CN108137652B - Foxm1衍生的肽和包含它们的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有诱导细胞毒性T细胞的能力的FOXM1衍生的表位肽。本发明还提供编码所述肽的多核苷酸，呈递所述肽的抗原呈递细胞，和靶向所述肽的细胞毒性T细胞，以及诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明还提供了含有它们作为活性成分的组合物和药物组合物。此外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、抗原呈递细胞、细胞毒性T细胞或药物组合物来治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法。还提供了诱导针对癌症的免疫应答的方法。

Description

FOXM1衍生的肽和包含它们的疫苗
技术领域
发明涉及生物科学领域，更具体的说涉及癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗有效的新肽，使用所述肽治疗和/或预防肿瘤的方法，以及包含所述肽的药物组合物。
发明背景
已知CD8-阳性细胞毒性T细胞(CTL)识别在细胞表面表达的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上呈递的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从发现黑素瘤抗原(MAGE)家族以来，已经通过免疫学方法发现了许多TAA(NPL1:Boon T,Int JCancer 1993,54(2):177-80；NPL2:Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med 1996,183(3):725-9)。这些TAA中的一些目前正在作为免疫治疗靶标进行临床开发。
在这些TAA中的数个中，鉴定了可以由CTL识别的表位肽，并且预期它们在用于各种类型的癌症的免疫治疗中的应用(NPL3:Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996,88(20):1442-55；NPL4:Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999,59(13):3134-42；NPL5:Vissers JL et al.,Cancer Res 1999,59(21):5554-9；NPL6:van der Burg SH et al.,JImmunol 1996,156(9):3308-14；NPL7:Tanaka F et al.,Cancer Res 1997,57(20):4465-8；NPL8:Fujie T et al.,Int J Cancer1999,80(2):169-72；NPL9:Kikuchi M et al.,IntJ Cancer 1999,81(3):459-66；NPL10:Oiso M et al.,Int J Cancer 1999,81(3):387-94)。到目前为止，已经报道了使用这些TAA衍生的表位肽的几项临床试验。然而不幸的是，许多临床试验中的反应率不高(NPL11:Belli F et al.,J Clin Oncol 2002,20(20):4169-80；NPL12:Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002,188:33-42；NPL13:Rosenberg SAet al.,Nat Med 2004,10(9):909-15)。因此，仍然需要鉴定可以用于癌症免疫治疗的新的CTL表位肽。
通过靶向27,648基因的cDNA微阵列的来自全基因组表达谱的结果，鉴定和报告了FOXM1(GenBank登录号:NM_202003；Forkhead box M1)作为在肝内胆管癌，非小细胞肺癌和食道癌组织中表达上调的基因(NPL14:Obama K et al.,Hepatology 2005,41(6):1339-48；NPL15:Yokomine K et al.,Int J Cancer 2010,126(9):2153-63；PTL1:WO2005/090603)。另一方面，与这些癌症组织相比，正常组织中的FOXM1表达水平非常低。此外，当FOXM1表达被抑制时，成神经管细胞瘤细胞的增殖受到抑制(NPL16:Priller M et al.,Clin Cancer Res 2011,17(21):6791-801)，FOXM1被认为是参与调节癌细胞增殖的基因。更具体地，FOXM1是许多癌症重复增殖的TAA，并因此认为衍生自FOXM1的表位肽适用于靶向癌症患者的免疫疗法。
最近，已经鉴定了FOXM1衍生的HLA-A02-限制性表位肽(PTL2:WO2009/025196)和HLA-A24-限制性表位肽(PTL3:WO2010/095428)。可预期这些肽在具有HLA-A02型或HLA-A24型的癌症患者中的治疗效果，但对其它癌症患者无法预期。
[引用列表]
[专利文献]
[PTL 1]WO2005/090603
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发明概述
本发明涉及肽，其可以诱导与表达FOXM1的细胞特异性反应的CTL。当这些肽与人白细胞抗原(HLA)形成复合物并通过抗原呈递细胞(APC)(其在其表面呈递所述复合物)呈递至CD8-阳性T细胞时，诱导出显示肽特异性细胞毒性活性的CTL。迄今已经鉴定的具有CTL诱导能力(CTL诱导力)的FOXM1衍生肽是HLA-A02限制性肽和HLA-A24限制性肽，并且当抗原呈递细胞不表达这些HLA时不能诱导CTL。因此，常规肽不适合在不具有这些HLA的受试者中进行免疫治疗。HLA-A33是亚洲人常见的等位基因，并且HLA-A01是在高加索人中常见的等位基因(Cao K,et al.,Hum Immunol 2001,62(9):1009-30)。期望对HLA-A33阳性受试者施用HLA-A33限制性肽，和对HLA-A01阳性受试者施用HLA-A01限制性肽。因此，本发明涉及FOXM1衍生肽，其具有对HLA-A33或HLA-A01限制性的CTL诱导能力。基于本文公开的结果，已经证明本发明的肽是表位肽，其能够诱导针对表达FOXM1和HLA-A33或HLA-A01的细胞的强力和特异性的免疫应答。
因此，本发明的目的之一是提供能够以HLA-A33-或HLA-A01限制性方式诱导CTL的FOXM1衍生肽。这些肽可以用于体外、离体或体内诱导CTL，或可用于施用至受试者用于诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答的目的。优选的肽是包含选自下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:1,2,3,6,7,11,12,17,18,20,22,24,26,32,33,36,39,41,42,45,46,48,49,50,52,53,55,56,57,58,59,60,和61；更优选的肽是九肽或十肽；和甚至更优选的肽是选自由以下氨基酸序列组成的肽SEQ ID NOs:1,2,3,6,7,11,12,17,18,20,22,24,26,32,33,36,39,41,42,45,46,48,49,50,52,53,55,56,57,58,59,60,和61。
本发明的肽包含其中一个，两个或更多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加的肽，只要所得修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的任一种肽。与本发明的肽类似，这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可施用至受试者用于诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答。
本发明还提供了组合物，其包含本发明的一种或多种类型的肽，编码本发明的一种或多种类型的肽的一种一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明的肽的外来体，和/或本发明的CTL。本发明的组合物优选是药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症，以及防止其手术后复发。它们还可以用于诱导针对癌症的免疫应答。当施用于受试者时，本发明的肽呈递于APC的表面上，并且结果诱导了靶向肽的CTL。因此，本发明的另一个目的是提供用于诱导CTL的组合物，其中组合物包含一种或多种类型的本发明的肽，编码一种或多种类型的本发明的肽的一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，和/或呈递本发明的肽的外来体。
本发明的另一个目的是提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包括将本发明的一种或多种类型的肽与APC接触的步骤，或将编码本发明的任何一种肽的多核苷酸引入APC的步骤。
本发明还提供了诱导CTL的方法，包括将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APC共培养的步骤，将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步骤，或将载体引入CD8-阳性T细胞的步骤，所述载体包含编码T细胞受体(TCR)的每个亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合由细胞表面上的HLA抗原所呈递的本发明的肽。本发明中优选的HLA抗原是HLA-A33或HLA-A01。
本发明的另一个目的是提供分离的APC，在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物。本发明还提供靶向本发明肽的分离的CTL。这些APC和CTL可以用于表达FOXM1的癌症的免疫治疗。在本发明中，进行免疫治疗的癌症是例如存在于具有HLA-A33或HLA-A01的纯合子或杂合子患者中的癌症。因此，APC或CTL也是具有HLA-A33或HLA-A01的纯合子或杂合子的细胞。也就是说，本发明提供了用于表达FOXM1和至少一种选自HLA-A33和HLA-A01的HLA抗原的癌症的免疫疗法。
本发明的另一个目的是提供在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用包含本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸的组合物、本发明的APC、呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。本发明的另一个目的是提供在受试者中治疗和/或预防癌症以及预防其手术后复发的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。
除了上述之外，当结合附图和实施例阅读以下详细描述时，本发明的其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，本发明的前述概述和以下详细描述都是示例性实施方案，而对本发明或本发明的其它替代实施方案不是限制性的。特别地，尽管本文参照多个具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，该描述是本发明的说明，而不构成对本发明的限制。在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的，特征，益处和优点将从该概述和下面描述的某些实施方案中变得明显，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。从上述结合所附实施例，数据，附图和从其中得出的所有合理推断，单独或与并入本文的参考文献一同考虑，此类目的，特征，益处和优点将是显而易见的。
附图简述
图1-1由照片(a)至(v)组成，其显示了使用衍生自FOXM1的肽诱导的细胞进行干扰素(IFN)-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定的结果。这些图中，“+”显示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；并且“-”显示针对没有用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生(阴性对照)。通过与阴性对照比较可以看出，在以下孔中观察到肽特异性IFN-gamma产生：
使用FOXM1-A33-9-180(SEQ ID NO:1)的孔#6(a)，
使用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)的孔#3(b)，
使用FOXM1-A33-9-693(SEQ ID NO:3)的孔#4(c)，
使用FOXM1-A33-9-516(SEQ ID NO:6)的孔#3(d)，
使用FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)的孔#5(e)，
使用FOXM1-A33-9-289(SEQ ID NO:11)的孔#6(f)，
使用FOXM1-A33-9-228(SEQ ID NO:12)的孔#6(g)，
使用FOXM1-A33-9-502(SEQ ID NO:17)的孔#4(h)，
使用FOXM1-A33-9-321(SEQ ID NO:18)的孔#2(i)，
使用FOXM1-A33-9-341(SEQ ID NO:20)的孔#6(j)，
使用FOXM1-A33-10-514(SEQ ID NO:22)的孔#8(k)，
使用FOXM1-A33-10-179(SEQ ID NO:24)的孔#6(l)，
使用FOXM1-A33-10-501(SEQ ID NO:26)的孔#5(m)，
使用FOXM1-A33-10-124(SEQ ID NO:32)的孔#5(n)，
使用FOXM1-A33-10-595(SEQ ID NO:33)的孔#3(o)，
使用FOXM1-A33-10-546(SEQ ID NO:36)的孔#5(p)，
使用FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)的孔#6(q)，
使用FOXM1-A33-10-607(SEQ ID NO:41)的孔#3(r)，
使用FOXM1-A33-10-265(SEQ ID NO:42)的孔#2(s)，
使用FOXM1-A33-10-4(SEQ ID NO:45)的孔#6(t)，和
使用FOXM1-A33-10-388(SEQ ID NO:46)的孔#5(u)。对照片中方框圈出的显示反应的细胞增殖以建立CTL细胞系。同时，FOXM1-A33-10-288(SEQ ID NO:25)(v)显示为其中没有观察到肽特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。
图1-2继续显示了图1-1。
图2由线形图(a)至(d)组成，其显示了使用IFN-gamma酶联免疫吸附测定(ELISA)，由用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)(a),FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)(b),FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)(c)或FOXM1-A33-10-265(SEQ ID NO:42)(d)刺激的CTL系所产生的IFN-gamma的测量结果。这些结果显示了用各个肽诱导后，建立了以肽特异性方式产生IFN-gamma的CTL细胞系。图中，“+”显示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生；并且“-”显示针对未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图3由一系列的线形图(a)至(b)组成，其显示了用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)(a)或FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)(b)诱导后通过有限稀释方法建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。这些结果显示CTL克隆的肽特异性IFN-gamma产生。图中，“+”显示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生；并且“-”显示针对未用任何肽冲击的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL克隆(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图4的线形图显示了针对表达FOXM1和HLA-A*33:03两者的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生。引入HLA-A*33:03或全长FOXM1基因的靶细胞用作阴性对照。使用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)诱导建立的CTL克隆显示针对引入FOXM1和HLA-A*33:03两者的COS7的IFN-gamma产生(黑色菱形)。另一方面，未显示出针对引入HLA-A*33:03(白色三角形)和FOXM1(白色圆形)之一的COS7细胞的显著IFN-gamma产生。
图5-1由照片(a)至(n)组成，其显示了使用用衍生自FOXM1的肽诱导的细胞进行的IFN-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定的结果。图中，“+”显示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；并且“-”显示针对未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生(阴性对照)。
通过与阴性对照比较可以看出，在以下孔中观察到肽特异性IFN-gamma产生：
使用FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO:48)的孔#3中(a)，
使用FOXM1-A01-9-539(SEQ ID NO:49)的孔#3中(b)，
使用FOXM1-A01-9-631(SEQ ID NO:50)的孔#3中(c)，
使用FOXM1-A01-9-231(SEQ ID NO:52)的孔#2中(d)，
使用FOXM1-A01-9-663(SEQ ID NO:53)的孔#2中(e)，
使用FOXM1-A01-9-494(SEQ ID NO:55)的孔#5中(f)，
使用FOXM1-A01-9-341(SEQ ID NO:20)的孔#2中(g)，
使用FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)的孔#1中(h)，
使用FOXM1-A01-10-263(SEQ ID NO:57)的孔#2中(i)，
使用FOXM1-A01-10-308(SEQ ID NO:58)的孔#4中(j)，
使用FOXM1-A01-10-232(SEQ ID NO:59)的孔#6中(k)，
使用FOXM1-A01-10-663(SEQ ID NO:60)的孔#6中(l)和
使用FOXM1-A01-10-341(SEQ ID NO:61)的孔#6中(m)。
对照片中画框的显示反应的细胞增殖以建立CTL系。同时，FOXM1-A01-10-265(SEQID NO:42)(n)显示为其中没有观察到肽特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。
图5-2继续显示了图5-1。
图6的线形图显示了通过ELISA测量用FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)刺激的CTL系产生的IFN-gamma的结果。结果显示，用肽诱导后，建立了以肽特异性方式产生IFN-gamma的CTL系。图中，“+”显示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生；并且“-”显示针对未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图7由一系列的线形图(a)至(b)组成，其显示了用FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO:48)或FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56).诱导后通过有限稀释方法建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。这些结果显示CTL克隆的肽特异性IFN-gamma产生。图中，“+”显示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生；并且“-”显示针对未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL克隆(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图8的线型图显示了针对表达FOXM1和HLA-A*01:01两者的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生。引入HLA-A*01:01或全长FOXM1基因的靶细胞用作阴性对照。使用FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)诱导建立的CTL克隆显示针对引入FOXM1和HLA-A*01:01两者的COS7的IFN-gamma产生(黑色菱形)。另一方面，未显示出针对引入HLA-A*01:01(白色三角形)和FOXM1(白色圆形)之一的COS7细胞的显著IFN-gamma产生。
发明详述
具体实施方式的说明
尽管在实施或检验本发明的实施方案中可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的特定大小，形状，尺度，材料，方法学，方案等，因为这些可以根据常规实验和优化改变。还应当理解，本说明书中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方案的目的，并且不旨在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
I.定义
除非另有明确说明，如本文中使用的词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如肽、抗体、多核苷酸等)相关使用时，指该物质基本上不含至少一种可以包括在天然来源中的物质。因此，分离的或纯化的肽指基本上不含另一种细胞材料，例如来自所述肽的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质或其它污染性蛋白质。当化学合成肽时，分离或纯化的肽是指基本上不含有前体物质或另一种化学物质的肽。短语“基本上不含细胞物质”包括肽制备物，其中所述肽与分离出该肽的或重组产生该肽的细胞的细胞组分是分离的。如此，基本上不含细胞材料的肽包括肽制备物，其含有小于约30％,20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重计)的其它细胞材料。
当肽以重组方式生成时，分离或纯化的肽基本上不含有培养基，且所述基本上不含有培养基的肽包含肽制备物，所述肽制备物含有小于肽制备物体积的约20％、10％、或5％、或3％、2％或1％(以干重计)的培养基。
或者，当化学合成肽时，分离或纯化的肽基本上不含有前体物质或其它化学物质，并且所述基本上不含前体物质或其它化学物质的肽含有肽制备物，所述肽制备物包含小于约30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％(以干重计)肽制备物体积的前体物质或其它化学物质。可以通过例如在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或此类凝胶之后出现单一条带来确认肽制备物是分离的或纯化的。在优选的实施方案中，本发明的肽和多核苷酸是分离的或纯化的。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并指氨基酸残基的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，这些术语也适用于非天然存在的氨基酸聚合物，其包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括氨基酸类似物，氨基酸模拟物，以及此类。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸是细胞中那些通过遗传密码编码的，以及那些翻译后修饰的(例如羟脯氨酸，gamma-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸等)。短语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(与氢结合的alpha碳，羧基，氨基和R基团)但具有修饰的R基团或修饰的骨架的化学化合物(如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍等)。短语“氨基酸模拟物”是指与一般氨基酸具有不同结构但与氨基酸具有相似功能的化合物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，并且本发明的肽优选是L-氨基酸聚合物。
术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。
本说明书中使用的术语“组合物”旨在包括包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。当组合物是药物组合物时，术语“组合物”旨在包括活性成分和惰性成分的产品，以及从任何两种或多种成分的组合，络合或聚集，从一种或多种成分的离解，或从一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明的化合物或细胞与药学上或生理学上可接受的载体混合而制备的任何组合物。不限于此，本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂和包封材料；并且是指药学或生理学上可接受的材料，组合物，物质或介质。
除非另有说明，术语“癌症”是指过表达FOXM1基因的癌症；且其实例包括急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等，但不限于此。在示例性的实施方案中，“癌症”是表达FOXM1和HLA-A33和/或HLA-A01的癌症。
除非另有说明，术语“细胞毒性T淋巴细胞”和“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用。除非另有明确说明，它们是指可识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞，病毒感染的细胞)并诱导此类细胞的死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有说明，术语“HLA-A33”是指包括诸如HLA-A*33:03,HLA-A*33:01,和HLA-A*33:04的亚型的HLA-A33型。
除非另有说明，术语“HLA-A01”是指包括诸如HLA-A*01:01,HLA-A*01:03,和HLA-A*01:04的亚型的HLA-A01型。
在受试者或患者的语境中，如本文所用，短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A33”是指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A33抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子，并且HLA-A33抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。类似地，本文所用的短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A01”指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A01抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子，并且HLA-A01抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。
