CN108132285B - 一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，电镀金层之前碳纸的导电性与亲水性通过电化学的方法进行了改善，有利于金均匀地镀在碳纸纤维的表面，得到多孔、柔性、成本较普通金电极更为低廉的电极；以表面引发原子转移自由基聚合的方法，可控地在电极表面接枝上聚合物链段，最后利用共价键将酶分子固定在电极表面。本发明使用导电性能优异，比表面积大的碳纸作为基底材料，以保证电极的电性能和化学性能。所使用的碳纸基底材料在经过电化学处理之后其亲水性能大大增强，有利于生物酶的固定及稳定性。所制备的电极有望作为植入体内可“开/关”智能生物酶燃料电池的阳极。

Description

一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法
技术领域
本发明属于电催化电极的制备技术领域，涉及一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法。
背景技术
酶生物电极是以生物活性酶代替贵金属催化剂构筑的电极。该电极可在生理体液环境下催化底物进行氧化-还原反应，并将其得失电子转换成电信号输出。以该酶电极可以构筑酶型生物传感器或者酶生物燃料电池。生物传感器是一种将生物物质作为底物，将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，在食品、制药、化工、临床检验、生物医学、环境监测等方面都有广泛的应用前景。而酶生物燃料电池是目前最具潜力的可用于植入体内小型医疗器械的绿色、可再生微型燃料电池，可以为心脏起搏器、神经刺激器、植入体内的生物传感器、医疗诊断装置等提供持续不断的电能，是这一领域研究者们关注的焦点。
作为植入体内的医疗器械，一般需要在某种病理条件下具有自动可“开/关”的功能。而构建可对外界某种刺激做出响应的酶电极，是构建具有可“开/关”功能酶生物燃料电池，实现医疗器械智能化的关键。然而，目前的酶电极本身载酶量低、电子传递效率低、酶易脱落，以此构建的酶燃料电池不可避免地遇到开路电压低、功率密度低、稳定性差等应用瓶颈。其次，响应性酶电极的电化学响应性一般依靠电极表面具有刺激响应性聚合物刷实现，但刺激响应性聚合物一般不导电，当其存在于电极表面时，就会进一步影响到酶电极的导电性以及载酶量，降低电子在酶活性中心与电极表面间的传递效率。要解决这些问题，就要调控响应性聚合物刷在电极表面的分布密度及分子聚集状态，在保证电极刺激响应性的同时，设法提高载酶量，最大程度提高电极的导电性。但是，当前人们大都采用在电极表面滴涂响应性聚合物、将聚合物直接接枝在电极上或在电极表面通过自由基聚合、电聚合等方法制备响应性薄膜，这些方法制备的聚合物膜厚度、接枝率、聚合物刷的结构等较难控制，电极刺激响应性与电极电性能之间的关系难以调控。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，制备的电极表面接枝聚合物的结构可控、响应灵敏，电极表面酶负载量较大并且负载稳定，可以作为植入体内可“开/关”智能生物酶燃料电池的阳极。
技术方案
一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1、清洗碳纸：将碳纸在无水甲醇中超声10～50min，超纯水冲洗碳纸表面，室温晾干；
步骤2、碳纸的改性：以碳纸为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极构筑三电极体系，在浓度为0.025～0.1M，pH值为6～8K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌速率为200～500rpm，先采用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-0.5～3V，扫描速率为0.01～0.5V s-1，扫描圈数2～20圈，再在同一溶液中向工作电极施加-0.8～-1.2V的恒电压50～200s，完毕后得到导电性与亲水性大大改善的碳纸电极，超纯水冲洗电极表面，室温晾干得到导电碳纸；
步骤3、碳纸表面均匀电镀金：以导电碳纸为工作电极，在三电极体系下，采用恒电流法在纳米金沉积液中进行电镀，阴极电流密度为2～10mA cm-2，时间为1000～2000s，扫描完毕后即得到有均匀金镀层的碳纸电极，用超纯水、无水乙醇分别冲洗电极表面，室温晾干；
所述纳米金沉积液是：将氯金酸配成5～15mg/mL的溶液，取该溶液500～1000μL加入5～20ml的pH值为8～12，浓度为0.05～0.2mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌均匀即得到纳米金沉积液，通入氮气至饱和；
步骤4、金镀层的修饰：将步骤3制备的电极浸泡于10～60mM的4-氨基苯硫酚、4-巯基苯甲酸或3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装12～24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了氨基或者羧基的电极；
