CN108125933A - 大鼠肝硬化模型构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大鼠肝硬化模型的构建方法，包括以下步骤：a、获得大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；c、检测并动态分析所述大鼠生理指标，当所述大鼠生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，若所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。根据上述方法构建得到的大鼠肝硬化模型，解决了现有技术中肝硬化建模给药停止后肝硬化指标恢复的难题，降低了建模过程的死亡率，并将所构建的模型与基因表达分析结合，为肝硬化的防治与研究提供了便利。

Description

大鼠肝硬化模型构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，并将其应用于基因表达分析领域。
背景技术
肝脏是动物体内以代谢功能为主的重要生命器官，调控着多种生理功能，主要包括解毒，储存肝糖原，合成分泌性蛋白质以及生成胆汁等。肝脏本身具有强大的再生能力，正常肝脏经三分之二部分肝切除后，残留的成熟肝细胞可快速增殖，并完全取代和恢复缺失肝脏的体积和功能。但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝硬化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能不断下降，最终危害人们的健康和生命。
中国是乙型病毒性肝炎的“重灾区”，目前全国乙型肝炎病毒感染人群占人口总数的10％以上，乙肝病毒携带者高达1.2亿，每年还有近百万的新发病例，这些病例中将有20％发展为肝纤维化/肝硬化，肝硬化是临床上常见的慢性进行性肝病。
肝硬化是肝脏对各种肝损伤所产生的的弥漫性纤维化和结节再生，是各种慢性肝病的终末期病理阶段。肝硬化在病理上分为代偿期和失代偿期。代偿期在临床上没有特异性症状或是体征，肝功能正常或轻度异常，而失代偿期则有明显的的临床特征及病理变化，肝功能严重受损。目前临床上针对肝硬化没有特别有效的治疗方法，对于失代偿期肝硬化的唯一有效治疗手段就是肝脏移植，但是由于肝脏供体持续紧缺，导致肝硬化患者等不到合适的肝源而死亡的事件屡见不鲜。因此建立类似人类失代偿期肝硬化模型，模拟其发病过程及病理改变，是研究失代偿期肝硬化最迫切的需要。
现阶段肝硬化模型建立主要依赖于CCL4来构建。将40％～60％的CCL4橄榄油溶液，根据大鼠体重，按0.13m l/100g给大鼠皮下注射，首剂加倍，每周2次，8～12周形成肝纤维化[1]。DMNA是一种具有肝毒性、细胞毒性和免疫毒性的化学物质，Kitarnura等曾对大鼠进行DMNA诱导实验，按照10mg/kg体重剂量，给予1％DMNA生理盐水稀释液腹腔注射，每周2次，4～8周，肝小叶可出现炎性细胞浸润和出血性坏死病变，且在肝内形成“中心-中心纤维间隔”或“中心-门静脉纤维间隔”[2]。但这些方法构建的肝硬化模型在停止给药后会有一定的好转反应，不利于将其用于肝硬化的临床诊断及治疗，且在建模过程中死亡率较高，而现阶段对肝硬化建模评价指标也没有标准。
参考文献：
[1]徐安书、文正荣.肝硬化实验动物模型的研究现状[J].医学综述，2010,16(7):1046-1048
[2]张贵阳.肝硬化动物模型构建的研究进展[J].综述，2008,13(3):266-269
发明内容
本发明的目的在于提供一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，克服利用现有技术中的建模方法构建的肝硬化模型在停止给药后会有一定的好转反应，建模过程死亡率较高的缺陷。
本发明提供了一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，包括以下步骤：
a、获取大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；
b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；
c、检测并动态分析所述大鼠生理指标样本的大鼠生理指标，当所述大鼠的生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；