只要本发明的方法和组合物在癌症“治疗”的语境中是有用的，则当其实现临床优势时，该治疗被认为是“有效的”，例如，在受试者中减少癌症的尺寸，扩散或转移能力，延缓癌症进展，减轻癌症的临床症状，延长存活期，抑制术后复发。当预防性地施用治疗时，“有效”是指治疗延迟或防止癌症形成，或防止或减轻癌症的临床症状。有效性是相对于任何公知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来确定的。
只要本发明的方法和组合物用于癌症“预防(防范)”的语境中，本文中术语“预防(防范)”包括减轻与癌症相关的死亡率或发病率的负担的任何工作。预防(防范)可以在“初级，二级和三级预防(防范)水平”进行。尽管一级预防(防范)避免疾病的发展，在二级和三级水平的预防(防范)包括预防(防范)疾病进展和症状的出现，以及旨在通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低现有疾病的不良影响。或者，预防(防范)可以包括减轻特定病症的严重性，例如旨在减少肿瘤生长和转移的广泛的预防性治疗。
在本发明的语境中，癌症的治疗和/或预防(防范)和/或其手术后复发预防(防范)包括任一事件，例如抑制癌细胞增殖，肿瘤退化或消退，诱导癌症发展的缓解和抑制，肿瘤消退，以及减少或抑制转移，抑制癌症的术后复发和延长存活期。癌症的有效治疗和/或预防(防范)降低死亡率，改善患有癌症的个体的预后，降低肿瘤标志物的血液水平，并减轻与癌症相关的可检测的症状。例如，症状的缓解或改善构成有效的治疗和/或预防(防范)，并包括其中症状稳定或减轻10％,20％,30％或更多的病患。
在本发明的语境中，术语“抗体”是指与指定的蛋白质或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体，灵长类化抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，人源化抗体，与其他蛋白或放射性标记融合的抗体，和抗体片段。此外，本文中的“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，由两个或多个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。“抗体”可以是所有类别的抗体(例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)。
除非另有说明，本文使用的技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的术语相同的含义。
II.肽
HLA-A33是亚洲人常见的等位基因，并且HLA-A01是在高加索人中常见的等位基因(Cao et al.,Hum Immunol 2001；62(9):1009-30)。因此，对于亚洲人或高加索人的大量群体，治疗表达FOXM1的癌症的有效方法可以通过提供限制于HLA-A33或HLA-A01的FOXM1衍生的CTL诱导肽来提供。因此本发明提供了FOXM1衍生肽，其能够以HLA-A33-或HLA-A01限制性方式诱导CTL。
本发明的肽是FOXM1衍生肽，其能够以HLA-A33-或HLA-A01限制性方式诱导CTL。能够以HLA-A33限制性方式诱导CTL的肽包括具有选自以下的氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46。能够以HLA-A01限制性方式诱导CTL的肽包括具有选自以下的氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61。
具有对这些肽特异的细胞毒性活性的CTL可以通过用这些肽冲击(pulsed)的树突细胞(DC)对T细胞体外刺激来建立。建立的CTL显示出针对用每种肽冲击的靶细胞的特异性细胞毒性活性。
FOXM1基因在癌症细胞中过表达，例如在急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等中的癌细胞中，但在大多数正常器官中不表达。因此它是免疫治疗的极好的靶标。因此，本发明的肽可以适当地用于癌症免疫治疗。优选的肽是九肽(由9个氨基酸残基组成的肽)或十肽(由10个氨基酸残基组成的肽)，并且更为优选的是由选自以下氨基酸序列组成的组的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58,59、60和61。例如具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对表达HLA-A33和FOXM1细胞的特异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于HLA-A33阳性患者的癌症免疫治疗。在更优选的实施方案中，本发明的肽是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽。另外，例如，具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的肽适于诱导显示出针对表达HLA-A01和FOXM1的细胞的特异性细胞毒性活性的CTL，并且可以适用于针对HLA-A01阳性患者的癌症免疫疗法。在更优选的实施方案中，本发明的肽是由SEQID NO:56.的氨基酸序列组成的肽。
对于本发明的肽，可以制得另外的氨基酸残基以附加(adjoin)本发明的肽的氨基酸序列，只要得到的肽保留原始肽的CTL诱导能力即可。另外的氨基酸残基可以由任何类型的氨基酸组成，只要它们不损害原始肽的CTL诱导能力即可。因此，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61。此类肽例如少于约40个氨基酸，在许多情况下少于约20个氨基酸，并通常少于约15个氨基酸。因此，如果原始肽是九肽，则本发明的肽包含10个氨基酸长或11-40个氨基酸长的肽，其通过将另外的氨基酸附加至所述肽产生。此外，如果原始肽是十肽，则本发明的肽包含11-40个氨基酸长的肽。此类肽可以是(例如)11-20个氨基酸长的肽或11-15个氨基酸长的肽。另外的氨基酸残基的优选实例为在FOXM1的全长氨基酸序列中邻接本发明的肽的氨基酸序列的氨基酸残基(例如SEQ ID NO:67、69、71、73或75)。因此，本发明的肽包括含有选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61，并且其中所述肽是FOXM1的肽片段并具有CTL诱导能力。
一般而言，某些肽中一个，两个或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，或在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中一个、两个或数个氨基酸残基修饰(即取代、添加、缺失和/或插入)的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81:5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10:6487-500；Dalbadie-McFarland等人.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可以是包含氨基酸序列的肽，其中一个、两个或数个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加至选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列，并具有CTL诱导能力。
本领域技术人员可以认识到对氨基酸序列的个别取代(其改变了单个氨基酸或少数百分比的氨基酸)倾向于导致原始氨基酸侧链的特性的保留。其通常被称作“保守取代”或“保守修饰”；且通过“保守取代”或“保守修饰”对蛋白质的修饰可以导致修饰的蛋白具有与原蛋白相似的功能。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。功能上相似的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、和具有以下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基侧链(S、T、Y)；含硫原子侧链(C、M)；含羧酸和酰胺侧链(D、N、E、Q)；含碱侧链(R、K、H)；和含芳香侧链(H、F、Y、W)。另外，以下八组各自含有本领域认可互为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins 1984)。
此类保守修饰肽也被包含在本发明的肽中。然而，本发明的肽不限于此，并可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不排除衍生自FOXM1的多态性变体、种间同源物、和等位基因的可诱导CTL的肽。
只要肽保留原始肽的CTL诱导能力，可以修饰(即取代，缺失，插入和/或添加)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如4个或3个或更少。被修饰的氨基酸的百分比优选为20％或更少，更优选15％或更少，进一步更优选10％或更少，或1至5％。
当在免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应当呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选的是本发明的肽拥有对HLA抗原的高结合亲和力。为此目的，可以对肽通过取代、缺失、插入和/或添加氨基酸残基来修饰以产生具有改善结合亲和力的修饰肽。由于通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律是已知的(Falk,等人,Immunogenetics 1994 40 232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9；Takiguchi,等人,Tissue Antigens 2000:55:296-302.)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的肽。
例如，在具有对HLA I类分子具有结合亲和力的肽中，自N末端起的第二个氨基酸和C末端氨基酸通常是参与结合至HLA I类的锚定残基(Rammensee HG,等人,Immunogenetics.1995；41(4):178-228)。例如，在HLA-A33中，对于来自N末端的第二氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，和对于C末端氨基酸的精氨酸和赖氨酸，已知其作为对HLA-A33具有高结合亲和力的锚定残基(Falk,et al.,Immunogenetics1994,40:232-41；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens 2000,55:296-302)。
另外，在HLA-A33中，已知来自N末端的第一氨基酸残基起到锚定残基的作用，并且已知天冬氨酸和谷氨酸优选作为来自N末端的第一个氨基酸(Falk,et al.,Immunogenetics 1994,40:232-41；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens2000:55:296-302)。因此，为了维持或增强HLA-A33结合亲和力，有可能期望用天冬氨酸或谷氨酸取代自N末端起的第一个氨基酸，并且用苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代自N末端起的第二个氨基酸，和/或用精氨酸或赖氨酸取代C末端氨基酸。
因此，具有CTL诱导能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中，其中在选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，自N末端起第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，自N末端起第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中，在选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，自N末端起第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，自N末端起第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。
即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其包含在选自SEQID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，具有选自以下(a)至(c)的一个或多个取代的氨基酸序列：
(a)自N末端起第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；
(b)自N末端起第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；和
(c)C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(c)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(c)的1、2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中在选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，自N末端起第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，自N末端起第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。即，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的肽，其包含在选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，具有选自以下(a)和(b)的一个或多个取代的氨基酸序列：
(a)自N末端起第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
(b)C末端氨基酸被取代为精氨酸或赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力肽，其由在选自SEQ IDNOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列中，具有选自以上(a)和(b)的一个或多个取代的氨基酸序列组成。在更优选的实施方案中，自N末端起的第二氨基酸被取代为苯丙氨酸或酪氨酸。
在HLA-A01中，对于自N端起的第三个氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸，和对于C末端氨基酸的酪氨酸已知是对HLA-A01具有高结合亲和力的锚定残基。此外，已知在HLA-A01的自N端起的第2位有辅助性锚定残基，以及已知苏氨酸和丝氨酸优选作为自N端起的第二个氨基酸(Kubo,R.T Journal of Immunology 1994,152:3913；Gambacorti-Passerini,C.Clinical Cancer Research 1997,3:675-83；Falk,K.Immunogenetics 1994,40:238-41)。
因此，为了维持或增强HLA-A01结合亲和力，有可能需要用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端起的第三个氨基酸，和/或用酪氨酸取代C-末端氨基酸。另一种可能性是需要用苏氨酸或丝氨酸取代自N端起的第二个氨基酸。因此，具有CTL诱导能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中，其中在选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。
即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含基酸序列的肽，其包含在选自SEQ IDNOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中，具有选自以下(a)至(c)的一个或多个取代的氨基酸序列：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸或丝氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；
(c)C末端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的的由氨基酸序列组成的肽，其中所述氨基酸序列在选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中具有选自以上(a)至(c)的一个或多个取代。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(c)的1,2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中在选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中，自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为酪氨酸。即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中所述氨基酸序列在选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中具有选自以下(a)和(b)的一个或多个取代：
(a)自N端起的第三个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为酪氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的的由氨基酸序列组成的肽，其中所述氨基酸序列在选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列中具有选自以上(a)至(b)的一个或多个取代。
不仅可以在锚定位点处引入氨基酸取代，而且可以在肽的潜在T细胞受体(TCR)识别位置处引入取代。数项研究已证明了具有氨基酸取代的肽可等同于或好于原来功能的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba等人.Cancer Res.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann等人.J Immunol.(2002)；168(3):1338-47.,S.O.Dionne等人.Cancer Immunol immunother.(2003)52:199-206及S.O.Dionne等人.CancerImmunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本发明还考虑也可以向本发明的肽(例如由选自以下氨基酸序列组成的肽：SEQID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61)的N末端和/或C末端添加1个、2个或数个氨基酸。更具体地，本发明提供了由氨基酸组成的肽，所述氨基酸中，一个、两个或数个氨基酸被添加至各个SEQID NO所示的氨基酸序列的N末端和C末端两者或之一。此类保留CTL诱导能力的修饰肽也包括在本发明中。例如，当肽与APC接触时(其中一个，两个或数个氨基酸被添加到由SEQ IDNO:2或56组成的氨基酸序列的肽的N末端和/或C末端时)，其掺入APC中并加工成由SEQ IDNOs:2或56的氨基酸序列组成的肽。然后其可以通过经由抗原呈递途径呈递在APC的细胞表面上诱导CTL。更具体地，本发明的肽可以是其中在N末端和C末端的任一个或两者上添加一个，两个或数个氨基酸的肽。
此外，在本发明的另一个实施方案中，提供了由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列在各个SEQ ID NOs所示的氨基酸序列中包含一个、两个或数个氨基酸取代，并且其中将一个、两个或数个氨基酸添加到这些取代的氨基酸序列的N末端和C末端之一或两者。
当本发明的肽包含氨基酸取代时，期望的取代位置例如可以是例如在由SEQ IDNOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46所示的氨基酸序列中选自自N末端起的第一个位置、自N末端起的第二个位置，以及C末端的一个、两个或三个位置，或者由SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61所示的氨基酸序列中选自自N末端起的第二个位置、自N末端起的第三个位置，以及C末端的一个、两个或三个位置。
然而，当肽的氨基酸序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可以诱导针对特定物质的自身免疫性疾病和/或过敏性症状等副作用。因此，优选使用可用的数据库进行同源性搜索，以避免肽的氨基酸序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了不存在与目标肽相比仅有1个或2个氨基酸差异的肽时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有发生此类副作用的危险。
预测其中本发明的肽的一个，两个或数个氨基酸被修饰的肽能够保留原始肽的CTL诱导能力；然而优选验证修饰肽的CTL诱导能力。本文中，“具有CTL诱导能力(CTL诱导力)的肽”指通过用肽刺激的APC诱导CTL的肽。
“CTL诱导”包括诱导分化成CTL，诱导CTL激活，诱导CTL增殖，诱导CTL的细胞毒活性，诱导CTL介导的靶细胞溶解，和诱导CTL的IFN-gamma产生增加。
CTL诱导能力的可通过如下来确认：用肽刺激表达感兴趣的HLA抗原的APC(例如B淋巴细胞，巨噬细胞或树突细胞)并将其与CD8阳性细胞混合；然后测量由CTL针对靶细胞所释放的IFN-gamma。对于APCs，可以优选使用人外周血单核细胞来源的树突细胞。作为反应系统，可使用已经制成以表达HLA抗原的转基因动物。或者，例如可以用51Cr或此类放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算肽-诱导的CTL的细胞毒性活性。或者，在肽刺激的APCs的存在下，可能通过以下评估CTL诱导能力：测量由CTL生成和释放的IFN-gamma，并使用抗IFN-gamma单克隆抗体显现培养基上的抑制区。
除上述的修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它肽，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当肽的例子包括衍生自其它TAA的CTL诱导肽。此外，本发明的肽也可以彼此连接。用于连接肽的合适的接头是本领域已知的，并且例如可以使用接头，如AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5:26)、AAA、NKRK(SEQ ID NO:62)(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165:7308-15)，或K(S.Ota et al.,CanRes.62,1471-6；K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168:5709-15)。肽可以以各种排列连接(例如，链状，重复等)，并且还可以连接三个或更多个肽。
本发明的肽还可连接至其它物质，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当物质的例子包括，例如，肽、脂质、糖或糖链、乙酰基，和天然的或合成的聚合物。本发明的肽可以进行如下修饰：糖基化、侧链氧化、或磷酸化等等，只要不破坏它们的CTL诱导能力。还可以实施此种类型的修饰以赋予额外的功能(例如，靶向功能和递送功能)或稳定所述肽。
例如，为了提高肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明的肽。肽的稳定性可以以多种方式测定。例如，可以通过使用肽酶以及各种生物介质例如人血浆和血清来测试稳定性(参见例如Verhoef等人,Eur J Drug Metab Pharmacokin1986,11:291-302)。
此外，如上文所述，在上述取代、缺失、插入和/或添加了1个、2个或数个氨基酸残基的修饰肽中，可以筛选或选择与原始肽相比具有相同或更高活性的那些。因此，本发明还提供由于筛选或选择与原始肽相比具有相同或更高活性的修饰肽的方法。具体地，本发明提供了筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)产生由其中对原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成的候选序列，其中所述原始氨基酸序列由选自SEQ ID Nos：1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列组成；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与FOXM1之外的任何已知人基因产物的肽均无显著同源性(或序列同源性)的候选序列；
(c)使由(b)中选择的候选序列组成的肽与APC接触；
(d)使(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择具有与由原始氨基酸序列组成的肽相等或更高的CTL诱导能力的肽。
本文中，本发明的肽也被描述为“FOXM1肽”。
III.本发明的肽的制备
本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，可以使用重组DNA技术或化学合成来制备本发明的肽。本发明的肽可独立地合成，或合成为包括两个或更多个肽的较长多肽。本发明的肽可以在使用重组DNA技术在宿主细胞中产生它们或者在化学合成它们之后从宿主细胞或合成反应产物分离。即，可以纯化或分离本发明的肽，以使其基本上不含其它宿主细胞蛋白质及其片段，或任何其它化学物质。
本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入一种或多种D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。
可以根据选定的氨基酸序列，通过化学合成来获得本发明的肽。可以适合于合成的常规肽合成方法的例子包括以下文献中描述的方法：
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；
(iii)“Peptide Synthesis”(in Japanese),Maruzen Co.,1975；
(iv)“Basics and Experiment of Peptide Synthesis”(in Japanese),MaruzenCo.,1985；
(v)“Development of Pharmaceuticals”(in Japanese),Continued Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；
(vi)WO99/67288；和
(vii)Barany G.&Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,Solid Phase PeptideSynthesis,Academic Press,New York,1980,100-118.