步骤5、引发剂的修饰：以0.3～2ml的三乙胺溶于10～30ml无水二氯甲烷，然后将步骤4处理的电极置入溶液，在冰水浴条件下，滴加0.5～3.5g溶解在5～10ml无水二氯甲烷中的2-溴异丁酰溴、2-溴丙酰溴或2-溴丁酰氯，之后在20～30℃下反应12～24个小时，以无水二氯甲烷冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰SI-ATRP引发剂的电极；
步骤6、聚合物在电极表面的接枝：将0.5～2g N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-二乙基丙烯酰胺或者N,N'-二甲基丙烯酰胺，10～30μL三(2-二甲氨基乙基)胺，10～20mg氯化亚铜溶解于5～10ml的异丙醇水溶液中，将步骤5得到的电极浸泡在溶液中，在氮气保护下，25～35℃下反应6～12个小时，反应完毕后得到敏感聚合物修饰的碳纸电极，将该电极浸泡在30℃以下的超纯水中，温和搅拌6～24个小时，除去聚合反应残留的铜盐，将该电极保存在超纯水；
步骤7、聚合物电极表面修饰：将步骤6中得到的电极表面用大量无水乙醇冲洗，之后浸泡在10～40mM的4-氨基苯硫酚、4-巯基苯甲酸或3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装12～24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了氨基或者羧基的电极；
步骤8、聚合物电极共价结合酶分子：将0.02～0.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.01～0.5g N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于5～15ml浓度为0.05～0.2mol/L，pH值为5～7的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入步骤7得到的电极，之后加入50～200mg葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶，20～25℃下反应24～48个小时，反应完毕即得到负载了生物酶的温度响应聚合物阳极。
所述步骤6的异丙醇以体积比为1:0.5～1:2的DMF取代。
所述超纯水电阻为18.2MΩ。
有益效果
本发明提出的一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，电镀金层之前碳纸的导电性与亲水性通过电化学的方法进行了改善，有利于金均匀地镀在碳纸纤维的表面，得到多孔、柔性、成本较普通金电极更为低廉的电极；以表面引发原子转移自由基聚合的方法，可控地在电极表面接枝上聚合物链段，最后利用共价键将酶分子固定在电极表面。
本发明提出的表面引发原子转移自由基聚合法与共价固定酶的方法能够调控响应性聚合物刷在电极表面的分布密度及分子聚集状态，在保证电极刺激响应性的同时，提高载酶量和稳定性。在酶电极表面电致自由基共聚，制备的刺激响应酶电极具有良好的“开/关”性能，完全“关闭”(37℃，pH＝8)时峰电流密度仅为“打开”(25℃，pH＝5)时的9.3％，三次重复“开-关”后，“打开”时的峰电流密度仍达到第一次“打开”时的98.9％。
采用电化学电镀与表面引发活性自由基聚合的方法分别在碳纸上制备均匀的金镀层与温度刺激响应的聚合物刷，是提高可“开/关”酶电极导电性、可“开/关”性能较为简单的方法；而共价固定酶的方法在长期重复使用酶电极时，可以有效地保障电极催化性能与稳定性。本发明所制备的电极在20mM葡萄糖溶液中催化峰电流为0.000771A，催化性能良好。在10次“开/关”循环中，催化峰电流仅下降6.49％，稳定性良好。本发明所制备的电极有望作为植入体内可“开/关”智能生物酶燃料电池的阳极。
表1有益效果
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附图说明
图1：为本发明的修饰层制备示意图，1为碳纸；
图2：为本发明涉及的温度刺激响应酶电极在不同温度下对不同浓度葡萄糖电化学检测的对比图：1为20℃下、葡萄糖浓度0mM时，电极氧化峰(-0.35V)的电流，2为20℃下、葡萄糖浓度10mM时，电极氧化峰(-0.35V)电流，3为20℃下、葡萄糖浓度20mM时，电极氧化峰(-0.35V)电流，4为40℃下、葡萄糖浓度0mM时，电极在-0.35V处的电流，5为40℃下、葡萄糖浓度10mM时，电极在-0.35V处的电流，6为40℃下、葡萄糖浓度20mM时，电极在-0.35V处的电流。
