CN108088781B - 一种用于细胞计数仪的试剂组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于自动化细胞计数仪的试剂组合，包含等渗液、台盼蓝、清洗液及消毒剂。所述等渗液为氯化钠和防腐剂组合，清洗液为等渗液和表面活性剂组合，消毒剂为异丙醇。本发明提供了一种新的试剂组合，与现有自动化细胞计数仪所使用的试剂组合相比成本低，作用效果近似。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于细胞计数仪的试剂组合。
背景技术
在哺乳动物细胞大规模培养中，细胞计数是一项重要而基础的工作，它是监控工艺过程的关键参数。传统的细胞计数是基于血细胞计数板由人工完成的，这项工作繁琐、耗时并且缺乏稳定性。近年来，计数仪越来越多地应用于细胞计数。
常见的血细胞计数仪分为半自动和全自动两种。半自动计数仪通常由人工将稀释并混匀了台盼蓝的样品注入特制的血细胞计数板中，然后用仪器分析。这种计数仪的代表有ThermoFisher公司的Countess® II FL细胞计数仪。由于稀释和混匀是由人工完成的，半自动计数仪增加了人工操作引起的误差。全自动计数仪只需将一定体积的细胞悬液注入样品杯中，后续的与台盼蓝混匀及分析均由计数仪完成，而且可实现批处理。这种计数仪的代表有Beckman Coulter公司的Vi-Cell XR计数仪和罗氏Cedex计数仪。
专利WO2012021458专利名称为：等渗缓冲组合物与能够细胞计数的方法，该专利公开了多功能计量流体/洗涤试剂，用于采用液体体积计量的自动细胞分析仪中。组合物包括螯合剂、离子化盐、可选的稳定离子、缓冲剂、非溶血性表面活性剂、以及可选的抗菌剂。还描述了组合物的使用方法，该专利的权利人为Beckman Coulter公司。
现有市售的用于自动化细胞计数仪的试剂组合物价格约为6000元，可测定240个样品，单个样品的成本约为25元，对于大规模蛋白质生产的企业来说，需要检测的环节及样品数量大，因此，用于此项检测的费用成本过于昂贵。
全自动计数仪虽然尽可能避免了人工误差并实现样品稳定检测，然而昂贵的试剂组合物阻止了它的应用。为此，我们开发了能够用于全自动计数仪的试剂组合物。
发明内容
本发明公开了一种用于自动化细胞计数仪检测的试剂组合，本发明所述的试剂组合物适用于Beckman Coulter公司的Vi-Cell XR计数仪。
本发明公开了一种用于自动化细胞计数仪的试剂组合，包含等渗液、台盼蓝、清洗液及消毒剂，其特征在于，所述等渗液为0.9%的氯化钠和0.001%至1%的防腐剂，清洗液为等渗液和0.01%至5%的表面活性剂，消毒剂为30%至90%异丙醇。
如上所述的用于自动化细胞计数仪的试剂组合，其特征在于，所述等渗液中的防腐剂为硫柳汞钠、苯甲酸钠、叠氮钠。
如上所述的用于自动化细胞计数仪的试剂组合，其特征在于，所述等渗液为0.9%的氯化钠和0.02%的硫柳汞钠。
如上所述的用于自动化细胞计数仪的试剂组合，其特征在于，所述清洗液中的表面活性剂为Tween20、Tween80、聚乙二醇。
如上所述的用于自动化细胞计数仪的试剂组合，其特征在于，所述清洗液为等渗液和0.05%的Tween20。
如上所述的用于自动化细胞计数仪的试剂组合，其特征在于，所述消毒剂为70%异丙醇。
本发明所提供的试剂组合物的各物品用量及价格（1个试剂组合物用量）：440mg台盼蓝6元，4950mg氯化钠1元，154mg异丙醇6元，110mg硫柳汞钠1元，1100mgTween1元，1个杯式滤器75元，总计90元。
由此可计算出，一个试剂组合物的成本为90元，可测定约240个样品，测定一个样品需要约0.4元。而一个进口试剂组合物的价格约为6000元，可测定240个样品，单个样品的成本约为25元。使用试剂组合物的成本为使用进口试剂组合物的1.6%。
本发明提供了适用于Vi-Cell自动细胞计数仪的进口替代试剂组合物，解决了台盼蓝沉淀、试剂防腐及仪器清洁维护的难题。与原厂家提供的试剂组合物成分不同（WO2012021458），本发明所提供的用于Vi-Cell自动细胞计数仪的试剂组合物均是本技术领域常用的试剂，且成本低。