或者，可适用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如MorrisonJ,J Bacteriology 1977,132:349-51；Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu等人)1983,101:347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。本发明还提供了此类载体和宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产本发明的肽。
IV.多核苷酸
本发明还提供编码任何本发明肽的多核苷酸。这些包括衍生自天然存在的FOXM1基因(例如GenBank登录号NM_202003(SEQ ID NO:52)、NM_001243088(SEQ ID NO:54)、NM_001243089(SEQ ID NO:56)、NM_021953(SEQ ID NO:58)或NM202002(SEQ ID NO:60))以及具有它们的保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。本文中，短语“保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码肽的核酸的每一种沉默变异在每个公开的序列中隐含地描述。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由诸如A、T、C和G的碱基适当地组成，并且在RNA中T被U替代。
本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中有或无居间氨基酸序列(intervening amino acid sequence)。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。此外，多核苷酸可以包括编码本发明的肽的编码序列的任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(如质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成本发明的多核苷酸。或者，可使用PCR技术或在合适宿主中表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48:2223-311；Matthes等人,EMBO J1984,3:801-5中记载的。可根据需要来纯化可以这种方式获得的几种肽的连接产物，并以该连接形式施用。在该情况下，连接的肽通过加工来生产科抗原呈递的肽并且引发每种肽的CTL诱导活性。因此，当连接了肽时，优选具有相同HLA限制的肽组合。或者肽可以通过切割连接部分作为单个肽的混合物施用。
V.外来体(exosomes)
本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在JPH11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治疗和/或预防(防范)对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
上述复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防(防范)的受试者的类型匹配。例如，HLA-A33(例如HLA-A*33:03)是在亚洲人中广泛和普遍见到的等位基因，并且认为该HLA抗原类型适合在亚洲患者中治疗。此外，HLA-A01(例如HLA-A*01:01)是在高加索人群体中广泛和普遍见到的等位基因，并且这些HLA抗原类型被认为适合在高加索人患者中治疗。典型地，在临床上，通过预先研究需要治疗的患者的HLA抗原类型，可以选择合适的肽，其对特定HLA抗原具有高水平的结合亲和力，或者通过由特异性HLA抗原介导的抗原呈递的CTL诱导能力。
本发明的外来体在其表面上呈递本发明的肽与HLA-A33或HLA-A01的复合物。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A33时，本发明的肽优选为具有选自以下的氨基酸序列的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46，并且更有选为由选自以下的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46。此外，当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的肽优选是具有选自以下氨基酸序列的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61，并且更有选为由选自以下的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。或者本发明提供了在其表面上具有在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。本发明的APC可以是分离的APC。当在细胞(APC，CTL等)的语境中使用时，术语“分离的”意指细胞与另一类型的细胞分离。本发明的APC可以是从衍生自待经受治疗和/或预防(防范)的患者的APC诱导的APC，并且可以作为疫苗自身或与其他药物(包括本发明的肽，外来体或CTL)组合施用。
本发明的APC不限于特定种类的细胞，并且可以是抑制在其细胞表面呈递蛋白质性质的抗原的细胞以通过淋巴细胞(例如树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞)识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导活性的代表性APC，可以优选使用DC作为本发明的APC。本发明中，优选的DC是源自人的分离的DC。此外，本发明的APC也可以是具有抗原呈递功能的多种类型的细胞的混合物，并且可以是APC的混合物，其中每种APC呈递不同类型的本发明的肽。
例如，可以通过从外周血单核细胞分离DC，然后在体外用本发明的肽刺激它们来获得本发明的APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此在将本发明的肽施用至受试者后，可以通过从受试者收集APC来获得本发明的APC。或者，可以通过使从受试者收集而来的APC与本发明的肽接触来获得本发明的APC。
为了在受试者中诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答，本发明的APC可以自身或者与其他药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合施用给受试者。例如，离体施用可包括下述步骤：
(a)自第一受试者收集APC；
(b)使步骤(a)的APC接触本发明的肽；和
(c)对第二受试者施用步骤(b)的APC。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。当第一受试者和第二受试者是不同个体时，优选第一受试者和第二受试者的HLA是相同类型。获得自上述步骤(b)中的APC可以是用于癌症治疗和/或预防(防范)的疫苗。
获得自如上描述方法的本发明的APCs具有CTL诱导能力。用于APC的语境中的术语“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”指APC与CD8阳性细胞接触时诱导CTL的能力。此外，“CTL诱导能力(CTL诱导力)”包括APC诱导CTL活化的能力，APC诱导CTL增殖的能力，APC促进CTL介导的溶解靶细胞的能力，和APC提高CTL介导的IFN-gamma生成的能力。由本发明的APC所诱导的CTL是对FOXM1特异性的CTL，并表现出对表达FOXM1的细胞的特异性细胞毒活性。
除了上述方法之外，可以通过在体外将编码本发明肽的多核苷酸导入至APCs来制备本发明的APCs。待导入的多核苷酸可以是DNA或RNA的形式。导入的方法并不特别限制，且其例子包括本领域中常规实施的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙法。更具体的说，可以使用描述于Cancer Res 1996,56:5672-7；J Immunol 1998,161:5607-13；J ExpMed 1996,184:465-72,和JP2000-509281中的方法。通过将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，多核苷酸在细胞中转录并翻译，然后产生的肽被MHC I类加工并通过呈递途径以将本发明的肽呈递在APC的细胞表面上。
在优选的实施方案中，本发明的APC在其细胞表面上呈递本发明的肽和HLA-A11(更优选地HLA-A*33:03)或HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)形成的复合物。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A33时，本发明的肽优选为具有选自以下的氨基酸序列的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46，并且更优选为由选自以下的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A01时，本发明的肽优选为具有选自以下的氨基酸序列的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61，并且更优选为由选自以下氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61。
本发明的APC优选是通过包括下述(a)或(b)的步骤的方法诱导的APC：
(a)将APC与本发明的肽接触，所述APC表达至少一种选自HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)和HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)的HLA；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，所述APC表达至少一种选自HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)和HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)的HLA。
与表达HLA-A33的APC接触的本发明的肽优选是具有选自以下的氨基酸序列的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46，并且更优选为由选自以下氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46。
与表达HLA-A01的APC接触的本发明的肽优选是具有选自以下的氨基酸序列的肽或其修饰的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61，并且更优选为由选自以下的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61。
本发明提供了本发明的肽用于制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的用途。另外，本发明提供了制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程。进一步地，本发明提供了本发明的肽，其用于诱导具有CTL诱导能力的APC。
VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
由本发明的肽诱导的CTL可以与本发明的肽相似的方式用作疫苗用于在体内增强靶向表达FOXM1的癌细胞的免疫应答。因此本发明提供了CTL，其通过本发明的肽诱导或活化。本发明的CTL是靶向本发明肽，并且能够结合至本发明的肽和HLA抗原的复合物的CTL。CTL与所述复合物的结合是经由存在于CTL的细胞表面的T细胞受体(TCR)介导的。本发明的CTL可以是分离的CTL。优选的CTL是分离的人源CTL。本发明的CTL也可以是CTL的混合物，其各自靶向不同类型的本发明肽。
本发明的CTL可以获得自(1)向受试者施用本发明的肽，(2)体外用本发明的肽刺激衍生自受试者的APC和CD8阳性T细胞，或外周血单核细胞(PBMC)，(3)体外将CD8阳性T细胞或PBMC与APC或外来体接触，所述APC或外来体在它们的表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物，或(4)将包含编码每种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合由细胞表面上HLA抗原所呈递的本发明的肽。用于上文(2)或(3)方法的外来体和APCs可以分别通过“V.外来体”和“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中描述的方法制备，且上文(4)的方法的详情将在“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中描述。
本发明的CTL可以单独施用至经受治疗和/或预防(防范)的患者，或与其他药物(包括本发明的肽、APC或外来体)组合施用以用于调节效果的目的。进一步地，本发明的CTL可以是诱导自CD8阳性T细胞的CTL，所述CD8阳性T细胞衍生自经受施用CTL的患者。本发明的CTL特异性作用于呈递本发明肽的靶细胞，例如，用于诱导本发明CTL的相同的肽。靶细胞可以是内源表达FOXM1的细胞，如癌细胞，或用FOXM1基因转染的细胞。因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可成为本发明CTL的攻击靶标。本发明的CTL靶向的细胞优选为对于HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)和HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)中的至少一种为阳性的细胞。
在优选的实施方案中，本发明的CTL特异性靶向表达FOXM1和选自HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)和HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)中至少一种的HLA的细胞。在本发明中，被CTL靶向的细胞可以是纯合或杂合地具有HLA-A33和HLA-A01的等位基因的任一种的细胞。
本文中，CTL“靶向”细胞指CTL对在其细胞表面上呈递HLA和本发明的肽的复合物的细胞的识别，和表现出对该细胞的细胞毒性活性。进一步地，“特异性靶向”指CTL表现出对这些细胞的细胞毒性活性，但未显示对其他细胞的破坏活性。在CTL的语境中使用的表述“识别细胞”指经由其TCR结合至呈递在细胞表面的HLA和本发明的肽的复合物，并表现出对该细胞的特异性细胞毒性活性。因此，本发明的CTL优选为能够经由TCR结合至呈递在细胞表面上的由本发明的肽和HLA-A*33:03)或HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)之间形成复合物的CTL。
此外，本发明的CTL优选是通过包括以下(a)或(b)中所述步骤的方法诱导的CTL：
(a)体外将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递本发明的肽和HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)或HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)的复合物的APCs或外来体接触；或
(b)将包含编码每种TCR的亚基的多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合通过HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)或HLA-A01(更优选地HLA-A*01:01)呈递在细胞表面的本发明的肽。由该方法诱导的CTL具有特异性识别用于诱导的肽和HLA抗原的复合物的TCR。因此，它们是与由于TCR结构的差异具有不同的反应特异性的其它CTL具有结构差异的细胞。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明还提供组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物包含编码每种TCR亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽。所述多核苷酸赋予CD8阳性T细胞针对表达FOXM1的癌细胞的特异性，这是通过表达能够结合通过HLA抗原呈递在CD8阳性T细胞的靶细胞表面的本发明的肽的TCR实现的。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出通过本发明的肽诱导的CTL中编码TCR亚基的alpha和beta链的多核苷酸(WO2007/032255及Morgan等人,J Immunol,171,3288(2003))。例如，优选PCR方法用于TCR分析。不限于此，用于分析的PCR引物可以是(例如)通过组合以下5'侧引物和3'侧引物的用于扩增的引物组：
5’侧引物:
5’-R引物(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:62)
3’侧引物:
TCR-alpha-链C-区-特异性
3-TRa-C引物(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID NO:63)
TCR-beta-链C1-区-特异性
3-TRb-C1引物(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO:64)或
TCR-beta-链C2-区-特异性
3-TR-beta-C2引物(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(SEQ ID NO:65)
通过将鉴定的多核苷酸导入CD8阳性T细胞而形成的TCRs能够以高亲合力结合呈递本发明的肽的靶细胞，并在体内和体外介导针对呈递本发明的肽的靶细胞的高效杀伤。
可以将编码每种TCR亚基的多核苷酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述多核苷酸或者包含它们的载体导入CD8阳性T细胞，例如衍生自患者的CD8阳性T细胞。本发明提供一种即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或衍生自其他受试者的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。
本文中，特异性TCR是当TCR呈递于CD8阳性T细胞的表面上时，能够通过特异性识别呈递在靶细胞表面上的本发明的肽和HLA抗原的复合物,赋予针对靶细胞特异性细胞毒活性的TCR。上述复合物的特异性识别可以通过任何已知方法来确认，并且其优选的例子包括使用HLA分子和本发明的肽的HLA多聚体染色分析，和ELISPOT测定方法。通过实施ELISPOT测定法，可以确认由导入有上述多核苷酸的T细胞和细胞内信号转导的靶细胞的特异的TCR介导的识别。当上述TCR呈递于CD8阳性T细胞表面上时，也可以通过已知方法确认TCR是否能够赋予针对CD8阳性T细胞的靶细胞特异性细胞毒性活性。优选的方法包括例如通过铬释放测定法等测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒性活性。
在HLA-A33的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基(其例如结合由具有选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽和HLA-A33抗原形成的复合物)的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备来CTL。
在HLA-A01的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基(其例如结合由具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽和HLA-A01抗原形成的复合物)的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备来CTL。
经转化的CTL在体内能够归巢(homing)(从血液至淋巴组织的移位(translocation))，并且可以利用公知的体外培养方法扩增(例如Kawakami et al.,JImmunol.,1989,142:3252-61)。可以利用本发明的CTL来形成免疫原性组合物，所述组合物有用于在需要治疗和/或预防(防范)的患者中的疾病治疗或预防(防范)(对于参考文献WO2006/031221，其内容通过提述并入本文)。
IX.药物组合物
本发明还提供了组合物或药物组合物，包含选自以下的至少一种活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
除了上述的活性成分之外，本发明的药物组合物可以根据需要包含载体、赋形剂等通常用于药物而没有特别的限制。可用于本发明的药物组合物的载体的实例包括无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。因此，本发明还提供药物组合物，其包含至少一种选自以下(a)至(e)的活性成分和药学上可接受的载体：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
此外，本发明的药物组合物可以根据需要包含稳定剂，混悬剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等。
与正常组织相比，癌细胞中FOXM1表达显著上调。因此本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可以用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发。因此本发明提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发的药物组合物，其包含作为活性成分的一种或多种类型的本发明的肽或多核苷酸。或者，可以制备本发明的肽以呈递在外来体或APCs的表面上用作为药物组合物的用途。此外，靶向任一种本发明肽的本发明的CTL也可用作本发明药物组合物的活性成分。本发明的药物组合物可包含治疗有效量或药学有效量的上述活性成分。
本发明的药物组合物还可以用作疫苗。在本发明的语境中，术语“疫苗”(也称为“免疫原性组合物”)指当接种到动物时具有诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答的功能的组合物。因此本发明的药物组合物可用于诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答。由本发明的肽、多核苷酸、APC、CTL和药物组合物诱导的免疫应答没有特别限制，只要其是导致抗肿瘤作用的免疫应答，并且例子包括诱导癌细胞特异的CTL和诱导癌细胞特异的细胞毒性活性。
本发明的药物组合物可用于在人类受试者或患者中治疗和/或预防的癌症，和/或预防其手术后复发。本发明的药物组合物可以优选用于对选自HLA-A33和HLA-A01中的至少一种HLA阳性的受试者。此外，本发明的药物组合物可优选用于治疗和/或预防表达FOXM1和选自HLA-A33和HLA-A01的至少一种HLA的癌症和/或预防其术后复发。
在另一个实施方案中，本发明提供选自以下的活性成分在制备用于治疗或预防癌症的药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分，其用于治疗或预防癌症：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括用药学上或生理上可接受的载体配制至少一种选自以下活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明还提供了制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了用于治疗或预防癌症的方法，其包括向受试者施用至少一种选自以下的活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A33限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A33(例如,HLA-A*33:03)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)、呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)、或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A33的受试者(即HLA-A33阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽的药物组合物。
类似地，在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A01限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A01(例如,HLA-A*01:01)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)。呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A01的受试者(即HLA-A01阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的肽的药物组合物。
通过本发明的药物组合物治疗和/或预防的癌症没有特别限制，只要它们是表达FOXM1的癌症，并包含各种癌症，例如急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等。此外，本发明的药物组合物可以优选用于纯合地或杂合地具有选自HLA-A33和HLA-A01的HLA等位基因的受试者。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含具有诱导针对癌细胞的CTL的能力的其他肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)，编码其他肽的其他多核苷酸，呈递其他肽的其他细胞等。
本发明的药物组合物还可以任选地包含其它治疗物质作为活性成分，只要它们不抑制上述活性成分(例如本发明的肽)的抗肿瘤作用即可。例如，本发明的药物组合物可任选地包含抗炎组合物，镇痛药，化学治疗剂等。除了将其它治疗物质包括在本发明的药物组合物本身以外，还可以与一种或多种其它药物组合物顺序或同时施用本发明的药物组合物。本发明的药物组合物和其它药物组合物的剂量取决于例如所使用的药物组合物的类型和所治疗的疾病，以及施用时间安排(scheduling)和施用途径。
应当理解，考虑到制剂类型，除了本文明确提及的成分之外，本发明的药物组合物可以包含本领域常规的其它组分。
本发明还提供包含本发明的药物组合物的制品或试剂盒。本发明的制品或试剂盒可以包括容纳本发明的药物组合物的容器。适当的容器的例子包括瓶，小瓶或试管，但不限于此。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。标签可以附着于容器，并且可以在标签中描述本发明的药物组合物所应用的疾病或疾病状态。标签还可指明关于施用的指导等等。
除了容纳本发明的药物组合物的容器之外，优选地本发明的制品或试剂盒还可以任选包含容纳药学上可接受的稀释剂的第二容器。本发明的制品或试剂盒还可包括从商业立场和用户角度所需的其它材料，例如其它缓冲液，稀释剂，过滤器，注射针，注射器，和具有使用说明的包装插页。
根据需要，本发明的药物组合物可包装在药包或分配装置中提供，该药包或分配装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包括例如金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配装置可附有施用说明书。
(1)包含肽作为活性成分的药物组合物
包含本发明的肽的药物组合物可以根据需要通过常规制剂方法配制。除了本发明的肽之外，本发明的药物组合物可以包含通常用于药物中的载体，赋形剂等，而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，Tris缓冲盐水，0.3％甘氨酸，培养液，等等。此外，本发明的药物组合物可根据需要含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、pH调节剂、聚集抑制剂，等等。本发明的药物组合物可以诱导针对表达FOXM1的癌细胞的特异性免疫，因此可以用于癌症治疗或预防(防范)的目的。
例如，可以通过以下制备本发明的药物组合物：在药学上或生理上可接受的水溶性载体中溶解，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水，并根据需要加入稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等，然后灭菌肽溶液。对肽溶液进行灭菌的方法没有特别限定，优选通过过滤灭菌进行。过滤灭菌可以使用(例如)孔径为0.22μm或以下的过滤灭菌过滤器进行。过滤灭菌的肽溶液可以例如作为注射剂施用至受试者，但不限于此。
本发明的药物组合物可以通过冷冻干燥上述肽溶液制备为冷冻干燥制剂。冷冻干燥制剂可以通过以下制备：将如上所述制备的肽溶液装入适当的容器，如安瓿、小瓶或塑料容器中，随后冷冻干燥并用洗涤灭菌的橡胶塞等在压力回收之后包封入容器中。冷冻干燥制剂可以在其再溶解于药学上或生理学上可接受的水溶性载体后施用至受试者，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水等。本发明的药物组合物的优选实例包括此类过滤灭菌的肽溶液的注射物和由冻干该肽溶液所产生的冷冻干燥制剂。本发明还包括含有此类冷冻干燥制剂和再溶解溶液的试剂盒。本发明还包括容纳冷冻干燥制剂(其是本发明的药物组合物)的容器和容纳再溶解溶液的容器的试剂盒。
本发明的药物组合物可以包含两种或更多种类型的本发明肽的组合。肽的组合可以采取混合的肽的鸡尾酒形式，或可以使用标准技术彼此缀合。例如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以从受试者分离APCs(例如DCs)，然后用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何所述本发明肽的APC。将这些APC重新施用给受试者以在受试者中诱导CTL，结果，可提高针对表达FOXM1的癌细胞的攻击性。
本发明的药物组合物还可以包含已知用于有效建立细胞免疫的佐剂。佐剂是指当与抗原一起(或连续)施用时增强针对具有免疫学活性的抗原的免疫应答的化合物。可以使用描述于文献中的已知佐剂，例如Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89。合适佐剂的例子包括铝盐(磷酸铝，氢氧化铝，羟基氧化铝等)、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素,IFA(不完全弗氏佐剂)、CFA(完全弗氏佐剂)、ISCOMatrix、GM-CSF和其他免疫刺激细胞因子、含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG7909等)，水包油乳液、皂苷或其衍生物(QS21等)、脂多糖例如脂质A或其衍生物(MPL,RC529,GLA,E6020等)、脂肽、乳铁蛋白、鞭毛蛋白、双链RNA或其衍生物(poli IC等)、细菌DNA、咪唑并喹啉(Imiquimod,R848等)、C型凝集素配体(海藻糖-6,6’-二山嵛酸/酯(TDB)等)、CD1d配体(alpha-半乳糖神经酰胺等)、角鲨烯乳液(MF59,AS03,AF03等)、PLGA等，但不限于此。在包含本发明的药物组合物的试剂盒中，佐剂可以包含在与包含本发明的肽的药物组合物分开的另一容器中。在这种情况下，佐剂和药物组合物可以连续地施用于受试者，或者在施用给受试者之前立即混合在一起。本发明还提供了包含含有本发明的肽药物组合物和佐剂的此类试剂盒。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒还可以包含再溶解溶液。此外，本发明提供试剂盒，其包括容纳本发明的药物组合物的容器和存储佐剂的容器。试剂盒可以根据需要进一步包含储存再溶解溶液的容器。
当油佐剂用作佐剂时，本发明的药物组合物可以制备为乳液。例如，可以通过混合并搅拌如上所述制备的肽溶液和油佐剂来制备乳液。肽溶液可以是在冷冻干燥后再溶解的溶液。乳液可以是W/O型乳液和O/W型乳液，且W/O型乳液优选用于获得高免疫应答增强效果。IFA可优选用作油佐剂，但不限于此。乳剂的制备可以在施用受试者之前立即进行，且在这种情况下，本发明的药物组合物可以作为包含本发明的肽溶液和油性佐剂的试剂盒提供。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒可以进一步包含再溶解溶液。
此外，本发明的药物组合物可以是其中包封了本发明肽的脂质体制剂、其中肽结合至具有几微米直径的珠子的颗粒配制剂，或其中脂质结合至肽的配制剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以以药学上可接受的盐的形式施用。优选的盐的实例包括与碱金属(锂，钾，钠等)的盐，与碱土金属(钙，镁等)的盐，与其他金属(铜，铁，锌，锰等)的盐,与有机碱的盐,与胺的盐,与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的盐,和与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、硝酸等等)的盐。本文中所用的短语“药学上可接受的盐”是指保留所述化合物的生物学，生理学，药理学和药学上的有效性和性质的盐。因此，包含本发明的肽的药学上可接受的盐的药物组合物也包括在本发明内。此外，除了游离肽之外，“本发明的肽”还包括其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的组分。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL响应的其他例子，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres等人,Nature 1989,342:561-4)。
用于施用本发明的肽或药物组合物的合适方法的实例包括口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶位点附近，但不限于此。优选的施用方法包括皮下注射到诸如腋窝或腹股沟的淋巴结附近。更优选地(例如)，当本发明的药物组合物包含作为活性成分的肽或外来体时，优选皮下施用。或者，可通过静脉注射等方式施用具有作为活性成分的APC或CTL的组合物。可以通过单次施用或通过多次施用加强来进行施用。
本发明的肽可以以治疗或药学有效量施用于受试者以治疗癌症，或以治疗或药学有效量以诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫(更具体地为CTL)。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整。对于本发明的每种肽，剂量通常是0.001mg-1000mg，例如0.01mg-100mg，例如0.1mg-30mg，例如0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，且例如，可以每周一次的间隔进行给药。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽和药学上或生理学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽，药学或生理学上可接受的载体和佐剂。本发明的药物组合物可以包含0.001mg-1000mg,优选0.01mg-100mg,更优选0.1mg-30mg，甚至更优选0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg的本发明的肽。当本发明的药物组合物是注射剂时，其可以包含以下浓度的本发明的肽：0.001mg/ml-1000mg/ml，优选0.01mg/ml-100mg/ml，更优选0.1mg/ml-30mg/ml，甚至更优选0.1mg/ml-10mg/ml，例如0.5mg/ml-5mg/ml。在这种情况下，例如，可以通过注射向受试者施用0.1至5ml，优选0.5ml至2ml的本发明的药物组合物。
此外，本发明提供了治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。如上所述，本发明的肽可以以通常为以下量的单一剂量施用于受试者：0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg，例如,0.1mg-30mg，例如,0.1mg-10mg，或例如，0.5mg-5mg。在优选的实施方案中，本发明的肽与佐剂一起施用于受试者。此外，给药间隔可以是每几天至几个月一次，优选每几天至每月一次，例如每周一次或每两周一次。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物组合物
本发明的药物组合物也可含有以可表达的形式编码本发明公开的肽的多核苷酸。在本文中，短语“以可表达的形式”意味着多核苷酸在导入细胞时会表达作为本发明的肽。在示例性的实施方案中，本发明的多核苷酸的序列包括用于本发明的肽的表达所必需的调节元件。本发明的多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的序列(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12)。参见例如Wolff等人,Science 1990,247:1465-8；美国专利号5,580,859,5,589,466,5,804,566,5,739,118,5,736,524,5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利号5,922,687)。
本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。例如，可以使用牛痘病毒作为表达本发明的肽的载体。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利号4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于Stover等人,Nature 1991,351:456-60。各种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等等。参见例如Shata等人,Mol Med Today2000,6:66-71；Shedlock等人.,J Leukoc Biol2000,68:793-806；Hipp等人.,In Vivo2000,14:571-85。
本发明的多核苷酸投递至患者中可以是直接的，在这种情况下患者可以直接暴露于携带本发明多核苷酸的载体，或者是间接的，在这种情况下首先在体外用携带本发明多核苷酸的载体转化细胞，然后将细胞移植入患者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 1993,12:488-505；Wu和Wu,Biotherapy 1991,3:87-95；Tolstoshev,Ann Rev PharmacolToxicol 1993,33:573-96；Mulligan,Science 1993,260:926-32；Morgan&Anderson,AnnRev Biochem 1993,62:191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5):155-215。在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,1993；及Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中描述了也可应用于本发明的重组DNA技术领域的公知方法。
与肽的施用类似，多核苷酸的施用可以通过口服、皮内、皮下、静脉内、肌肉内、骨内、或腹膜内注射等等进行。多核苷酸的施用可以是系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明的多核苷酸可以以治疗或药学有效量施用于受试者，用于诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫(更具体地，CTL)，或以治疗或药学有效量用于治疗癌症。合适载体中的多核苷酸的剂量或使用编码本发明的肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等适当地调整，且通常是0.001mg-1000mg，例如，0.01mg-100mg,例如，0.1mg-30mg，例如，0.1mg-10mg，或例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，例如，给药可以每周一次的间隔进行。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法