图3：为本发明涉及的温度刺激响应酶电极在不同温度下对不同浓度葡萄糖的循环伏安测试(CV)：1为20℃下、葡萄糖浓度0mM时的CV曲线，2为20℃下、葡萄糖浓度10mM时的CV曲线，3为20℃下、葡萄糖浓度20mM时的CV曲线，4为40℃下、葡萄糖浓度0mM时的CV曲线，5为40℃下、葡萄糖浓度10mM时的CV曲线，6为40℃下、葡萄糖浓度20mM时的CV曲线。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
本发明：将清洗过的洁净碳纸进行改性后在电极表面用电化学沉积的方法制备金镀层；用含有巯基的偶联剂在金镀层上修饰氨基或羧基，采用表面引发原子转移自由基聚合法SI-ATRP在电极表面聚合对温度刺激响应的单体，控制聚合物的结构与表面接枝率得到可对温度响应灵敏的电极基底；在该电极基底上修饰巯基偶联剂，用共价键合的方法固定生物酶，得到温度响应性酶阳极。
实施实例1：反应流程图如图1所示。
碳纸表面改性的步骤：
步骤一：碳纸的清洗：将亲水的碳纸在无水甲醇中超声50min，超纯水(电阻18.2MΩ)冲洗碳纸表面，室温晾干，备用；
步骤二：碳纸的改性：取一洁净的碳纸为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极构筑三电极体系，在浓度为0.1M，pH值为8的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌速率为500rpm，先采用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-0.5～3V，扫描速率为0.5V s-1，扫描圈数20圈，再在同一溶液中向工作电极施加-1V的恒电压200s，完毕后得到导电性与亲水性大大改善的碳纸电极，超纯水冲洗电极表面，室温晾干，备用。
碳纸表面电化学沉积的步骤：
步骤一：纳米金沉积液的制备：将氯金酸配成5mg/mL的溶液，取该溶液1000μL加入15ml的pH值为12，浓度为0.2mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌均匀即得到纳米金沉积液，通入氮气至饱和，备用；
步骤二：碳纸表面均匀电镀金：利用处理的导电碳纸为工作电极，在三电极体系下，采用恒电流法在所制备的纳米金沉积液中进行电镀，阴极电流密度为10mA cm-2，时间为2000s，扫描完毕后即得到有均匀金镀层的碳纸电极，用超纯水、无水乙醇分别冲洗电极表面，室温晾干，备用。
表面接枝响应聚合物的步骤：
步骤一：金镀层的修饰：将所制备的金镀层碳纸电极立即浸泡于60mM的4-氨基苯硫酚的无水乙醇溶液中，室温下自组装24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了氨基的电极；
步骤二：引发剂的修饰：取2ml的三乙胺溶于30ml无水二氯甲烷，放入修饰了氨基的电极，冰水浴条件下，逐滴加入3.5g溶解在10ml无水二氯甲烷中的2-溴异丁酰溴，之后在30℃下反应24个小时，以无水二氯甲烷冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了SI-ATRP引发剂的电极；
步骤三：聚合物在电极表面的接枝：将2g N-异丙基丙烯酰胺，30μL三(2-二甲氨基乙基)胺，20mg氯化亚铜溶解于10ml的异丙醇中，将修饰了SI-ATRP引发剂的电极浸泡在该溶液中，在氮气保护下，35℃反应12个小时，反应完毕后得到敏感聚合物修饰的碳纸电极，将该电极浸泡在30℃以下的超纯水中，温和搅拌24个小时，除去聚合反应残留的铜盐，将该电极保存在超纯水备用。
酶在电极上的固定步骤：
步骤一：聚合物电极表面修饰：将聚合物修饰的电极表面用大量无水乙醇冲洗，之后浸泡在40mM的4-氨基苯硫酚的无水乙醇溶液中，室温下自组装24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了氨基的电极；
步骤二：聚合物电极共价结合酶分子：将0.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.5g N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于15ml浓度为0.2mol/L，pH值为7的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，放入修饰了氨基的聚合物碳纸电极，之后加入200mg葡萄糖氧化酶，25℃下反应48个小时，反应完毕即得到负载了生物酶的敏感聚合物阳极。
实施实例2：
碳纸表面改性的步骤：
步骤一：碳纸的清洗：将亲水的碳纸在无水甲醇中超声10min，超纯水(电阻18.2MΩ)冲洗碳纸表面，室温晾干，备用；
步骤二：碳纸的改性：取一洁净的碳纸为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极构筑三电极体系，在浓度为0.025M，pH值为6的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌速率为200rpm，先采用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-0.5～3V，扫描速率为0.01V s-1，扫描圈数2圈，再在同一溶液中向工作电极施加-1.2V的恒电压50s，完毕后得到导电性与亲水性大大改善的碳纸电极，超纯水冲洗电极表面，室温晾干，备用。
