CN108107200A - 一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法。包括：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体‑酶标他克莫司复合物的指示试剂；上述酶标他克莫司由他克莫司和葡萄糖脱氢酶偶联而成。本发明的他克莫司免疫检测试剂可以精确快速地确定人体血液等样品中他克莫司含量。与市场上现有的检测试剂相比，本发明检测试剂具有方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，有利于临床的推广使用。

Description

一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体是一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法。
背景技术
他克莫司又名FK506，是80年代从土壤真菌肉汤中提取的钙调酶抑制剂，属于大环内酯类免疫抑制剂，其免疫抑制作用强于环孢素A的10-100倍，主要通过抑制T淋巴细胞的活化与增殖，发挥强大的抑制免疫作用。FK506是器官移植，特别是肾脏移植患者的常用药物，移植后合理服用他克莫司可使器官免遭排斥。此外，FK506现还逐渐应用于一些自身免疫性疾病的治疗，如原发性或继发性肾小球疾病等。但是，剂量过高又会引起严重的副反应，包括肾脏毒性，肝脏毒性和其他一系列的并发症。通过检测病人全血中的FK506的浓度，结合其它临床指征来合理用药，是确保器官移植接受者获得免疫抑制的最有效方法。
目前检测他克莫司的常用方法有：高效液相色谱分析（HPLC）、液相色谱质谱联用法（LC-MS）和荧光偏振法等。其中，HPLC和LC-MS都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，准确性较差；荧光偏振法，检测结果准确性差，对样品的纯度要求较高，还需要昂贵的试剂和仪器设备。
本发明采用的方法为均相酶免疫检测法，其优点为：操作简便、快速、灵敏度高、准确性好、适合于自动化，应用广泛，并且用全自动生化分析仪对小分子物质和大分子物质都能高通量快速测定。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中他克莫司检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、准确检测出待测样本中他克莫司含量的他克莫司均相酶免疫检测试剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂；上述酶标他克莫司由他克莫司和葡萄糖脱氢酶偶联而成。
作为本发明进一步的方案，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。
作为本发明进一步的方案，所述的一种他克莫司免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物的制备：葡萄糖脱氢酶（GDH）与他克莫司偶联，纯化偶联的酶标抗原；
（2）他克莫司均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂1的制备：由他克莫司抗体和均相酶底物混合而成；
试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。
作为本发明进一步的方案，所述的一种他克莫司免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：
1）葡萄糖脱氢酶（GDH）与他克莫司的偶联
a. 将20-100 mg他克莫司溶于甲醇中，加入无水乙酸钠，溶解混匀后加入羧甲基羟胺，溶解混匀，氮气保护下加温反应过夜，然后减压蒸馏得蜡状物，加入二甲基甲酰胺溶解，过滤去除沉淀，减压蒸馏去除溶剂得产物A；
b. 用20-100 mL二甲基甲酰胺溶解10-50 mg产物A，再将50-150 μL的碳二亚胺（EDC）在搅拌下缓慢滴加到上述溶液中，旋转混合60-150分钟；
c. 取10-50 mg 规格为100-300 KU的GDH溶解于PBS缓冲液中震荡均匀；
d. 将上述b的他克莫司溶液在搅拌下缓慢加入到GDH溶液中，搅拌反应8-16小时。
2）纯化偶联的酶标抗原
通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物，于2-8℃下储存。
作为本发明进一步的方案，所述的一种他克莫司免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：
试剂1 的制备：将2-5 g氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、0.5-3 g葡萄糖用0.5-2L磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将他克莫司抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物加到磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
作为本发明进一步的方案，所述的他克莫司免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将待测样本与他克莫司抗体接触；
2）根据待测样本中酶标他克莫司与他克莫司抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中他克莫司的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
本发明的原理是抗原与酶结合成酶标抗原，保留抗原和酶的生物活性，当酶标抗原与抗体结合后，抗原分子上的酶蛋白与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响，酶的活性受到抑制。测定时样本中的抗原、酶标抗原与抗体竞争性结合，样本中的抗原含量越高，加底物后其OD值越高。
本发明的优点在于：本发明的他克莫司免疫检测试剂可以精确快速地确定人体血液等样品中他克莫司含量。与市场上现有的检测试剂相比，本发明检测试剂具有方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，有利于临床的推广使用。
附图说明
图1 是他克莫司均相酶免疫反应校准曲线图。
图2 是他克莫司均相酶免疫线性范围图。
具体实施方式
本发明提供了一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法，为使本发明目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法。包括：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂；上述酶标他克莫司由他克莫司和葡萄糖脱氢酶偶联而成。
本发明中所指的“他克莫司”不仅仅指完整的他克莫司分子，也包括保留完整抗原特异性结合能力的他克莫司片断或者衍生物。
一种他克莫司均相酶免疫检测试剂，包括：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物，其可通过化学合成方法得到。
上述的他克莫司免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
1）将待测样本与他克莫司抗体接触；
2）根据待测样本中酶标他克莫司与他克莫司抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中他克莫司的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液等。优选的，待测样本为血清或血浆。
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明。
实施例一：葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物的制备
a. 将40 mg他克莫司溶于10 mL甲醇中，加入20 mg无水乙酸钠，溶解混匀后加入30 mg羧甲基羟胺，溶解混匀，氮气保护下加温反应过夜，然后减压蒸馏得蜡状物，加入10 mL二甲基甲酰胺溶解，过滤去除沉淀，减压蒸馏去除溶剂得产物A；
b. 用30 mL二甲基甲酰胺溶解30 mg产物A，再将80 μL的碳二亚胺（EDC）在搅拌下缓慢滴加到上述溶液中，旋转混合90分钟；
c. 取20 mg 规格为150 KU的GDH溶解于20 mL 浓度为50 mM pH 7.4的PBS缓冲液中震荡均匀；
d. 将上述b的他克莫司溶液在搅拌下缓慢加入到GDH溶液中，搅拌反应14小时。
2）纯化偶联的酶标抗原
通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物，于2-8℃下储存。
实施例二：他克莫司均相酶免疫检测试剂的制备
他克莫司均相酶免疫检测试剂，包括：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物，其可通过化学合成方法得到。