本发明的肽和多核苷酸可用于诱导APCs和CTL。也可以使用本发明的的外来体和APC来诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要其CTL诱导能力不被抑制。因此，可以使用包含本发明的任何肽，多核苷酸，APC和外来体的药物组合物来诱导本发明的CTL。此外，可以使用包含本发明的肽或多核苷酸的药物组合物来诱导本发明的APC。
(1)诱导APC的方法
本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸诱导具有CTL诱导能力的APC的方法。
本发明的方法包括在体外、离体或体内使APC与本发明的肽接触的步骤。例如，使APC与肽离体接触的方法可以包括以下步骤：
(a)从受试者收集APC；和
(b)使步骤(a)的APC与本发明的肽接触。
上述APC不限于特定种类的细胞，并且可以使用已知在其细胞表面上呈递蛋白质抗原以被淋巴细胞识别的细胞，例如DC，Langerhans细胞，巨噬细胞，B细胞，和活化的T细胞。DC在APC中具有最强的CTL诱导能力，并因此优选使用DC。本发明的任何肽均可以由其自身或与本发明的其它肽组合使用。此外，本发明的肽可以与其它CTL诱导肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)组合使用。
同时，当将本发明的肽施用给受试者时，APC在体内接触到所述肽，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明的方法可包向受试者施用本发明的肽的步骤。类似地，当将可表达形式的本发明的多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达，表达的肽在体内与APCs接触，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还可以包括向受试者施用本发明的多核苷酸的步骤。
为了诱导具有CTL诱导能力的APC，本发明还包括将本发明的多核苷酸导入APC的步骤。例如，所述方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；并
(b)将编码本发明肽的多核苷酸导入步骤(a)的APC。
步骤(b)可如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；并
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC中。
此外，本发明提供了制备具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC中。
上述方法可以在体外、离体或体内实施，并优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APC可以衍生自计划施用诱导的APC的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC时，施用受试者和供体必须具有相同的HLA类型。
在本发明的方法中，当具有选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体两者中的HLA优选为HLA-A33(更优选HLA-A*33:03)。或者，在上述方法中使用的APC优选是表达HLA-A33(更优选HLA-A*33:03)的APC。
类似地，当具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中的HLA优选为HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)。或者，在上述方法中使用的APC优选是表达HLA-A01(更优选HLA-A*01:01)的APC。在通过特定重力离心法等从供体收集的血液中分离PBMC之后，可以使用已知方法从PBMC制备APC。
在另一个实施方案中，本发明还提供了包含本发明的肽或编码该肽的多核苷酸的药物组合物，其用于诱导具有CTL诱导能力的APC。
或者，本发明还提供了本发明的肽或编码该肽的多核苷酸在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物中的用途。
或者，本发明还提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸，用于诱导具有CTL诱导能力的APC。
或者，本发明进一步提供制备用于诱导APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体相混合的步骤。
通过本发明的方法诱导的APC可诱导对FOXM1特异性的CTL(即本发明的CTL)。
(2)诱导CTL的方法
本发明还提供了使用本发明的肽，多核苷酸，外来体或APC来诱导CTL的方法。本发明还提供了使用一种或多种编码能够形成T细胞受体(TCR)的多肽(即TCR亚基)的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。优选地，诱导CTL的方法包含选自以下的至少一个步骤：
(a)使CD8阳性T细胞与抗原呈递细胞接触，所述抗原呈递细胞在其表面上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；
(b)使CD8阳性T细胞与外来体接触，所述外来体在其表面上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入一种或多种编码能够形成TCR的多肽的多核苷酸，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。
当本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用至受试者后，在受试者的身体中诱导CTL，而且靶向表达FOXM1的癌细胞的免疫应答的强度增强。因此，本发明的方法可包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者的步骤。
或者，也可在体外或离体使用它们来诱导CTL。例如，本发明的方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；
(b)将步骤(a)的APC与本发明的肽接触；和
(c)将步骤(b)的APC与CD8阳性T细胞共培养。
诱导的CTL可以随后返回到受试者。
上文步骤(c)中要与CD8阳性T细胞共培养的APC也可通过将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分所述。然而，用于本发明的方法中的APC不限于此，并且可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的任何APC。
在本发明的方法中，除了此类APCs，也可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明的方法可以包括与在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体共培养的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。
此外，可通过将包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞来诱导CTL，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。此类转化可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导CTL的方法，包括选自以下的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APCs共培养，所述APCs在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。
上述方法可以在体外，离体或体内实施，并且优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APCs或外来体和CD8阳性T细胞可以衍生自计划施用诱导的CTL的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC或外来体和CD8阳性T细胞时，施用对象和供体必须具有相同的HLA类型。例如，当具有SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作为本发明的肽时，在施用对象和供体中HLA类型优选为HLA-A33(更优选HLA-A*33:03)。或者，上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递HLA-A33(更优选HLA-A*33:03)和本发明的肽(具有SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。在这种情况下，诱导的CTL显示出针对呈递HLA-A33和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达FOXM1的HLA-A33阳性细胞)的细胞毒活性。
或者，例如当使用具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽或其修饰的肽作为本发明的肽时，施用受试者和供体两者中HLA型优选为HLA-A01(更优选为HLA-A*01:01)。或者用于上述方法的APC和外来体优选为在其表面呈递HLA-A01(更优选为HLA-A*01:01)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽或其修饰的肽)的复合物的APC和外来体。在这种情况下，诱导的CTL显示出针对呈递HLA-A01和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达FOXM1的HLA-A01阳性细胞)的细胞毒活性。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于诱导CTL的组合物或药物组合物，其包含至少一种选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分用于诱导CTL：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供了制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物的方法或过程，其是包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物的方法或过程，其实包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
XI.诱导免疫应答的方法
本发明还提供了诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答的方法。适用的癌症包括急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等，但不限于此。优选的是癌症表达选自HLA-A33和HLA-A01中至少一种HLA。
本发明还提供了诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答的方法。FOXM1被认为在上述各种类型的癌症中过表达。因此，当诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答时，结果抑制了癌细胞的增殖。因此，本发明还提供了抑制表达FOXM1的癌细胞增殖的方法。本发明的方法特别适用于抑制表达FOXM1和选自HLA-A33和HLA-A01中至少一种HLA的癌细胞的增殖。
本发明的方法可以包括施用包含本发明的任何肽或编码所述肽的多核苷酸的组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明的肽的APC或外来体。关于详情参见“IX.药物组合物”部分，特别是描述本发明的药物组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于本发明的诱导免疫应答的方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法”的项(1)和(2)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于抑制表达FOXM1的癌细胞增殖的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明提供了选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达FOXM1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分在制备用于抑制表达FOXM1的癌细胞的增殖的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
本发明还提供了用于制备诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答的药物组合物的方法或过程，其中所述方法可以包括将本发明的肽或多核苷酸与药学上可接受的载体进行混合或配制的步骤。
或者，本发明提供了抑制表达FOXM1的癌细胞增殖的方法或诱导针对癌症的免疫应答的方法，其包括向受试者施用包含选自以下的活性成分的疫苗或药物组合物的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明的语境中，可以通过施用本发明的肽、多核苷酸、APC、外来体和/或CTL来治疗表达FOXM1的癌症。或者通过施用本发明的肽、多核苷酸、APC、外来体和/或CTL可以诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答。此类癌症的例子包括急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等，但不限于此。此外，通过施用本发明的肽、多核苷酸、APC、外来体和/或CTL可以诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答。因此，在施用包含上述活性成分的疫苗或药物组合物之前，优选确认待治疗的受试者中患病部位的FOXM1表达水平是否增加。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要癌症治疗的患者中治疗表达FOXM1的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中FOXM1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的FOXM1表达水平鉴定具有表达FOXM1的癌症的受试者；和
(iii)向患者施用选自由以上(a)至(e)组成的组的至少一种成分，所述患者患有相较于正常对照过表达FOXM1的癌症。
或者，本发明进一步提供了疫苗和药物组合物，其包含至少一种选自由以上(a)至(e)组成的组的活性成分，用于向具有表达FOXM1的癌症患者施用。本发明还提供鉴定或选择要用至少一种选自上述(a)至(e)的活性成分治疗的受试者的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中FOXM1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的FOXM1表达水平鉴定具有表达FOXM1的癌症的受试者；和
(iii)鉴定或选择(ii)中鉴定的受试者作为可以用至少一种选自由(a)至(e)组成的组的活性成分治疗的受试者。
在上述方法中从受试者收集的用于测量FOXM1表达水平的生物样品没有特别限制，并且例如，可以优选使用通过活组织检查等收集的含有癌细胞的组织样品。生物样品中的FOXM1表达水平可以通过已知方法测量，例如，可以使用通过探针或PCR方法检测FOXM1基因的转录产物的方法(例如cDNA微阵列法，Northern印迹法，RT-PCR法等)、通过抗体等检测FOXM1基因的翻译产物的方法(例如，Western印迹法，免疫染色法等)，等等。此外，生物样品可以是血液样品，并且在这种情况下，测量针对FOXM1或其片段的抗体的血液水平，并且可以基于血液水平来评估患病部位的FOXM1表达水平。可以使用已知方法测量针对FOXM1的抗体的血液水平，例如，可以使用使用FOXM1蛋白或本发明的肽作为抗原的酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)等。
通常，在不表达FOXM1的组织和细胞中，几乎没有检测到FOXM1转录产物和翻译产物。因此，当在从受试者收集的癌细胞或含有癌细胞的组织样品中检测到FOXM1的转录产物或翻译产物时，可以确定受试者的癌症表达FOXM1。在没有表达FOXM1的癌症的受试者的血液样品中，几乎没有检测到针对FOXM1或其片段的抗体。因此，当在从受试者收集的血液样品中检测到针对FOXM1或其片段的抗体时，可以确定受试者的癌症表达FOXM1。
受试者的癌症是否表达FOXM1也可以通过与收集自受试者的非癌症部位的相同类型的生物材料的测量结果相比较或与收集自未患有癌症的受试者的相同类型的生物材料(正常对照样品)相比较。即，在与正常对照样品中的测量的靶水平(正常对照水平)进行比较中，当测试受试者的生物样品中的水平升高时，受试者的癌症被评估为表达FOXM1。例如，当检测到的测量对象的量与正常对照水平相比增加至少10％或更高时，可以评估受试者的癌症表达FOXM1。期望的是，检测到的测量目标的量优选地比正常对照水平高25％或更高，更优选50％或更高。此外，检测到的FOXM1的转录产物或翻译产物的量可以通过相对于检测到的已知持家基因(例如β-肌动蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1)的量标准化来评价。
在优选的实施方案中，优选在施用至少一种选自由上述(a)至(e)组成的组的活性成分之前确认受试者的HLA类型。例如，对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A33阳性受试者。对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A01阳性受试者。
本发明还提供了本发明的肽与HLA的复合物。上述本发明的复合物可以是单体或多聚体。当本发明的复合物为多聚体时，聚合的数目没有特别限制，且可以是任何聚合数目的多聚体。例子包括但不限于四聚体，五聚体，六聚体等。本发明的多聚体还包括dextramers(WO2002/072631)和streptamers(Knabel M等人,Nat Med.2002Jun；8(6):631-7.)。本发明的肽和HLA的复合物可以根据已知方法制备(例如,Altman JD等人,Science.1996,274(5284):94-6；WO2002/072631；WO2009/003492；Knabel M,NatMed.2002Jun；8(6):631-7等)。
例如，本发明的复合物可用于定量对本发明的肽特异的CTL。例如，从施用本发明的药物组合物的受试者收集血液样品，并且在分离PBMC之后制备CD4阴性细胞并与本发明的荧光染料-缀合的复合物接触。然后，可以通过流式细胞术分析测量对本发明的肽特异性的CTL的百分比。例如，可以通过在施用本发明的药物组合物之前，期间和/或之后测量针对本发明的肽的特异性CTL来监测本发明的药物组合物的免疫应答诱导作用。
XII.抗体
本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)不是本发明的肽。在另一个实施方案中，此类抗体可以包括在HLA分子的背景下识别肽的抗体，即结合肽-MHC复合物的抗体。抗体的结合特异性可以通过抑制测定来确认。也就是说，如果在本发明的肽的存在下，待分析的抗体与全长FOXM1多肽之间的结合被抑制，则该抗体显示出特异性结合本发明的肽。针对本发明的肽的抗体可用于疾病诊断和预后的测定，以及用于选择施用本发明的药物组合物的受试者选择和监测本发明的药物组合物。
本发明还提供了用于检测和/或定量本发明的肽或其片段的各种免疫测定。此类免疫测定包括但不限于放射免疫测定，免疫色谱，酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫荧光测定(ELIFA)等，并且在本领域熟知的各种免疫测定形式的范围内进行。
本发明的抗体可以用于可以检测表达FOXM1癌症的免疫学成像方法，且其实例包括但不限于使用本发明的标记抗体的放射性闪烁照相成像。此类测定方法在临床上用于检测，监测和预后表达FOXM1的癌症；且此类癌症的例子包括急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等，但不限于此。
本发明的抗体可以以任何任意形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且还可包括通过用本发明的肽免疫动物(诸如家兔)而获得的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，人抗体，及通过遗传重组生成的嵌合抗体和人源化抗体。
用作获得抗体的抗原的本发明的肽或其片段可以通过基于本文公开的氨基酸序列通过化学合成或基因工程技术获得。
用作免疫抗原的肽可以是本发明的肽或本发明的肽的片段。此外，该肽可以与载体结合或与载体缀合以增加免疫原性。匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于将KLH结合至肽的方法也是本领域公知的。
可以用上述抗原免疫任何哺乳动物，且当产生单克隆抗体时优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(旧大陆猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射和皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。然后，优选的是使用每4至21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。
可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从哺乳动物中收集血液(其已经在免疫后确认了所需抗体血清水平的增)，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可以是包括含有多克隆抗体的血清，或可以从所述血清中分离的，含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。
为了制备单克隆抗体，在确认免疫后所需抗体的血清水平增加时，从哺乳动物收集免疫细胞并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。对于其他与上述免疫细胞融合的亲本细胞，例如，可以使用哺乳动物骨髓瘤细胞，并且更优选为已获得融合细胞的药物选择性质的骨髓瘤细胞。
可根据已知的方法，例如Milstein et al.(Galfre and Milstein,MethodsEnzymol,1981,73:3-46)的方法，将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
对于由细胞融合得到的杂交瘤，可在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养以进行选择。通常在HAT培养基中继续细胞培养足够的时间(例如，数天至数周)，以允许除了所需的杂交瘤之外的所有其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，通过标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，可以使经过免疫的淋巴细胞与永生化的衍生自人的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤(JPS63-17688)。
然后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。
或者，可以通过癌基因永生化抗体产生免疫细胞(如免疫的淋巴细胞)，并用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,由MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它结合本发明的肽。例如，期望抗体片段含有抗体的抗原结合位点。具体来说，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:5879-83)。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co et al.,J Immunol,1994,152:2968-76；Better and Horwitz,Methods Enzymol,1989,178:476-96；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol,1989,178:497-515；Lamoyi,Methods Enzymol,1986,121:652-63；Rousseaux et al.,Methods Enzymol,1986,121:663-9；Bird和Walker,TrendsBiotechnol,1991,9:132-7))。
抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过此类修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用非人抗体CDR序列取代人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al.,Science,1988,239:1534-6)。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中人可变域的一小部分已被来自非人物种的相应序列所取代。
也可以使用完全的人抗体，这样的抗体除了人框架区和恒定区外还包含人可变区。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom&Winter,J.Mol.Biol.,1991,227:381)。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分离和纯化抗体(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和色谱，示例性的色谱包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人,Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析程序，诸如HPLC和FPLC。
例如，可通过使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光(IF)来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，然后施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并通过测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。为了评估抗体的结合活性，可以使用肽片段如C-末端或N-末端片段作为抗原。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。
通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的肽的样品，并检测或测量在抗体和肽之间形成的免疫复合物，可以检测或测量使用以上方法的本发明的肽。
例如，本发明的抗体可用于检测受试者的血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的肽。或者，也可以使用本发明的肽来检测受试者血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的抗体。在受试者的血液样品中测量本发明的肽或本发明的抗体的结果可以用于受试者选择用于施用本发明的药物组合物或监测药物组合物的功效。此外，已报道具有抗体(其针对作为疫苗施用的肽)的患者可能对疫苗具有高的应答性。因此，当使用患者的抗体作为指标(index)施用作为疫苗的本发明的肽时，本发明的肽可用作免疫测定抗原用于选择具有高应答性的患者。
XII.载体和宿主细胞
本发明提供包含编码本发明的肽的多核苷酸的载体和导入有所述载体的宿主细胞。本发明的载体可以用于将本发明的多核苷酸保持在宿主细胞中，以在宿主细胞中表达本发明的肽，或者以施用本发明的多核苷酸用于基因疗法。
当大肠杆菌为宿主细胞且在大肠杆菌(例如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue)中大量扩增和生成载体时，载体需要具有用于在大肠杆菌中扩增的“复制起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T，pDIRECT和pT7可用于克隆以及以上载体。当载体用于生产本发明的肽时，可以使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人,Nature 341:544-6(1989)；FASEB J 6:2422-7(1989))、araB启动子(Better等人,Science 240:1041-3(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来取代上述载体。另外，载体还可以包含用于肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列((Lei et al.,J Bacteriol,1987,169:4379)。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，还可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17):5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。
为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.,Nature,1979,277:108)、MMLV-LTR启动子、EF1-alpha启动子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res,1990,18:5322)、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
下面基于上述说明例示本发明的实施方案；然而本发明不限于这些实施方案。
[1]具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61；和
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61。
[2][1]的肽其选自下组(i)至(ii)：
(i)包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括引入选自下组的氨基酸序列中的选自下组(a)至(c)的一个或多个取代：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45和46：
(a)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N末端起的第一个氨基酸；
(b)用选自由苯丙氨酸，酪氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸组成的组的氨基酸取代自N末端起的第二个氨基酸；和
(c)用选自由精氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；
(ii)包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括引入选自下组的氨基酸序列中的选自下组(a)至(c)的一个或多个取代：SEQ ID NOs:48、49、50、52、53、55、20、56、57、58、59、60和61：
(a)用选自由苏氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸取代自N末端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N末端起的第三个氨基酸；和
(c)用酪氨酸取代C末端的氨基酸。
[3]权利要求[1]的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61。
[4]多核苷酸，其编码[1]至[3]中任一项的肽。
[5]组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[6][5]的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
[7][5]的组合物，其是药物组合物。
[8][7]的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
[9][7]的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
[10][8]或[9]的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤，和睾丸肿瘤。
[11][5]to[10]中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A33和HLA-A01。
[12]诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外，离体或体内将APC与[1]至[3]中任一项的肽接触；和
(b)将编码[1]至[3]中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
[13]诱导CTL的方法，其包含选自下组(a)至(c)的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的[1]至[3]中任一项的肽。
[14]APC，其在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物。
[15][14]的APC，其通过[12]的方法诱导。
[16]CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[17][16]的CTL，其通过[13]的方法诱导。
18.诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
19.治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[20]抗体，其结合[1]至[3]中任一项的肽。
[21]筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NOs:1、2、3、6、7、11、12、17、18、20、22、24、26、32、33、36、39、41、42、45、46、48、49、50、52、53、55、56、57、58、59、60和61；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择除FOXM1外的与任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
[22]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于诱导针对癌症的免疫应答的组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[23]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的药物组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[24]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分用于诱导针对癌症的免疫应答的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[25]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[26]诱导针对表达FOXM1的细胞的细胞毒性活性的方法，其包括向受试者施用选自下组(a)至(e)中的至少一种成分的步骤：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[27]冷冻干燥制剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽。
[28]药物组合物，其通过包括如下的方法制备：将一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽溶解在水溶性载体中，并进行过滤灭菌。
[29]过滤灭菌水溶液，其是包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽和水溶性载体的水溶液。
[30]乳剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
[31]试剂盒，其包含容纳[5]至[11]中任一项的药物组合物的容器和容纳佐剂的容器。
[32]试剂盒，其包含储存包含[1]至[3]中任一项的肽的冷冻干燥制剂的容器、储存佐剂的容器，和储存在溶解液冷冻干燥制剂的容器。
本文参考其具体实施方案在此详细解释本发明。然而，应当理解，上述解释实际上是说明性和解释性解释，并且旨在解释本发明及其优选实施方式。通过常规实验，本领域技术人员将容易地认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变和修改。因此，本发明不限于上述说明，而是旨在由所附权利要求及其等同物限定。
在下文中，参照实施例更为详细地描述本发明。然而，虽然下述材料、方法和实施例可以用来帮助普通技术人员进行和使用本发明的某些实施方案，但是这些仅意图例示本发明的各方面，如此绝不限制本发明的范围。如本领域普通技术人员会容易认可与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试。
本文引用的所有现有技术文献通过引用并入本说明书。
实施例
[实施例1]
材料和方法
细胞系
C1R细胞(HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系)，和COS7细胞(非洲绿猴肾细胞系)购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*33:03表达的靶细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*33:03的C1R(C1R-A33)作为刺激CTL的细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*33:03的cDNA，并克隆到表达载体中。在药物选择下，在含有G418(Invitrogen)的培养基中培养引入了HLA-A*33:03基因表达载体的C1R细胞两周。稀释G418抗性C1R细胞悬液，接种于96孔板中，并进一步在含G418的培养基中选择性培养30天。通过流式细胞术分析证实C1R细胞中的HLA-A*33:03表达。
FOXM1衍生肽的选择
使用结合预测服务器“NetMHC pan2.8”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-2.8/)(Buus et al.,Tissue Antigens.2003,62(5):378-84；Nielsen et al.,ProteinSci.2003,12(5):1007-17；Bioinformatics.2004,20(9):1388-97)确定了预期结合HLA-A*33:03分子的FOXM1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过American Peptide Company(Sunnyvale,CA)根据标准固相合成法合成所述肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。通过HPLC和质谱来确保肽的质量(纯度90％或更高)。将肽用二甲基亚砜溶解(最终浓度：20mg/ml)并储存在-80℃
体外CTL诱导
使用单核细胞来源的树突状细胞(DC)作为抗原呈递细胞以诱导针对人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。正如文献报道的那样，体外生成DC(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体来说，将带有Ficoll-Paque plus溶液(Pharmacia)的从健康志愿者收集的外周血单核细胞(PBMC)接种入塑料组织培养皿(Corning)中以使PBMC中的单核细胞粘附在皿上。这在1000IU/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养7天。含有5％灭活的AB型血清(ABS)的AIM-V培养基(Invitrogen)用作培养基。用20μg/ml各自合成的肽冲击使用细胞因子从单核细胞诱导分化的DC(37摄氏度,3小时)。在含有3μg/ml beta2-微球蛋白的AIM-V培养基中进行肽冲击。通过X射线照射(20Gy)失活这些肽冲击的DC，将其与通过使用CD8阳性分离试剂盒(Invitrogen)获得的自体CD8阳性T细胞以1:20比率混合(1.5x 104DC和3x 105CD8阳性T细胞)，并在48孔板(Corning)中培养。每孔含有0.5ml的5％ABS/AIM-V培养基，并且向其加入IL-7(R&D System)(终浓度:10ng/ml)。培养开始两天后，添加IL-2(Novartis)(终浓度：20IU/ml)。在培养的第7天和第14天，用肽冲击的DC进一步刺激CD8阳性T细胞。DC在使用时通过与上述相同的方法制备。21天后(3次DC刺激后)，使用人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫斑点(ELISPOT)测定(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,ClinCancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)来确认针对肽冲击的C1R-A33的IFN-gamma产生。