碳纸表面电化学沉积的步骤：
步骤一：纳米金沉积液的制备：将氯金酸配成10mg/mL的溶液，取该溶液500μL加入10ml的pH值为8，浓度为0.05mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌均匀即得到纳米金沉积液，通入氮气至饱和，备用；
步骤二：碳纸表面均匀电镀金：利用处理的导电碳纸为工作电极，在三电极体系下，采用恒电流法在所制备纳米金沉积液中进行电镀，阴极电流密度为2mA cm-2，时间为1000s，扫描完毕后即得到有均匀金镀层的碳纸电极，用超纯水、无水乙醇分别冲洗电极表面，室温晾干，备用。
表面接枝响应聚合物的步骤：
步骤一：金镀层的修饰：将制备的金镀层电极立即浸泡于10mM的4-巯基苯甲酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装12个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了羧基的电极；
步骤二：引发剂的修饰：取0.3ml的三乙胺溶于30ml无水二氯甲烷，放入表面修饰了羧基的电极，冰水浴条件下，逐滴加入0.5g溶解在10ml无水二氯甲烷中的2-溴丙酰溴，之后在20℃下反应12个小时，以无水二氯甲烷冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰SI-ATRP引发剂的电极；
步骤三：聚合物在电极表面的接枝：将0.5g N,N'-二乙基丙烯酰胺，10μL三(2-二甲氨基乙基)胺，10mg氯化亚铜溶解于5ml的体积比为1:1的DMF/水溶液中，将表面修饰SI-ATRP引发剂的电极浸泡在溶液中，在氮气保护下，30℃反应6个小时，反应完毕后得到敏感聚合物修饰的碳纸电极，将该电极浸泡在30℃以下的超纯水中，温和搅拌6个小时，除去聚合反应残留的铜盐，将该电极保存在超纯水备用。
酶在电极上的固定步骤：
步骤一：聚合物电极表面修饰：将所制备的敏感聚合物修饰的碳纸电极表面用大量无水乙醇冲洗，之后浸泡在10mM的4-巯基苯甲酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装12个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了羧基的电极；
步骤二：聚合物电极共价结合酶分子：将0.02g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.01g N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于10ml浓度为0.0.5mol/L，pH值为5的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入修饰了羧基的聚合物碳纸电极，之后加入50mg葡萄糖脱氢酶，25℃下反应24个小时，反应完毕即得到负载了生物酶的敏感聚合物阳极。
实施实例3：
碳纸表面改性的步骤：
步骤一：碳纸的清洗：将亲水的碳纸在无水甲醇中超声45min，超纯水(电阻18.2MΩ)冲洗碳纸表面，室温晾干，备用；
步骤二：碳纸的改性：取一洁净的碳纸为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极构筑三电极体系，在浓度为0.01M，pH值为6的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌速率为400rpm，先采用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-0.5～3V，扫描速率为0.1V s-1，扫描圈数10圈，再在同一溶液中向工作电极施加-0.8V的恒电压100s，完毕后得到导电性与亲水性大大改善的碳纸电极，超纯水冲洗电极表面，室温晾干，备用。
碳纸表面电化学沉积的步骤：
步骤一：纳米金沉积液的制备：将氯金酸配成10mg/mL的溶液，取该溶液1000μL加入10ml的pH值为8，浓度为0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌均匀即得到纳米金沉积液，通入氮气至饱和，备用；
步骤二：碳纸表面均匀电镀金：利用已处理的导电碳纸为工作电极，在三电极体系下，采用恒电流法在所制备的纳米金沉积液中进行电镀，阴极电流密度为5mA cm-2，时间为1500s，扫描完毕后即得到有均匀金镀层的碳纸电极，用超纯水、无水乙醇分别冲洗电极表面，室温晾干，备用。
表面接枝响应聚合物的步骤：
步骤一：金镀层的修饰：将制备的金镀层碳纸电极立即浸泡于30mM的3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了羧基的电极；
