CN108125982A - 一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点的制备方法及其应用 - Google Patents

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潘统鹤
杨梅
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Abstract

本发明公开了靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点的制备方法及其应用,其技术方案(1)以芘为原料,制备三硝基嵌二萘,并将其冷冻干燥;利用氨水将三硝基嵌二萘水热反应制备氨基化石墨烯量子点;(2)利用碳化二亚胺/N‑羟基琥珀酰亚胺在常温条件下活化FITC‑RGDS多肽的羧基端,通过酰胺反应将FITC‑RGDS多肽与氨基化石墨烯量子点共价连接获得靶向肿瘤的石墨烯量子点,(3)再一次通过酰胺反应将TAT多肽与步骤(2)制备的石墨烯量子点表面剩余伯氨基共价连接,制备获得靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点。本发明的优点是:通过本发明工艺合成的靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点具有特异的靶向肿瘤和细胞核的功能,其对于肿瘤细胞具有明显的杀伤力效果,因此可应用于抗肿瘤药物的制备。

Description

一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种石墨烯量子点,具体是指一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点的制备方法及其应用。
背景技术
石墨烯量子点(Graphene quantum dots,简称GQDs),具有独特的量子效应、拥有丰富的边界缺陷,在各种溶剂中呈现出优异的分散性能。表面经过有机物钝化处理的石墨烯纳米颗粒,是一种有机无机杂化纳米材料,具有与传统量子点(QDs)媲美的荧光性能,同时因其本身不含任何有毒重金属元素,具备优异的环境友好性和生物相容性,且易于表面功能化修饰,一经发现便引起了人们广泛的研究兴趣。氨基化石墨烯量子点具有一种新型的氨基终止的石墨烯结构。
目前,国内外有关石墨烯量子点应用的研究报道,主要集中在细胞成像、靶向示踪、光电器件、多价金属离子及蛋白质检测。但是,关于在杀灭肿瘤细胞的药物上的应用目前尚未见报道。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点。
本发明的第三个目的是提供一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点在制备抗肿瘤药物的应用。
为实现本发明的第一个目的,其技术方案是包括以下步骤:
(1)以芘为原料,在高温条件下将芘与硝酸反应制备三硝基嵌二萘,并将其冷冻干燥;利用氨水将三硝基嵌二萘重悬,超声反应后,将反应后的混合物加入反应釜中,通过水热反应制备氨基化石墨烯量子点,将氨基化石墨烯量子点在透析袋中通过去离子水中透析并冷冻干燥,透析袋的截留分子量为≤3500;
(2)利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺在常温条件下活化FITC-RGDS多肽的羧基端,通过酰胺反应将FITC-RGDS多肽与步骤(1)制备的氨基化石墨烯量子点共价连接制备获得靶向肿瘤的石墨烯量子点,该步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点为RGDS多肽共价连接的石墨烯量子点;
(3)利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺在常温条件下活化TAT多肽的羧基端,使其与步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点的边缘剩余伯氨基共价结合,构建具有靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点,该靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点为RGDS多肽与TAT多肽共价连接石墨烯量子点。
进一步设置是步骤(1)高温条件为80-100℃。
进一步设置是步骤(1)的水热反应的条件为180-200℃,10-12小时。
进一步设置是所述的步骤(2)中FITC-RGDS多肽和氨基化石墨烯量子点的质量比为1:2-1:10,优选最佳质量比为1:5。
进一步设置是TAT多肽和步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点的最佳质量比为1:2-1:10。优选最佳质量比为1:5
本发明的第二个目的是提供一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点。