细胞计数仪常替代人工用于哺乳动物细胞培养的细胞计数，然而昂贵的试剂组合物阻止了计数仪的普遍应用。本发明所公开的试剂组合物，在使用试剂组合物时，活细胞密度和活率的相对误差与使用进口试剂时无显著差异，且使用试剂组合物的成本为使用进口试剂组合物的1.6%。
附图说明
图1、自动化计数仪工作流程图
图2、进口试剂组合运行500个样品后的流通池图像
图3、试剂组合运行500个样品后的流通池图像。
具体实施方式
实施例1：溶液的配制
自制溶液包括等渗液、台盼蓝、清洗液和消毒剂。等渗液为0.9%氯化钠溶液，并添加0.02%硫柳汞钠。
缓冲液配制的具体操作如下：称取18g氯化钠至注射用水中，并加入400mg硫柳汞钠，溶解后定容至2.0升，并于室温下避光保存。
台盼蓝和清洗液均配制于等渗液中：台盼蓝浓度为0.3%，在等渗液中溶解1小时，之后用0.22μm杯式滤器过滤，取滤过液于室温避光保存。清洗液是在等渗溶液中添加0.05%（v/v）Tween20，混匀后于室温避光保存。
消毒剂为70%（v/v）异丙醇，混匀后室温保存。
计数仪运行参数设置：细胞悬液混匀次数1次；台盼蓝与细胞悬液混匀1次；其余参数设置均采用仪器默认设置的CHO细胞分析参数。
实施例2、计数仪工作流程
计数仪自动吸取细胞悬液，与台盼蓝混匀、注入流通池并自动分析并获取活细胞数和活率，其工作流程如图1所示。在计数仪的工作流程中，先后使用了四种试剂：台盼蓝、清洗液、消毒剂和缓冲液。台盼蓝是一种染料，用于区分死细胞和活细胞；清洗液用于管路、流通池等的清洗，主要用于清除系统中细胞和杂质；消毒剂用于杀灭系统中的微生物；缓冲液提供等渗环境。本研究旨在开发适用于计数仪的台盼蓝、清洗液、消毒剂和缓冲液。
实施例3、台盼蓝溶液沉淀的去除
台盼蓝是一种常用的细胞计数染料，常用于台盼蓝染料排除法计算活率。常规使用的0.4%台盼蓝溶液配制于磷酸缓冲盐（PBS）中，然而台盼蓝配制时有大量沉淀，这些沉淀过滤时常常堵塞过滤器。而且，过滤后的台盼蓝在室温时放置时常常有沉淀析出，沉淀往往随着时间而增多，这些沉淀造成计数困难并且使得计数室清洗困难。
本发明中使用注射用水代替纯化水用于台盼蓝配制，使用0.9%氯化钠溶液作为等渗溶液替代PBS，溶液中加入硫柳汞钠以抑制细菌生长。实验证实，新配的台盼蓝在室温下完全溶解，过滤时无滤器堵塞，而且过滤后溶液在室温下放置一个月无沉淀生成。
实验例1、两种试剂组合物对计数结果的影响：
计数仪的清洗液主要成分有缓冲液、防腐剂、表面活性剂，为了清除细胞悬液中的蛋白，蛋白酶也可加入到清洗液中。硫汞柳酸钠是一种含汞的有机化合物，长期以来一直被广泛用生物制品及药物制剂的防腐剂和皮肤粘膜消毒剂，在本研究中用于抑制细菌和作霉菌生长。Tween 20是一种非离子型表面活性剂，常用于ELISA和Westen blot的清洗液，在本研究中用于清洗液。
试剂组合物包含台盼蓝、清洗液、消毒剂和等渗液用于替代进口试剂组合物中的相应试剂。试剂和进口试剂对活细胞密度及活率的影响见表1 ，VCD：活细胞密度，每个样品运行3次，结果显示为平均值±相对误差。
新更换试剂组合物时，试剂组合物在低细胞密度和高细胞密度时的活细胞计数误差均在5.00%以内，高、低活率时的活率误差均在1.0%以内，使用试剂对活细胞密度和活率的相对误差无显著影响。使用试剂测试500个样品以后，高、低密度时的活细胞密度的相对误差与使用进口试剂无显著差异，高、低活率时活率的相对误差与使用进口试剂时无显著差异。
由此可见，使用试剂组合物代替进口试剂组合物对计数结果无显著影响。
表1 不同试剂组合物对计数结果影响
实验例2、长期使用的效果评价
通过观察试剂通过的八通阀及用于计数的流通池来评价试剂对仪器正常使用的影响。使用试剂组合物运行500个样品后，八通阀管道中无可见沉淀及污物；流通池图像见图2进口试剂组合运行500个样品后的流通池图像，及图3本发明试剂组合运行500个样品后的流通池图像，其中无可见沉淀及污物，且使用试剂组合物运行500个样品时的流通池与使用进口试剂时无显著差异。
Claims (1)
1.一种用于自动化细胞计数仪的试剂组合，包含等渗液、台盼蓝、清洗液及消毒剂，其特征在于，所述等渗液为0.9％的氯化钠和0.02％的硫柳汞钠，台盼蓝浓度为0.3％，清洗液为等渗液和体积比为0.05％的Tween20，消毒剂为体积比70％的异丙醇。
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