他克莫司均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是分开放置的，因此他克莫司均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂，具体如下：
1.试剂1 的制备：将3.588 g（10 mM）氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.802 g（10mM）葡萄糖用1L 50 mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将他克莫司抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:500。
2.试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物加到50 mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:1800。
上述他克莫司均相酶免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
1）将待测样本与他克莫司抗体接触；
2）根据待测样本中酶标他克莫司与他克莫司抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中他克莫司的含量；
具体的，检测时将待测样本加到试剂1中，待测样本中的他克莫司与试剂1中的他克莫司抗体发生特异性结合，生成抗他克莫司抗体-他克莫司复合物；再加入试剂2，此时试剂2中的葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物与试剂1中的酶的底物混合、接触，发生酶促反应，构成检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂，指示试剂根据待测样本中他克莫司与上述他克莫司抗体的结合情况判断待测样本中他克莫司的含量。
由于葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与待测样本中的他克莫司竞争性结合他克莫司抗体，所以，待测样本中他克莫司的量越多，均相酶溶液中游离的葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物的量越多，酶促反应越快，导致OD340 上升。
上述待测样本为生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等，作为一种优选的方案，上述待测样本为血清或血浆。
实施例三：他克莫司均相酶免疫检测试剂反应校准曲线。
1）校准品配制：将市售人他克莫司重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液（NaCl0.9%，BSA 0.2%，NaN3 0.1%，Tris-HCl pH 7.4）中，制成不同浓度的校准品。以深圳市新产业生物医学工程股份有限公司他克莫司校准品为原始标准，采用其他克莫司试剂盒对不同浓度的校准品分别检测10次，求出均值，得到他克莫司校准品的浓度：0，5，10，20，50，100 ng/mL。
2）生化分析仪检测：以日立7170操作为例：测定波长为340 nm，分别取不同浓度的校准品溶液（15μL），加入他克莫司R1试剂（160μL），混匀，再加入他克莫司R2试剂（40μL），混匀后，测定不同时间点的OD340 吸光值，算出不同校准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂1和试剂2的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，每管重复测定3次，以各校准管3次测得的吸光度差值ΔA的平均值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制“浓度-吸光度差值”校准曲线（见图1）。
取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中他克莫司的含量。如果血清或血浆中他克莫司的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。
本检测试剂不仅适用于日立7170，还适用于其它品牌和型号的半自动、全自动生化分析仪，具体参数可根据仪器进行调整。
实施例四：线性范围确定
用接近线性范围上限的他克莫司高浓度样本（96 ng/mL），用上述类似人血清基质的溶液将其按1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64 稀释，共配制成6个稀释浓度（xi）的溶液，用所述生化分析仪检测方法测定各稀释样本浓度。每个稀释浓度测试3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以测定均值（yi）为因变量求出线性回归方程，根据公式（1）计算线性回归的相关系数r，结果显示回归方程为y=0.9847x+0.1147，相关系数r=0.9996，表明本发明试剂在1.5 ng/mL-96.0 ng/mL线性范围内相关性较好（见图2）。
由于本发明的检测过程是由仪器全自动化完成，所以对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
需要说明的是，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的专利保护范围内。
此外，以上所述的仅是本发明的优选实施方案，并非因此限制本发明的专利范围，对于本技术领城的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做若干的改进和调整，这些改进的调整均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种他克莫司免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标他克莫司、用于检测他克莫司抗体-酶标他克莫司复合物的指示试剂。
2.根据权利要求1所述的他克莫司的免疫检测试剂，其特征在于：所述酶标他克莫司由他克莫司和葡萄糖脱氢酶偶联而成。
3.根据权利要求1所述的他克莫司免疫检测试剂，其特征在于：所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。
4.一种他克莫司免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物的制备：葡萄糖脱氢酶（GDH）与他克莫司偶联，纯化偶联的酶标抗原；
（2）他克莫司均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂1的制备：由他克莫司抗体和均相酶底物混合而成；
试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。
5.根据权利要求5所述的一种他克莫司免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：
1）葡萄糖脱氢酶（GDH）与他克莫司的偶联
a. 将20-100 mg他克莫司溶于甲醇中，加入无水乙酸钠，溶解混匀后加入羧甲基羟胺，溶解混匀，氮气保护下加温反应过夜，然后减压蒸馏得蜡状物，加入二甲基甲酰胺溶解，过滤去除沉淀，减压蒸馏去除溶剂得产物A；
b. 用20-100 mL二甲基甲酰胺溶解10-50 mg产物A，再将50-150 μL的碳二亚胺（EDC）在搅拌下缓慢滴加到上述溶液中，旋转混合60-150分钟；
c. 取10-50 mg 规格为100-300 KU的GDH溶解于PBS缓冲液中震荡均匀；
d. 将上述b的他克莫司溶液在搅拌下缓慢加入到GDH溶液中，搅拌反应8-16小时；
2）纯化偶联的酶标抗原
通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物，于2-8℃下储存。
6.根据权利要求5所述的一种他克莫司免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：
试剂1的制备：将2-5 g氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、0.5-3 g葡萄糖用0.5-2 L磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将他克莫司抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-他克莫司偶联物加到磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
7.利用权利要求1至4任意一项所述的他克莫司免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将待测样本与他克莫司抗体接触；
2）根据待测样本中他克莫司与他克莫司抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中他克莫司的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
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