CN108096266A - miRNA-370在抗肿瘤作用、实施方法及用途 - Google Patents
miRNA-370在抗肿瘤作用、实施方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及miRNA‑370的抗肿瘤作用、实施方法及用途,属于生物医学材料技术领域。具体涉及miR‑370‑3p在抑制肺癌生长中的用途和应用方法。本发明的miR‑370‑3p在肺癌细胞中用抑制肺癌靶标MCM2的表达的方法抑制肺癌生长,可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。尤其用于制备预防或治疗肺癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,具体地说,本发明涉及一种RNA小分子——miR-370-3p的抗肿瘤作用、实施方法及用途。
背景技术
微小RNA(microRNA,简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA,长约18~24nt。关于miRNA的报道,最早是1993年Lee等在秀丽线虫(C.elegans)体内发现的一种呈时间特异性表达的小分子RNA,即可调节线虫发育的lin-4【Lee RC,FeinbaumRL,Ambros AV.The C.elegans heterochronic gene encodes small RNAs withantisense complementarity to lin-4[J].Current Biology.】。2000年,Reinhart等【Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7RNA regulatesdevelopmental timing in Caenorhabditis elegans.[J].Nature,2000,403(6772):901-6.】又发现不同时期表达的let-7。到目前为止,公用miRNA数据库中已收录了数百种人类microRNA序列,其中三分之二已被实验证实。
微小RNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(pri-miRNA),pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60~80nt的具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)。miRNA前体转运至胞质后,被进一步加工成miRNA。
微小RNA在动植物细胞中通过对目标mRNA的切割和转录抑制发挥重要作用,参与细胞生长、组织分化和肿瘤形成等多种过程。miRNA在物种间具有高度的保守性、时续性和组织特异性。目前认为miRNA在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用,参与人体大约30%的基因调节,与肿瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关。
在上述疾病中,miRNA与肿瘤的关系是很多研究的重点。已经发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。miRNA的正调控靶基因现象是最近的发现,具体机制还不明确。
有学者提出了“癌microRNA(OncomiRs)”的观点【Esquela-Kerscher,A.等,Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer.2006,6:259-269;Hammond,SM.等,MicroRNAs as oncogenes.Curr Opin Genet.2006,16:4-9】,即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。
miRNA的表达主要由miRNA基因首先表达为miRNA前体(pri-miRNA)。pri-miRNA经转运出核后,由Dicer酶剪切成为pre-miRNA,pre-miRNA表现为典型的茎环结构,茎部序列不完全互补配对。其茎部序列经剪切后成为成熟体miRNA从而发挥生物学功能。
miR-370-3p位于人14号染色体及同源的小鼠12号染色体上的Dlk1/DIO3印记基因区。根据已有文献报道,微小RNA miR-370-3p抑制肝癌细胞的增殖【孙戈,侯毅斌,余林等。miR-370在肝癌组织中的表达及与临床病理和预后的关系[J].海南医学院学报,2016,22(16):1771-1774.】,抑制胶质母细胞瘤的增殖【彭泽生,田道锋,张申起等。miR-370-3p对胶质母细胞瘤U87-MG细胞株增殖能力的影响[J].中国临床神经外科杂志,2016(4):223-226.】,说明miR-370-3p可能参与几种肿瘤的发生和进展。然而,本领域中尚无关于miR-370-3p在肺癌和另外其他癌细胞中的表达量和作用的报道。
肺癌不仅是肿瘤相关死亡率中排名第一的疾病,也是全球最常见的肿瘤。每年大约有超过180万例新增肺癌病例(所有肿瘤中占13%)和160万例肺癌相关死亡病例(所有肿瘤中占19.4%)。其中,非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)大约占了所有肺癌病例的85%。以NSCLC为例,在过去的几十年来,以铂为基础的化疗是NSCLC唯一的全身治疗方案,而生存时间只有8-10个月。因此,探求NSCLC的有效治疗新方法是本领域的重中之重。