d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。
本发明公开了一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，所述方法包括对大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4，使大鼠肝细胞及肝脏微环境失衡，短期内造成大鼠肝细胞及肝脏微环境的不可逆损伤，采用该方法建模，给药停止后肝硬化指标不会恢复，该方法稳定、可靠、重复性强，降低了肝硬化建模过程中大鼠的死亡率，实现了模拟人类失代偿期肝硬化发病过程及病理指标改变。
进一步地，步骤a具体包括：)获取大鼠，并称所述大鼠体重；2)根据所述大鼠体重，按65～75mg/kg的质量浓度计算二甲基亚硝胺用量，溶解二甲基亚硝胺，使其注射浓度为30～40mg/ml，对所述大鼠注射所述二甲基亚硝胺溶液，饲养所述大鼠三天；3)对所述大鼠注射按0.1～0.3ml/kg计算的10％～30％CCL4的橄榄油溶液，饲养所述大鼠三天；4)重复步骤2)至步骤3)共重复7～8次。
通过对二甲基亚硝胺和CCL4剂量的严格控制，进一步降低建模过程中大鼠的死亡率，提高成模率。
进一步地，步骤b具体地，采集所述大鼠生理指标样本的周期为2周。
进一步地，所述大鼠生理指标样本包括大鼠血液样本和大鼠肝组织样本。
进一步地，所述大鼠肝组织样本为新鲜肝组织样本和经包埋、切片、保存的大鼠肝组织固定样本。
进一步地，所述步骤c中检测所述大鼠生理指标样本具体指，对大鼠肝组织固定样本进行染色。
进一步地，所述步骤c中检测所述大鼠生理指标的大鼠血液样本指标包括：谷草转氨酶含量、谷丙转氨酶含量、总血胆红素、血氨浓度、血浆凝血酶原时间和国际标准化比率。
进一步地，所述步骤c中显示达到给药停止时间的所述大鼠生理指标，具体包括：a、所述大鼠的谷草转氨酶>175u/l；且b、所述大鼠的谷丙转氨酶＞42u/l；且c、所述大鼠的总血胆红素＞0.45mg/d l；且d、所述大鼠的血氨浓度＞90mmo l/l；且e、所述大鼠的血浆凝血酶原时间＞20s；且f、所述大鼠的国际标准化比率＞1.7。
进一步地，所述步骤c中显示达到给药停止时间的所述大鼠生理指标，包括：a、所述大鼠活动反应能力下降，眼睛及皮肤泛黄，体重下降10％以上；且b、所述大鼠的腹部膨隆，腹水持续存在；且c、所述大鼠的新鲜肝组织样品肿大、质硬，表面凹凸不平，呈大小颗粒状，肝叶之间有粘连，门静脉突出；且d所述大鼠的肝组织固定样品经染色可判断为肝硬化。
进一步地，本发明对所述的大鼠的生理指标制定了一套判断不可逆肝硬化建模成功的标准，路线合理，易操作。
进一步地，本发明还提供了一种采用所述方法构建的大鼠肝硬化模型在基因表达分析或蛋白质表达分析领域的应用。
进一步地，所述基因表达分析包括向所述大鼠肝硬化模型中导入携带目的基因HNF4α的重组载体AAV-HNF4α-GFP，使所述目的基因HNF4α在所述大鼠体内表达后检测所述大鼠的生理指标。
附图说明
图1为实施例一中正常对照组与大鼠不可逆肝硬化模型组在第11周的离体肝脏外观对比图；
图2为实施例一中正常对照组与大鼠不可逆肝硬化模型组在第11周时的肝组织病理学对比图；
图3为实施例一中现有技术大鼠肝硬化模型与大鼠不可逆肝硬化模型在第11周的离体肝脏外观对比图；
图4为实施例一中现有技术大鼠肝硬化模型与大鼠不可逆肝硬化模型在第11周时的肝组织病理学对比图；
图5为实施例二中正常对照组、模型实验组和模型对照组在第2周和第4周的肝组织病理变化图；
图6为实施例二中正常对照组、模型实验组、模型对照组的肝细胞相对表达HNF4α量对比图；
图7为实施例二中正常对照组、模型实验组、模型对照组的肝细胞分泌ALB量的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
其中，本发明所述大鼠为上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，产品编号为F344；
二甲基亚硝胺产品编号为WET022、CCL4产品编号为488488、橄榄油产品编号为1478254、水合氯醛产品编号为47335-U、甲醛产品编号为F8775、乙醚产品编号为613479，均为美国S i gma-A l dr i ch公司生产；