CTL扩增程序
使用与Riddell等(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995,333(16):1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996,2(2):216-23)报道的方法相似的方法在培养物中扩增CTL。在25ml 5％ABS/AIM-V培养基中与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系(5x 106细胞/25ml每个培养基)和抗CD3抗体(终浓度40ng/ml)一同培养CTL。开始培养后一天，向培养物添加IL-2(终浓度：120IU/ml)。在第5天、第8天和第11天，将培养基更换为含有IL-2(终浓度：30IU/ml)的5％ABS/AIM-V培养基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,ClinCancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
体外诱导CTL后，将CTL以1细胞/孔或10细胞/孔接种到96孔圆底微孔板(NalgeNunc International)上。在含有抗CD3抗体(终浓度：30ng/ml)和IL-2(终浓度：125IU/ml)的总共150微升/孔的AIM-V/5％ABS/AIM-V培养基中，将CTL与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养物中加入含有500IU/ml IL-2的50微升5％的ABS/AIM-V。在第14天或之后，使用与上述方法相同的方法扩增在ELISPOT测定中显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
IFN-gamma产生的确认
为了确认用肽诱导的CTL的肽特异性IFN-gamma产生，进行了IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。将肽冲击的C1R-A33(1x104细胞/孔)制备为靶细胞。根据制造商的说明进行IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。
强迫表达FOXM1基因和HLA-A*33:03的细胞的制备
通过PCR扩增了编码FOXM1或HLA-A*33:03基因的cDNA。将PCR扩增产物各自克隆入表达载体。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，将FOXM1基因表达载体和HLA-A*33:03基因表达载体之一或两者引入COS7细胞(其是HLA阴性细胞系)。基因引入后一天，使用Versene(Invitrogen)解离并收获COS7细胞，并用作确认IFN-gamma产生的靶细胞(5x 104细胞/孔)。
结果
FOXM1衍生的HLA-A*33：03结合肽的预测
表1a和1b以结合亲和力的降序显示了通过“NetMHC pan2.8”预测结合HLA-A*33：03的FOXM1衍生的9聚体肽和10聚体肽。总共47个潜在具有HLA-A*33：03结合能力的肽用作表位肽候选物。
[表1a]
衍生自FOXM1的HLA-A*33：03结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
180 SLSNIQWLR 13.57 1
308 WTIHPSANR 34.66 2
693 QVSGLAANR 75.29 3
190 MSSDGLGSR 132.48 4
515 MLVIQHRER 138.98 5
516 LVIQHRERR 156.26 6
146 AARDVNLPR 230.20 7
140 TLGPKPAAR 248.65 8
389 SLMSSELAR 262.06 9
246 QFAINSTER 277.30 10
289 LSLHDMFVR 439.26 11
228 SWQNSVSER 481.46 12
125 TQTSYDAKR 519.42 13
489 DSSQSPTPR 646.55 14
270 FPYFKHIAK 766.69 15
216 QVKVEEPSR 835.12 16
502 YSGLRSPTR 855.62 17
321 DQVFKQQKR 1343.52 18
393 SELARHSKR 1443.91 19
341 KTELPLGAR 1574.92 20
547 FSEGPSTSR 1679.70 21
起始位置指示从FOXM1的N端起的氨基酸残基的数目。
解离常数[Kd(nM)]来源于“NetMHC2.8”。
[表1b]
衍生自FOXM1的HLA-A*33：03结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
514 EMLVIQHRER 26.71 22
139 ETLGPKPAAR 33.00 23
179 NSLSNIQWLR 34.89 24
288 NLSLHDMFVR 91.77 25
501 SYSGLRSPTR 109.92 26
515 MLVIQHRERR 114.82 27
307 FWTIHPSANR 131.76 28
398 HSKRVRIAPK 150.52 29
245 IQFAINSTER 172.14 30
269 HFPYFKHIAK 176.26 31
124 QTQTSYDAKR 190.55 32
595 STPSKSVLPR 240.63 33
394 ELARHSKRVR 278.30 34
247 FAINSTERKR 299.53 35
546 LFSEGPSTSR 332.38 36
392 SSELARHSKR 608.20 37
227 ASWQNSVSER 753.17 38
391 MSSELARHSK 875.46 39
326 QQKRPNPELR 880.19 40
607 ESWRLTPPAK 1179.88 41
265 WIEDHFPYFK 1214.75 42
497 RPKKSYSGLR 1332.87 43
471 EWPSPAPSFK 1418.64 44
4 SPRRPLILKR 1427.21 45
388 ASLMSSELAR 1586.13 46
651 SAPPLESPQR 1587.27 47
起始位置指示从FOXM1的N端起的氨基酸残基的数目。
解离常数[Kd(nM)]来源于“NetMHC2.8”。
通过预测的FOXM1衍生的HLA-A*33:03限制性肽来诱导CTL
根据“材料和方法”中描述的方案来诱导FOXM1衍生的肽特异性CTL。通过ELISPOT测定来确认肽特异性IFN-gamma产生(图1)。在以下孔中观察到肽特异性IFN-gamma产生：
使用OXM1-A33-9-180(SEQ ID NO:1)的孔#6中(a)
使用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)的孔#3中(b)
使用FOXM1-A33-9-693(SEQ ID NO:3)的孔#4中(c)
使用FOXM1-A33-9-516(SEQ ID NO:6)的孔#3中(d)
使用FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)的孔#5中(e)
使用FOXM1-A33-9-289(SEQ ID NO:11)的孔#6中(f)
使用FOXM1-A33-9-228(SEQ ID NO:12)的孔#6中(g)
使用FOXM1-A33-9-502(SEQ ID NO:17)的孔#4中(h)
使用FOXM1-A33-9-321(SEQ ID NO:18)的孔#2中(i)
使用FOXM1-A33-9-341(SEQ ID NO:20)的孔#6中(j)
使用FOXM1-A33-10-514(SEQ ID NO:22)的孔#8中(k)
使用FOXM1-A33-10-179(SEQ ID NO:24)的孔#6中(l)
使用FOXM1-A33-10-501(SEQ ID NO:26)的孔#5中(m)
使用FOXM1-A33-10-124(SEQ ID NO:32)的孔#5中(n)
使用FOXM1-A33-10-595(SEQ ID NO:33)的孔#3中(o)
使用FOXM1-A33-10-546(SEQ ID NO:36)的孔#5中(p)
使用FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)的孔#6中(q)
使用FOXM1-A33-10-607(SEQ ID NO:41)的孔#3中(r)
使用FOXM1-A33-10-265(SEQ ID NO:42)的孔#2中(s)
使用FOXM1-A33-10-4(SEQ ID NO:45)的孔#6中(t)和
使用FOXM1-A33-10-388(SEQ ID NO:46)的孔#5中(u)。
同时，未观察到针对表1a和1b中显示的其它肽的特异性IFN-gamma生产。例如，未观察到针对FOXM1-A33-10-288(SEQ ID NO:25)的特异性IFN-gamma生产(v)。结果，尽管所有的肽均具有结合HLA-A*33:03的潜力，选择了21个肽作为具有CTL诱导能力的肽。
对HLA-A*33:03限制性FOXM1衍生的肽特异性的CTL系和克隆的建立
通过在IFN-gamma ELISPOT测定中的以下孔中增殖细胞来建立CTL系：使用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)的孔#3中(a)、使用FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)的孔#5中(b)、使用FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)的孔#6中(c)，和使用FOXM1-A33-10-265(SEQID NO:42)的孔#6中(d)。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，观察到由针对以下靶细胞(C1R-A33)的CTL系的IFN-gamma产生(图2)：用具有FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)的孔#3冲击的靶细胞(a)、用具有FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)的孔#5冲击的靶细胞(b)、用具有FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)的孔#6冲击的靶细胞(c)，或FOXM1-A33-10-265(SEQID NO:42)。此外，通过从如以上“材料和方法”部分中描述的CTL系的有限稀释建立CTL克隆。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，用FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)(a)或FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)(b)刺激的CTL克隆各自显示了肽特异性IFN-gamma产生(图3)。
针对表达FOXM1和HLA-A*33:03的靶细胞的IFN-gamma产生
研究了针对表达FOXM1和HLA-A*33:03的靶细胞的FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)特异性CTL克隆的IFN-gamma产生。将表达FOXM1和HLA-A*33:03两者的COS7细胞制备为靶细胞。将表达FOXM1和HLA-A*33:03之一的COS7细胞制备为阴性对照细胞。FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)特异性CTL克隆显示出针对表达FOXM1和HLA-A*33:03两者的COS7细胞的IFN-gamma产生(图4)。另一方面，未观察到针对阴性对照细胞的显著的IFN-gamma产生。这明确地证明了FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)是由抗原加工所产生的肽，且与HLA-A*33:03分子呈递在细胞表面并由CTL识别。该结果表明FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)作为癌症疫苗可以对其癌症细胞中FOXM1表达增强的患者有用。
抗原肽的同源性分析
已经证实FOXM1-A33-9-180(SEQ ID NO:1)、FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)、FOXM1-A33-9-693(SEQ ID NO:3)、FOXM1-A33-9-516(SEQ ID NO:6)、FOXM1-A33-9-146(SEQID NO:7)、FOXM1-A33-9-289(SEQ ID NO:11)、FOXM1-A33-9-228(SEQ ID NO:12)、FOXM1-A33-9-502(SEQ ID NO:17)、FOXM1-A33-9-321(SEQ ID NO:18)、FOXM1-A33-9-341(SEQ IDNO:20)、FOXM1-A33-10-514(SEQ ID NO:22)、FOXM1-A33-10-179(SEQ ID NO:24)、FOXM1-A33-10-501(SEQ ID NO:26)、FOXM1-A33-10-124(SEQ ID NO:32)、FOXM1-A33-10-595(SEQID NO:33)、FOXM1-A33-10-546(SEQ ID NO:36)、FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)、FOXM1-A33-10-607(SEQ ID NO:41)、FOXM1-A33-10-265(SEQ ID NO:42)、FOXM1-A33-10-4(SEQ ID NO:45)和FOXM1-A33-10-388(SEQ ID NO:46)可以诱导显示肽特异性IFN-gamma产生的CTL。因此，为了确认FOXM1-A33-9-180(SEQ ID NO:1)、FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)、FOXM1-A33-9-693(SEQ ID NO:3)、FOXM1-A33-9-516(SEQ ID NO:6)、FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)、FOXM1-A33-9-289(SEQ ID NO:11)、FOXM1-A33-9-228(SEQ ID NO:12)、FOXM1-A33-9-502(SEQ ID NO:17)、FOXM1-A33-9-321(SEQ ID NO:18)、FOXM1-A33-9-341(SEQ ID NO:20)、FOXM1-A33-10-514(SEQ ID NO:22)、FOXM1-A33-10-179(SEQ ID NO:24)、FOXM1-A33-10-501(SEQ ID NO:26)、FOXM1-A33-10-124(SEQ ID NO:32)、FOXM1-A33-10-595(SEQ ID NO:33)、FOXM1-A33-10-546(SEQ ID NO:36)、FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)、FOXM1-A33-10-607(SEQ ID NO:41)、FOXM1-A33-10-265(SEQ ID NO:42)、FOXM1-A33-10-4(SEQ ID NO:45)和FOXM1-A33-10-388(SEQ ID NO:46)序列仅衍生自FOXM1，使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行了肽序列的同源性分析。结果，仅在FOXM1中发现FOXM1-A33-9-180(SEQ ID NO:1)、FOXM1-A33-9-308(SEQ ID NO:2)、FOXM1-A33-9-693(SEQ ID NO:3)、FOXM1-A33-9-516(SEQ ID NO:6)、FOXM1-A33-9-146(SEQ ID NO:7)、FOXM1-A33-9-289(SEQ ID NO:11)、FOXM1-A33-9-228(SEQ ID NO:12)、FOXM1-A33-9-502(SEQ ID NO:17)、FOXM1-A33-9-321(SEQ ID NO:18)、FOXM1-A33-9-341(SEQ ID NO:20)、FOXM1-A33-10-514(SEQ ID NO:22)、FOXM1-A33-10-179(SEQ ID NO:24)、FOXM1-A33-10-501(SEQ ID NO:26)、FOXM1-A33-10-124(SEQ ID NO:32)、FOXM1-A33-10-595(SEQ ID NO:33)、FOXM1-A33-10-546(SEQ ID NO:36)、FOXM1-A33-10-391(SEQ ID NO:39)、FOXM1-A33-10-607(SEQ ID NO:41)、FOXM1-A33-10-265(SEQ ID NO:42)、FOXM1-A33-10-4(SEQ ID NO:45)和FOXM1-A33-10-388(SEQ ID NO:46)序列。因此，根据本发明人的知识，这些肽对FOXM1特异，使得这些肽几乎不可能引发针对除FOXM1以外的分子(已知其致敏人免疫系统)的不期望的免疫反应。总之，鉴定了新型FOXM1衍生的HLA-A*33:03限制性表位肽。证明了FOXM1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例2]
材料和方法
细胞系
C1R细胞(HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系)，和COS7细胞(非洲绿猴肾细胞系)购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*01:01表达的靶细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*01:01的C1R(C1R-A01)作为刺激CTL的细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*01:01的cDNA，并克隆到表达载体中。在药物选择下，在含有G418(Invitrogen)的培养基中培养引入了HLA-A*01:01基因表达载体的C1R细胞两周。稀释G418抗性C1R细胞悬液，接种于96孔板中，并进一步在含G418的培养基中选择性培养30天。通过流式细胞术分析证实C1R细胞中的HLA-A*01:01表达。
FOXM1衍生肽的选择
使用结合预测服务器“NetMHC 3.4”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.4/)(Buus S et al.,Tissue Antigens.2003,62(5):378-84；Nielsen M et al.,ProteinSci.2003,12(5):1007-17；Nielsen M et al.,Bioinformatics.2004,20(9):1388-97)确定了预期结合HLA-A*01:01分子的FOXM1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过American Peptide Company(Sunnyvale,CA)根据标准固相合成法合成所述肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。通过HPLC和质谱来确保肽的质量(纯度90％或更高)。将肽用二甲基亚砜溶解(最终浓度：20mg/ml)并储存在-80℃
体外CTL诱导
使用单核细胞来源的树突状细胞(DC)作为抗原呈递细胞以诱导针对人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。正如文献报道的那样，体外生成DC(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体来说，将从健康志愿者(HLA-A*01:01阳性)收集的外周血单核细胞(PBMC)接种入塑料组织培养皿(Corning)中以使PBMC中的单核细胞粘附在皿上。这在1000IU/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(R&DSystem)和1000IU/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养7天。含有5％灭活的AB型血清(ABS)的AIM-V培养基(Invitrogen)用作培养基。用20μg/ml各自合成的肽冲击使用细胞因子从单核细胞诱导分化的DC(37摄氏度,3小时)。在含有3μg/ml beta 2-微球蛋白的AIM-V培养基中进行肽冲击。通过X射线照射(20Gy)失活这些肽冲击的DC，将其与通过使用CD8阳性分离试剂盒(Invitrogen)获得的自体CD8阳性T细胞以1:20比率混合(1.5x 104DC和3x105CD8阳性T细胞)，并在48孔板(Corning)中培养。每孔含有0.5ml的5％ABS/AIM-V培养基，并且向其加入IL-7(R&D System)(终浓度:10ng/ml)。培养开始两天后，添加IL-2(Novartis)(终浓度：20IU/ml)。在培养的第7天和第14天，用肽冲击的DC进一步刺激CD8阳性T细胞。DC在使用时通过与上述相同的方法制备。21天后(3次DC刺激后)，使用人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫斑点(ELISPOT)测定(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,Clin CancerRes 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe Tet al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)来确认针对肽冲击的C1R-A01的IFN-gamma产生。
CTL扩增程序
使用与Riddell等(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995,333(16):1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996,2(2):216-23)公开的方法相似的方法扩增CTL。在25ml5％ABS/AIM-V培养基中与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系(5x 106细胞/25ml每个培养基)和抗CD3抗体(终浓度40ng/ml)一同培养CTL。开始培养后一天，向培养物添加IL-2(终浓度：120IU/ml)。在第5天、第8天和第11天，将培养基更换为含有IL-2(终浓度：30IU/ml)的5％ABS/AIM-V培养基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T etal.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
体外诱导CTL后，将CTL以1细胞/孔或10细胞/孔接种到96孔圆底微孔板(NalgeNunc International)上。在含有抗CD3抗体(终浓度：30ng/ml)和IL-2(终浓度：125IU/ml)的总共150微升/孔的AIM-V/5％ABS/AIM-V培养基中，将CTL与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系共培养(1x104细胞/孔)。10天后向培养物中加入含有500IU/ml IL-2的50微升5％的ABS/AIM-V。在第14天或之后，使用与上述方法相同的方法扩增在ELISPOT测定中显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
IFN-gamma产生的确认
为了确认用肽诱导的CTL的肽特异性IFN-gamm产生产，进行了IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。将肽冲击的C1R-A01(1x104细胞/孔)制备为靶细胞。根据制造商的说明进行IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。
强迫表达FOXM1基因和HLA-A*01:01的细胞的制备
通过PCR扩增了编码FOXM1或HLA-A*01:01基因的cDNA。将PCR扩增产物各自整合到表达载体中。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，将FOXM1基因表达载体和HLA-A*01:01基因表达载体之一或两者引入COS7细胞(其是HLA阴性细胞系)。在基因引入后一天，使用Versene(Invitrogen)解离并收获COS7细胞，并用作确认IFN-gamma产生的靶细胞(5x 104细胞/孔)。
结果
FOXM1衍生的HLA-A*01：01结合肽的预测
表2a和2b以结合亲和力的降序显示了通过“NetMHC 3.4”预测结合HLA-A*01：01的FOXM1衍生的9聚体肽和10聚体肽。总共16个潜在具有HLA-A*01：01结合能力的肽用作表位肽候选物。
[表2a]
预测结合HLA-A*01：01的FOXM1衍生9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
233 VSERPPYSY 73 48
539 CVDEPELLF 666 49
631 ASDPLPDPL 1807 50
703 LTEGLVLDT 6665 51
231 NSVSERPPY 6867 52
663 SSEPLDLIS 9729 53
392 SSELARHSK 18415 54
494 PTPRPKKSY 19761 55
341 KTELPLGAR 20899 20
起始位置的编号指示肽的第一个氨基酸对应的FOXM1蛋白的N末端起的氨基酸数目。
使用“NetMHC3.4”计算解离常数[Kd(nM)]。
[表2b]
预测结合HLA-A*01：01的FOXM1衍生10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
566 SSDPASQLSY 15 56
263 YTWIEDHFPY 156 57
308 WTIHPSANRY 554 58
232 SVSERPPYSY 1482 59
663 SSEP1DLISV 10539 60
265 WIEDHFPYFK 18243 42
341 KTELPLGARR 26951 61
起始位置的编号指示肽的第一个氨基酸对应的FOXM1蛋白的N末端起的氨基酸数目。
使用“NetMHC3.4”计算解离常数[Kd(nM)]。
通过预测的FOXM1衍生的HLA-A*01：01限制性肽来诱导CTL
根据“材料和方法”中描述的方案来诱导FOXM1衍生的肽特异性CTL。通过ELISPOT测定来确认肽特异性IFN-gamma产生(图5)。在以下孔中观察到肽特异性IFN-gamma产生：
使用FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO：48)的孔#3中(a)，
使用FOXM1-A01-9-539(SEQ ID NO：49)的孔#3中(b)，
使用有FOXM1-A01-9-631(SEQ ID NO：50)的孔#3中(c)，
使用FOXM1-A01-9-231(SEQ ID NO：52)的孔#2中(d)，
使用FOXM1-A01-9-663(SEQ ID NO：53)的孔#2中(e)，
使用FOXM1-A01-9-494(SEQ ID NO：55)的孔#5中(f)，
使用FOXM1-A01-9-341(SEQ ID NO：20)的孔#2中(g)，
使用FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO：56)的孔#1中(h)，
使用FOXM1-A01-10-263(SEQ ID NO：57)的孔#2中(i)，
使用FOXM1-A01-10-308(SEQ ID NO：58)的孔#4中(j)，
使用FOXM1-A01-10-232(SEQ ID NO：59)的孔#6中(k)，
使用FOXM1-A01-10-663(SEQ ID NO：60)的孔#6中(1)和
使用FOXM1-A01-10-341(SEQ ID NO：61)的孔#6中(m)。
同时，未观察到针对表1a和1b中显示的其它肽的特异性IFN-gamma产生。例如，未观察到针对FOXM1-A01-10-265(SEQID NO：42)的特异性IFN-gamma产生(n)。结果，尽管所有的肽均具有结合HLA-A*01:01的潜力，选择了13个肽作为具有CTL诱导能力的肽。
对HLA-A*01:01限制性FOXM1衍生的肽特异性的CTL系和克隆的建立
通过扩增孔1#中的细胞建立CTL系，其在IFN-gamma ELISPOT测定中显示针对FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)的特异性IFN-gamma产生。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，观察到针对用FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)冲击的靶细胞(C1R-A01)的CTL系的IFN-gamma产生。此外，通过有限稀释方法建立了CTL克隆。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，用FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO:48)(a)或FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)(b)刺激的CTL克隆各自显示了肽特异性IFN-gamma产生(图7)。
针对表达FOXM1和HLA-A*01:01的靶细胞的IFN-gamma产生
研究了针对表达FOXM1和HLA-A*01:01的靶细胞的FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)特异性CTL克隆的IFN-gamma产生。将表达FOXM1和HLA-A*01:01两者的COS7细胞制备为靶细胞。将表达FOXM1和HLA-A*01:01之一的COS7细胞制备为阴性对照细胞。FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)特异性CTL克隆显示出针对表达FOXM1和HLA-A*01:01两者的COS7细胞的IFN-gamma产生(图8)。另一方面，未观察到针对阴性对照细胞的显著的IFN-gamma产生。这明确地证明了FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)是由抗原加工所产生的肽，且与HLA-A*01:01分子呈递在细胞表面并由CTL识别。该结果表明FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)作为癌症疫苗可以对癌症细胞中FOXM1表达增强的患者有用。
抗原肽的同源性分析
已经证实FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO:48)、FOXM1-A01-9-539(SEQ ID NO:49)、FOXM1-A01-9-631(SEQ ID NO:50)、FOXM1-A01-9-231(SEQ ID NO:52)、FOXM1-A01-9-663(SEQ ID NO:53)、FOXM1-A01-9-494(SEQ ID NO:55)、FOXM1-A01-9-341(SEQ ID NO:20)、FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)、FOXM1-A01-10-263(SEQ ID NO:57)、FOXM1-A01-10-308(SEQ ID NO:58)、FOXM1-A01-10-232(SEQ ID NO:59)、FOXM1-A01-10-663(SEQ ID NO:60)和FOXM1-A01-10-341(SEQ ID NO:61)可以诱导显示肽特异性IFN-gamma产生的CTL。因此，为了确认FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO:48)、FOXM1-A01-9-539(SEQ ID NO:49)、FOXM1-A01-9-631(SEQ ID NO:50)、FOXM1-A01-9-231(SEQ ID NO:52)、FOXM1-A01-9-663(SEQ IDNO:53)、FOXM1-A01-9-494(SEQ ID NO:55)、FOXM1-A01-9-341(SEQ ID NO:20)、FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)、FOXM1-A01-10-263(SEQ ID NO:57)、FOXM1-A01-10-308(SEQ IDNO:58)、FOXM1-A01-10-232(SEQ ID NO:59)、FOXM1-A01-10-663(SEQ ID NO:60)和FOXM1-A01-10-341(SEQ ID NO:61)序列仅衍生自FOXM1，使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行了肽序列的同源性分析。结果，仅在FOXM1中发现FOXM1-A01-9-233(SEQ ID NO:48)、FOXM1-A01-9-539(SEQ ID NO:49)、FOXM1-A01-9-631(SEQ ID NO:50)、FOXM1-A01-9-231(SEQ ID NO:52)、FOXM1-A01-9-663(SEQ ID NO:53)、FOXM1-A01-9-494(SEQ ID NO:55)、FOXM1-A01-9-341(SEQ ID NO:20)、FOXM1-A01-10-566(SEQ ID NO:56)、FOXM1-A01-10-263(SEQ ID NO:57)、FOXM1-A01-10-308(SEQ ID NO:58)、FOXM1-A01-10-232(SEQ ID NO:59)、FOXM1-A01-10-663(SEQ ID NO:60)和FOXM1-A01-10-341(SEQ ID NO:61)。因此，根据本发明人的知识，这些肽对FOXM1特异，使得这些肽几乎不可能引发针对除FOXM1以外的分子(已知其致敏人免疫系统)的不期望的免疫反应。总之，鉴定了新型FOXM1衍生的HLA-A*01:01限制性表位肽。证明了FOXM1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例3]
乳液制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂或无菌生理盐水中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并收集到注射器中。这经由连接器连接至装有与注射溶剂或无菌生理盐水等量的IFA的注射器，然后通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop test method)评价乳液的完成。滴落试验法可以通过将一滴混合样品滴在水上进行。当滴在水上的样品不立即在水中扩散时，评估乳液完成；并且当滴在水上的样品立即在水中扩散时，该乳液被评估为未完成。当乳液被评估为不完全时，进行进一步混合以完成乳液。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等。
冷冻干燥制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并过滤灭菌。将其装入灭菌的小瓶中，并用无菌橡胶塞半封闭。将该小瓶冷冻干燥后，将其完全封闭并用铝盖缝合以产生冷冻干燥的制剂。当使用时，将注射溶剂或无菌生理盐水注入小瓶中以重新溶解冷冻干燥的粉末。使用注射器收集小瓶中的再溶解溶液，并且通过连接器将注射器与填充有与收集的再溶解溶液的量相同量的IFA的注射器连接。通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合重新溶解的溶液和IFA。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop testmethod)评价乳液的完成。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、睾丸肿瘤等。
工业应用性
本发明提供了FOXM1衍生的新型HLA-A33限制性和HLA-A01限制性表位肽，其诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且因此具有广泛的癌症类型的可用性。本发明的肽、组合物、APC和CTL可用作针对表达FOXM1癌症的肽疫苗，例如：急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、弥漫性胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤、和睾丸肿瘤。
尽管本文详细地并且关于其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，前述描述本质上是示例性和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。
序列表
<110> 肿瘤疗法科学股份有限公司
<120> FOXM1衍生的肽和包含它们的疫苗
<130> ONC-A1604P
<150> JP 2015-200221
<151> 2015-10-08
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg
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<223> 衍生自FOXM1的肽
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<223> 衍生自FOXM1的肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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<223> 衍生自FOXM1的肽
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<223> 衍生自FOXM1的肽
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Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg
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<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 38
Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg
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<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 39
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<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 40
Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 41
Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 42
Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg
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<213> 人工序列
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<223> 衍生自FOXM1的肽
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Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg
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Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr
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Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe
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<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
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Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu
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<223> 衍生自FOXM1的肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 52
Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 53
Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 54
Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 55
Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 56
Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 57
Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 58
Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 59
Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 60
Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自FOXM1的肽
<400> 61
Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg
1 5 10
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 62
gtctaccagg cattcgcttc at 22
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 63
tcagctggac cacagccgca gcgt 24
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 64
tcagaaatcc tttctcttga c 21
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 65
ctagcctctg gaatcctttc tctt 24
<210> 66
<211> 3506
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (284)..(2530)
<400> 66
tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60
gggaccccct cccctcccgg gatcccccgg ggttcccacc ccgcccgcac cgccggggac 120
ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180
cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240
cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act agc 295
Met Lys Thr Ser
1
ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct gtt 343
Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro Val
5 10 15 20
caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc cct 391
Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser Pro
25 30 35
gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca gag 439
Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala Glu
40 45 50
tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac ccc 487
Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His Pro
55 60 65
acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat att 535
Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn Ile
70 75 80
cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc agt 583
His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly Ser
85 90 95 100
agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca act 631
Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr
105 110 115
cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc aaa 679
Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala Lys
120 125 130
agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct agg 727
Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala Arg
135 140 145
gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa cgg 775
Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg
150 155 160
gag acc tgt gca gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat agc 823
Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser
165 170 175 180
cta tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg ggc 871
Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly
185 190 195
tcc cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac ctg 919
Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu
200 205 210
gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc 967
Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser
215 220 225
tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg 1015
Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met
230 235 240
ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa 1063
Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys
245 250 255 260
gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att 1111
Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile
265 270 275
gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac 1159
Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His
280 285 290
gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg 1207
Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp
295 300 305
acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt 1255
Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe
310 315 320
aag cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc 1303
Lys Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile
325 330 335 340
aaa acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta 1351
Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu
345 350 355
cca cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag 1399
Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln
360 365 370
tca ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct 1447
Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala
375 380 385
tcc ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att 1495
Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile
390 395 400
gcc ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct tct 1543
Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser
405 410 415 420
gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt tct 1591
Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser
425 430 435
cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct ggg 1639
Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly
440 445 450
gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct ccc 1687
Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro
455 460 465
ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca tct 1735
Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser
470 475 480
cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag aag 1783
His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys
485 490 495 500
tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg ctt 1831
Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu
505 510 515
gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg aaa 1879
Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys
520 525 530
cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc tca 1927
Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser
535 540 545
gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca gca 1975
Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala
550 555 560
gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg gga 2023
Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly
565 570 575 580
gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc acc 2071
Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr
585 590 595
ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc acg 2119
Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr
600 605 610
ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc tcc 2167
Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser
615 620 625
cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat ctc 2215
Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu
630 635 640
agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa agg 2263
Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg
645 650 655 660
ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc aac 2311
Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn
665 670 675
tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca 2359
Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro
680 685 690
cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg gtc 2407
Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val
695 700 705
ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc agc 2455
Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser
710 715 720
ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac tgg 2503
Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp
725 730 735 740
tcc cag ttt att cct gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt 2550
Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
745
gctcaagctg tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg 2610
aggacagcag gcagggactg ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa 2670
gtagcagtca caccctagcc actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct 2730
ctgctgtccc tgccaggagc tgaagggtgg gaacaacaaa ggcaatggtg aaaagagatt 2790
aggaaccccc cagcctgttt ccattctctg cccagcagtc tcttaccttc cctgatcttt 2850
gcagggtggt ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa 2910
gcttatttcc ttagatcatt atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt 2970
ttcaattgac ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg 3030
gtttcttcca ggctgaggta cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt 3090
ggatctgctt gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca 3150
gctttcctgc aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa 3210
tttggggtgg gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt 3270
agatgtttct ctgataatgt ccccaatcat accagggaga ctggcattga cgagaactca 3330
ggtggaggct tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc tggcttcctt agcttgcccc 3390
tcagctttgc aaagagccac cctaggcccc agctgaccgc atgggtgtga gccagcttga 3450
gaacactaac tactcaataa aagcgaaggt ggacatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3506
<210> 67
<211> 748
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu
1 5 10 15
Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro
20 25 30
Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys
35 40 45
Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile
50 55 60
Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn
65 70 75 80
Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
85 90 95
Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr
165 170 175
Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser
180 185 190
Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu
195 200 205
Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg
210 215 220
Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser
225 230 235 240
Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg
245 250 255
Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr
260 265 270
Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn
275 280 285
Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys
290 295 300
Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu
305 310 315 320
Asp Gln Val Phe Lys Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg
325 330 335
Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met
340 345 350
Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe
355 360 365
Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu
370 375 380
Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys
385 390 395 400
Arg Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala
405 410 415
Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly
420 425 430
Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu
435 440 445
Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val
450 455 460
Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys
465 470 475 480
Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro
485 490 495
Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val
500 505 510
Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg
515 520 525
Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu
530 535 540
Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu
545 550 555 560
Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser
565 570 575
Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro
580 585 590
Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser
595 600 605
Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro
610 615 620
Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly
625 630 635 640
Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu
645 650 655
Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val
660 665 670
Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly
675 680 685
Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr
690 695 700
Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu
705 710 715 720
Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp
725 730 735
Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
740 745
<210> 68
<211> 3506
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (284)..(2530)
<400> 68
tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60
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ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180
cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240
cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act agc 295
Met Lys Thr Ser
1
ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct gtt 343
Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro Val
5 10 15 20
caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc cct 391
Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser Pro
25 30 35
gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca gag 439
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tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac ccc 487
Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His Pro
55 60 65
acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat att 535
Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn Ile
70 75 80
cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc agt 583
His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly Ser
85 90 95 100
agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca act 631
Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr
105 110 115
cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc aaa 679
Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala Lys
120 125 130
agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct agg 727
Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala Arg
135 140 145
gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa cgg 775
Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg
150 155 160
gag acc tgt gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat agc cta 823
Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser Leu
165 170 175 180
tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg ggc tcc 871
Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly Ser
185 190 195
cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac ctg gag 919
Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu Glu
200 205 210
cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc tgg 967
Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser Trp
215 220 225
cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg ata 1015
Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met Ile
230 235 240
caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa gac 1063
Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys Asp
245 250 255 260
atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att gcc 1111
Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile Ala
265 270 275
aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac gac 1159
Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Asp
280 285 290
atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg acc 1207
Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp Thr
295 300 305
att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt aag 1255
Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe Lys
310 315 320
cag cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc 1303
Gln Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile
325 330 335 340
aaa acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta 1351
Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu
345 350 355
cca cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag 1399
Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln
360 365 370
tca ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct 1447
Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala
375 380 385
tcc ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att 1495
Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile
390 395 400
gcc ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct tct 1543
Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser
405 410 415 420
gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt tct 1591
Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser
425 430 435
cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct ggg 1639
Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly
440 445 450
gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct ccc 1687
Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro
455 460 465
ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca tct 1735
Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser
470 475 480
cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag aag 1783
His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys
485 490 495 500
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Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu
505 510 515
gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg aaa 1879
Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys
520 525 530
cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc tca 1927
Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser
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550 555 560
gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg gga 2023
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Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr
585 590 595
ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc acg 2119
Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr
600 605 610
ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc tcc 2167
Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser
615 620 625
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Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu
630 635 640
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Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg
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ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc aac 2311
Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn
665 670 675
tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca 2359
Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro
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Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val
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ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc agc 2455
Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser
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Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp
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tcc cag ttt att cct gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt 2550
Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
745
gctcaagctg tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg 2610
aggacagcag gcagggactg ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa 2670
gtagcagtca caccctagcc actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct 2730
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gcagggtggt ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa 2910
gcttatttcc ttagatcatt atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt 2970
ttcaattgac ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg 3030
gtttcttcca ggctgaggta cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt 3090
ggatctgctt gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca 3150
gctttcctgc aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa 3210
tttggggtgg gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt 3270
agatgtttct ctgataatgt ccccaatcat accagggaga ctggcattga cgagaactca 3330
ggtggaggct tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc tggcttcctt agcttgcccc 3390
tcagctttgc aaagagccac cctaggcccc agctgaccgc atgggtgtga gccagcttga 3450
gaacactaac tactcaataa aagcgaaggt ggacatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3506
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<212> PRT
<213> 智人
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
85 90 95
Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile
165 170 175
Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp
180 185 190
Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn
195 200 205
Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr
225 230 235 240
Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met
245 250 255
Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe
260 265 270
Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu
275 280 285
Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val
290 295 300
Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp
305 310 315 320
Gln Val Phe Lys Gln Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg
325 330 335
Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met
340 345 350
Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe
355 360 365
Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu
370 375 380
Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys
385 390 395 400
Arg Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala
405 410 415
Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly
420 425 430
Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu
435 440 445
Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val
450 455 460
Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys
465 470 475 480
Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro
485 490 495
Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val
500 505 510
Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg
515 520 525
Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu
530 535 540
Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu
545 550 555 560
Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser
565 570 575
Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro
580 585 590
Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser
595 600 605
Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro
610 615 620
Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly
625 630 635 640
Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu
645 650 655
Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val
660 665 670
Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly
675 680 685
Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr
690 695 700
Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu
705 710 715 720
Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp
725 730 735
Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
740 745
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (284)..(2527)
<400> 70
tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60
gggaccccct cccctcccgg gatcccccgg ggttcccacc ccgcccgcac cgccggggac 120
ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180
cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240
cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act agc 295
Met Lys Thr Ser
1
ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct gtt 343
Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro Val
5 10 15 20
caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc cct 391
Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser Pro
25 30 35
gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca gag 439
Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala Glu
40 45 50
tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac ccc 487
Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His Pro
55 60 65
acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat att 535
Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn Ile
70 75 80
cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc agt 583
His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly Ser
85 90 95 100
agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca act 631
Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr
105 110 115
cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc aaa 679
Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala Lys
120 125 130
agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct agg 727
Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala Arg
135 140 145
gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa cgg 775
Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg
150 155 160
gag acc tgt gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat agc cta 823
Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser Leu
165 170 175 180
tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg ggc tcc 871
Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly Ser
185 190 195
cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac ctg gag 919
Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu Glu
200 205 210
cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc tgg 967
Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser Trp
215 220 225
cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg ata 1015
Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met Ile
230 235 240
caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa gac 1063
Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys Asp
245 250 255 260
atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att gcc 1111
Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile Ala
265 270 275
aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac gac 1159
Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Asp
280 285 290
atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg acc 1207
Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp Thr
295 300 305
att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt aag 1255
Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe Lys
310 315 320
cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc aaa 1303
Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile Lys
325 330 335 340
acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta cca 1351
Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu Pro
345 350 355
cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag tca 1399
Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln Ser
360 365 370
ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct tcc 1447
Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala Ser
375 380 385
ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att gcc 1495
Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile Ala
390 395 400
ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct tct gca 1543
Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser Ala
405 410 415 420
gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt tct cct 1591
Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro
425 430 435
ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct ggg gag 1639
Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly Glu
440 445 450
gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct ccc ttg 1687
Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu
455 460 465
gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca tct cac 1735
Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser His
470 475 480
tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag aag tcc 1783
Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser
485 490 495 500
tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg ctt gtg 1831
Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu Val
505 510 515
att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg aaa cag 1879
Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln
520 525 530
cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc tca gag 1927
His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu
535 540 545
ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca gca gac 1975
Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp
550 555 560
tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg gga gga 2023
Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly
565 570 575 580
cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc acc ccg 2071
Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro
585 590 595
agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc acg ccc 2119
Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro
600 605 610
cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc tcc cag 2167
Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln
615 620 625
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Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser
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Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser
665 670 675
tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca cag 2359
Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln
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Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu
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Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe
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cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac tgg tcc 2503
Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser
725 730 735 740
cag ttt att cct gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt gctcaagctg 2557
Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
745
tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg aggacagcag 2617
gcagggactg ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa gtagcagtca 2677
caccctagcc actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct ctgctgtccc 2737
tgccaggagc tgaagggtgg gaacaacaaa ggcaatggtg aaaagagatt aggaaccccc 2797
cagcctgttt ccattctctg cccagcagtc tcttaccttc cctgatcttt gcagggtggt 2857
ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa gcttatttcc 2917
ttagatcatt atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt ttcaattgac 2977
ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg gtttcttcca 3037
ggctgaggta cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt ggatctgctt 3097
gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca gctttcctgc 3157
aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa tttggggtgg 3217
gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt agatgtttct 3277
ctgataatgt ccccaatcat accagggaga ctggcattga cgagaactca ggtggaggct 3337
tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc tggcttcctt agcttgcccc tcagctttgc 3397
aaagagccac cctaggcccc agctgaccgc atgggtgtga gccagcttga gaacactaac 3457
tactcaataa aagcgaaggt ggacatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3503
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<211> 747
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
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Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro
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Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys
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Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile
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Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
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Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
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Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
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Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile
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Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp
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Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn
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Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr
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Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met
245 250 255
Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe
260 265 270
Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu
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Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val
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Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp
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Gln Val Phe Lys Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn
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Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys
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Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg
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Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu
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<211> 3551
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (284)..(2575)
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Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His
280 285 290
gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg 1207
Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp
295 300 305
acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt 1255
Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe
310 315 320
aag cca ctg gac cca ggg tct cca caa ttg ccc gag cac ttg gaa tca 1303
Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu His Leu Glu Ser
325 330 335 340
cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc aaa 1351
Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile Lys
345 350 355
acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta cca 1399
Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu Pro
360 365 370
cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag tca 1447
Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln Ser
375 380 385
ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct tcc 1495
Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala Ser
390 395 400
ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att gcc 1543
Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile Ala
405 410 415 420
ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct tct gca 1591
Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser Ala
425 430 435
gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt tct cct 1639
Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro
440 445 450
ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct ggg gag 1687
Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly Glu
455 460 465
gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct ccc ttg 1735
Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu
470 475 480
gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca tct cac 1783
Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser His
485 490 495 500
tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag aag tcc 1831
Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser
505 510 515
tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg ctt gtg 1879
Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu Val
520 525 530
att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg aaa cag 1927
Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln
535 540 545
cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc tca gag 1975
His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu
550 555 560
ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca gca gac 2023
Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp
565 570 575 580
tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg gga gga 2071
Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly
585 590 595
cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc acc ccg 2119
Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro
600 605 610
agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc acg ccc 2167
Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro
615 620 625
cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc tcc cag 2215
Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln
630 635 640
ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat ctc agc 2263
Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser
645 650 655 660
acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa agg ctc 2311
Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg Leu
665 670 675
ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc aac tct 2359
Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser
680 685 690
tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca cag 2407
Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln
695 700 705
gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg gtc ctg 2455
Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu
710 715 720
gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc agc ttt 2503
Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe
725 730 735 740
cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac tgg tcc 2551
Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser
745 750 755
cag ttt att cct gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt gctcaagctg 2605
Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
760
tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg aggacagcag 2665
gcagggactg ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa gtagcagtca 2725
caccctagcc actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct ctgctgtccc 2785
