CN108112235A - 改变类固醇代谢以用于治疗类固醇依赖性疾病 - Google Patents

Abstract

描述了一种治疗患者中诸如前列腺癌的类固醇依赖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的CYP17A抑制剂和有效量的5‑α‑还原酶抑制剂。

Description

改变类固醇代谢以用于治疗类固醇依赖性疾病

政府资助

本发明在包括美国国家癌症研究所的资助号为R01CA168899、R01CA172382和R01CA190289和美国陆军医学研究和装备司令部的资助号为PC121382的政府支助下完成。政府对本发明享有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年3月6日提交的序列号为62/129,215的美国临时专利申请和2015年8月20日提交的序列号为62/207,594的美国临时专利申请的优先权，二者均以引用的方式并入本文。

背景技术

转移性前列腺癌通常最初对医学或外科去势发生反应，继而最终产生抗性如去势抵抗前列腺癌(CRPC)，其由肿瘤的代谢能力驱动而重新组成强大的雄性激素，主要来自脱氢表雄酮(DHEA)/DHEA硫酸盐，从而刺激雄激素受体(AR)。(Chang等人，Cell，154，1074-1084(2013))。

阿比特龙(Abiraterone，简写为Abi，采用阿比特龙醋酸酯口服给药)，是一种类固醇药物，即使在用多西紫杉醇化疗治疗后，也可抑制17α-羟化酶/17，20-裂解酶(CYP17A1)、阻断雄激素合成并延长生存期(deBono等人，The New England journal of medicine，364，1995-2005(2011))。然而，患者也产生对阿比特龙治疗的耐药性。因此，我们仍亟待需要治疗类固醇依赖性疾病诸如去势抵抗前列腺癌的方法。

发明内容

类固醇依赖性疾病，如前列腺癌和乳腺癌，需要将前体类固醇转化为活性类固醇。前列腺癌最初对性腺睾酮去除的治疗作出反应，但最终成为去势抵抗前列腺癌(CRPC)，其由肿瘤驱动将前体类固醇(例如脱氢表雄酮(DHEA)和脱氢表雄酮硫酸酯)转化为睾酮和/或二氢睾酮(DHT)。阿比特龙是一种类固醇CYP17A抑制剂，主要通过抑制雄激素合成所需的CYP17A酶阻断这一过程。本发明人已经证明，在患者者中阿比特龙被转化为一种尚未被描述过的代谢物Δ⁴-阿比特龙(D4A)，且D4A是通过阻断雄激素途径的多个步骤而起作用的更有效的药物。因此，对阿比特龙的临床反应可能在某种程度上取决于向D4A的转化。然而，D4A可以在患者体内进一步代谢，并被类固醇5-α-还原酶转化为5α-阿比特龙。与Δ⁴-阿比特龙(D4A)的有效抗肿瘤作用相反，5α-阿比特龙似乎反而刺激雄激素受体，预期其会促进肿瘤生长。然而，药理学上5-α-还原酶抑制剂可阻断D4A转化为5α-阿比特龙。

本发明人已经发现并开发了一种在有需要的患者者中治疗类固醇依赖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的CYP17A抑制剂(如阿比特龙)和有效量的5-α-还原酶抑制剂。在一些实施方式中，该类固醇依赖性疾病是类固醇依赖性癌症，例如前列腺癌或去势抵抗前列腺癌。在一些实施方式中，该方法还包括通过使用从确定来自患者的生物样本中的一种或多种CYP17A抑制剂代谢物的水平获得的信息来修改治疗的步骤。

附图说明

参考以下附图可以更容易地理解本发明，其中：

图la-图le提供了显示了从Abi向D4A的转化的结构后果的化学结构和图，该转化在小鼠和患者中均发生，并且需要3β-羟基类固醇脱氢酶(3βHSD)。a.Abi转换为用于用于生成3βHSD的底物和产物的D4A.*双键和C3位原理图。b.Abi在体内转化为D4A。在5只小鼠腹膜内注射阿比特龙醋酸酯。注射后2小时和4小时收集血液。阿比特龙和D4A的血清浓度通过质谱法进行定量，并以阿比特龙+D4A的总和的百分比表示。c.D4A在所有用阿比特龙醋酸酯治疗过的CRPC患者(n＝12)中均可检测到。d.典型质谱示踪经阿比特龙醋酸酯治疗的患者的血清中的D4A和阿比特龙。e.3βHSD1能够将阿比特龙转化为D4A。用10μM阿比特龙(或[³H]-DHEA)处理过表达3βHSD1的LAPC4细胞24小时。通过HPLC分离D4A(作为阿比特龙+D4A的百分比)、[³H]-DHEA和[³H]-DHEA代谢物(标记的代谢物)。结果以多个生物学重复的平均值(n＝3)±标准差(s.d.)表示。实验至少独立重复3次。

图2a-图2e提供了显示D4A抑制雄激素途径中的3βHSD、CYP17A和5α-还原酶酶活性的反应方案和图表。A.CRPC中肾上腺前体到二氢睾酮(DHT)和雄激素受体(AR)刺激的类固醇生成途径的示意图。B.D4A抑制LNCaP中的3βHSD1活性。用包含0.1、1或10μM的D4A和阿比特龙的[³H]-DHEA处理细胞持续9和24小时。通过HPLC定量测定脱氢表雄酮(DHEA)和Δ4-雄烯二酮(AD)。箭头表示0.1μM D4A和1μM Abi治疗组的AD百分比。C.孕烯醇酮代谢和D4A抑制人3βHSD1和3βHSD2活性的Lineweaver-Burk图。D4A显示对3βHSD1的混合的竞争性-非竞争性抑制和对3βHSD2活性的非竞争性抑制。D.D4A的CYP17A1抑制与阿比特龙相当。用0.1、1或10nM D4A或阿比特龙与[³H]-孕烯醇酮一起处理稳定表达CYP17A1的293个细胞持续3和6小时。通过HPLC分离和定量孕烯醇酮和DHEA。E.是D4A但不是阿比特龙或恩杂鲁胺抑制5α-还原酶活性。用[3H]-AD处理LAPC4细胞和指定药物浓度。通过HPLC定量测定类固醇。箭头表示10μM D4A和100μM Abi处理组的5α还原雄激素的百分数。所有实验均设计了生物学重复(n＝3)，独立重复三次。所有结果显示为平均值±标准差(s.d.)。

图3A-图3G提供的图表显示：D4A与AR结合，并抑制AR染色质占有率、AR-应答基因表达和细胞生长。A和B，D4A有效地结合突变的和野生型AR。D4A、阿比特龙和恩杂鲁胺(Enz)(0.001-10μM)用于与0.1nM[³H]-R1881竞争突变的AR(LNCaP)或野生型AR(LAPC4)。将细胞内放射性标准化为蛋白质浓度。C，D4A对Enz的剂量依赖性抑制AR染色质占有率。用指示浓度的DHT、D4A和Enz处理LNCaP细胞3小时。用ChIP检测PSA、TMPRSS2和FKBP5的AR染色质占有率。将将ARChIP标准化为用于每个基因的未处理对照。D，D4A抑制PSA、FKBP5和TMPRSS2表达。用含有或不含阿比特龙或D4A(1μM)的DHT(0.5nM)、DHEA(40nM)或R1881(0.1nM)处理LNCaP细胞24小时。通过qPCR检测基因表达，并归一化为RPLPO。E和F，D4A对DHT诱导的PSA表达的抑制可与LNCaP和LAPC4中的Enz相当。G，D4A抑制LNCaP中DHT(0.5nM)诱导的细胞生长。通过在处理2、4和6天后测定DNA含量，在指定的时间点定量细胞。将A、B和G中的实验进行了生物学重复；将C到F进行了技术性重复。所有实验独立重复三次。所有结果用平均值(对于面板g，n＝5；对于所有其他实验，n＝3)±标准差(s.d.)表示。

图4A-图4E提供了显示D4A抑制异种移植物类固醇生成的图。A和B，D4A抑制LNCaP和VCaP异种移植物中的类固醇产生。异种移植物于NSG小鼠皮下生长。将达到约1000mm³的异种移植物切碎，并用[³H]-DHEA加上阿比特龙或D4A(0.1、1和1μΜ)处理。通过HPLC分离和定量DHEA和AD。将实验进行了生物学重复(n＝3个异种移植组织)，用平均值±标准差(s.d.)表示结果。箭头表示0.1μM D4A和1μM阿比特龙治疗组的AD百分数。C，D4A比阿比特龙更有效阻断VCaP异种移植物进展。显示了采用介质组(Ctrl；n＝9只小鼠)、阿比特龙醋酸酯治疗组(AA；n＝10)和D4A治疗组(n＝10)的异种移植进展的时间(肿瘤体积增加>20％)。所有3个治疗组彼此间有显著差异：Ctrl与AA比较，P＝0.02；Ctrl与D4A比较，P<0.001；AA与D4A比较，P＝0.01。D，D4A(n＝10)用于阻断C4-2异种移植进展比AA(n＝10)和Enz(n＝11)更有效：Ctrl与D4A比较，P<0.001；AA与D4A比较，P＝0.01；Enz与D4A比较，P＝0.02。E，D4A活性和雄激素途径中的IC50和与阿比特龙和Enz的比较的示意图。

图5A-图5C提供了显示了用阿比特龙醋酸酯治疗的患者中5α-和5β-还原的阿比特龙代谢产物产生的化学方案和图表。(A)类固醇生成酶催化阿比特龙代谢。上文中，在雄激素代谢途径中，3βHSD将脱氢表雄酮(DHEA)转化为△⁴-雄烯二酮(AD)，AD可在5α-位还原为5α-雄甾烷二酮(5α二酮)，其依次在3-酮位被还原成雄酮。下文中，阿比特龙到D4A的结构类似转换能够在碳5位(箭头)实现D4A的5α-和5β-还原，产生6种另外的阿比特龙代谢物。虚线箭头表示不能确定3α和3β异构体之间的直接转换。(B)LAPC4前列腺癌细胞系中阿比特龙代谢物的相互转化。用阿比特龙或指示代谢物(0.1μM)处理细胞48小时，并通过液相色谱-质谱(LC-MS/MS)一式三份检测每个指示代谢物。错误条表示标准差(SD)。(C)用阿比特龙醋酸酯处理的12名前列腺癌患者的血清中的阿比特龙代谢物。通过LC-MS/MS测量代谢物。

图6A-图6D提供了显示体外时间过程和5α还原的阿比特龙代谢物体内形成的图表。(A)从D4A转变为5α还原的阿比特龙代谢物，(B)5α-阿比特龙到3α-羟基-5α-阿比特龙的3-酮基还原。(C)可在LNCaP和LAPC4前列腺癌细胞系中检测到3α-羟基-5α-阿比特龙到5α-阿比特龙的3α-羟基-氧化。用10μM指定化合物处理细胞，通过高效液相色谱(HPLC)分离代谢物，并通过紫外光谱法定量代谢物。(D)小鼠体内阿比特龙代谢。用阿比特龙(n＝5只小鼠)或D4A(n＝5只小鼠)进行治疗可以检测到所有6种5α-还原的代谢物。用三种5α-还原的阿比特龙代谢物(每种化合物n＝4只小鼠)中的任一种进行治疗导致检测到另外两种5α-还原的代谢物，证明了相互转化的发生。将A-C中的实验实施至少三次，每次一式三份，误差条代表SD。

图7A-图7E提供了显示参与形成5α-还原的阿比特龙代谢物的酶的图。(A)3βHSD1催化阿比特龙向D4A的转化和5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙在下游积累。用阿比特龙处理前用指定量的编码3βHSD1或载体对照的表达构建物将LAPC4细胞瞬时转染。(B)由类固醇-5α-还原酶1(SRD5A1)或类固醇-5α-还原酶2(SRD5A2)催化D4A至5α-阿比特龙的转化。将指定量的SRD5A1或SRD5A2或空载体质粒转染到293T细胞中，并将细胞与D4A一起孵育指定的孵育时间。(C)SRD5A1沉默阻止D4A的5α还原。用D4A和代谢物处理稳定表达靶向SRD5A1的shRNAs的LAPC4细胞或非沉默对照并持续指定时间。(D)药理学的SRD5A抑制阻止D4A的5α-还原。用D4A和SRD5A抑制剂度他雄胺或LY191704处理LAPC4细胞。平行对照实验显示了抑制了[³H]-AD的5α-还原。(E)AKR1C2催化5α-阿比特龙转化为3α-羟基-5α-阿比特龙。用AKR1C2或空载体转染293T细胞，并用5α-阿比特龙处理指定的时间。所有实验的代谢物通过HPLC分离，并通过紫外光谱(阿比特龙代谢物)或β-RAM([³H]-雄激素)定量。所有实验中的误差条代表SD。所有实验至少实施3次。