谷草转氨酶试剂盒产品编号为BA02300、谷丙转氨酶试剂盒产品编号为BA01300、TBL试剂盒产品编号为BC38300、白蛋白试剂盒产品编号为BE07300皆为威特曼生物科技(南京)有限公司生产；
血氨试剂盒为长春江力集团公司生产，产品编号为K056；
含钙凝血活酶为中国生物技术集团公司生产，产品编号为S10870005；
天狼星红染色试剂盒为YEASEN公司生产，产品编号为36324ES60；
AAV-HNF4α-GFP重组载体为和元生物科技有限公司构建；
QPCR是利用罗氏公司提供的系统，高通量实时荧光定量PCR系统实施的；
全自动生化分析仪为迈瑞生物医疗电子股份有限公司制造，仪器编号BS-200。
本发明实施例提供了一种大鼠肝硬化模型的构建方法，该方法包括以下步骤：
a、获取大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；
b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；
c、检测并动态分析所述大鼠生理指标样本，当获得的大鼠生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；
d、比较停止注射二甲基亚硝胺和CCL44～5周后和停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标，若停止注射二甲基亚硝胺和CCL44～5周后所述大鼠生理指标与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标相比，显示所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。
所述方法包括对大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4，使大鼠肝细胞及肝脏微环境失衡，短期内造成大鼠肝细胞及肝脏微环境的不可逆损伤。并且通过对二甲基亚硝胺和CCL4剂量的严格控制，降低了建模过程中大鼠的死亡率，提高了成模率，说明该方法是一种稳定、可靠、重复性强的大鼠不可逆肝硬化建模方法。
实施例1：
本实施例提供了一种大鼠肝硬化模型的构建方法，具体包括以下过程：
一、构建大鼠不可逆肝硬化模型
采用雄性6～8周龄F344品种大鼠，共20只，在洁净环境中饲养，予以相同饲养条件，随机分为A组和B组两组大鼠进行试验，每组10只，A组为正常对照组，B组为大鼠不可逆肝硬化模型组。B组大鼠予以二甲基亚硝胺和CCL4给药方案，根据大鼠体重，按70mg/kg的质量浓度计算二甲基亚硝胺用量，以等渗生理盐水溶解，得到注射浓度为35mg/ml二甲基亚硝胺注射液，经腹腔注射，三天后腹腔注射按0.2ml/kg计算的20％CCL4橄榄油溶液；每隔三天交替注射二甲基亚硝胺和CCL4溶液，如此反复共14次，造模至第7周时停止给药，之后按正常条件饲养4周，造模11周的时间即得到大鼠不可逆肝硬化模型。A组大鼠予以等渗生理盐水溶液及橄榄油，以相同的注射计量方法及时间节点经腹腔给药。
在本发明的其他优选实施例中，所述根据大鼠体重，按65mg/kg或75mg/kg计算二甲基亚硝胺用量，以等渗生理盐水溶解，得到注射浓度为30～40mg/ml二甲基亚硝胺注射液。
在本发明的其他优选实施例中，所述根据大鼠体重，按65～75mg/kg计算二甲基亚硝胺用量，以等渗生理盐水溶解，得到注射浓度为30mg/ml或40mg/ml二甲基亚硝胺注射液。
在本发明的其他优选实施例中，所述得到的二甲基亚硝胺注射液经皮下注射或静脉注射。
在本发明的其他优选实施例中，所述根据大鼠体重，三天后腹腔注射按0.1ml/kg或0.3ml/kg计算的10～30％CCL4橄榄油溶液。
在本发明的其他优选实施例中，所述根据大鼠体重，三天后腹腔注射按0.1～0.3ml/kg计算的10％或30％CCL4橄榄油溶液。
在本发明的其他优选实施例中，所述根据大鼠体重，三天后腹腔注射按0.2ml/kg计算的20％CCL4茶油或植物油溶液。
二、建模评价的方法与结果
(一)、评价指标
1、大鼠生物行为学及肝脏外观改变
在造模过程中观察并记录两组大鼠的活动反应能力，眼睛及皮肤的颜色改变，腹部膨胀情况，体重的变化。造模11周，两组大鼠禁食12小时，在10％水合氯醛腹腔麻醉的条件下，在体剖腹探查及离体观察两组大鼠肝脏，观其大小、色泽、硬度、表面质感及门静脉有无扩张。
2、大鼠肝组织病理学观察