近年来,随着miRNA功能研究的不断深入,miRNA在肺癌的发生发展中的作用也逐渐为研究者所关注。大研究证据表明,miRNA在肺癌的发生和发展、早期诊断和临床治疗中起着重要作用。在肺癌细胞系中miR-126的过度表达使得肺癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力下降【Zheng D,Haddadin S,Wang Y,et al.Plasma microRNAs as novel biomarkers forearly detection of lung cancer[J].International Journal of Clinical&Experimental Pathology,2011,4(6):575-86.】。Let-7低表达调控肺癌细胞的转移能力,与肺癌患者的存活率呈负相关【Jeong HC,Kim EK,Lee JH,et al.Aberrant expressionof let-7a miRNA in the blood of non-small cell lung cancer patients.[J].Molecular Medicine Reports,2011,4(2):383-387.】。miR-183的表达与肺癌的转移呈负相关,过度表达能抑制肺癌细胞转移【Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNAexpression profiles classify human cancers.[J].Nature,2005,435(7043):834-838.】。miR-31能够抑制肺癌细胞增殖及体内肿瘤组织的生成【Chen,Li jia,Xing,etal.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers fordiagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Research,2008,18(10):997-1006.】。miR221/222促进肿瘤细胞的转移【Jason D.Arroyo,John R.Chevillet,EvanM.Kroh,Ingrid K.Ruf,Colin C.Pritchard,Donald F.Gibson,Patrick S.Mitchell,Christopher F.Bennett,Era L.Pogosova-Agadjanyan,Derek L.Stirewalt,JonathanF.Tait,Muneesh Tewari.Argonaute2 complexes carry a population of circulatingmicroRNAs independent of vesicles in human plasma[J].Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(12):5003-5008.】。因此,miRNA有可能成为肺癌早期诊断、治疗及预后评估的重要手段。
然而,本领域中已知的miRNA种类繁多,功能各异,而且同一个miRNA在不同种类的癌细胞中的表达量和作用往往不一样。要从中筛选出与肿瘤相关的miRNA存在较大的难度。目前尚无miR-370-3p在肺癌中作用的研究报道。
综上所述,本领域中迫切需要开发出可有效针对肺癌及其他癌症的预防和治疗药物。
发明内容
本发明正是从数百种已知的miRNA中筛选出了肿瘤(尤其是肺癌)表达相关性及其对肺癌生长的具有调控作用的miR-370-3p,由此本发明提供了miR-370-3p有效抗肿瘤的新用途。
在本发明的第一方面中,提供了微小RNA miR-370-3p或其前体在制备预防或治疗肺癌及其他癌症的组合物中的应用。
在本发明的一个实施方式中,所述miR-370-3p的序列为gccugcugggguggaaccuggu。
在本发明的另一个实施方式中,所述miR-370-3p的前体在对象体内经加工转化为miR-370-3p。
在本发明的另一个实施方式中,所述miR-370-3p或其前体来自:人、大鼠、小鼠、羊、猴、犬、马、牛或兔,也可以来自化学或生物合成。
在一个优选例中,所述肺癌选自:非小细胞肺癌和小细胞肺癌。优选小细胞肺癌,更优选非小细胞肺癌。
在本发明的另一个实施方式中,所述的其他癌症选自:肝癌、胃癌、皮肤癌、食管癌、直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤。
在本发明的另一个实施方式中,所述组合物是药物组合物或疫苗组合物。
在本发明的第二方面中,提供了一种组合物,所述组合物包含:(a)有效量的微小RNA miR-370-3p或其前体;和(b)药学上或免疫学上可接受的载体。
在一个优选例中,组分(a)的浓度为5~200nM,优选10~150nM,更优选20~100nM,最优选40~60nM。
在本发明的一个实施方式中,所述组合物还包含治疗或预防肿瘤(优选肺癌)的其它活性成分。
在一个优选例中,所述治疗或预防肿瘤(优选肺癌)的其它活性成分包括:化疗剂或放疗剂。
在一个优选例中,所述其它活性成分选自:烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、或免疫制剂,优选:细胞有丝分裂抑制剂、喜树碱、高三尖杉酯碱、丙卡巴肼、门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、米托蒽醌、他莫昔芬、环磷酰胺、盐酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、优氟啶、卡莫氟、巯嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、巯鸟嘌呤、六甲蜜胺、羟基脲、丝裂霉素、阿霉素、表柔比星、博莱霉素、培莱霉素、阿伐司汀、赫赛汀、格列卫、吉西他滨、托泊替康和/或亮丙瑞林。
在另一个优选例中,所述细胞有丝分裂抑制剂选自:长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙胺、秋水仙碱、秋水仙酰胺、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇或多西他赛。
在本发明的另一个实施方式中,所述组合物的形式适于:直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、蛋白或多肽包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因枪轰击法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒表达RNA法。
在本发明的另一方面中,提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法,所述方法包括:给予需要预防和/或治疗的对象有效量的微小miR-370-3p或其前体。