图8A-8I提供了显示5α-还原的阿比特龙代谢物对雄激素途径和肿瘤进展影响的图。(A)阿比特龙和D4A的强有力的CYP17A1抑制活性通过转化为5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙而被减弱。用[³H]-孕烯醇酮处理过表达CYP17A1的293细胞，并在存在指定药物下评估向DHEA的转化。(B)D4A的5α还原引起3βHSD抑制活性的丧失。用[³H]-DHEA和指定药物处理LNCaP细胞48小时，评估了AD代谢通量。(C)5α-阿比特龙和3α-OH-5α-阿比特龙失去SRD5A抑制活性由D4A造成。用[³H]-AD和指定药物处理LAPC4细胞，并且在孵育24小时后评估向5α-二酮的转化量。(D)5α-阿比特龙与AR的结合与D4A与AR的结合相当。LNCaP和LAPC4分别表达突变的AR和野生型AR，并与[³H]-R1881和指定的化合物一起孵育30分钟。将细胞内放射性标准化为蛋白质浓度。(E)和(F)5α-阿比特龙刺激LAPC4和LNCaP中的雄激素应答基因表达。用3α-OH-5α-阿比特龙刺激延迟和更适度的PSA表达。(G)LAPC4中5a-阿比特龙对PSA表达的剂量依赖性刺激。(H)与对照(n＝9只小鼠)比较，使用5a-阿比特龙(n＝10只小鼠)而不是3α-OH-5α-阿比特龙(n＝9只小鼠)的治疗加速了去势小鼠中VCaP CRPC异种移植物生长。当CRPC肿瘤达到100mm³时，开始用指定的化合物进行治疗，并且无进展生存期被评估为2次贯序测量>30％生长量的时间。用对数秩检验评估治疗组之间的差异的显著性。**5α-阿比特龙和Ctrl之间的差异，P<0.01。(I)5β-还原的阿比特龙代谢物不刺激PSA表达。在E-G和I中，表达被统一为RPLPO和介质表达。误差条代表A-G和I中的标准差(SD)。A-G和I中的所有实验至少实施3次

图9A-图9E提供了显示长期暴露于阿比特龙和D4A导致SRD5A表达和酶活性增加以及从D4A转化为至5α-还原的阿比特龙代谢物的转化增加的方案、图像和图表。(A)实验方案。单独用DHEA(100nM)或连续给予指定浓度的阿比特龙或D4A培养VCaP细胞6个月。用相似的条件(分别用LN1、LN3和LN5＝VCaP1、VCaP3和VCaP5处理)分别处理LNCaP细胞。用阿比特龙或D4A处理诱导LNCaP中SRD5A酶活性增加以及在(B)VCaP和(C)LNCaP中D4A向5α-阿比特龙代谢物转化增加。用[³H]-AD、[³H]-T或D4A处理细胞24或48小时，通过HPLC评估向5α-还原的代谢物的转化。(D)VCaP和(E)LNCaP中的阿比特龙和D4A治疗提高了SRD5A1蛋白表达量。一式三份实施(C)和(D)，其中误差条代表SD。所有实验至少实施3次。

图10A-图10F提供了显示SRD5A抑制显著增加血清D4A并且特异性且显著地耗尽用阿比特龙醋酸酯治疗的患者血清中的所有三种5α-阿比特龙代谢物的图表和表格。(A)临床试验方案。在用阿比特龙醋酸酯+泼尼松(开始周期3)治疗2个月后，再加用度他雄胺治疗1和4个月(开始周期4和7)后，收集用于测量阿比特龙代谢物的血液。血清中的(B)阿比特龙、(C)D4A、(D)所有三种5α还原的阿比特龙代谢物、以及(E)所有三种5β-还原的阿比特龙代谢物的血清浓度。(F)临床试验中在3个时间点的每个时间点的平均阿比特龙和阿比特龙代谢物浓度的表格总结。

具体实施方式

本发明人在本文中已经证明，施用治疗有效量的CYP17A抑制剂和有效量的5-α-还原酶抑制剂的方法可用于治疗患者中诸如前列腺癌的类固醇依赖性疾病。

定义

本文所述的术语仅用于描述实施例，并且不应解释为对整个发明的限制。如在本发明和所附权利要求的描述中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”、“所述”包括它们的复数形式，除非与其语境相矛盾。

在本文中，“治疗”和“处理”等是指对患有类固醇依赖性疾病(如前列腺癌)的患者提供益处的任何行为，包括通过减轻或抑制至少一种症状和疾病进展延迟等作用来改善病情。

本文所用的“预防”是指对受到类固醇依赖性疾病如前列腺癌危险的患者提供受益的行为，包括避免不适或疾病发展或万一发病则减少该疾病的一种或多种症状。家族史可能引起该患者面临风险。

本文所用的“药学上可接受的”是指，根据疾病的严重性和治疗的必要性，化合物或组合物适合于给予本文所述方法的患者，而不会产生过度有害的副作用。

术语“治疗有效”旨在限定实现降低疾病严重性的目的同时避免不利的副作用(例如通常与替代疗法相关的那些副作用)的每种药物的量。治疗有效量可以是以一个或多个剂量施用。另一方面，有效剂量是足以提供某种效果(例如酶抑制)的量，但可能或可能不是治疗有效的。

如本文所使用的，术语“诊断”可以包括确定患者的疾病的性质，以及确定疾病或疾病发作的严重性和可能的结果和/或恢复(预后)的前景。“诊断”还可以包括在理性治疗的背景下的诊断，其中诊断指导治疗，包括治疗的初始选择、治疗的修改(例如，剂量和/或剂量方案的调整)等。

本发明包括本文所述的任何药学上可接受的形式的活性剂，包括异构体(例如非对映体和对映异构体)，互变异构体，盐，溶剂化物，多晶型物，前体药物等。特别地，如果化合物是有光学活性的，则本发明具体包括化合物的对映异构体以及该对映异构体的外消旋混合物的每种。应当理解的是，术语“化合物”包括任何或所有这些形式，无论是否明确地表示(尽管有时“盐”被明确地陈述)。

类固醇依赖性疾病的治疗

一方面，本发明提供了在有需要的患者中治疗类固醇依赖性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的CYP17A抑制剂和有效量的5-α-还原酶抑制剂。

CYP17A抑制剂和5-α还原酶抑制剂(即活性剂)联合给药可用于提供预防性的和/或治疗性的治疗。例如，本发明的活性剂可以在发生类固醇依赖性疾病之前预防性施用于受试者。预防性的(即防止性的)给药可有效降低随后在受试者中发生类固醇依赖性疾病的可能性，或降低随后出现的类固醇依赖性疾病的严重程度。可以向发生类固醇依赖性疾病的风险较高的受试者例如具有类固醇依赖性疾病家族史的受试者提供预防性治疗，。

可选地，活性剂可以治疗性地施用于已经受类固醇依赖性疾病影响的受试者。经诊断患有类固醇依赖性疾病的受试者是需要治疗的受试者。需要接受癌症治疗的对象可以是被诊断为具有以不期望的和快速的细胞增殖为特征的失调的受试者。这些失调包括但不限于癌症和癌症前期状况。在治疗性给药的一实施方式中，化合物的给药可有效地消除类固醇依赖性疾病；在另一个实施方式中，活性剂的给药有效地降低类固醇依赖性疾病的严重性或延长受影响的患者的寿命。优选地受试者是哺乳动物，例如驯养的农场动物(例如，牛，马，猪)或宠物(例如狗，猫)。更优选地，受试者是人。

类固醇依赖性疾病

本发明提供了用于诊断、治疗和指导类固醇依赖性疾病治疗的方法。这里所用的类固醇依赖性疾病是指其维持依赖于类固醇激素的存在的疾病。特别地，类固醇依赖性疾病是指CYP17A1酶在调节疾病所依赖的类固醇的量中起作用的疾病。类固醇依赖性疾病的实例包括哮喘，高血压，炎性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)，肾炎综合征，子宫内膜异位症，肾上腺功能障碍，乳腺癌和前列腺癌。这里所用的类固醇依赖性疾病还包括通常被认为是类固醇依赖性疾病但具有或发展为类固醇非依赖性的疾病。

在一些实施方式中，类固醇依赖性疾病是癌症。类固醇依赖性癌症的实施例包括膀胱癌，乳腺癌，子宫内膜癌，胰腺癌和前列腺癌。对可能是类固醇依赖性的其他类型的癌症鉴定正在不断进行。在一些实施方式中，癌症所依赖的类固醇是性类固醇，也称为性腺类固醇，是与雄激素或雌激素受体相互作用的类固醇激素。性类固醇包括：雄激素，如合成代谢类固醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮、二氢睾酮和睾酮；雌激素，如雌二醇，雌三醇和雌酮；和孕激素黄体酮。

这里所用的术语“肿瘤”或“癌症”是指以受试者异常细胞异常快速增殖为特征的病症。异常细胞通常被称为“赘生性细胞”，其是可形成实体瘤的转化细胞。术语“肿瘤”是指由过度或异常的细胞分裂(无论是恶性的还是良性的)以及癌前细胞和癌细胞引起的异常细胞(例如两个或多个细胞)群体。恶性肿瘤与良性生长或肿瘤的区别在于，除了不受控制的细胞增殖之外，它们可以侵入周围组织并且可以转移。

在一些实施方式中，所述癌症是前列腺癌。这里所用的前列腺癌是指在雄性生殖系统的前列腺发生癌症的疾病。前列腺癌被分类为当分泌正常精液的前列腺细胞突变成癌细胞时开始的腺瘤。在前列腺癌的初期阶段，癌细胞的小细胞团仍然局限于其他正常的前列腺，这种疾病称为原位癌或前列腺上皮内瘤变(PIN)，是一种前列腺癌前病变。随着时间的推移，这些癌细胞开始扩增并扩散到周围的前列腺组织(基质)，形成肿瘤。虽然前列腺癌起源并且可能保留在前列腺中，但是前列腺肿瘤细胞可以发展出在血流和淋巴系统中传播的能力，因此在其他器官或组织中可以找到。前列腺癌最常转移到骨骼、淋巴结、直肠和膀胱。本文所用的前列腺癌的治疗或预防也指治疗在其它器官或组织中发现的转移性前列腺癌。

大多数类固醇依赖性癌症在1至3年后变得难治，尽管治疗，其仍然恢复生长。因此，在一些实施方式中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌，也称为激素难治性前列腺癌或雄激素不依赖性的前列腺癌。患有去势抵抗前列腺癌的受试者对通过化学或外科手段减少可用的雄激素/睾酮/DHT的去势治疗不再发生反应。然而，这些癌症依然表现为依赖激素来激活雄激素受体。

可以使用本领域技术人员已知的各种技术来确认前列腺癌或其它类固醇依赖性疾病。用于确认前列腺癌存在的优选方法是进行活组织检查。在前列腺癌活组织检查中，来自前列腺的组织样本一般使用插入和移除特殊空芯针的活检枪通过直肠获得。然后将组织样本在显微镜下检查以确定是否存在癌细胞，并评估发现的任何癌症的显微镜特征或Gleason评分。用于确定人类受试者是否患有前列腺癌的另外的操作包括但不限于直肠指检、膀胱镜检查、经直肠超声检查、超声和磁共振成像。

在癌症治疗的病例中，治疗类固醇依赖性疾病的方法还可以包括消融癌症的步骤。可以使用选自冷冻消融、热消融、放射疗法、化学疗法，射频消融、电穿孔、酒精消融、高强度聚焦超声、光动力疗法、单克隆抗体给药和免疫毒素给药的方法来完成癌症的消融。

活性剂

本发明使用CYP17A抑制剂和5-α还原酶抑制剂的联合治疗来治疗类固醇依赖性疾病。通过改变类固醇代谢，患类固醇依赖性疾病的受试者产生对CYP17A抑制剂治疗的耐药性。本发明人已经展示，受试者中阿比特龙被转化为一种之前尚未被描述过的代谢物D4A，D4A是通过阻断沿着雄激素途径的多个步骤而起作用的更有效的药物。因此，对阿比特龙的临床反应可能在某种程度上取决于是否转化为D4A。然而，D4A可以在患者体内进一步代谢，并被类固醇5-α-还原酶转化为5-α-阿比特龙。与D4A的有效抗肿瘤作用相反，5-α-阿比特龙似乎反而刺激预期促进肿瘤生长的雄激素受体。然而，药理学上可以通过5-α-还原酶抑制剂阻断D4A向5-α-阿比特龙的转化。

5α-还原酶抑制剂的大部分药效源自于其克服对用于治疗类固醇依赖性疾病的CYP17A抑制剂的抗性的能力，CYP17A抑制剂和5-α还原酶抑制剂应该在时间上足够接近一起施用，使5-α还原酶抑制剂增加CYP17A抑制剂的药效。在本文中这可以被称为在时间上接近地施用。时间上的接近组成可以随着个体的新陈代谢以及正在施用的CYP17A抑制剂和5-α-还原酶抑制剂的剂量变化。在一些实施方式中，时间上的接近可在在其它药剂的给药1小时内、6小时内、12小时内或24小时内。在一些实施方式中，同时施用CYP17A抑制剂和5-α还原酶抑制剂。然而，在其它实施方式中，5-α-还原酶抑制剂可以在接近给予CYP17A抑制剂之前或之后的时间，或接近CYP17A抑制剂给药之前的时间或接近CYP17A抑制剂给药后的时间给药。

CYP17A和5-α还原酶抑制剂可以作为一对施用，或与其它药物或营养物如在辅助治疗中同时施用。在定义本文所述化合物的用途和一种或多种其它药剂中的用途时，术语“辅助治疗”或“联合治疗”定义了本文所描述的化合物和一种或多种其它药剂的使用，旨在包括在一方案中以一种序贯方式施用每种药物并将提供药物组合的有益作用，并且还旨在包含以基本上同时的方式例如具有固定比例的这些活性药物的单一配方中或在每种药物的多个分开的配方将这些药物共同给药。