麻醉条件下完整取切肝脏，切成1.0cmx1.0cmx0.5cm的组织块，放在4％中性甲醛固定液固定，石蜡包埋，4微米连续切片，制备得到肝组织学切片，用于苦味酸天狼星红染色。
在本发明的其他优选实施例中，制备得到的肝组织学切片，用于苏木精-伊红染色。
3、大鼠肝血清学谷草转氨酶、谷丙转氨酶指标改变
自大鼠造模开始，每只大鼠在乙醚溶液麻醉条件下每隔1周以眼眦取血的方式采血1.5ml，3000r/mi n离心10mi n后取上层血清负八十度保存。用谷草转氨酶、谷丙转氨酶检测试剂盒及全自动生化仪进行检测。
4、大鼠血液样品其他指标的检测
总血胆红素、血氨浓度、血浆凝血酶原均采用专业生化试剂盒进行检测，具体按说明书操作。
5、统计学分析
利用SPSS10.0统计软件进行独立样本t检验分析，所有数据均以M+-SD表示。
(二)建模结果
1、大鼠生物行为学及肝脏外观观察
在造模过程中，所有大鼠皆存活，成模率100％。造模至第11周时，所述B组与所述A组相比，所述B组大鼠的活动次数明显下降，只有在获得较强外界刺激时才有反应，眼睛、爪子及毛色泛黄，呈弓背状，体重较所述A组下降15％左右，如表1所示,所述A1对应A组大鼠建模11周后的体重，所述B1对应B组大鼠建模11周后的体重；在体剖腹探查大鼠肝脏，结果发现B组腹腔积水明显，肝脏外观失去正常的光洁及润泽，肝脏肿胀，质感坚硬，表面凹凸不平呈大小颗粒结节样变，A组肝脏正常，如附图1中A1、B1所示，其中，A1是A组大鼠建模11周后的大鼠肝脏离体外观，B1是B组大鼠建模11周后的离体肝脏外观。
表1
2.大鼠肝组织病理学观察
经苦味酸天狼星红染色后的肝组织切片的结果如附图2中A2、B2所示。其中A2是A组大鼠建模11周后，经苦味酸天狼星红染色后的肝组织切片结果；B2是B组大鼠建模11周后，经苦味酸天狼星红染色后的肝组织切片结果，观察发现，A组大鼠为正常肝小叶结构，无纤维间隔形成，肝细胞有序无坏死，天狼星红染色基本呈阴性。B组大鼠肝实质内出现大量纤维间隔，增生的纤维间隔向肝实质内延伸，包绕并分割肝小叶，相互交错的纤维间隔形成完全或是不完全的假肝小叶，部分假小叶由几个不完整的肝小叶构成，内含二、三个中央静脉或一个偏在边缘部的中央静脉，甚至没有中央静脉；有的假小叶则由再生肝细胞结节构成，肝细胞的排列和血窦的分布极不规则,肝细胞排列紊乱并呈明显的气球样变，可见点灶状及碎片样肝细胞坏死，汇管区因结缔组织增生而显著增宽，胆汁郁积明显，天狼星红染色可见肝实质内大量胶原纤维着色反应。
3、大鼠肝血清学谷草转氨酶、谷丙转氨酶检测结果
观察用谷草转氨酶、谷丙转氨酶检测试剂盒检测的所述大鼠的肝血清学谷草转氨酶、谷丙转氨酶指标发现，所述B组相较于所述A组皆有明显的差异，在B组中，体重下降明显,代表肝损伤的指标谷草转氨酶、谷丙转氨酶上升十分明显，如表2中A2、B2所示，其中，所述A2对应A组大鼠建模11周后的肝血清学检测结果，所述B2对应B组大鼠建模11周后的肝血清学检测结果。
表2
4、大鼠血液样品其他指标检测结果
观察经专业生化试剂盒进行检测的所述大鼠血液样品的其他指标发现，所述B组相较于所述A组皆有明显差异，在所述B组中，体重下降明显代表肝功能指标总血胆红素、血氨浓度、血浆凝血酶原时间及国际标准化比率同样较对照组明显上升，如表2中A2、B2所示，其中，所述A2对应A组大鼠建模11周后的肝血清学检测结果，所述B2对应B组大鼠建模11周后的肝血清学检测结果。对比例1：
在相同时间内，现有技术大鼠肝硬化模型与大鼠不可逆肝硬化模型的比较
现有技术肝硬化模型构建方法中以CCL4诱导肝硬化模型最为经典，现在相同时间内，将现有技术大鼠肝硬化构建的模型与大鼠不可逆肝硬化模型进行比较，具体方法如下：
采用雄性6～8周龄F344品种大鼠，共20只，在洁净环境中饲养，予以相同饲养条件，随机分为B、D两组进行试验，每组10只，D组为现有技术大鼠肝硬化模型组：根据大鼠体重，按2ml/kg计算40％CCL4的橄榄油溶液的用量后予以腹腔注射，每周2次，造模至第7周时停止给药，之后按正常条件饲养4周，造模时间11周后得到大鼠肝硬化模型，B组为大鼠不可逆肝硬化模型，造模方法参照实施例1。D、B两组分别在第8周停止给药前和第11周造模成功时，采集血液样品及肝组织样品进行检测。