在一个优选例中,所述微小RNA miR-370-3p或其前体是通过如下方法给予对象的:直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、蛋白或多肽包裹RNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒表达RNA法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1:miR-370-3p降低肺癌细胞系中的靶标MCM2的表达。图1a:在肺癌细胞H460中,转染了miR-370-3p的细胞与对照组相比,MCM2蛋白水平显著下降。MCM2小干扰RNA(siMCM2)作为阳性对照;图1b:在肺癌细胞A549中,转染了miR-370-3p的细胞与对照组相比,MCM2蛋白水平显著下降。siMCM2作为阳性对照;图1c:在肺癌细胞H1299中,转染了miR-370-3p的细胞与对照组相比,MCM2蛋白水平显著下降。siMCM2作为阳性对照。图1注释:untreated:空白对照组;Ctrl.RNA:negative control阴性对照RNA组;miR-370-3p:化学合成物miR-370-3p;miR-495-3p:化学合成物miR-495-3p;siMCM2:化学合成的MCM2小干扰RNA。
图2:miR-370-3p抑制肺癌细胞H1299的DNA复制。图2a:在S期的H1299细胞中,转染了miR-370-3p的细胞与对照组细胞相比,EdU阳性标记的细胞百分比明显减少;图2b:三次独立重复试验的均值的统计图。图2注释:Ctrl.RNA:negative control RNA阴性对照RNA组;miR-370-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-370-3p;miR-495-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-495-3p;siMCM2:化学合成的MCM2小干扰RNA;DIPI:细胞核染色剂;EdU:胸腺嘧啶核苷类似物;Merge:DIPI、EdU图像合并技术。
图3:miR-370-3p降低肺癌细胞的迁移能力。图3a:与对照组和未转染细胞相比,转染了miR-370-3p的细胞明显愈合减慢;图3b:不同时刻两次细胞划痕宽度的差值占初始(0h)伤痕宽度的百分比,即为迁移能力。该图为三次独立重复试验的均值统计。图3注释:UN:untreated空白对照组;NC/Ctrl.RNA:negative control阴性对照RNA组;miR-370-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-370-3p;miR-495-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-495-3p;siMCM2:化学合成的MCM2小干扰RNA。
图4:miR-370-3p可以抑制肺癌细胞A549的细胞增殖。图4a:与对照组相比,转染了miR-370-3p的细胞增殖能力降低;图4b:肺癌细胞计数分析,转染了miR-370-3p的肺癌细胞数量较低。图4注释:UN:untreated空白对照组;MIR-370-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-370-3p;MIR-495-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-495-3p;siMCM2:化学合成的MCM2小干扰RNA。
图5:WST-1实验结果显示miR-370-3p可抑制肺癌细胞A549的细胞增殖能力。图5注释:注释:UN:untreated空白对照组;mIR-370-3p:化学合成的模拟生物体内源的miR-370-3p。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究发现:肺癌患者的肿瘤组织中微小RNA miR-370-3p会影响微小染色体维持蛋白(MCM)的家族成员MCM2的表达。MCM2高表达于人类多种肿瘤细胞中,可作为肿瘤细胞的靶标,用以检测活性物质对肿瘤细胞的抑制作用。miR-370-3p使得MCM2在肺癌细胞A495、H1299、H460的表达显著下调,从而证实miR-370-3p能靶向作用于肺癌细胞。发明人在此基础上进行进一步的研究发现:miR-370-3p可在体外有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长,从而发挥抗肿瘤的作用。由此,发明人发现了miR-370-3p在抗肿瘤中的新用途,从而在此基础上完成了本发明。
如本文所用,“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”;“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用,“分离的”或“分离纯化的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
本发明提到的特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
miR-370-3p及其前体
如本文所用,术语“miR-370-3p”或“MIR-370-3p”或“微小RNA miR-370-3p”可互换使用,是指包含序列gccugcugggguggaaccuggu或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-370-3p,例如人、大鼠、小鼠、羊、猴等,这些同源序列均包含在本发明的术语“miR-370-3p”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-370-3p序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸,或经过生物学化学修饰,且仍然具有抗肿瘤活性的衍生RNA。
如本文所用,术语“miR-370-3p前体”是指在被施予对象的细胞内或体内可被加工成为miR-370-3p的miRNA前体。本领域普通技术人员知晓获得天然存在的miR-370-3p前体的方法和手段,也可基于分子和遗传学理论和手段构建所述前体,例如【Doghman M等,Regulation of Insulin-like Growth Factor-Mammalian Target of RapamycinSignaling by MicroRNA in Childhood Adrenocortical Tumors.CancerResearch.2010,70:4666-4675】。