许多CYP17A抑制剂是已知的并且适用于该方法。细胞色素P450 17A(CYP17A)，也称为类固醇17-α-单加氧酶、或17α-羟化酶/17,20裂解酶/17,20碳链酶，是人类由CYP17A1基因编码的酶。它具有17α-羟化酶和17,20-裂合酶活性，并且是产生孕激素、盐皮质激素、糖皮质激素、雄激素和雌激素的类固醇生成途径中的关键酶。CYP17A抑制剂的实例包括阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A、galeterone、orteronel、VT-464和CFG920(参见Gomez等人，Steroids，95，80-87(2015))。在一些实施方式中，CYP17A抑制剂是选自由阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A和galeterone组成的组中的甾族化合物，而在进一步的实施方案中，CYP17A抑制剂选自由阿比特龙、阿比特龙代谢物D4A组成的组。

多种5-α-还原酶抑制剂是已知的并且适用于该方法。这些试剂抑制5α还原酶，5α还原酶参与各种内源性类固醇的代谢转化。5α-还原酶，也称为3-氧代-5α-类固醇4-脱氢酶，是参与类固醇代谢的酶。有三种5-α还原酶的同工酶(1、2和3)，其在不同组织中随年龄而变化。大多数5α-还原酶抑制是已知用于在雄激素相关失调中阻止睾酮(主要雄激素性激素)转化为更有效的二氢睾酮(DHT)。在一些实施方式中，所述5-α-还原酶抑制剂选自由度他雄胺(dutasteride)、非那雄胺(finasteride)、拉匹雄胺(lapisteride)、妥罗雄脲(turosteride)、贝氯特来(bexlosteride)、艾宗特来(izonsteride)和依立雄胺(epristeride)。

可以在动物模型中进行候选药物测试。所述动物模型应该适用于正在治疗的类固醇依赖性疾病，如前列腺癌。例如，动物模型可以是用于研究癌症的一种动物模型。人类癌症研究中，研究动物模型(例如小鼠)中的各种癌症是普遍可接受的做法。例如，人类肿瘤细胞注射到动物体内的裸小鼠模型通常被接受为可用于研究各种各样癌症的一般模型(参见例如Polin等人，Investig.NeDrugs，15：99-108(1997))。通常在用候选药物治疗的对照动物和未接受治疗的对照同窝出的动物之间比较结果。转基因动物模型也是可获得的，并且做为人类疾病的模型被普遍接受(参见例如，Greenberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：3439-3443(1995))。可以在这些动物模型中施用候选试剂来确定候选试剂是否减少与癌症相关的一种或多种症状，包括例如癌症转移、癌细胞运动性、癌细胞侵袭性或其结合。

通过确定一种或多种CYP17A抑制剂代谢物的水平修改治疗

该方法的另一个实施方式包括通过确定来自患者的生物学样本中一种或多种CYP17A抑制剂代谢物的水平来进行修改治疗的步骤。CYP17A抑制剂代谢物的水平可用于评价是否应该修改用5-α还原酶抑制剂进行治疗的方案。也就是说，CYP17A抑制剂代谢物被用作生物标记物来监测治疗的有效性。对治疗的修改包括例如改变所施用的5-α还原酶抑制剂、改变给药日程、或改变正在给药的5-α还原酶或CYP17A抑制剂的剂量。所述代谢物通常是类固醇代谢物。例如，当施用阿比特龙时，CYP17A抑制剂代谢产物包括选自由D4A、3β-羟基-5β-阿比特龙，3-酮基-5α-阿比特龙、3-酮基-5β-阿比特龙、3α-羟基-5α-阿比特龙、3α-羟基-5β-阿比特龙和3β-羟基-5α-阿比特龙组成的组的类固醇代谢物。

在一些实施方式中，该方法包括确定在治疗之前取自受试者的生物学样本中的一种或多种CYP17A抑制剂代谢物的水平，然后确定在治疗期间或之后取自受试者的相应生物样本中CYP17A抑制剂代谢物的水平。可选地，该方法可以包括确定在治疗之前或之后取自受试者的生物样本中的一种或多种CYP17A抑制剂代谢物的水平，并将其与预定值进行比较。通常，CYP17A抑制剂代谢物形成水平增加是治疗应该被修改的一个迹象，尽管一些情况下特定增加的代谢物可以是一个显示治疗类固醇依赖性疾病的类固醇合成抑制正在维持的阳性指标。

生物学样本包括但不限于体液如尿液和血液相关样本(例如全血，血清，血浆和其他血液来源的样本)，尿液，脑脊髓液，支气管肺泡灌洗液等。生物样本的另一个实例是组织样本。可以通过定量或定性量评估从受试者获取的生物样本中的CYP17A抑制剂代谢物的水平，通常是定量评估。可以在体内或体外测定CYP17A抑制剂代谢物的水平。

生物学样本可以是新鲜的或储存的(例如存储在血库中的血液或血液部分)。样本可以储存到达不同的时间，例如储存一小时，一天，一周，一个月或超过一个月。生物学样本可以是为了本发明的测定而明确获得的体液或为另一目的而获得的体液，其可以为了进行本发明的测定被二次抽样。

可以使用分析装置测量受试者中CYP17A抑制剂代谢物的水平，该分析装置是包括能够鉴定类固醇及其片段的检测器的机器。该分析装置可以是光谱仪，例如质谱仪，紫外光谱仪或核磁共振光谱仪。该光谱仪是一种使用光谱技术来评估如生物学样本(例如体液)的介质中给定物质的浓度或量的装置。用于测量CYP17A抑制剂代谢物水平的分析装置可以是便携式或固定式装置。除了包括用于检测CYP17A抑制剂代谢物的设备之外，分析装置还可以包括在分析之前提供分析物的纯化(即物理分离)的附加设备。例如，如果分析物检测器是质谱仪，则其还可以包括高效液相色谱仪(HPLC)或气相色谱仪(GC)，以便在通过质谱检测之前纯化CYP17A抑制剂代谢物，或者优选地可使用凝胶电泳纯化蛋白质。

如本文所示，基于质谱法的方法可用于评估生物学样本中CYP17A抑制剂代谢物的水平。质谱仪包括离子化源(例如电喷雾离子化)，用于根据离子化的质量与电荷比(m/z)来分离在离子化源中形成的离子的分析仪和用于测量带电离子的检测器。串联质谱包括两种或更多种分析仪。这些方法是本领域的标准，包括例如具有在线电喷雾离子化(ESI)和串联质谱法的HPLC。

在一些实施方式中，比较了从受试者获得的生物学样本中的CYP17A抑制剂代谢物的水平与预定值。在一实施方式中，预定值建立在从被给予CYP17A抑制剂的受试者池中获得的可比较样本中CYP17A抑制剂代谢物的水平的基础上。这些对照受试者也可以接受5-α-还原酶抑制剂，或者可以不接受5-α-还原酶抑制剂。

可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行该比较。例如，可以由操作分析设备的个人或者访问分析设备提供的数据的另一个人进行数学上或定性地比较。可选地，确定和比较CYP17A抑制剂代谢物的水平的步骤可以电子方式地(例如，通过电子数据处理器)进行。

药物施用和配制

本发明还提供药物组合物，其包作为活性成分的CYP17A抑制剂和5-α-还原酶抑制剂，以及与活性成分相结合的药学上可接受的液体或固体载体或多种载体。本发明的药物组合物包括上述任何适合于治疗类固醇依赖性疾病的化合物。

该化合物可以作为药学上可接受的盐施用。药学上可接受的盐是指化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者根据化合物的性质通过单独地使根据式I的纯化化合物与合适的相反离子反应，并分离由此形成的盐。代表性的相反离子包括氯化物，溴化物，硝酸盐，铵，硫酸盐，甲苯磺酸盐，磷酸盐，酒石酸盐，乙二胺和马来酸盐等。参见例如Haynes等人，J.Pharm.Sci，94，2111-2120(2005)。例如，优选的阿比特龙的盐形式是阿比特龙醋酸酯。

所述药物组合物包括一种或多种活性成分以及一种或多种用于运载至受试者的生理学上可接受的载体，包括本领域普通技术人员已知的各种稀释剂或赋形剂。例如，肠外给药，优选使用等渗盐水。外用给药，可以使用包括载体(如二甲基亚砜(DMSO))的乳膏或通常在外用乳膏中发现的不阻断或抑制肽活性的其它试剂。其它合适的载体包括但不限于乙醇、磷酸盐缓冲盐水和其它平衡的盐溶液。

方便地，该制剂可以以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。优选地，这样的方法包括使活性药物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂制备是均匀且密切地将活性药物与液体载体、细分散的固体载体或两者均匀结合，并且以及如果需要将产物成型为所需的制剂。本发明的方法包括以产生所需效果的有效量施用本发明组合物于受试者，优选哺乳动物，更优选为人。CYP17A抑制剂和5-α还原酶抑制剂可以单剂或多剂量施用。可以通过比较其体外活性及其在动物模型中的体内活性来确定活性剂的有用剂量。将在小鼠和其他动物中施用的有效剂量外推到人的方法是本领域已知的；例如，参见专利号为4,938,949的美国专利。

优选地本发明的药物配制在药物组合物中，然后根据本发明的方法，通过适合所选给药途径的各种形式施用于受试者，例如人类患者。该制剂包括但不限于适用于口服，吸入，直肠，阴道，局部，鼻，眼或肠胃外(包括皮下，肌内，腹膜内和静脉内)给药等。

在一些实施方案中，口服施用一种或多种CYP17A抑制剂和/或5-α还原酶抑制剂。适合于口服给药的本发明的制剂可以作为分散的单位呈现，例如片剂，锭剂，胶囊，锭剂，晶片或扁囊剂。其各自含有预定量的作为粉末或颗粒的活性剂，作为含有活性化合物的脂质体，或作为在水性液体或非水液体(如糖浆，酏剂，乳剂或气流)的溶液或悬浮液。这样的组合物和制剂通常含有至少约0.1wt％的活性剂。根据式I的化合物(即活性药物)的量是使得该剂量水平对于在受试者中产生所需结果将是有效的剂量。

吸入制剂包括那些设计用于从吸入器装置给药的制剂。用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液、气溶胶和粉末。优选地，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物产生局部或全身效应。优选地，可以通过使用惰性气体来雾化药学上可接受的溶剂中的组合物。优选地，可以以适当的方式从递送制剂的装置，口服或鼻施用溶液、悬浮液或粉末组合物。鼻喷雾制剂包括活性药物与防腐剂和等渗剂的纯化水溶液。优选将这些制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

用于直肠或阴道给药的制剂可以用适当的载体例如可可脂或氢化脂肪或氢化脂肪羧酸制成栓剂。眼用制剂可通过与鼻喷雾相似的方法制备，不同之处在于优选将pH和等渗因子调节至与眼睛相匹配。局部制剂包括溶解或悬浮在一种或多种介质(如矿物油、石油、多羟基醇)中的或用于局部药物制剂的其它碱中的活性剂。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可以含有以下一种或多种组分：粘合剂如黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖，果糖，乳糖或阿斯巴甜；和天然或人造调味剂。当单位剂型是胶囊时，其还可以含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可以作为涂层存在，或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂，丸剂或胶囊可以用明胶，蜡，虫胶，糖等做包衣。糖浆或酏剂可以含有一种或多种甜味剂、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、延缓糖结晶的试剂、增加任何其它成分(如多元醇)的溶解度的试剂(例如甘油或山梨糖醇)、染料和调味剂。用于制备任何单位剂型的材料在所用量中基本上无毒。活性剂可以并入缓释制剂和装置中。

化合物的制备

本发明的化合物可以通过包括与化学领域中熟知的方法类似的方法的合成路线特别是根据本文描述的路线合成。起始原料通常可从商业来源例如Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wisconsin，USA)购买获得，或者使用本领域技术人员熟知的方法容易地制备(例如，通过Louis.Fieser和Mary Fieser，Reagents for Organic Synthesis，卷1-19，Wiley，NewYork，(1967-1999ed.)；Alan R.Katritsky，Otto Meth-Cohn，Charles W.Rees，Comprehensive Organic Functional Group Transformations，卷1-6，Pergamon Press，Oxford，England，(1995)；Barry M.Trost和Ian Fleming，Comprehensive OrganicSynthesis，卷1-8，Pergamon Press，Oxford，England，(1991)；或Beilsteins Handbuchder organischen Chemie，4，Aufl.Ed.Springer-Verlag，Berlin，Germany，包括补充(也可通过Beilstein在线数据库获得)。

本领域技术人员可以理解，本发明的化合物可以使用各种合成途径来合成。虽然反应方案描述了具体的起始原料和试剂，并将在下文讨论，但其它起始材料和试剂可以轻松地被替代从而提供各种衍生物和/或反应条件。此外，根据本公开使用本领域技术人员熟知的常规方法可以进一步修饰由下述方法制备的许多化合物

以下实施例可解释本发明。可以理解的是，特定实施例、材料、数量和操作步骤将根据本文所阐述的本发明的范围和精神进行更宽泛的解释。

实施例

实施例1：将阿比特龙转化为Δ⁴-阿比特龙(D4A)可驱动前列腺癌的抗肿瘤活性:

前列腺癌对发生对去势的抵抗的原因是肿瘤获得将前体类固醇转化为5α-二氢睾酮(DHT)的代谢能力，促进雄激素受体(AR)的信号产生和去势抵抗前列腺癌(CRPC)的发展(Chang等人，Cell，154：1074-1084(2013))。该抗性的必要条件是，从肾上腺前体类固醇合成DHT或可能从胆固醇的从头合成DHT通常需要3β-羟基类固醇脱氢酶(3βHSD)、类固醇-5α-还原酶(SRD5A)和17β-羟基类固醇脱氢酶(17βHSD)同工酶催化的酶反应(Knudsen KE，PenningTM.，Trends Endocrinol Metab，21：315-324(2010))。阿比特龙，一种甾族17α-羟化酶/17,20-裂解酶(CYP17A1)抑制剂，阻断了该合成过程并延长了生存期(Ryan等人，NEngl J Med，368(2)：138-48，(2012)。我们假定阿比特龙被酶转化为活性更强的阻断多种类固醇生成酶并拮抗雄激素受体(AR)的Δ4-阿比特龙(D4A)，为阿比特龙的临床活性提供了另外的解释。在这里我们证明，阿比特龙在患有前列腺癌的小鼠和患者中转化为D4A。D4A抑制DHT合成所需的CYP17A1、3βHSD和SRD5A。此外，D4A造成的竞争性AR拮抗作用与强效拮抗剂恩扎鲁胺(enzalutamide)相当。D4A也具有比阿比特龙更强的抗异种移植肿瘤的抗肿瘤活性。我们的研究结果为阿比特龙治疗的生存期延长提出了另外一种解释–即转化为活性更强的药物。我们建议，直接用D4A治疗比阿比特龙治疗更有临床意义。

阻断了CYP17A1(一种雄激素合成所需的酶)的阿比特龙(Abi)以及强有效地和竞争性地阻止了AR的恩杂鲁胺(enzalutamide)，所产生的临床益处和总体生存益处证明了CRPC中雄激素代谢和AR的核心作用和关键需求(Beer等人，N Engl J Med，371(5)：424-33(2014))。阿比特龙(以其醋酸酯形式施用以有利于生物利用度)是甾族化合物，因此潜在地被类固醇代谢酶转化。我们假设阿比特龙的Δ⁵，3β-羟基结构，其也存在于天然类固醇基底脱氢表雄酮(DHEA)和Δ⁵-雄甾烯二醇(A5diol)中，使其对3βHSD同工酶催化的转化为其Δ⁴，3酮基同属结构(Δ⁴-阿比特龙或D4A)易感，其将使类固醇A和B环与睾酮(T)相同，使其与AR和DHT合成所需的其它类固醇生成酶(包括SRD5A)发生抑制性相互作用(图1A)。外周组织中的这种转化将允许D4A与多个靶标配合以增强其对雄激素途径的作用，这为阿比特龙治疗的临床疗效提供了替代解释，从而提供了直接治疗更有效的可能性。

我们发现在施用阿比特龙醋酸酯的小鼠的血清中(图1B)，以及来自接受用阿比特龙醋酸酯治疗的CRPC患者的血清(图1C，1D)可以检测到D4A。在通常具有低3βHSD活性的LAPC4前列腺癌细胞系中，在只有3βHSD过表达情况下才能检测到阿比特龙向D4A的转化(图1E)。其他具有强大内源性3βHSD酶活性的组织如小鼠肾上腺(但不是小鼠前列腺)也将阿比特龙转化为D4A。这些结果表明，D4A是阿比特龙的主要代谢产物，其转化需要3βHSD，并可能对由阿比特龙间接引起的肿瘤产生影响。

D4A可能妨碍雄激素途径的多个步骤，包括CYP17A1、3βHSD、SRD5A和与AR的直接相互作用(图2A)。尽管增加阿比特龙药物暴露可能阻止3βHSD，但正常剂量给药可能不发生阻止。(Li等人，Clin Cancer Res.，18：3571-3579(2012))。另一方面，如通过薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC；图2B))评估的结果所示，D4A在LNCaP和VCaP细胞中抑制由3βHSD催化的[³H]-DHEA向Δ^4--雄烯二酮(AD)转化的效力，大约比阿比特龙高出约10倍。D4A抑制3βHSD1和3βHSD2这两种人类同工酶，具有混合的抑制动力学(图2C)。CYP17A1抑制是阿比特龙的主要直接作用机制(Ferraldeschi等人，Clin Cancer Res.，19：3353-3359(2013))。改性甾族唑的结构研究表明，D4A的A环构象不会明显地干扰与CYP17A1的结合(Garrido等人，JSteroid Biochem Mol Biol.，143：1-10(2014))。D4A和阿比特龙类似地阻止CYP17A1将[³H]-孕烯醇酮转化为DHEA，HPLC显示在孵3小时育后，在表达CYP17A1的完整293细胞中，介质(vehicle)、1nM D4A和1nM Abi转化为DHEA的百分比分别为70.1％、4.2％和2.6％)(图2D)。D4A的Δ⁴，3-酮基结构与生理的SRD5A基底如T和AD相同(图1A)(Chang等人，Proc NatlAcad Sci U.SA.，108：13728-13733(2011))。为了测定D4A对内源性表达的SRD5A的影响，用D4、阿比特龙或恩杂鲁胺处理表现出强的SRD5A酶活性的LAPC4细胞，并在³[H]-AD(优选的SRD5A1的天然基底)存在条件下培养。D4A(10μM)几乎完全阻断从AD向5α-雄甾烷二酮和其它5α-还原型雄激素的转变，而即使在浓度为100μM时也无法检测到阿比特龙和恩杂鲁胺的影响(图2E)。

据报道，特别是在配体结合结构域(LBD)中存在突变的情况下阿比特龙对AR具有最适度的亲和力(Richards等人，Cancer Res.，72：2176-2182(2012))。3βHSD将阿比特龙转化为D4A，将提供与T和DHT(对AR具有最高亲和力的类固醇)共享的3-酮基结构(图1A)。为了确定从阿比特龙到D4A的3-酮基结构的转化如何影响AR的药物亲合力，我们进行了竞争试验。D4A对突变体(在LNCaP表达，IC50＝5.3nM)和野生型(在以LAPC4表达，IC50＝7.9nM)AR的亲和力大于阿比特龙对其的亲和力(分别为IC50＝418和>500nM)，可与恩杂鲁胺相当(分别为IC50＝24和23nM，图3A-3B)或者稍微大于恩杂鲁胺，并显著大于比卡鲁胺(bicalutamide)，比卡鲁胺是引入恩杂鲁胺之前最有效的竞争性非甾族AR拮抗剂。D4A对ARLBD的亲和力转化为对位于染色质上的PSA、TMPRSS2和FKBP5调节元件上的DHT诱导的AR染色质占据的抑制作用，其优于阿比特龙并略比恩杂鲁胺逊色(图3C)。AR亲和力与D4A和恩杂鲁胺对染色质占有率的影响之间的不一致性与先前报道的关于一些AR拮抗剂在非活性复合物中的组合的AR拮抗作用和染色质结合相一致。(Hodgson等人，JBiolChem。280：6511-6519(2005)。

我们接下来研究了D4A对雄激素应答基因表达的影响的累积结果。与阿比特龙相比，D4A显著更好地抑制了LNCAP、LAPC4和C4-2细胞系中由DHT、DHEA和R1881诱导的PSA，TMPRSS2和FKBP5表达(图3D)。D4A以剂量依赖的方式抑制AR靶基因表达。对D4A与恩杂鲁胺对DHT诱导的内源性PSA表达影响的比较结果表明，D4A对突变型和野生型AR的抵抗与恩杂鲁胺相当(图3E-图3F)。雄激素应答基因表达的下游，D4A和恩杂鲁胺对DHT刺激的细胞生长的影响是相当的(图3G)，两者都比阿比特龙更有效。

为了确定观察到的组织培养中证实的D4A对类固醇合成的抑制作用是否也在肿瘤中发生，我们评估了D4A在两种具有强烈3βHSD酶活性的前列腺癌异种移植模型中的作用。在雄性NSG小鼠中培养VCaP和LNCaP细胞的皮下小鼠异种移植肿瘤，其两者都携带有效增加酶活性的编码3βHSD1中的错义的突变基因。收获新鲜肿瘤后，切碎肿瘤并与[³H]–DHEA+阿比特龙或D4A(0.1-10μM)一起孵育。与图2所示的效果相似，在LNCaP(图4A)和VCaP异种移植物(图4B)中，D4A对由3βHSD催化的从DHEA转化为AD的阻断效力比阿比特龙高出10倍。例如，对于在LNCaP和VCaP两种异种移植物中，0.1μM D4A阻断AD积累的48小时的作用与1μM阿比特龙相当。为了测试与阿比特龙相比，D4A对类固醇合成的抑制和直接阻断AR的组合作用是否引起增强的抗肿瘤活性，将VCaP异种移植物用DHEA颗粒植入(模拟人肾上腺生理学，图4C)到睾丸切除小鼠中皮下让其生长。通过生成Kaplan-Meier生存曲线并用对数秩检验比较治疗组，我们评估了用D4A、阿比特龙醋酸酯或介质开始治疗到肿瘤进展(肿瘤体积增加＞20％)的时间。与阿比特龙醋酸酯组相比，D4A组的进展明显延迟(P＝0.011)。我们还使用与C4-2细胞系模型相同的方法比较异种移植物生长。与阿比特龙醋酸酯和恩杂鲁胺相比，D4A治疗延长了无进展生存期(图4D)。在异种移植研究结束时从D4A治疗的小鼠中收集的血清中，没有可检测到的脱氧皮质酮升高，脱氧皮质酮是用阿比特龙醋酸酯治疗的患者中极度升高的盐皮质激素，可引起高血压和高钾血症。(Attard等人，J Clin Oncol.，26：4563-4571(2008))。图4E描述了雄激素途径中多个点，在这些点处患者中的阿比特龙被3βHSD转化为D4A并因此妨碍AR信号产生和前列腺癌的进展，以及D4A、阿比特龙和恩杂鲁胺的相对效力。

下一代激素疗法，阿比特龙和恩杂鲁胺，分别具有单独的主要靶点(CYP17A1和AR)。这些药物已经证明是临床有效的，即雄激素合成和AR刺激，是刺激CRPC发生和进展所需的重要组成部分。口服后，阿比特龙醋酸酯水解从而转化为阿比特龙，阻断CYP17A1证实阿比特龙是主要的活性药物。已经识别的主要的阿比特龙代谢产物来自肝CYP3A4和SULT2A1加工、分别形成阿比特龙和阿比特龙硫酸盐的N-氧化物。这些修饰都不影响类固醇骨架的Δ⁵，3β-羟基结构。相比之下，转化为D4A可将甾族结构改变为更能与AR、SRD5A和3βHSD配合的甾族结构，从而在保留CYP17A1抑制性的同时阻断所有这些步骤的雄激素信号产生。必须根据药代动力学研究来观察阿比特龙转化为D4A和对患者雄激素途径的各个成分的影响的临床意义，研究显示C_max约为1μM，并且具有广泛的患者间可变性。此外，我们的研究结果表明，与阿比特龙相比，D4A还具有针对CRPC的更有效的抗肿瘤活性。

直接用D4A治疗CRPC患者的潜在临床应用依赖于尚未完全阐明的阿比特龙耐药性的潜在机制以及阿比特龙药效药效失尽的临床环境。有证据表明，持续的AR信号产生是为阿比特龙耐药性病例中的至少一亚群的特征。例如，CRPC中增加的AR拷贝数与缺少对阿比特龙的临床反应相关(Carreira等人，Sci Transl Med.6：254ral25(2014))，并且增加的AR蛋白表达似乎在获得的对阿比特龙的性临床抗性发展时出现。虽然阿比特龙是强有效的CYP17A1抑制剂，但对患者中尿类固醇代谢物的研究表明，雄激素合成抑制是不完全的，其增加了持续的类固醇生成作为抵抗机制的可能性(Attard等人，J Clin EndocrinolMetab.97：507-516(2012))。临床上，在CRPC患者中CYP17A1抑制和有效的AR拮抗剂的组合似乎产生更强的雄激素信号传导抑制作用。(Efstathiou等人，ASCO Meeting Abstracts，32：5000(2014))

用阿比特龙醋酸酯治疗的患者中，D4A的循环浓度似乎相当可变。与肝脏阿比特龙代谢物相反，外周组织中阿比特龙转化为D4A可能导致外周组织(如CRPC)的D4A浓度高于血清中的D4A浓度。因此，基于仅根据血清浓度我们可能低估了D4A对CRPC中雄激素信号传导的影响，特别是在DHT合成中的远端步骤和作为AR拮抗剂的活性方面。尽管如此，外周组织的D4A水平和D4A对阿比特龙临床活性的确切作用目前尚未确定。

最后，我们的结果提高了存在甾族与非甾族CYP17A1抑制剂之间以前未被认可的类效应的可能性。与阿比特龙醋酸酯相反，TAK-700是一种非甾族CYP17A1抑制剂，不能延长转移性CRPC的存活(Fizazi等人，J Clin Oncol.，33(7)：723-31(2015))。活性下游甾族代谢物的缺乏可能有助于这些发现。应考虑用其他甾族和非甾族CYP17A1抑制剂进行进一步的临床研究。

总之，我们已经确定了一种新型阿比特龙代谢物，其存在于用阿比特龙醋酸酯治疗的CRPC患者中，并且比母药物具有更强的抗肿瘤活性。转化为D4A可能产生使用阿比特龙治疗所观察到的一些临床活性。我们认为，用D4A治疗可能获得比阿比特龙更大的临床益处。

方法

细胞系

LNCaP和VCaP细胞购自American Type Culture Collection(Manassas，VA)，并保存在具有10％FBS的RPMI-1640培养基。LAPC4细胞由Charles Sawyers博士(MemorialSloan Kettering Cancer Center,New York，NY)友情提供，并在具有10％FBS的Iscove'sModified Dulbecco's Medium中生长。C4-2细胞由Leland Chung博士(Cedars-SinaiMedical Center，Los Angeles，CA)友情提供，并保持在含10％FBS的RPMI-1640中。在用聚-DL-鸟氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)涂布的平板上实施用LNCaP和VCaP进行的所有实验。通过用质粒pcDNA3-CYP17(旧金山University of California的Walter Miller博士的慷慨礼物)转染并用G418进行选择，产生稳定表达人CYP17A1的293细胞系。细胞系由DDCMedical(Fairfield，OH)认证，并采用引物确定为阴性支原体。