步骤二：引发剂的修饰：取1ml的三乙胺溶于30ml无水二氯甲烷，放入表面修饰了羧基的电极，冰水浴条件下，逐滴加入1g溶解在10ml无水二氯甲烷中的2-溴丁酰氯，之后在30℃下反应24个小时，以无水二氯甲烷冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰SI-ATRP引发剂的电极；
步骤三：聚合物在电极表面的接枝：将1g N,N'-二甲基丙烯酰胺，20μL三(2-二甲氨基乙基)胺，15mg氯化亚铜溶解于10ml的异丙醇中，将表面修饰SI-ATRP引发剂的电极浸泡在该溶液中，在氮气保护下，30℃反应12个小时，反应完毕后得到敏感聚合物修饰的碳纸电极，将该电极浸泡在30℃以下的超纯水中，温和搅拌12个小时，除去聚合反应残留的铜盐，将该电极保存在超纯水备用。
酶在电极上的固定步骤：
步骤一：聚合物电极表面修饰：将制备的聚合物碳纸电极表面用大量无水乙醇冲洗，之后浸泡在30mM的3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了羧基的电极；
步骤二：聚合物电极共价结合酶分子：将0.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.5g N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于10ml浓度为0.1mol/L，pH值为7的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入表面修饰有羧基的聚合物碳纸电极，之后加入100mg葡萄糖氧化酶，25℃下反应24个小时，反应完毕即得到负载了生物酶的敏感聚合物阳极。
实施实例4：
碳纸表面改性的步骤：
步骤一：碳纸的清洗：将亲水的碳纸在无水甲醇中超声30min，超纯水(电阻18.2MΩ)冲洗碳纸表面，室温晾干，备用；
步骤二：碳纸的改性：取一洁净的碳纸为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极构筑三电极体系，在浓度为0.1M，pH值为7K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌速率为400rpm，先采用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-0.5～3V，扫描速率为0.2V s-1，扫描圈数10圈，再在同一溶液中向工作电极施加-1V的恒电压100s，完毕后得到导电性与亲水性大大改善的碳纸电极，超纯水冲洗电极表面，室温晾干，备用。
碳纸表面电化学沉积的步骤：
步骤一：纳米金沉积液的制备：将氯金酸配成10mg/mL的溶液，取该溶液1000μL加入10ml的pH值为8，浓度为0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌均匀即得到纳米金沉积液，通入氮气至饱和，备用；
步骤二：碳纸表面均匀电镀金：利用已处理的导电碳纸为工作电极，在三电极体系下，采用恒电流法在所制备的纳米金沉积液中进行电镀，阴极电流密度为5mA cm-2，时间为1000s，扫描完毕后即得到有均匀金镀层的碳纸电极，用超纯水、无水乙醇分别冲洗电极表面，室温晾干，备用。
1.一种温度刺激响应酶阳极的制备方法，其特征在于，表面接枝响应聚合物的步骤：
步骤一：金镀层的修饰：将所制备的金镀层碳纸电极立即浸泡于40mM的4-巯基苯甲酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了羧基的电极；
步骤二：引发剂的修饰：取2ml的三乙胺溶于30ml无水二氯甲烷，放入表面修饰了羧基的电极，冰水浴条件下，逐滴加入3.5g溶解在10ml无水二氯甲烷中的2-溴丁酰氯，之后在30℃下反应24个小时，以无水二氯甲烷冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰SI-ATRP引发剂的电极；
步骤三：聚合物在电极表面的接枝：将2g N,N'-二乙基丙烯酰胺，30μL三(2-二甲氨基乙基)胺，20mg氯化亚铜溶解于5ml的异丙醇中，将表面修饰SI-ATRP引发剂的电极浸泡在溶液中，在氮气保护下，30℃反应12个小时，反应完毕后得到敏感聚合物修饰的碳纸电极，将该电极浸泡在30℃以下的超纯水中，温和搅拌24个小时，除去聚合反应残留的铜盐，将该电极保存在超纯水备用。
酶在电极上的固定步骤：
步骤一：聚合物电极表面修饰：将所制备的聚合物电极表面用大量无水乙醇冲洗，之后浸泡在40mM的3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了羧基的电极；
