量的第一工序；和
将所述含量与和健康者的毛发相关的正常值进行比较的第二工序，
在所述含量大于所述正常值时，判定为有肿瘤存在的可能性。
2.如权利要求1所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
在所述第一工序中，测定所述鸟氨酸的所述含量，
在所述第二工序中，将所述鸟氨酸的所述含量与所述正常值进行比较。
3.如权利要求1所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
所述多胺为选自精胺、亚精胺、腐胺和二氨基丙烷中的至少一种多胺。
4.如权利要求1或2所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
所述多胺为亚精胺。
5.如权利要求1～4中任一项所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
在所述第二工序中，在所述多胺含量为所述正常值的标准偏差以上时，判定为有肿瘤存在的可能性。
6.如权利要求1～5中任一项所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
所述第一工序中使用质谱分析法。
7.如权利要求1～6中任一项所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
作为所述第一工序的所述测定所涉及的样本调节的前处理，对所述毛发实施干式粉碎。
8.如权利要求1～7中任一项所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
在所述第二工序中，使所述健康者与所述被检查者的年龄差为±5岁。
9.如权利要求1～8中任一项所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
在所述第二工序中，使所述健康者与所述被检查者为相同的人种和性别。
10.如权利要求1～9中任一项所述的肿瘤的检测方法，其特征在于：
所述毛发在美容院或理发店采集。
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