化学品

阿比特龙醋酸酯购自Medkoo Biosciences(Chapel Hill，NC)。按照如前所述合成了阿比特龙和D4A(看见：Li等人，Clin Cancer Res.，18：3571-3579(2012)。恩杂鲁胺来自Medivation(SanFrancisco，CA)。

类固醇代谢

细胞系代谢：在37℃下，将细胞接种在12孔板(每孔20万个细胞)中并孵育约24小时，然后再与放射性(³[H]标记的)和非放射性的雄激素的混合物(终浓度为100nM；约1,000,000cpm/孔；PerkinElmer，W altham，MA)一起孵育。在指定时间收集培养基的等量样本。收集的培养基用1000单位β-葡糖醛酸糖苷酶(Helix pomatia；Sigma-Aldrich)在65℃处理2小时，用860μL乙酸乙酯：异辛烷(1:1)萃取，并在氮气下浓缩。异种移植代谢：将10⁷LNCaP或VCaP细胞用Matrigel皮下注射到睾丸手术切割后的NSG小鼠，并且小鼠中植入了5mg 90天缓释DHEA颗粒(Innovative Research of American，Sarasota，FL)。当达到1000mm³时，收获异种移植物，切碎，并在37℃下用含有10％FBS并含有放射性([³H]标记的)和非放射性雄激素的混合物或阿比特龙的DMEM中培养直至达到1000mm³。在至少三次独立实验中一式三份分析每个异种移植物。在指定时间收集培养基的等量试样。收集培养基用1000单位β-葡糖醛酸糖苷酶在65℃处理2小时，用860μL乙酸乙酯：异辛烷(1：1)萃取，并在氮气中浓缩。

在Waters 717Plus HPLC或Agilent 1260HPLC上进行高效液相色谱(HPLC)分析。将干燥样本在50％甲醇中重构，并注入HPLC中。在30℃下使用甲醇/水梯度在Kinetex 100×2.1mm、2.6μm粒径C₁₈反相柱(Phenomenex，Torrance，CA)上分离类固醇和药物代谢物。使用Liquiscint scintillation cocktail(National Diagnostics，Atlanta，GA)，使用设在254nm的双波长UV-可见检测器或β-RAM模型3在线放射性检测器(IN/USSystems，Inc.)分析了柱流出物。或者，将干燥的样本施加到塑料背衬硅胶板上，并使用3:1氯仿：乙酸乙酯的流动相通过薄层色谱(TLC)分离，然后将板暴露于磷相仪屏幕(phosphorimager screen)并用Storm Model 860磷相仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量。所有HPLC和TLC研究一式三份进行，以独立实验重复至少3次。结果显示为平均值±标准差。

基因表达

将细胞用无酚红和血清游离培养基饥饿至少48小时，并用指定的药物和/或雄激素处理。用GenElute Mammalian Total RNA miniprep试剂盒(Sigma-Aldrich)萃取RNA。使用iScriptc DNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)在逆转录反应中从1μg RNA合成cDNA。使用前面描述的PSA、TMPRSS2、FKBP5和RPLPO的引物按照一式三份进行定量PCR(qPCR)分析(Chang等人，Cell，154：1074-1084(2013))，其中使用ABI 7500实时PCR机(AppliedBiosystems)并使用具有ROX(Bio-Rad)的iTaq Fast SYBR Green Supermix，在96孔板中进行，最终反应体积为20μL。通过将样本值归一化为RPLPO和介质处理的细胞，实现每个mRNA的准确定量。

ChIP试验

LNCaP细胞进行血清饥饿处理至少48小时，用指定药物和DHT处理3小时。用如前所述的抗AR抗体(Santa Cruz，sc-816)进行ChIP试验(参见：Li等人，Proc Natl Acad SciUSA.，108：3116-3123(2011))。所有沉淀的DNA样本通过qPCR定量并归一化为输入DNA。所有ChIP实验至少进行三次。用于ChIP实验的引物来自前面所述的实验(Evaul等人，Endocrinology，151：3514-3520(2010))。

小鼠异种移植物研究

6至8周龄的雄性NSG小鼠获自克利夫兰诊所生物资源设施部(Cleveland ClinicBiological Resources Unit facility)。所有小鼠研究均按照克利夫兰诊所机构动物保护和使用委员会(Cleveland Clinic Institutional Animal Care and Use Committee)批准的协议实施。根据我们以前对CRPC异种移植模型中类固醇生成抑制的研究确定样本量(Chang等人，Proc Natl Acad Sci USA.，108：13728-13733(2011))。基于用于临床进展的类似标准确定进展的标准。手术切除小鼠的睾丸并将5mg 90天缓释的DHEA颗粒(美国Innovative Research)植入小鼠，以在人肾上腺生理学的背景下模拟CRPC。两天后，用基质胶将10⁷个VCaP或C4-2细胞皮下注射。一旦肿瘤长到300mm³(长×宽×高×0.52)，将小鼠任意(但不严格随机)分配给介质组(分别为VCaP和C4-2，分别为n＝9或10只小鼠)、阿比特龙醋酸酯治疗组(对于两种细胞系n＝10只小鼠)、D4A(对于两种细胞系均为n＝10只小鼠)或恩杂鲁胺(对于C4-2为n＝11)治疗组。通过腹腔注射5mL/kg每天施用阿比特龙醋酸酯和D4A(0.5mmol/kg/天，在0.1mL5％苄醇和95％红花油溶液中)长达15天。对照组每天通过腹膜内注射0.1mL5％苄醇和95％红花油溶液。恩杂鲁胺组小鼠每天食用的食物中含有恩杂鲁胺(10mg/Kg/天)(Tran等人，Science，324：787-790(2009))。治疗方法并不对调查人员设盲。每天测量肿瘤体积，确定肿瘤体积增加20％的时间。在治疗第15天或当肿瘤大小比基线大2倍时处死小鼠。使用SigmaStat 3.5中的对数秩检验，通过生存分析(卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)分析)评估治疗组之间差异的显著性。

酶试验

为了测试作为3βHSD的抑制剂的D4A，如前所述进行酶测定。(Li等人，Clin CancerRes.，18：3571-3579(2012))。简言之，用重组人3βHSD1或3βHSD2(分别在酵母微粒体中，每个孵育分别为45或2.5μg蛋白质)、[³H]-孕烯醇酮(100,000cpm，1-20μmol/L)和D4A(5-20μmol/L乙醇)或乙醇介质在0.5mL磷酸钾缓冲液(pH7.4)中制备孵化物。在37℃预孵育1～3分钟后，加入NAD⁺(1mmol/L)，37℃培养20分钟。加入1mL乙酸乙酯：异辛烷(1：1)终止反应，然后将类固醇萃取到有机相中并干燥。干燥提取物中的类固醇通过HPLC溶解并通过在线闪烁计数定量。

AR竞争试验

将细胞在无血清培养基中培养48小时，然后用[³H]-R1881和指定浓度的D4A、阿比特龙、恩杂鲁胺、R1881或比卡鲁胺(bicalutamide)治疗30分钟。在细胞裂解之前，用1X PBS洗涤细胞4次，用0.9％的NaCl溶液洗涤2次。通过Beckman Coulter LS60001C液体闪烁计数器测量细胞内的放射性，并将其标准化为如用WallacVictor2 1420多标签计数器(PerkinElmer)检测到的蛋白质浓度。

细胞增殖试验

将LNCaP细胞(10万/mL)接种在96孔板中，并在无酚红RPMI-1640培养基+含有雄激素和/或药物的10％活性炭处理后的FBS(charcoal stripped FBS)中进行培养。每隔一天更换一次培养基，2、4或6天后，收集细胞并处理后裂解。然后用Hoechst染色和WallacVictor2 1420Multilabel计数器(PerkinElmer)检测DNA含量，并基于此进而确定生长情况。采用双尾student氏t检验确定显著性。

质谱

患者血清收集和药物提取。根据机构审查委员会批准的协议(案例7813)获得12名患有CRPC并正在接受阿比特龙醋酸酯治疗的患者的同意。使用Vacutainer Plus血液采集管(#BD367814，Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)收集血液。在施用1000mg日剂量的阿比特龙醋酸酯后2至14小时之间收集血液。使血液凝结，并将管子于2500RPM离心10分钟。将血浆等量试样在-80℃冷冻直到加工。使用甲基叔丁基醚(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)从200μL患者血清中提取药物代谢物和内标(d₄-皮质醇，CDN同位素Pointe-Claire，加拿大魁北克省)，先用氮气流蒸发并在甲醇中重组，然进行质谱分析。

鼠血清采集、衍生和提取。在小鼠异种移植物研究的完成时，收集小鼠血清用于类固醇分析。20μL血清和d₈-脱氧皮质酮内标是由羟胺(SigmaAldrich，st.Louis，MO)衍生而来的。用甲基叔丁基醚(Sigma Aldrich，st.Louis，MO)提取类固醇，在氮气流中蒸发并在甲烷：水(50:50)中进行重组，然后进行质谱分析。

稳定同位素稀释液相色谱质谱分析

小鼠血清分析。在Thermo TSQ Quantiva-Prelude SPLC系统(ThermoScientific，Waltham，MA)上用Aria MX 2.1和Tracefinder 3.2.368.22软件进行样本分析以用于仪器对照和定量。使用LCMS级甲醇和水(Thermo Scientific，Waltham，MA)为流动相，使用25-100％甲醇的梯度，流速为0.6ml/min，使用Accucore 50×3mm、2.6μmC18柱(Thermo Scientific，Waltham，MA)分离分析物。通过电喷雾离子化使类固醇离子化并处于正离子模式。用多重反应监测跟踪脱氧皮质酮(m/z：361.2/124.1)和d8-脱氧皮质酮(m/z：369.4/128.1)(Steraloids Newport，RI)的肟的质量转换。使用稳定同位素稀释分析测定浓度。

患者血清分析。根据克利夫兰诊所机构审查委员会批准的协议，从达成同意的前列腺癌患者获得血液。用配有DGU-20A3R脱气机、2台LC-30AD泵、SIL-30AC自动进样器、CTO-10A柱式烘箱、以及CBM-20A系统控制器的超高效液相色谱站(Shimadzu，Kyoto，Japan)与QTRAP 5500质谱仪(ABSciex，Framingham，MA)配合使用分析样本。流动相由LC-MS级(Fisher)甲醇：乙腈：水(44:36:20)组成。使用Zorbax Eclipse+150×2.1mm、3.5μmC18柱(Agilent，Santa Clara，CA)以0.2ml/min的流速实现药物代谢物的分离。用正离子模式的电喷雾离子化将药物代谢物离子化。用多重反应监测跟踪D4A(m/z：348.2/156.3)、阿比特龙(m/z：350.3/156.1)和d₄-皮质醇(m/z：367.1/121.1)的质量转换。使用掺有已知浓度的每种代谢物的人血清制作标准曲线，以确定患者样本中未知浓度。

实施例2将阿比特龙的代谢重新定向到生物化学上微调前列腺癌的治疗

阿比特龙在患者体内代谢为甚至具有更强的抗肿瘤活性和与内源性甾族5α还原酶基底(如睾酮)具有结构相似性的D4A。在这里，我们证明D4A被转化为至少三种5α-还原的和三种5β-还原的代谢物。在服用阿比特龙的前列腺癌患者中，初始的5α-还原代谢物，3-酮基-5α-阿比特龙比D4A更丰富，并且是促进前列腺癌进展的雄激素受体(AR)激动剂。在单独的阿比特龙接下来是阿比特龙加度他雄胺(5α-还原酶抑制剂)进行的临床试验中，3-酮基-5α-阿比特龙和下游的代谢物被耗尽，而D4A浓度升高，有效地阻断促进代谢产物生成的肿瘤的生成并允许D4A积累。此外，度他雄胺不会消耗三种临床上可检测的5β-还原的代谢物，这证明了药物5α-还原酶抑制对阿比特龙代谢的特异性生物化学作用。我们的研究结果表明，以前没有注意的和生化特异性的，临床上微调阿比特龙代谢来优化治疗的方法。

结果

D4A的Δ⁴，3-酮基结构使其潜在地对包括还原成3-酮基-5α-阿比特龙(5α-阿比特龙)的5α-还原或还原成3-酮基-5β-阿比特龙(5β-阿比特龙)的5β-还原两种不可逆反应(图5A)敏感。这两种代谢物的3-酮基-还原可以将其可逆地转化为它们的3α-OH和3β-ΟH同系物，制备了D4A下游总共有6种新的代谢物(图5A)。通过质谱法，在LAPC4前列腺癌细胞系中可以检测到从阿比特龙和D4A到所有3种5α-还原的代谢物，三种5α-还原代谢物之间的相互转化以及3种5β-还原代谢物之间的相互转化(5B)。结果与治疗前列腺癌的VCaP细胞系模型的实验结果相似。此外在12例用阿比特龙醋酸酯治疗的CRPC患者的血清中都可以临床检测到所有六种代谢物(图5C)。