本发明的第三个目的是提供一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点在制备抗肿瘤药物的应用,该抗肿瘤药物包括有靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点。
本发明的优点是:通过本发明工艺合成的靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点具有靶向肿瘤和靶向细胞核的特异功能,其对于肿瘤细胞的具有明显的杀伤力效果,因此可应用于抗肿瘤药物的制备。具体数据见实施例。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1中,RGDS-NHGQDs以及RGDS/TAT-NHGQDs的实验分析图(图1a:HRTEM观察NH-GQDs;图1b:NH-GQDs的XPS光谱图;图1c:UV-Vis光谱表征TAT多肽、NH-GQDs、RGDS-NHGQDs以及RGDS/TAT-NHGQDs;图1d FTIR光谱表征NH-GQDs、RGDS-NHGQDs以及RGDS/TAT-NHGQD;
图2 激光共聚焦显微镜观察与RGDS/TAT-NHGQDs共培养的OCM-1、Hela以及ARPE-19细胞的胞内荧光图(图2中红色荧光为细胞骨架;蓝色荧光为RGDS/TAT-NHGQDs自发荧光;叠加图片为叠加了红色和蓝色荧光图片;标尺为20μm)
图3 激光共聚焦显微镜观察与NH-GQDs或RGDS/TAT-NHGQDs共培养的OCM-1以及Hela细胞的胞内荧光图(图3中红色荧光为细胞核;蓝色荧光为RGDS/TAT-NHGQDs自发荧光;叠加图片为叠加了红色和蓝色荧光图片;标尺为20μm);
图4 在NH-GQDs(图4a,4 b, 4c)或RGDS/TAT-NHGQDs(4d,4e, 4f)刺激下ARPE-19、OCM-1和Hela细胞的存活率图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本实施例中,采用NH-GQDs表示氨基化石墨烯量子点,采用RGDS-NHGQDs表示RGDS多肽共价连接的石墨烯量子点,采用RGDS/TAT-NHGQDs表示RGDS多肽与TAT多肽共价连接石墨烯量子点,EDCI/NHS表示碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例
(1)以芘为原料,在高温条件下 (80-100℃)将芘与硝酸反应制备三硝基嵌二萘,并将其冷冻干燥;利用氨水将三硝基嵌二萘重悬,超声反应2小时后,将混合物加入反应釜中,通过水热反应(180-200℃,10-12小时)制备氨基化石墨烯量子点(NH-GQDs)。将NH-GQDs在去离子水中透析3天(3500 Da)并冷冻干燥。
(2)利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)在常温条件下活化FITC-RGDS多肽的羧基端,通过酰胺反应将FITC-RGDS多肽与NH-GQDs共价连接制备肿瘤靶向石墨烯量子点RGDS-NHGQDs,发明中分别设定了不同的FITC-RGDS和NH-GQDs的质量比:1:2,1:5;1:10,其中靶向效果最佳质量比为1:5;
(3)进一步利用EDCI/NHS在常温条件下活化TAT多肽的羧基端,使其与RGDS-NHGQDs边缘剩余伯氨基共价结合,构建具有肿瘤细胞核靶向的石墨烯量子点RGDS/TAT-NHGQDs,发明中分别设定了不同的TAT和RGDS-NHGQDs的质量比:1:2,1:5;1:10,其中靶向效果最佳质量比为1:5。
试验例
将RGDS/TAT-NHGQDs(1:2、1:5和1:10)与肿瘤细胞或正常组织细胞培养不同时间,利用激光共聚焦显微镜观察RGDS/TAT-NHGQDs能够靶向侵染肿瘤细胞核;
利用CCK-8实验方法检测TAT-NHGQDs对细胞的杀伤力,与未修饰的NH-GQDs相比,RGDS/TAT-NHGQDs对肿瘤细胞的杀伤力增加了30-40倍;
利用高分辨透射电镜(HRTEM),X射线光电子能谱(XPS)表征NH-GQDs(图1a, b)。如图1a所示,本方法制备的NH-GQDs大小均一,直径在3-5 nm;高分辨XPS光谱的C1峰显示NH-GQDs具有C-N (285.0 eV), sp2C (284.5 eV), sp3C (285.5 eV), O-C=O (289.O eV) 和 π-π*(290.0 eV)等官能团(图1b);
利用紫外可见分光光谱(UV-Vis)和傅里叶红外光谱(FTIR)表征RGDS-NHGQDs以及RGDS/TAT-NHGQDs(图1c, d)。如图1c,RGDS-NHGQDs的UV-Vis光谱中在460-490nm区间具有明显的FITC紫外吸收峰,说明FITC-RGDS连接在NH-GQDs表面,与此同时在RGDS/TAT-NHGQDs的紫外吸收光谱中,我们同时观察到了FITC和TAT两个物质的紫外吸收峰,由此说明FITC-RGDS和TAT多肽均连接在NH-GQDs表面;在RGDS-NHGQDs和RGDS/TAT-NHGQDs的FTIR光谱中,在1642cm-1处出现了新的酰胺键吸收峰,此外两种产物在3158cm-1处的吸收峰明显下降,由此说明两种多肽均是通过酰胺键共价连接在NH-GQDs多肽表面。