分析两组造模的结果：经过4周停止给药的缓冲期后，在现有技术肝硬化构建的模型中，肝脏外观硬化迹象明显减弱，大鼠不可逆肝硬化模型中，肝脏外观硬化迹象没有明显变化，如附图3中D3、B3及附图4中D4、B4所示，其中，D3是现有技术大鼠肝硬化模型在第11周的离体肝脏外观图，B3是大鼠不可逆肝硬化模型在第11周的离体肝脏外观图，D4是现有技术大鼠肝硬化模型在第11周时的肝组织病理学对图，B4是大鼠不可逆肝硬化模型在第11周时的肝组织病理学对图，各项代表肝功能的指标明显较停药前上升，肝组织形态也较之前回复正常，明显有可逆的迹象，而在大鼠不可逆模型中反弹不明显，如表3中D8、D11、B8、B11所示，二者造模后的指标对比也十分明显。D8代表现有技术大鼠肝硬化模型组在第8周时的代表肝功能的各项指标，D11代表现有技术大鼠肝硬化模型组在第11周时的代表肝功能的各项指标，B8代表大鼠不可逆肝硬化模型组在第8周时的代表肝功能的各项指标，B11代表大鼠不可逆肝硬化模型组在第11周时的代表肝功能的各项指标，而在建模过程中，D组大鼠死亡了3只，成模率70％，B组没有大鼠死亡，成模率100％。
表3
实施例2：
本实施例提供了一种使用本发明所述大鼠不可逆肝硬化模型构建方法构建的大鼠不可逆肝硬化模型在基因表达分析中的应用，具体地，以AAV-HNF4α基因在大鼠肝硬化模型中的基因表达分析为例进行说明，所述基因表达分析过程包括：
1、获得HNF4αcDNA片段；
2、构建表达HNF4α的腺病毒质粒、包装以及扩增表达HNF4α的腺病毒；
3、采用雄性6～8周龄F344品种大鼠，共30只，在洁净环境中饲养，予以相同饲养条件，随机分为A组、B组、C组三组进行试验，每组10只，A组为生理盐水注射组，以下简称正常对照组，B组和C组为大鼠不可逆肝硬化模型组，其中B组为注射AAV-HNF4α-GFP基因表达分析组，以下简称模型实验组，C组为注射AAV-GFP病毒载体组，以下简称模型对照组。B组、C组造模后，分别以经尾静脉注射7.5x1011pfuAAV-HNF4α-GFP及7.5x1011pfuAAV-GFP。2周及4周时各组分别处死5只大鼠，留取大鼠血清标本，同时取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片，剩余组织液氮冻存，留做蛋白提取等用途。
4、分别检测各组大鼠血清肝功能指标
观察经专业生化试剂盒检测的所述大鼠血清肝功能指标发现，模型实验组大鼠肝功能指标较模型对照组和正常对照组明显改善，结果如表4所示。
表4
5、肝组织石蜡切片进行苦味酸天狼星染色测定肝硬化程度
经苦味酸天狼星红染色的肝组织石蜡切片结果如附图5所示。附图5中，A5表示正常对照组在第二周时的肝组织的天狼星红染色图；B5代表模型实验组在第二周时的肝组织的天狼星红染色图；C5代表模型对照组在第二周时的肝组织的天狼星红染色图；A6代表正常对照组在第四周时的肝组织的天狼星红染色图；B6代表模型实验组在第四周时的肝组织的天狼星红染色图；C6代表模型对照组在第四周时的肝组织的天狼星红染色图。结果显示，模型实验组大鼠肝硬化程度明显较模型对照组和正常对照组肝硬化程度减轻。
6、QPCR及全自动生化仪测定肝细胞表达HNF4α及ALB情况
经QPCR及全自动生化仪测定的肝细胞表达HNF4α及ALB的量的结果如附图6、附图7所示。
附图6中，m代表肝细胞HNF4α的相对表达量，n代表实验组别，A代表正常对照组，B代表模型实验组，C代表模型对照组。柱形图中A、B、C上端凸起代表误差线。
附图7中，x代表肝细胞ALB的分泌量，y代表实验组别，A代表正常对照组，B代表模型实验组，C代表模型对照组。柱形图中A、B、C上端凸起代表误差线。
结果显示，模型实验组的肝细胞HNF4α的表达水平及ALB的分泌水平高于模型对照组和正常对照组的肝细胞HNF4α的表达水平及ALB的分泌水平，
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
上面对本发明的各种实施方式的描述以描述的目的提供给本领域技术人员。其不旨在是穷举的、或者不旨在将本发明限制于单个公开的实施方式。如上所述，本发明的各种替代和变化对于上述技术所属领域技术人员而言将是显而易见的。因此，虽然已经具体讨论了一些另选的实施方式，但是其它实施方式将是显而易见的，或者本领域技术人员相对容易得出。本发明旨在包括在此已经讨论过的本发明的所有替代、修改、和变化，以及落在上述申请的精神和范围内的其它实施方式。
虽然通过实施方式描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。

Claims (11)

1.一种大鼠肝硬化模型构建方法，依次包括如下步骤：
a、获取大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；