类固醇5α-还原保留类固醇平面结构，并且在调节生物活性的雄激素(即将睾酮转化为DHT和将△⁴-雄烯二酮[AD]转化为5α-雄甾烷二酮[5α-二酮])中起重要作用。(Chang等人，ProcNatlAcadSciU.SA.，108,13728-13733(2011))。另一方面，类固醇5β-还原通过引入90°弯曲来破坏平面构象，其通常使类固醇激素失活并促进清除。因此，我们着重研究D4A的5α还原途径和代谢物。在LNCaP和LAPC4人类前列腺癌细胞系和VCaP异种移植物中，用D4A直接孵育导致转化为5α-阿比特龙和3α-OH-5α-阿比特龙(图6A)，用5α-阿比特龙处理导致转化为3α-OH-5α-阿比特龙(图6B)。特别是在LAPC4中，这种反应的可逆性可以通过检测3α-OH-5α-阿比特龙处理下的5a-阿比特龙证明(图6C)。然而，还原为3α-OH-5α-阿比特龙似乎是优选的方向性。类似地，体内，尽管也可以检测到反向反应，但是5α-阿比特龙优先转化为3α-OH-5α-阿比特龙(图6D)。3β-OΗ-5α-阿比特龙也被氧化成5α-阿比特龙并转化为3α-OH-5α-阿比特龙。这反映类固醇5α还原具有不可逆性，用任何5α-还原的阿比特龙代谢物处理后，不能检测到阿比特龙、D4A或5β-还原的代谢物。这些数据一起支持这样的模型，其中，一旦D4A被5α还原成5α-阿比特龙，3-酮基还原成3-(α和β)-羟基异构体以及其逆反应在前列腺癌细胞和体内都发生。

上游部分3βHSD将阿比特龙转化为D4A，促进了5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙合成(图7A)。在没有内源性类固醇-5α-还原酶(SRD5A)表达的细胞中，SRD5A1或SRD5A2的表达使D4A转化为5α-阿比特龙(图7B)。在主要表达SRD5A1的LAPC4细胞中，基因沉默SRD5A1(图7C)、或SRD5A1抑制剂LY191704(Hirsch等人，Proc Natl Acad Sci USA.，90，5277-5281(1993))的药理学阻塞、或临床上可实现的双重同功酶抑制剂度他雄胺的浓度(Clark等人，JClinEndocrinolMetab。，89,2179-2184(2004))，阻止D4A转变为5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙(图7D)。醛酮还原酶同工酶AKR1C2被认为是主要的3-酮还原酶，可将3-酮基类固醇DHT转化为5α-雄甾烷-3α，17β-二醇(Rizner等人，Endocrinology 144，2922-2932(2003))。我们发现AKR1C2表达还能够将5α-阿比特龙还原成3α-羟基-5α-阿比特龙(图7E)。

接下来，我们试图确定雄激素途径上的5α-阿比特龙代谢物活性。如分别通过[³H]-孕烯醇酮向DHEA转化、[³H]-DHEA转化为AD、以及[³H]-AD转化为5α-二酮所评估的那样，D4A至5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙的5α-还原伴随着CYP17A1(图8A)、3βHSD(图8B)和SRD5A抑制活性(图8C)的减弱或丧失。D4A和5α-阿比特龙代谢物对于3βHSD的作用或缺乏与其他内源性Δ⁴，3-酮基类固醇抑制3βHSD和5α-还原导致抑制活性丧失的观察结果一致(Byrne等人，J Clin Endocrinol Metab.，62，413-418(1986))。

5α-阿比特龙与D4A对LNCaP中的T877A突变体AR的和对LAPC4中的野生型AR的亲和力相当，而3α-羟基-5α-阿比特龙和阿比特龙的亲和力较低(图8D)。为了评估5α与AR结合的后果，我们评估了雄激素应答基因的表达。用5α阿比特龙处理可导致LAPC4和LNCaP中雄激素应答基因的表达(图8E、F和G)。3α-羟基-5α-阿比特龙处理产生较低的诱导水平。3α-羟基-5α-阿比特龙对PSA诱导的延迟和适度作用与对AR的低结合亲和力和3α-羟基-5α-阿比特龙适当转化为5α相吻合，与LNCaP相比，转化似乎更大程度发生在LAPC4中(图6C)。为了测试5α-阿比特龙的AR刺激对肿瘤生长的影响，用5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙处理CRPC异种移植物。5α-阿比特龙显著缩短无进展生存期(P<0.01)，而与对照异种移植物相比，3α-羟基-5α-阿比特龙无明显作用(图8H)。我们还测试了所有三种5β-还原的阿比特龙代谢物对雄激素应答基因表达的影响，并证实类固醇平面结构的扰动伴随着代谢物活性的缺失(图8I)。

我们假设，在阿比特龙治疗的条件下，前列腺癌细胞可能会通过SRD5A上调，发展加快D4A转化为5α-阿比特龙的能力。将VCaP和LNCaP细胞与DHEA一起用D4A或阿比特龙培养6个月以模拟人肾上腺雄激素环境(图9A)。通过[³H]–AD转化为5α-还原的雄激素、[³H]–T转化为DHT、以及D4A转化为5α-还原的阿比特龙代谢物评估证明，与D4A和阿比特龙一起在长期培养物中繁殖的细胞显示升高的SRD5A酶活性(图9B-C)。增加的SRD5A酶活性伴随着SRD5A1mRNA和蛋白质表达的显著增加(图9D-E)。总之，这些结果表明，消耗与D4A相关的抗肿瘤活性和/或增加增大的5α-阿比特龙浓度的AR激动剂活性可能具有选择性增长优势。

其次，我们假设在用阿比特龙醋酸酯治疗的患者中，增加的5α-阿比特龙：D4A的比例约为2.5:1是特异的和临床上可以使用度他雄胺通过双SRD5A同工酶抑制逆转的。阿比特龙醋酸酯(每天1000mg)+泼尼松(每日5mg)2个月(2个周期)(NCT01393730)并随后在循环3开始时加入度他雄胺(3.5mg，每日一次；图10A)的II期临床试验在患有转移性CRPC的男性中进行。在分析中包括16名单独使用阿比特龙醋酸酯(周期3开始)和添加度他雄胺后(周期4和周期7开始)收集血液的患者。令人瞩目的是，加度他雄胺后5α-阿比特龙的平均浓度下降了89％(周期3：25.8nM对周期4：2.9nM；图10D)。这进一步证实了度他雄胺对患者D4A的5α还原的阻断作用的影响，SRD5A下游其他两种5α-还原的代谢物呈相似的下降趋势(3α-OH-5α-阿比特龙下降92％，3β-OH-5α-阿比特龙下降73％)。药理学上SRD5A抑制几乎使D4A的平均血清浓度翻倍(周期3：9.9nM对周期4：18.2nM；图10C)。出乎意料的是，添加度他雄胺也几乎将阿比特龙的平均浓度增加了(周期3：191.2nM对周期4：372.4nM；图10B)一倍，尽管该差异没有达到统计学显著性(P＝0.051)。尽管在基线时单独的阿比特龙的变化略有减轻(图10F)，但在添加度他雄胺后的第二个时间点，周期7的比特龙、D4A和5α-阿比特龙代谢物的浓度与周期4相似。最后，与添加他雄胺后5α-阿比特龙代谢物的显著下降形成鲜明对照，三种5β-还原的阿比特龙代谢物中的任何一种的浓度都没有降低，这支持SRD5A抑制对5α-阿比特龙代谢的非常特异的生化作用(图10E)。总之，这些研究结果表明，5α-阿比特龙与D4A比例的升高是药理学上的、特异性的和临床上的可用度他雄胺逆转的。

讨论

虽然临床上阿比特龙对CRPC的治疗有效，但最终会产生耐药性。阿比特龙对CYP17A1的抑制在临床上是不完全的，如已经残留的尿中雄激素代谢物(Attard等人，JClin Endocrinol Metab.，97,507-516(2012))和DHEA-硫酸盐高残留血清浓度证实的，由人类肾上腺产生的主要雄激素，其一起在阿比特龙治疗患者中持续存在。综合基因组研究表明，支持AR信号传递的分子畸变参与了去势抵抗前列腺癌(CRPC)的发展(Robinson等人，Cell161,1215-1228(2015))，阿比特龙治疗的患者中其他循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞信号传导的临床研究表明，维持的AR轴信号传递可促进阿比特龙耐药性产生(Carreira等人，Sci Transl Med.，6,254ral25(2104))。总而言之，这些研究表明，逆转持续性AR信号传递应至少在阿比特龙抗性疾病患者的亚群(subset)中具有治疗效果。

持续的AR信号产生的一个组成部分是通过持续的类固醇生成提供的内源性雄激素(睾酮和/或DHT)的连续供给而发生的。临床前模型确实表明，通过上调类固醇生成酶促使产生阿比特龙耐药性(Mostaghel等人，Clin Cancer Res.，17(18)：5913-25(2011))。我们的研究结果表明，随着有效的内源性雄激素的提供，类固醇生成酶也可以通过调节阿比特龙代谢来实现双重目的，特别是通过将SRD5A酶活性增加而将阿比特龙转化为5α-阿比特龙来加速与D4A相关的抗肿瘤活性的消除，相反具有促进肿瘤的AR激动剂活性。与我们的发现一致，SRD5A已被其他人注意到是阿比特龙抗性另一模型中最上调的类固醇生成酶转录物之一。

根据关于阿比特龙的广泛的类固醇生成代谢的发现，我们应该考虑类固醇生成酶关于内源性类固醇对阿比特龙的协同作用。例如，通过增加DHT合成并将D4A转化为5α-阿比特龙，增加的SRD5A酶活性应对肿瘤生长具有一致的有利影响。另一方面，增加3βHSD活性预计会产生不一致的作用，因为合成T和DHT(有利于肿瘤)是必需的，但会增加阿比特龙转化为D4A(对肿瘤有害)。在这种情况下，可能的是增加的肿瘤内3βHSD活性可能产生有益的净作用，因为内源性基底(即DHEA，△⁵-雄烯二醇和孕烯醇酮)可能优于D4A。与内源性5α-还原的雄激素和5α-阿比特龙相关的第三个酶反应是氧化为3-酮基-类固醇的3α-OH氧化。不会刺激AR的(3α-OH)5α-雄甾烷二醇向(3-酮基)DHT的氧化或“反向转换”可刺激AR信号产生。(Biswas，M.G.和Russell，D.W.，J Biol Chem.，272，15959-15966(1997))。因此，预期这种反应对雄激素和阿比特龙代谢的净作用是一致的和刺激性的，因为除增加DHT合成外，3α-羟基-5α-阿比特龙转变为5α-阿比特龙也增加了对AR的亲合力(图8D)，刺激雄激素应答基因表达(图8E-G)和肿瘤生长(图8H)。我们的发现，即更大程度发生在LAPC4模型(图6C)中的3α-羟基-5α-阿比特龙向5α-阿比特龙的的转化增加，与以前在LAPC4模型中鉴定5α-雄甾烷二醇对DHT的优先氧化是一致的(Mohler等人，Cancer research 71,1486-1496(2011))。我们在LAPC4而不是LNCaP(图8E-G)中观察到的3α-羟基-5α-阿比特龙对前列腺特异性抗原(PSA)表达的适度和延迟刺激也与依赖于向5α-阿比特龙的氧化的间接作用一致。

尽管有这些考虑，在血清中发现的大多数阿比特龙代谢物的形成可能与肿瘤代谢无关并且由肝酶的活性导致。尽管我们发现前列腺癌细胞系容易在5α位还原D4A，但没有观察到前列腺癌依赖性5β-还原。已知类固醇5α-和5β-还原酶反应都发生在肝脏中。尽管如此，在我们的临床研究中，向用阿比特龙醋酸酯的处理中添加度他雄胺，导致5α-阿比特龙的循环的浓度下降了约90％，5α-阿比特龙是D4A的5α还原的瞬时产物，其他5α-阿比代谢产物也有相似的下降。添加度他雄胺后伴随D4A浓度上升，该结果支持度他雄胺对D4A代谢的特异药理作用。在数字上，阿比特龙浓度也有上升，虽然没有达到普遍接受的统计学显著水平(P＝0.051)，但确实提高了SRD5A清除阿比特龙的重要机制的可能性，至少在一个患者亚群中。

与周期3的开始相比，度他雄胺的作用似乎在周期7开始时略微减轻。这可能是由于治疗持续时间更长的尚未确定的代谢效应。

据报道，非那雄胺是结构上与度他雄胺有关的SRD5A抑制剂，其结合并抑制5β-还原酶(Drury等人，J Biol Chem.，284，197786-19790(2009))。其对5β-还原的阿比特龙代谢产物没有任何影响，证明了度他雄胺对D4A的5α还原的显著特异性。5β还原的代谢物的存在和维持进一步表明具有药理学5α-还原酶抑制的代谢的“逃逸”机制，也可能通过5β-还原酶抑制进一步提高D4A和可能的阿比特龙浓度，导致进一步的治疗增强的可能。

我们的研究表明，SRD5A对用阿比特龙治疗的患者的D4A代谢的抑制作用是具有明确的特异性生物化学作用的，预期会增加阿比特龙治疗的有益效果。使用SRD5A抑制微调阿比特龙代谢的临床益处仍需要在随机试验中进一步研究。