tgccaggagc tgaagggtgg gaacaacaaa ggcaatggtg aaaagagatt aggaaccccc 2845
cagcctgttt ccattctctg cccagcagtc tcttaccttc cctgatcttt gcagggtggt 2905
ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa gcttatttcc 2965
ttagatcatt atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt ttcaattgac 3025
ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg gtttcttcca 3085
ggctgaggta cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt ggatctgctt 3145
gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca gctttcctgc 3205
aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa tttggggtgg 3265
gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt agatgtttct 3325
ctgataatgt ccccaatcat accagggaga ctggcattga cgagaactca ggtggaggct 3385
tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc tggcttcctt agcttgcccc tcagctttgc 3445
aaagagccac cctaggcccc agctgaccgc atgggtgtga gccagcttga gaacactaac 3505
tactcaataa aagcgaaggt ggacatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3551
<210> 73
<211> 763
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu
1 5 10 15
Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro
20 25 30
Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys
35 40 45
Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile
50 55 60
Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn
65 70 75 80
Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
85 90 95
Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr
165 170 175
Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser
180 185 190
Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu
195 200 205
Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg
210 215 220
Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser
225 230 235 240
Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg
245 250 255
Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr
260 265 270
Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn
275 280 285
Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys
290 295 300
Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu
305 310 315 320
Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu
325 330 335
His Leu Glu Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn
340 345 350
Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys
355 360 365
Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro
370 375 380
Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro
385 390 395 400
Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg
405 410 415
Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro
420 425 430
Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu
435 440 445
Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile
450 455 460
Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu
465 470 475 480
Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu
485 490 495
Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg
500 505 510
Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser
515 520 525
Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser
530 535 540
Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu
545 550 555 560
Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro
565 570 575
Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln
580 585 590
Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile
595 600 605
Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp
610 615 620
Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val
625 630 635 640
Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu
645 650 655
Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser
660 665 670
Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro
675 680 685
Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser
690 695 700
Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu
705 710 715 720
Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu
725 730 735
Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn
740 745 750
Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
755 760
<210> 74
<211> 3665
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (284)..(2689)
<400> 74
tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60
gggaccccct cccctcccgg gatcccccgg ggttcccacc ccgcccgcac cgccggggac 120
ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180
cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240
cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act agc 295
Met Lys Thr Ser
1
ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct gtt 343
Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro Val
5 10 15 20
caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc cct 391
Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser Pro
25 30 35
gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca gag 439
Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala Glu
40 45 50
tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac ccc 487
Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His Pro
55 60 65
acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat att 535
Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn Ile
70 75 80
cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc agt 583
His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly Ser
85 90 95 100
agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca act 631
Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr
105 110 115
cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc aaa 679
Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala Lys
120 125 130
agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct agg 727
Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala Arg
135 140 145
gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa cgg 775
Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg
150 155 160
gag acc tgt gca gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat agc 823
Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser
165 170 175 180
cta tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg ggc 871
Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly
185 190 195
tcc cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac ctg 919
Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu
200 205 210
gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc 967
Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser
215 220 225
tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg 1015
Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met
230 235 240
ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa 1063
Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys
245 250 255 260
gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att 1111
Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile
265 270 275
gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac 1159
Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His
280 285 290
gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg 1207
Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp
295 300 305
acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt 1255
Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe
310 315 320
aag cca ctg gac cca ggg tct cca caa ttg ccc gag cac ttg gaa tca 1303
Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu His Leu Glu Ser
325 330 335 340
cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc aaa 1351
Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile Lys
345 350 355
acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta cca 1399
Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu Pro
360 365 370
cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag tca 1447
Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln Ser
375 380 385
ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct tcc 1495
Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala Ser
390 395 400
ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att gcc 1543
Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile Ala
405 410 415 420
ccc aag gtt ttt ggg gaa cag gtg gtg ttt ggt tac atg agt aag ttc 1591
Pro Lys Val Phe Gly Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr Met Ser Lys Phe
425 430 435
ttt agt ggc gat ctg cga gat ttt ggt aca ccc atc acc agc ttg ttt 1639
Phe Ser Gly Asp Leu Arg Asp Phe Gly Thr Pro Ile Thr Ser Leu Phe
440 445 450
aat ttt atc ttt ctt tgt tta tca gtg ctg cta gct gag gag ggg ata 1687
Asn Phe Ile Phe Leu Cys Leu Ser Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile
455 460 465
gct cct ctt tct tct gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt 1735
Ala Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe
470 475 480
gga gaa ggg ttt tct cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa 1783
Gly Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu
485 490 495 500
gaa atc cag cct ggg gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa 1831
Glu Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys
505 510 515
gtg gag agc cct ccc ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc 1879
Val Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe
520 525 530
aaa gag gaa tca tct cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc 1927
Lys Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr
535 540 545
cca aga ccc aag aag tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt 1975
Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys
550 555 560
gtc tcg gaa atg ctt gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc 2023
Val Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser
565 570 575 580
cgg tct cgg agg aaa cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg 2071
Arg Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro
585 590 595
gag ctg ctc ttc tca gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag 2119
Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu
600 605 610
ctc ccg ttc cca gca gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac 2167
Leu Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr
615 620 625
tcc cag gaa gtg gga gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg 2215
Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu
630 635 640
ccc atc tcc tcc acc ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa 2263
Pro Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu
645 650 655 660
tcc tgg agg ctc acg ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc 2311
Ser Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser
665 670 675
cca gta caa acc tcc cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg 2359
Pro Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu
680 685 690
ggg ctg atg gat ctc agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt 2407
Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu
695 700 705
gaa tca ccg caa agg ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc 2455
Glu Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser
710 715 720
gtc ccc ttt ggc aac tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca 2503
Val Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro
725 730 735 740
ggc tcc ccg gag cca cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg 2551
Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu
745 750 755
aca gaa ggc ctg gtc ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc 2599
Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile
760 765 770
ctg ctg gac atc agc ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct 2647
Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro
775 780 785
gac aac atc aac tgg tcc cag ttt att cct gag cta cag tag 2689
Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln
790 795 800
agccctgccc ttgcccctgt gctcaagctg tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt 2749
gcaccccaag cctctgagtg aggacagcag gcagggactg ttctgctcct catagctccc 2809
tgctgcctga ttatgcaaaa gtagcagtca caccctagcc actgctggga ccttgtgttc 2869
cccaagagta tctgattcct ctgctgtccc tgccaggagc tgaagggtgg gaacaacaaa 2929
ggcaatggtg aaaagagatt aggaaccccc cagcctgttt ccattctctg cccagcagtc 2989
tcttaccttc cctgatcttt gcagggtggt ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta 3049
tcctctaatt ataaatgtaa gcttatttcc ttagatcatt atccagagac tgccagaagg 3109
tgggtaggat gacctggggt ttcaattgac ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa 3169
gggaagacct gcagtgcacg gtttcttcca ggctgaggta cctggatctt gggttcttca 3229
ctgcagggac ccagacaagt ggatctgctt gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac 3289
ctccccgtgt ttccaagtca gctttcctgc aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt 3349
gtattgggtc aggagttgaa tttggggtgg gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg 3409
gtgcccagat gtgcgctatt agatgtttct ctgataatgt ccccaatcat accagggaga 3469
ctggcattga cgagaactca ggtggaggct tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc 3529
tggcttcctt agcttgcccc tcagctttgc aaagagccac cctaggcccc agctgaccgc 3589
atgggtgtga gccagcttga gaacactaac tactcaataa aagcgaaggt ggacatgaaa 3649
aaaaaaaaaa aaaaaa 3665
<210> 75
<211> 801
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu
1 5 10 15
Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro
20 25 30
Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys
35 40 45
Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile
50 55 60
Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn
65 70 75 80
Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
85 90 95
Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr
165 170 175
Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser
180 185 190
Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu
195 200 205
Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg
210 215 220
Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser
225 230 235 240
Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg
245 250 255
Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr
260 265 270
Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn
275 280 285
Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys
290 295 300
Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu
305 310 315 320
Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu
325 330 335
His Leu Glu Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn
340 345 350
Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys
355 360 365
Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro
370 375 380
Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro
385 390 395 400
Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg
405 410 415
Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Phe Gly Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr
420 425 430
Met Ser Lys Phe Phe Ser Gly Asp Leu Arg Asp Phe Gly Thr Pro Ile
435 440 445
Thr Ser Leu Phe Asn Phe Ile Phe Leu Cys Leu Ser Val Leu Leu Ala
450 455 460
Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu
465 470 475 480
Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr
485 490 495
Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala
500 505 510
Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro
515 520 525
Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser
530 535 540
Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser
545 550 555 560
Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg
565 570 575
Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys
580 585 590
Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg
595 600 605
Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser
610 615 620
Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile
625 630 635 640
Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro
645 650 655
Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly
660 665 670
Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu
675 680 685
Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser
690 695 700
Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu
705 710 715 720
Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp
725 730 735
Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala
740 745 750
Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser
755 760 765
Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp
770 775 780
Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu
785 790 795 800
Gln
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 76
Asn Lys Arg Lys
1

Claims (18)

1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的肽，其是由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成的肽或者由SEQ ID NO: 2的C末端氨基酸被赖氨酸取代的氨基酸序列组成的肽。
2.多核苷酸，其编码权利要求1的肽。
3.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a) 一种或多种类型的权利要求1的肽；
(b) 一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1的肽；
(c) 抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物；和
(d) 外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物。
4.权利要求3的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a) 一种或多种类型的权利要求1的肽；
(b) 一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1的肽；
(c) 抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物；和
(d) 外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物。
5.权利要求3的组合物，其是药物组合物。
6.权利要求5的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗, (ii)癌症预防和(iii)手术后癌症复发的预防，其中所述癌症是表达FOXM1的癌症。
7.权利要求5的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
8.权利要求6或7的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：急性髓样白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓样白血病(CML)、结肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)、软组织瘤和睾丸肿瘤。
9.权利要求3至8中任一项的组合物，其配制为用于对至少HLA-A33阳性的受试者施用。
10.诱导具有CTL诱导能力的APC的体外方法，其包含选自下组的步骤：
(a) 在体外将APC与权利要求1的肽接触； 和
(b) 将编码权利要求1的肽的多核苷酸导入APC。
11.诱导CTL的体外方法，其包含选自下组的步骤：
(a) 将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1的肽的复合物；
(b) 将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1的肽的复合物；和
(c) 将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合由细胞表面上的HLA抗原呈递的权利要求1的肽。
12.APC，其在其表面呈递HLA抗原与权利要求1的肽的复合物。
13.权利要求12的APC，其通过权利要求10的方法诱导。
14.乳剂，其包含一种或多种类型的权利要求1的肽，水溶性载体和油佐剂。
15.试剂盒，其包含含有权利要求3至9中任一项的组合物的容器和含有佐剂的容器。
16.权利要求1的肽或编码权利要求1的肽的多核苷酸在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的方法的组合物中的用途，其中所述方法包含选自下组的步骤：
(a) 在体外将APC与权利要求1的肽接触； 和
(b) 将编码权利要求1的肽的多核苷酸导入APC。
17.选自下组（a）至（d）中的至少一种组分在制备用于诱导针对表达FOXM1的癌症的免疫应答的方法的组合物中的用途，所述方法包括向受试者施用选自下述（a）至（d）组成的组的至少一种组分：
(a) 一种或多种类型的权利要求1的肽；
(b) 一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1的肽；
(c) APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物；和
(d) 外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物。
18.选自下组（a）至（d）中的至少一种组分在制备用于治疗和/或预防表达FOXM1的癌症和/或预防其术后复发的方法的组合物中的用途，所述方法包括向受试者施用选自下述（a）至（d）组成的组的至少一种组分：
(a) 一种或多种类型的权利要求1的肽；
(b) 一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1的肽；
(c) APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物；和
(d) 外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1的肽与HLA-A33的复合物。
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