b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；
c、检测并动态分析所述大鼠生理指标样本的大鼠生理指标，当所述大鼠的生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；
d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，若所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。
2.如权利要求1所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤a具体包括：1)获取大鼠，并称所述大鼠体重；2)根据所述大鼠体重，按65～75mg/kg的质量浓度计算二甲基亚硝胺用量，溶解二甲基亚硝胺，得到注射浓度为30～40mg/ml的二甲基亚硝胺溶液，对所述大鼠注射所述二甲基亚硝胺溶液，饲养所述大鼠三天；3)对所述大鼠注射按0.1～0.3ml/kg计算的10％～30％CCL4的橄榄油溶液，饲养所述大鼠三天；4)重复步骤2)至步骤3)7～8次。
3.如权利要求1所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤b中，采集所述大鼠生理指标样本的周期为2周。
4.如权利要求1或3所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤b中所述大鼠生理指标样本，包括大鼠血液样本和大鼠肝组织样本。
5.如权利要求4所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，所述大鼠肝组织样本，为大鼠新鲜肝组织样本和经包埋、切片及保存后的大鼠肝组织固定样本。
6.如权利要求4所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，对所述大鼠血液样本进行检测的大鼠生理指标包括：谷草转氨酶含量、谷丙转氨酶含量、总血胆红素含量、血氨浓度、血浆凝血酶原时间和国际标准化比率。
7.如权利要求1所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤c中检测所述大鼠生理指标样本具体指，对大鼠肝组织固定样本进行染色。
8.如权利要求1所述大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，显示达到给药停止时间的所述大鼠生理指标为：a、所述大鼠的谷草转氨酶>175u/l；且b、所述大鼠的谷丙转氨酶＞42u/l；且c、所述大鼠的总血胆红素＞0.45mg/dl；且d、所述大鼠的血氨浓度＞90mmol/l；且e、所述大鼠的血浆凝血酶原时间＞20s；且f、所述大鼠的国际标准化比率＞1.7。
9.如权利要求1所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，显示达到给药停止时间的所述大鼠生理指标包括：a、所述大鼠活动反应能力下降，眼睛及皮肤泛黄，体重下降10％以上；且b、所述大鼠的腹部膨隆，腹水持续存在；且c、所述大鼠的新鲜肝组织肿大、质硬，表面凹凸不平，呈大小颗粒状，肝叶之间有粘连，门静脉突出；且d、所述大鼠的肝组织固定样品经染色判断为肝硬化。
10.如权利要求1～9任一项所述方法构建的大鼠肝硬化模型在基因表达分析或蛋白质表达分析领域的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述基因表达分析包括向所述大鼠肝硬化模型中导入携带目的基因HNF4α的重组载体AAV-HNF4α-GFP，使所述目的基因HNF4α在所述大鼠体内表达后检测所述大鼠的生理指标。
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RU2817175C1 (ru) * 2023-11-11 2024-04-11 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ моделирования цирроза печени в эксперименте

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