实验步骤

细胞系，药物和构建物。LNCaP、293T和VCaP细胞购自American Type CultureCollection(Manassas，VA)，并在具有10％FBS(Gemini生物产品)的RPMI-1640(LNCaP)或DMEM(293T和VCaP)中保持。LAPC4细胞系由Charles Sawyers博士(Memorial SloanKettering Cancer Center，New York，NY)友情提供，并在含有10％FBS的Iscove'sModified Dulbecco's培养基中生长。如前所述建立了具有SRD5A1敲低的稳定的LAPC4细胞系(Chang等人，Proc Natl Acad Sci USA.，108，13728-13733(2011))。使用质粒pcDNA3-cl7(Walter Miller博士的慷慨捐赠，University of California,San Francisco,CA)建立了表达人CYP17A1的293稳定细胞系(Papari-Zareei等人，Endocrinology 147,1591-1597(2006))。细胞系由DDC Medical(Fairfield，OH)鉴定，并用引物确定为无支原体。度他雄胺购自Medkoo Biosciences(Chapel Hill，NC)。恩杂鲁胺得自Medivation(SanFrancisco，CA)。AKR1C2表达质粒是Trevor Penning博士(University ofPennsylvania,Philadelphia,PA)的馈赠。

细胞系代谢：按20万个/ml接种细胞，并在12孔板中孵育约24小时，然后与指定的药物或[³H]标记的(约1,000,000cpm/孔；PerkinElmer，Waltham，MA)和非放射性的雄激素的混合物(终浓度，100nM)在37℃一起孵育。收集的培养基用β-葡糖苷酸酶(Helixpomatia；Sigma-Aldrich)处理，用乙酸乙酯：异辛烷(1:1)萃取，并在氮气中按如上所述方法浓缩(Li等，523，347-351(2015))。

异种移植代谢：用5mg、90天缓释的DHEA颗粒(Innovative Research ofAmerican，Sarasota，FL)为载体，将10⁷个具有人工基底膜的VCaP细胞皮下注射到睾丸切除的NSG小鼠中。收获约1000mm³异种移植物，切碎，并用含有10％FBS的DMEM在37℃下用指定药物培养。在指定时间收集培养基的等量试样。收将集的用于HPLC的培养基采用与来自细胞系的培养基相同的方案进行。

HPLC

在Waters 717加HPLC或Agilent 1260HPLC中进行HPLC分析。将干燥的样本在50％甲醇中重新配制，并在30℃下使用甲醇/水梯度在Kinetex 100×2.1mm、2.6μm粒径的C18反相柱(Phenomenex，Torrance，CA)上分离。使用Liquiscint闪烁混合物(NationalDiagnostics，Atlanta，GA)，使用254nm UV-可见检测器或β-RAM模型3在线放射性检测器(IN/US Systems，Inc.)对柱流出物进行分析。所有HPLC研究都实施一式三份，在独立实验中重复至少3次。结果显示为平均值±标准差(SD)。

基因表达和免疫印迹法

在用指定的药物和/或雄激素治疗之前，用无酚红和血清游离培养基将细胞饥饿处理至少48小时。分别用GenElute Mammalian Total RNA miniprep试剂盒(Sigma-Aldrich)和iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)提取RNA和合成cDNA。如前所述，使用具有ROX(Bio-Rad)的iTaq Fast SYBR Green Supermix和用于TMPRSS2、PSA和RPLPO的引物，在ABI 7500实时PCR机(Applied Biosystems)中一式三份进行定量PCR(qPCR)分析(Chang等人，Cell154，1047-1084(2013))。通过将样本值归一化为RPLPO和介质处理的细胞，可以准确定量每个mRNA。兔抗SRD5A1(Abnova)抗体和小鼠抗β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)抗体的免疫印迹每次取用50μg细胞裂解物。

小鼠异种移植研究

6至8周龄的雄性NSG小鼠购自克利夫兰诊所生物资源部设施处(ClevelandClinic Biological Resources Unit facility)。所有小鼠研究均按照克利夫兰诊所机构动物保护和使用委员会批准的协议进行。给10⁷只VCaP细胞皮下注射基质胶。当肿瘤达到100mm³(长×宽x高×0.52)时，对小鼠实施外科睾丸手术切割并任意分配给介质组(n＝9)、5α阿比特龙治疗组(n＝10)或3α-羟基-5α-阿比特龙(n＝9)治疗组。每天腹膜注射0.15mL的5α-阿比特龙和3α-羟基-5α-阿比特龙(分别为0.15mmol/kg/天和0.075mmol/kg/天，分别溶解在5％苄醇和95％红花油溶液中)，最多达20天。对照组每天经腹膜注射0.15mL5％苄醇和95％红花油溶液。每隔一天测量肿瘤体积，确定肿瘤体积增加30％的时间(2次连续增加)。在治疗第20天处死小鼠。使用SigmaStat 3.5中的对数秩检验通过Kaplan-Meier生存分析来评估治疗组之间的差异的显著性。

AR竞争试验

用无酚红和血清游离培养基将细胞饥饿至少48小时，然后用[³H]-R1881和指定浓度的药物处理30分钟。用PBS彻底洗涤细胞，然后用RIPA缓冲液裂解。用Beckman CoulterLS60001C液体闪烁计数器测量细胞内放射性，并用Wallac Victor2 1420Multilabel计数器(Perkin Elmer)将细胞内放射性标准化为检测到的蛋白质浓度。

患者血清收集和药物提取

根据机构审查委员会批准的协议(案例7813)获得克利夫兰诊所(ClevelandClinic)接受阿比特龙醋酸酯治疗的12名CRPC患者的知情同意书。在给予1000mg日剂量的阿比特龙醋酸酯后1至16小时之间，使用Vacutainer Plus血清血液采血管(#BD367814，Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)收集血液，并使其凝结。将采血管于2500RPM或1430×g离心10分钟。将血清等量试样在-80℃冷冻保存直到分析。为了研究度他雄胺对阿比特龙代谢的影响，从Dana-Farber癌症研究所II期临床试验(NCT01393730)治疗的患者收集血清样本。每位患者接受阿比特龙醋酸酯(每日1000毫克)加上泼尼松(每日5毫克)2个周期(8周)，然后开始用度他雄胺(3.5毫克/日)的附加治疗。收集在用阿比特龙单独治疗的样本和加入度他雄胺后(周期3、4和7的开始)的样本。在这项临床试验中，本研究所接受治疗的17例患者均有所有3个时间点的血液供应。一名患者的阿比特龙浓度低于检测限，随后由于不良反应决定停止治疗，因此不包括在分析中。使用甲基叔丁基醚(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)从100μL患者血清中提取药物代谢物和内标(d4-阿比特龙，TorontoResearch Chemicals Inc，OntarioCanada)，在氮气流下蒸发并在甲醇：水(50:50)中重新组合，然后进行质谱分析。使用掺有已知浓度的每种代谢物的人血清制作标准曲线，以确定患者样本中未知浓度。

小鼠血清提取物

用含有内标(d₄-阿比特龙)的500μl甲醇沉淀20μl小鼠血清，然后将上清液注入质量分析仪。用掺有已知代谢物浓度的小鼠血清制备标准曲线，以准确测定未知的代谢物浓度。

细胞系培养基提取

用甲基叔丁基醚(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)提取在不同时间点收集的200μl培养基，在氮气流下蒸发，并在质谱分析之前在甲醇：水(50:50)中重新配制。

质谱

使用配备有DGU-20A3R脱气机、2台LC-30AD泵、SIL-30AC自动进样器、CTO-10A柱式炉和CBM-20A系统控制器的超高效液相色谱仪(Shimadzu，Kyoto，Japan)控制器与QTRAP5500质谱仪(ABSciex，Framingham，MA)配合使用分析样本。用正离子模式的电喷雾离子化仪器将药物代谢物离子化。用多重反应监测跟踪阿比特龙、IS和代谢物的质量转换(表1)。由于代谢物具有结构和质量转换的相似性，需要用色谱分离它们。使用由LC-MS级(Fisher)甲醇：乙腈：水：甲酸(39:26:34:1)组成的流动相以0.2ml/min的流速和C18分析柱，分离药物代谢物；Zorbax Eclipse加上150x2.1mm、3.5μm(Agilent，SantaClara，CA)。

表1阿比特龙代谢物和IS的母离子(Ql)和产物离子(Q3)

分析物	Q1(m/z)	Q3(m/z)
			阿比特龙	350.5	156.1
D4A	348.3	156.1
			3-酮基-5α-阿比特龙	350.3	156.2
3-酮基-5β-阿比特龙	350.4	156.1
			3α-羟基-5α-阿比特龙	352.4	156.2
3α-羟基-5β-阿比特龙	352.4	156.4
			3β-羟基-5α-阿比特龙	352.3	156.1
3β-羟基-5β-阿比特龙	352.1	156.1
			d4-阿比特龙(IS)	354.4	156.1

实施例3：阿比特龙代谢物的合成

化学合成

我们已经开发了阿比特龙(Abi)代谢物：D4A、5α-阿比特龙，3α-羟基-5α-阿比特龙、3β-羟基-5α-阿比特龙、5β-阿比特龙、3α-羟基-5β-阿比特龙和3β-羟基-5β-阿比特龙的合成。3β-羟基-5α-阿比特龙的合成起始于3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮，保护羟基为乙酸酯，形成16，17-烯醇三氟甲磺酸酯，在Suzuki偶联反应中3β-羟基-5α-阿比特龙用3-二乙基吡啶基硼烷处理(方案1的收率约为85％)。通过在氢氧化钾中用溶剂分解除去乙酰基，得到3β-羟基-5α-阿比特龙，并用铬酸氧化该化合物，得到5α-阿比特龙(收率约90％)。通过Mitsunobu反应反转C-3的立体化学，由3β-羟基-5α-阿比特龙制备出3α-羟基-5α-阿比特龙。这种方法的根本原因是起始物质3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮比3α-羟基-5α-雄甾烷-17-酮经济很多，并产生全部3种化合物；因此，开发的合成方法是非常经济的。用相同的策略从本胆烷醇酮(3α-羟基-5β-雄甾烷-17-酮)起始，合成相应的5β-类似物，但是3β-羟基-5β-阿比特龙的合成(方案2)的Mitsunobu反应的产率较低。除了使用Oppenauer氧化将3β-羟基-羟基-△⁵-阿比特龙转化为D4A以外，采用早期的相似的方法，由DHEA开始合成D4A，总体提高了偶联反应和Oppenauer反应的产率(方案3)。

方案1：5α-阿比特龙，3α-羟基-5α-阿比特龙，3β-羟基-5α-阿比特龙

C-3乙酰基保护形成的一般过程

向溶于吡啶的起始原料中加入乙酸酐，将反应物在室温下搅拌6-7小时。完成后，将反应物在剧烈搅拌下倒入冰冷水中1小时。将形成的白色沉淀物过滤，用过量的水洗涤并真空干燥过夜。

3β-乙酸基-5α-雄甾-16-烯-17-基-三氟甲磺酸酯(2)

在-78℃下将化合物1(1.63g，4.9mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液用双(三甲基甲硅烷基)氨基钾(KHMDS，0.5M，9.8mL，4.9mmol)处理，并在-78℃搅拌1小时。加入N-苯基-双(三氟甲烷磺酰亚胺)(简写为：N-ph(OTf)₂，2.09g，5.88mmol)，并将反应物在-78℃下搅拌2小时，然后缓慢升温至室温，并用饱和氯化铵淬火1小时。产物用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱(己烷至10％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化化合物2，产率为85％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：5.5(s，1H)，4.7(s，1H)，1.9(s，3H)，0.9(s，3H)，0.7(s，3H)ppm。

3β-乙酰基-17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯(3)

将化合物2(2g，4.30mmol)、二乙基-3-吡啶基硼烷(758.5mg，5.48mmol)，双(三苯基膦)氯化钯(II)(30mg，0.043mmol)在THF(20mL)中的悬浮液加到碳酸钠水溶液(2M，7.5mL)中。将混合物在N₂下回流18小时。将反应物减压浓缩，残余物用乙酸乙酯萃取；有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并减压浓缩。化合物3通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至50％乙酸乙酯的己烷溶液)，产率：90％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.6(s，1H)，8.5(d，J＝4.8Hz，1H)，7.7(d，J＝7.6Hz，1H)，7.3(dd，J1＝4.8Hz和J2＝7.6Hz，1H)，6.0(s，1H)，4.7(bs，1H)，2.24(d，1H)，2.0-0.9(m，16H)，1.0(s，3H)，0.98(s，3H)ppm。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：170.6，151.7，147.8，143.7,140.8,133.6,129.1,122.9,69.9,21.5,11.3,9.1ppm。

17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯-3β-醇(3β-羟基-5α-阿比特龙；(4)

将化合物3(800mg，1.2mmol)在室温下溶解在甲醇(10mL)中。加入10％KOH的甲醇溶液(7mL)，将混合物搅拌1.5小时，然后减压浓缩。加入二氯甲烷(40mL)和水(40mL)，将混合物搅拌1小时。分离有机相并用Na₂SO₄干燥。化合物4通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)，产率：85％，HPLC纯度99.3％。¹HNMR(400MHz，CDCl3)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8,1H)，7.6(d，J＝7.6,1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6(m，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，3.6(m，1H)，2.2(d，1H)，2.0(t，2H)，1.2-1.8(m，17H)，0.9(s，3H)，0.8(s，3H)ppm。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ：151.5，147.4，147.3，133.9，133.1，129.3，123.1，66.3，57.5，54.5，47.5，39.3，36.2，35.3，34.0，31.8，31.7，29.0，28.4，20.7，16.7，11.2ppm。高分辨率质谱仪(HRMS)测量m/z为[M+H]＝352.2642，预测m/z＝352.2635。

17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯-3-酮(5α-阿比特龙；5)