本领域中已知miR-370-3p编码基因的初始转录产物经过一系列的加工成熟之后,形成成熟的miR-370-3p。miR-370-3p前体只有在加工成成熟的miR-370-3p后才具有相应的生物学功能,因此,本领域普通技术人员可合理预期利用miR-370-3p的成熟序列及能够产生或加工成为miR-370-3p的各种其它形式的核酸物质(即本发明所述的“miR-370-3p前体”)均可获得本发明所需获得的效果,即起到抗肿瘤的效果,从而均可用于制备治疗或预防肿瘤的组合物。
本发明还包括一种载体,它含有携带所述miRNA或其前体的构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的构建物或表达载体。这些方法包括但不限于:基因重组技术、体外合成技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
组合物
本发明还提供了一种组合物(尤其是药物组合物或疫苗组合物),所述的组合物可用于预防和/或治疗肿瘤、及由其引起的相关症状和疾病。所述组合物含有有效量的本发明的miR-370-3p以及药学上或免疫学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
所述“药学上/免疫学上可接受的载体”指用于治疗剂或疫苗给药的载体,包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。该术语指这样一些药剂或疫苗载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物/疫苗制剂应与给药方式相匹配,例如,本发明的组合物可以用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备,以制得针剂形式。所述组合物宜在无菌条件下制造。本发明的制剂还可制成缓释制剂。
本发明的miR-370-3p的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:miR-370-3p的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
当本发明的miR-370-3p或其前体以适当剂量给予对象时可获得令人满意的效果。例如,当本发明的miR-370-3p或其前体,每天以约2.5-25nmol/20g(优选的为10-20nmol/20g)动物(如小鼠)体重的剂量给予动物时,可获得令人满意的抗肿瘤效果。
给药方式
本发明的组合物,可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。
给药途径可采用例如(但不限于):(1)直接裸RNA注射法;(2)脂质体包裹RNA直接注射法;(3)金包被RNA基因枪轰击法;(4)蛋白或多肽包裹RNA直接注射法、(5)细菌携带质粒表达RNA法;(6)病毒表达RNA法;(7)电打孔法,等等。
此外,本发明的组合物中还可含有用于改善和/或治疗肿瘤的其它活性物质,所述的其它活性物质选自下组(包括但不限于):临床常用抗肿瘤药物(包括但不限于):化疗剂或放疗剂,优选烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、或免疫制剂,更优选细胞有丝分裂抑制剂、喜树碱、高三尖杉酯碱、丙卡巴肼、门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、米托蒽醌、他莫昔芬、环磷酰胺、盐酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、优氟啶、卡莫氟、巯嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、巯鸟嘌呤、六甲蜜胺、羟基脲、丝裂霉素、阿霉素、表柔比星、博莱霉素、培莱霉素、阿伐司汀、赫赛汀、格列卫、吉西他滨、托泊替康和/或亮丙瑞林。
本发明的miR-370-3p还可以与其它药物和治疗手段(例如手术疗法)联合,用于肿瘤的预防和治疗。
本发明的优点
本发明的优点主要在于:(a)本发明揭示了miR-370-3p在预防和/或治疗肺癌中的新用途,为miR-370-3p乃至miRNA的研究和开发利用提供了新的思路和途径;(b)本发明的miR-370-3p或其前体可有效用于抗肺癌,从而为本领域提供了一种新颖的肺癌发生诊断剂和/或治疗剂,具有一定的临床应用前景。
实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆:实验室指南》(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和分数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1:miR-370-3p降低肺癌细胞系中的MCM2的表达。转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到密度为30~40%肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。转染4-6小时后,更换培养基。第一次转染完16-18小时后,进行第二次转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。第二次转染完4-6小时后,更换培养基。第二次转染完48小时收获细胞,进行Western blot实验,检测肺癌细胞靶蛋白MCM2的表达。实验结果显示,miR-370-3p降低肺癌细胞系中的MCM2的表达,如图1。
实施例2:miR-370-3p抑制肺癌细胞H1299的DNA复制。miR-370-3p降低肺癌细胞系中的MCM2的表达。转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到密度为30~40%肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。转染4-6小时后,更换培养基。第一次转染完16-18小时后,进行第二次转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。第二次转染完4-6小时后,更换培养基。第二次转染完24小时的细胞铺到6孔板(10^5/孔)、48孔板(5000/孔)。第二次转染完48小时后加0.5mM含羞草碱(mimosine)于48孔板、6孔板。20小时后,细胞阻滞在G1/S期,更换培养基,3.5小时后加EdU于培养基,孵育0.5小时。通过荧光染色实验,检测EdU标记细胞的百分比。实验结果表明,miR-370-3p抑制肺癌细胞H1299的DNA复制,如图2。