步骤二：聚合物电极共价结合酶分子：将0.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.5g N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于10ml浓度为0.1mol/L，pH值为7的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入修饰有羧基的聚合物碳纸电极，之后加入200mg葡萄糖脱氢酶，25℃下反应48个小时，反应完毕即得到负载了生物酶的敏感聚合物阳极。

Claims (3)

1.一种负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1、清洗碳纸：将碳纸在无水甲醇中超声10～50min，超纯水冲洗碳纸表面，室温晾干；
步骤2、碳纸的改性：以碳纸为工作电极，铂柱电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极构筑三电极体系，在浓度为0.025～0.1M，pH值为6～8K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌速率为200～500rpm，先采用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-0.5～3V，扫描速率为0.01～0.5V s-1，扫描圈数2～20圈，再在同一溶液中向工作电极施加-0.8～-1.2V的恒电压50～200s，完毕后得到导电性与亲水性大大改善的碳纸电极，超纯水冲洗电极表面，室温晾干得到导电碳纸；
步骤3、碳纸表面均匀电镀金：以导电碳纸为工作电极，在三电极体系下，采用恒电流法在纳米金沉积液中进行电镀，阴极电流密度为2～10mA cm-2，时间为1000～2000s，扫描完毕后即得到有均匀金镀层的碳纸电极，用超纯水、无水乙醇分别冲洗电极表面，室温晾干；
所述纳米金沉积液是：将氯金酸配成5～15mg/mL的溶液，取该溶液500～1000μL加入5～20ml的pH值为8～12，浓度为0.05～0.2mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，搅拌均匀即得到纳米金沉积液，通入氮气至饱和；
步骤4、金镀层的修饰：将步骤3制备的电极浸泡于10～60mM的4-氨基苯硫酚、4-巯基苯甲酸或3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装12～24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了氨基或者羧基的电极；
步骤5、引发剂的修饰：以0.3～2ml的三乙胺溶于10～30ml无水二氯甲烷，然后将步骤4处理的电极置入溶液，在冰水浴条件下，滴加0.5～3.5g溶解在5～10ml无水二氯甲烷中的2-溴异丁酰溴、2-溴丙酰溴或2-溴丁酰氯，之后在20～30℃下反应12～24个小时，以无水二氯甲烷冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰SI-ATRP引发剂的电极；
步骤6、聚合物在电极表面的接枝：将0.5～2g N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-二乙基丙烯酰胺或者N,N'-二甲基丙烯酰胺，10～30μL三(2-二甲氨基乙基)胺，10～20mg氯化亚铜溶解于5～10ml的异丙醇水溶液中，将步骤5得到的电极浸泡在溶液中，在氮气保护下，25～35℃下反应6～12个小时，反应完毕后得到敏感聚合物修饰的碳纸电极，将该电极浸泡在30℃以下的超纯水中，温和搅拌6～24个小时，除去聚合反应残留的铜盐，将该电极保存在超纯水；
步骤7、聚合物电极表面修饰：将步骤6中得到的电极表面用大量无水乙醇冲洗，之后浸泡在10～40mM的4-氨基苯硫酚、4-巯基苯甲酸或3-巯基丙酸的无水乙醇溶液中，室温下自组装12～24个小时，以无水乙醇冲洗电极表面，室温晾干，得到表面修饰了氨基或者羧基的电极；
步骤8、聚合物电极共价结合酶分子：将0.02～0.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，0.01～0.5gN-羟基琥珀酰亚胺，溶解于5～15ml浓度为0.05～0.2mol/L，pH值为5～7的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入步骤7得到的电极，之后加入50～200mg葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶，20～25℃下反应24～48个小时，反应完毕即得到负载了生物酶的温度响应聚合物阳极。
2.根据权利要求1所述负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，其特征在于：所述步骤6的异丙醇以体积比为1:0.5～1:2的DMF取代。
3.根据权利要求1所述负载生物酶的温度刺激响应酶阳极的制备方法，其特征在于：所述超纯水电阻率为18.2MΩ·cm。
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