在0℃，向化合物4(270mg，0.14mmol)的丙酮(25mL)溶液中滴加10％(w/v)铬酸(4.5mL)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后加入碳酸氢钠溶液至pH＝7。反应混合物用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤并用Na₂SO₄干燥。化合物5通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至40％乙酸乙酯的己烷溶液)，产率：85％，HPLC纯度99.4％。¹HNMR(400MHz，CDCl3)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8,1H)，7.6(d，J＝7.6,1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz，J₂＝7.6Hz，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，2.4-1.2(m，20H)，1.1(s，3H)，1.0(s，3H)ppm。¹³C NMR(100MHz，CDCl3)δ：211.8，151.5，147.4，147.3，134.2，133.1，129.3，123.1，69.3，57.5，54.5，47.5，39.3，36.2，35.3，34.0，31.8，31.7，29.0，28.4，20.7，16.7，11.2ppm。HRMS测得的m/z为[M+H]＝350.2489，预测m/z＝350.2478。

17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯-3α-(4-苯氧基)苯甲酸酯(6)

将化合物4(132mg，0.375mmol)、三苯基膦(PPh3，108mg，0.412mmol)和4-苯氧基苯甲酸(P-OPh-benzoic acid，81mg，0.375mmol)在室温下溶于无水THF(5mL)中，并冷却至0℃保持15分钟，然后缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，使在添加的过程中黄色消失。将混合物搅拌2.5小时，然后减压去除挥发性组分。通过硅胶快速柱色谱(己烷至己烷中的20％乙酸乙酯)从残留物中纯化化合物6，产率为85％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ:8.6(s，lH)，8.4(d，J＝4.8，1H)，8.0(d，2H)，7.6(d，J＝7.6，1H)，7.35(t，2H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，7.16(dd，1H)，7.03(d，2H)，6.97(d，2H)，5.94(d，J＝1.6Hz)，5.25(bs，lH)，2.2(d，lH)，2.0(t，2H)，1.2-1.8(m，17H)，0.97(s，3H)，0.96(s，3H)ppm。

17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯-3α-醇(3α-羟基-5α-阿比特龙；7)

将化合物6(40mg，0.102mmol)在室温下溶于甲醇(4mL)中。加入10％KOH的甲醇溶液(2.0mL)，混合物在80℃下搅拌2-3小时，然后减压浓缩。加入二氯甲烷(25mL)和水(25mL)，将混合物搅拌1小时。分离有机相并用Na₂SO₄干燥。通过硅胶快速柱色谱(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)纯化化合物7，产率为85％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8，1H)，7.6(d，J＝7.6，1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz，J₂＝7.6Hz，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，4.1(m，1H)，2.2(d，1H)，2.0(t，2H)，1.2-1.8(m，17H)，0.9(s，3H)，0.8(s，3H)ppm。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：151.5，147.4，147.3，133.9，133.1，129.3，123.1，66.3，57.5，54.5，47.5，39.3，36.2，35.3，34.0，31.8，31.7，29.0，28.4，20.7，16.7，11.2ppm。HRMS测量m/z为[M+H]＝352.2642，预测m/z＝352.2635。

方案2：合成5β-阿比特龙、3α-羟基-5β-阿比特龙和3β-羟基-5β-阿比特龙

3α-乙酸基-5β-雄甾-16-烯-17-基-三氟甲基磺酸酯(9)

将化合物8(500mg，1.50mmol)溶于四氢呋喃(6mL)中的溶液在-78℃下用双(三甲基甲硅烷基)氨基钾(KHMDS，0.7M，2.4mL，1.50mmol)处理，并在-78℃搅拌1小时。加入氮-苯基-双(三氟甲烷磺酰亚胺)(626mg，1.81mmol)，将反应物在-78℃下搅拌2小时，然后缓慢升温至室温，用饱和NH₄Cl淬灭。产物用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。化合物9通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至10％乙酸乙酯的己烷溶液)，产率：85％。¹HNMR(400MHz，CDCl3)δ：4.70(s，1H)，2.02(s，3H)，0.94(s，3H)，0.93(s，3H)ppm。

3α-乙酸基-17-(3-吡啶基)-5β-雄甾-16-烯(10)

加入化合物9(698mg，1.50mmol)、二乙基-3-吡啶基硼烷(265mg，1.80mmol)，二(三苯基膦)氯化钯(II)(11.0mg，0.015mmol)在THF(15mL)中的悬浮液到碳酸钠水溶液(2M，5mL)中。将混合物在N₂下回流18小时。将反应物减压浓缩，残余物用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)纯化化合物10，产率为90％。¹HNMR(400MHz，CDCl3)δ：8.6(s，1H)，8.5(d，J＝4.8Hz，1H)，7.7(d，J＝7.6Hz，1H)，7.3(dd，J1＝4.8Hz和J2＝7.6Hz，1H)，6.0(s，1H)，4.75(bs，1H)，2.24(d，1H)，2.0-0.9(m，16H)，1.0(s，3H)，0.98)ppm。

17-(3-吡啶基)-5β-雄甾-16-烯-3α-醇(3α-羟基-5β-阿比特龙；(11)

在室温下向化合物10(150mg，0.383mmol)溶解在甲醇(5mL)中。加入10％KOH的甲醇溶液(2.0mL)，将混合物搅拌1.5小时，然后减压浓缩。加入二氯甲烷(25mL)和水(25mL)，将会和无搅拌1小时。分离有机相并用Na₂SO₄干燥。通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至50％乙酸乙酯的己烷溶液)化合物11，产率：35％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ:8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8，1H)，7.6(d，J＝7.6，1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，3.6(m，1H)，2.2(d，1H)，2.0(t，2H)，1.2-1.8(m，17H)，0.97(s，3H)，0.96(s，3H)ppm。

17-(3-吡啶基)-5β-雄甾-16-烯3-酮(5β-阿比特龙；(12)

在0℃下向化合物11(50mg，0.14mmol)在丙酮(4mL)中的溶液中逐滴添加10％(w/v)铬酸(1.0mL)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后加入碳酸氢钠溶液至pH＝7。反应混合物用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤并用Na₂SO₄干燥。通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至40％乙酸乙酯的己烷溶液)化合物12，产率：85％，HPLC纯度99.4％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8,1H)，7.6(d，J＝7.6,1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，2.4-1.2(m，20H)，1.1(s，3H)，1.0(s，3H)ppm。

17-(3-吡啶基)-5β-雄甾-16-烯-3β-(4-苯氧基)苯甲酸酯(13)

将化合物11(132mg，0.375mmol)、三苯基膦(108mg，0.412mmol)和4-苯氧基苯甲酸(81mg，0.375mmol)溶于无水THF(5mL)中，冷却至0℃并保持15分钟，然后缓慢地加入偶氮二羧酸二异丙酯，允许黄色在添加过程消失。将混合物搅拌2.5小时，并在减压下除去挥发性组分。通过硅胶快速柱色谱法(20％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱剂)从残余物中纯化化合物13，产率为35％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8,1H)，8.0(d，2H)，7.6(d，J＝7.6,1H)，7.35(t，2H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，7.16(dd，1H)，7.03(d，2H)，6.97(d，2H)，5.94(d，J＝1.6Hz)，5.25(bs，1H)，2.2(d，1H)，2.0(t，2H)，1.2-1.8(m，17H)，0.97(s，3H)，0.96(s，3H)ppm。

17-(3-吡啶基-5β-雄甾-16-烯-3β-醇(3β-羟基-5β-阿比特龙；(14)

将化合物13(40mg，0.102mmol)在室温下溶于甲醇(4mL)中。加入10％KOH的甲醇溶液(2.0mL)，将混合物在80℃下搅拌2-3小时，然后减压浓缩。加入二氯甲烷(25mL)和水(25mL)，将混合物搅拌1小时。分离有机相并用Na₂SO₄干燥。通过硅胶快速柱色谱法(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)纯化化合物14，产率为85％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8，1H)，7.6(d，J＝7.6，1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，4.1(m，1H)，2.2(d，1H)，2.0(t，2H)，1.2-1.8(m，17H)，0.97(s，3H)，0.96(s，3H)ppm。

方案3：D4A的合成

3β-乙酸基-5α-雄甾-16-烯-17-基-三氟甲基磺酸酯(17)

在-78℃下将化合物16(4.0g，12.10mmol)的四氢呋喃溶液用六甲基二硅氮烷钾盐(KHMDS，0.5M，24.0mL，12.10mmol)处理，并在-78℃下搅拌1小时。加入N-苯基-双(三氟甲烷磺酰亚胺)(5.18g，14.52mmol)，将反应物在-78℃下搅拌2小时，然后缓慢升温至室温，用饱和NH₄Cl淬灭。减压浓缩后，残余物用乙酸乙酯萃取，有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱纯化化合物17，产率：85％。¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.58(bs，1H)，5.42-5.32(m，1H)，4.66-4.52(m，1H)，2.40-2.10(m，5H)，2.08-1.40(m，18H)，1.24-1.09(m，2H)，1.05(s，3H)，0.99(s，3H)ppm。

3β-乙酸基-17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯(18)

加入化合物17(3.6g，7.78mmol)、二乙基-3-吡啶基硼烷(1.37g，9.34mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(54mg，0.077mmol)在THF(35mL)中的悬浮液加到碳酸钠水溶液(2M，10mL)中。将混合物在N₂下回流18小时。将反应物减压浓缩，残余物用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)纯化化合物18，产率为90％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.47(d，J＝4Hz，1H)，7.68-7.62(m，1H)，7.25-7.20(m，1H)，5.95(bs，1H)，5.48-5.38(d，1H，3.6Hz)，4.69-4.56(m，1H)，2.44-2.22(m，4H)，2.16-2.0(m，8H)，1.96-1.44(m，15H)，1.30-1.00(m，11H)ppm。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：170.82，151.89，148.14，148.08，140.26，133.95，129.49，123.28，122.54，77.52，77.27，77.01，74.10，77.70，57.70，50.50，47.56，38.37，37.15，37.01，35.42，39.54°，32.02，31.73，30.63，27.98，21.70，21.04，19.48，16.82ppm。

17-(3-吡啶基)-5α-雄甾-16-烯-3β-醇(19)

在室温下将化合物18(2.4g，3.6mmol)溶于甲醇(30mL)中。加入10％KOH的甲醇(21mL)溶液，将混合物搅拌1.5小时，然后减压浓缩。加入二氯甲烷(80mL)和水(80mL)，将混合物搅拌1小时。分离有机相并用Na₂SO₄干燥。通过硅胶快速柱色谱纯化(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)化合物19，产率：85％，HPLC纯度99.3％。¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8Hz，1H)，7.6(d，J＝7.6Hz，1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，6.0(s，1H)，5.42-5.36(m，1H)，3.56-3.42(m，1H)，2.48-2.36(m，6H)，2.32-1.96(m 6H)，1.94-1.38(m，20H)，1.36-0.86(m，16H)ppm。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：151.91，148.13，148.06，141.37，133.90，129.48，121.59，71.93，57.78，50.58，47.57，37.41，36.93，35.48，32.05，31.86，31.76，30.67，21.11，19.59，16.83ppm。

17-(3-吡啶基)雄甾-4,16-二烯-3-酮(20)

使用Dean-Stark装置将甲苯(100mL)加热至回流，直至蒸出35mL。将剩余的甲苯(65mL)冷却至室温，加入化合物19(2.2g，6.29mmol)，2-丁酮(20mL)和异丙醇铝(Al(iPro)₃，3.2g，15.74mmol)。将反应物再回流16小时，然后减压除去溶剂。将产物萃取到乙酸乙酯中，有机相用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(己烷至己烷中的50％乙酸乙酯)纯化化合物20，产率：85％，HPLC纯度99.2％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.6(s，1H)，8.4(d，J＝4.8Hz，1H)，7.6(d，J＝7.6Hz，1H)，7.2(dd，J₁＝4.8Hz和J₂＝7.6Hz，1H)，5.9(d，J＝1.6Hz)，5.7(s，1H)，2.5-1.2(complex，16H)，1.2(s，3H)，1.0(s，3H)ppm。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ：199.3，170.8，151.3，147.5，147.4，133.9，132.8，129.2，123.9，123.1，56.7，53.9，38.6，35.5，35.0，34.1，33.9，32.7，31.7，31.6，36.9。20.8，17.2，16.5ppm。HRMS测得的m/z为[M+H]＝348.2328，预计m/z＝348.2322。

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Claims (11)

1.一种在有需要的患者中治疗类固醇依赖性疾病的方法，包括给所述患者施用治疗有效量的CYP17A抑制剂和有效量的5-α-还原酶抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述类固醇依赖性疾病是类固醇依赖性癌症。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述癌症是前列腺癌。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述前列腺癌为去势抵抗前列腺癌。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述CYP17A抑制剂选自由阿比特龙、阿比特龙代谢产物D4A和galeterone组成的组。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述CYP17A抑制剂选自由阿比特龙和阿比特龙代谢产物D4A组成的组。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括通过确定来自所述患者的生物学样本中的一种或多种CYP17A抑制剂代谢物的水平来修改治疗。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述CYP17A抑制剂为阿比特龙，所述CYP17A抑制剂代谢物选自由D4A、3β-羟基-5β-阿比特龙、3-酮基-5α-阿比特龙、3-酮基-5β-阿比特龙、3α–羟基-5α-阿比特龙、3α-羟基-5β-阿比特龙和3β-羟基-5α-阿比特龙组成的组。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述5-α-还原酶抑制剂选自由度他雄胺、非那雄胺、拉匹雄胺、妥罗雄脲、贝氯特来、艾宗特来和依立雄胺组成的组。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述CYP17A抑制剂和所述5-α-还原酶抑制剂是通过药学上可接受的载体施用。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述CYP17A抑制剂中的一个或多个和/或所述5-α-还原酶抑制剂是口服施用。