将RGDS/TAT-NHGQDs分别与人子宫颈癌细胞(Hela)、人脉络膜黑色素瘤细胞(OCM-1)以及人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)共培养6h,利用激光共聚焦显微镜观察发现,RGDS/TAT-NHGQDs能够进入Hela和OCM-1细胞,但是在ARPE-19细胞中找不到材料的荧光,由此说明RGDS/TAT-NHGQDs对肿瘤细胞具有靶向作用(图2)。
将NH-GQDs或RGDS/TAT-NHGQDs分布于OCM-1和Hela细胞共培养,材料刺激细胞6h后,我们将培养液替换为新鲜的培养液并继续培养24h。通过激光共聚焦显微镜观察发现NH-GQDs基本全部分布于细胞质中(图3a),但是RGDS/TAT-NHGQDs大部分聚集在细胞核区域,由此说明RGDS/TAT-NHGQDs能够靶向肿瘤细胞核(图3b)。
利用CCK-8手段检测了NH-GQDs以及RGDS/TAT-NHGQDs对ARPE-19细胞、OCM-1和Hela细胞的杀伤力。细胞分别与10或100 μg/mL的NH-GQDs或RGDS/TAT-NHGQDs共培养,6h后将细胞培养液更换为新鲜的培养液继续培养6、18和24h(6-6、6-18、6-24)。如图4所示,NH-GQDs对两种细胞几乎没有杀伤力,细胞的存活率均接近100%(图4a, b, c);当细胞与RGDS/TAT-NHGQDs共培养时,ARPE-19的细胞生存率几乎没有受到影响(图4d),但是OCM-1和Hela细胞等生存率明显下降(图4e, f),在100 μg/mL的RGDS/TAT-NHGQDs刺激下OCM-1和Hela细胞的生存率均有30-40%的下降,比NH-GQDs对细胞的杀伤力增加了30-40倍。
因此,可将靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点用于制备抗肿瘤药物。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以芘为原料,在高温条件下将芘与硝酸反应制备三硝基嵌二萘,并将其冷冻干燥;利用氨水将三硝基嵌二萘重悬,超声反应后,将反应后的混合物加入反应釜中,通过水热反应制备氨基化石墨烯量子点,将氨基化石墨烯量子点在透析袋中通过去离子水中透析并冷冻干燥,透析袋的截留分子量为≤3500;
(2)利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺在常温条件下活化FITC-RGDS多肽的羧基端,通过酰胺反应将FITC-RGDS多肽与步骤(1)制备的氨基化石墨烯量子点共价连接制备获得靶向肿瘤的石墨烯量子点,该步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点为RGDS多肽共价连接的石墨烯量子点;
(3)利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺在常温条件下活化TAT多肽的羧基端,使其与步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点的边缘剩余伯氨基共价结合,构建具有靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点,该靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点为RGDS多肽与TAT多肽共价连接石墨烯量子点。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)高温条件为80-100℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)的水热反应的条件为180-200℃,10-12小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述的步骤(2)中FITC-RGDS多肽和氨基化石墨烯量子点的质量比为1:2-1:10。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述的步骤(2)中FITC-RGDS多肽和氨基化石墨烯量子点的最佳质量比为1:5。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:TAT多肽和步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点的最佳质量比为1:2-1:10。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:TAT多肽和步骤(2)制备的靶向肿瘤的石墨烯量子点的最佳质量比为1:5。
8.一种如权利要求1-7之一所述的制备方法所制备的靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点。
9.一种靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点在制备抗肿瘤药物的应用,其特征在于:该抗肿瘤药物包括有如权利要求8所述靶向肿瘤细胞核的石墨烯量子点。
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