实施例3:miR-370-3p降低肺癌细胞的迁移能力。miR-370-3p抑制肺癌细胞H1299的DNA复制。miR-370-3p降低肺癌细胞系中的MCM2的表达。转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到密度为30~40%肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。转染4-6小时后,更换培养基。第一次转染完16-18小时后,进行第二次转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。第二次转染完4-6小时后,更换培养基。第二次转染完24小时的细胞铺到24孔板(3*10^5)。用黄色枪头在孔中央做划痕,分别于划痕完0小时和24小时拍照(10倍显微镜),观察划痕两侧细胞愈合情况。实验结果表明miR-370-3p降低肺癌细胞的迁移能力,如图3。
实施例4:miR-370-3p可以抑制肺癌细胞A549的细胞增殖。miR-370-3p降低肺癌细胞的迁移能力。miR-370-3p抑制肺癌细胞H1299的DNA复制。miR-370-3p降低肺癌细胞系中的MCM2的表达。转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到密度为30~40%肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。转染4-6小时后,更换培养基。第一次转染完16-18小时后,进行第二次转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。第二次转染完4-6小时后,更换培养基。第二次转染完24小时的细胞铺到12孔板(10^4孔)。于10倍显微镜下拍照,观察细胞的形态后计数。实验结果表明,miR-370-3p可以抑制肺癌细胞A549的细胞增殖能力。
实施例5:WST-1实验结果显示miR-370-3p可抑制肺癌细胞A549的细胞增殖能力。miR-370-3p可以抑制肺癌细胞A549的细胞增殖。miR-370-3p降低肺癌细胞的迁移能力。miR-370-3p抑制肺癌细胞H1299的DNA复制。miR-370-3p降低肺癌细胞系中的MCM2的表达。转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到密度为30~40%肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。转染4-6小时后,更换培养基。第一次转染完16-18小时后,进行第二次转染终浓度为60nM的miR-370-3p(Ribobio公司)在RNAimax(Inviitrogen公司)到肺癌细胞系(H1299、H460、A549)中。第二次转染完4-6小时后,更换培养基。第二次转染完24小时的细胞铺到96孔板(1000/孔)。做WST-1实验,检测细胞增值能力。实验结果表明,miR-370-3p可抑制肺癌细胞A549的细胞增殖能力,见图5。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.微小RNA miR-370-3p或其前体在制备预防或治疗肺癌及其他癌症的组合物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-370-3p的序列为gccugcugggguggaaccuggu。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-370-3p的前体在对象体内经加工转化为miR-370-3p。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-370-3p或其前体来自:人、大鼠、小鼠、羊、猴、犬、马、牛或兔,也可以来自化学或生物合成。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的肺癌选自:非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
6.如权利要求5所述的非小细胞肺癌,其特征在于,所述非小细胞肺癌包括肺腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌。
7.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的其他癌症选自:肝癌、胃癌、皮肤癌、食管癌、直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤。
8.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述组合物是药物组合物或疫苗组合物。
9.一种组合物,所述组合物包含:(a)有效量的微小RNA miR-370-3p或其前体;和(b)药学上或免疫学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的组合物,其特征在于,所述组合物还包括治疗或预防肿瘤的其他活性成分。
11.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述治疗或预防肿瘤的其他活性成分包括:化疗剂或放疗剂。
12.如权利要求9所述的组合物,其特征在于,所述组合物的形式适用于:直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、蛋白或多肽包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因枪轰击法、细菌携带质粒表达RNA法或病毒表达RNA法。
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