CN108085399A

CN108085399A - lncRNA及其反式调控基因WNT11的新用途

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Publication number: CN108085399A
Application number: CN201711461872.8A
Authority: CN
Inventors: 苗向阳; 黄万龙; 李嫒; 解领丽; 张秀秀
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108085399B

Abstract

本发明涉及lncRNA及其反式调控基因WNT11的新用途。发明利用高通量测序技术比较分析大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织基因表达谱，筛选出与成脂分化及脂代谢相关的关键差异表达lncRNA，进一步分析显示该lncRNA调控基因Wnt信号通路家族成员WNT11的表达。本发明对调控猪肌内脂肪沉积的mRNA和lncRNA进行了全面分析，为培育高肉品质猪品种及预防和治疗脂代谢相关疾病研究提供了一定依据。

Description

lncRNA及其反式调控基因WNT11的新用途

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及表达下调的lncRNA及其反式调控基因WNT11的新用途，更具体地涉及lncRNA及其反式调控基因WNT11在选育高品质家畜中应用。

背景技术

lncRNA是一类长度大于200个nt的RNA，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)参与蛋白编码基因调控，包括细胞增殖分化、个体发育、信号转导、干细胞维持、代谢等重要生命活动中发挥关键的调控作用，与多种重大疾病的发生密切相关，参与基因组印记、X染色体沉默以及染色质修饰、核内运输、转录干扰、转录激活。lncRNA对靶基因的调控主要包括对临近自身蛋白编码基因的顺式作用调控(cis-regulation)和对距离较远蛋白编码基因的反式作用调控(trans-regulation)。

Wnt信号通路是一条在进化上保守的信号途径，在控制胚胎发育，调节细胞生长、迁移、分化，调控正常组织重建等生命活动中发挥重要的作用，其异常活化与众多人类肿瘤的发生、发展密切相关。WNT家族成员包括WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16共19位成员，其中对WNT11已有研究表现其与肺癌、食管癌、黑色素瘤、宫颈鳞癌相关，但是其与猪肌内脂肪的关系未见报道。

本研究选取莱芜猪和大白猪为实验材料，利用高通量测序技术比较分析大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织基因表达谱，筛选出与成脂分化及脂代谢相关的关键差异表达lncRNA，进一步分析显示该lncRNA调控基因Wnt信号通路家族成员WNT11的表达。本发明对调控猪肌内脂肪沉积的mRNA和lncRNA进行了全面分析，为培育高肉品质猪品种及预防和治疗脂代谢相关疾病研究提供了一定依据。

发明内容

本发明的目的在于提供XLOC_064336靶基因及其表达产物在预测或辅助预测家畜肌肉品质中的应用，所述XLOC_064336靶基因为WNT家族基因。

WNT家族基因成员包括WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16。

优选的，WNT家族基因为WNT11基因。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序方法筛选到候选基因XLOC_064336，进一步通过分子细胞生物学方法验证了XLOC_064336及其靶基因WNT11与猪肌内脂肪密切关系，可用于预测或辅助预测猪肉品质，在畜牧业育种中具有重要的意义。

本发明的目的在于提供XLOC_064336靶基因及其表达产物在选育具有不同家畜肌肉品质种猪中的应用，所述XLOC_064336靶基因为WNT家族基因。

优选的，WNT家族基因为WNT11基因。

进一步，通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测WNT11基因的表达水平。

优选的，核酸扩增技术采用一对特异性引物扩增WNT11基因；核酸杂交包括与WNT11基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，通过免疫方法检测WNT11基因表达产物的表达水平。

优选的，通过ELISA检测试剂盒和/或胶体金检测试剂盒检测WNT11基因表达产物的表达水平。

优选的，家畜为猪。

一种检测肌内脂肪的试剂盒，试剂盒包含用于核酸扩增的引物对，序列为SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对。

本发明的目的在于提供一种lncRNA，所述lncRNA为XLOC_064336，与猪肌内脂肪相关，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

优选的，XLOC_064336序列与SEQ ID NO.1具有95％以上序列同源性；更优选的，长链非编码RNA序列为SEQ ID NO.1。

更优选的，所述lncRNA来源为猪。

本发明的目的在于提供一种检测肌内脂肪的试剂，试剂通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测XLOC_064336的表达水平。

优选的，通过高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测XLOC_064336的表达水平。

更优选的，核酸扩增检测XLOC_064336的表达水平的试剂含有一对特异性扩增XLOC_064336的引物；核酸杂交检测XLOC_064336的表达水平的试剂包括与XLOC_064336的核酸序列杂交的探针。

进一步，核酸扩增检测XLOC_064336的表达水平的试剂包含一对用于核酸扩增的引物，序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

进一步，上述检测肌内脂肪的试剂检测的样本为猪。

进一步，上述检测肌内脂肪的试剂检测的样本为组织，优选为肌内脂肪组织。

本发明的目的在于提供下述任意一项应用：

上述lncRNA在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述lncRNA在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述lncRNA在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

上述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对XLOC_064336的任何特定变体的基因表达进行定量。在一些实施方案中，其具有与XLOC_064336序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个蛋白质或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。蛋白质和DNA的同源性常常通过它们序列的相似性来判定，相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列；当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导的引物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部核苷酸中通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

附图说明

图1为肌内脂肪差异表达基因分布图；

图2为差异表达基因qRT-PCR验证结果图；

图3为WNT11基因的qRT-PCR验证结果图；

图4为XLOC_064336的qRT-PCR验证结果图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 样品采集制备及实验设计

实验猪屠宰之后，迅速采集其背最长肌肌内脂肪组织，剪成小块，装填入5mL冻存管中，投入液氮冷冻，之后转移到-80℃冰箱长期保存，用于总RNA的提取，实验设置3组，分别对大白猪肌内脂肪组织(D_JN)与莱芜猪肌内脂肪组织(L_JN)中的lncRNA进行鉴定，及分析他们肌内脂肪组织基因表达谱，每个样本设置3个重复。

实施例2 样品总RNA的提取及质控

分别取出等量低温保存的脂肪组织样品，按照使用说明书，使用mirVana^TM RNA抽提试剂盒提取每个脂肪组织样本的总RNA，分离的总RNA样品保存在-80℃冰箱。应用NanoDrop 2000分光光度计测定RNA样品的浓度以及OD260nm/OD280nm值，并且控制在1.9～2.1之间，应用Bioanalyzer 2100评估总RNA的质量，并控制RIN>＝7且28S/18S>＝0.7，利用RNase-free DNaseⅠ消除潜在的基因组DNA污染。

实施例3 cDNA文库构建和RNA测序

链特异性cDNA文库

(1)Ribo-zero kit去除rRNA

(2)RNA片段化

(3)双链cDNA合成及纯化

(4)末端修复，加入A碱基

(5)测序接头连接

(6)DNA片段富集纯化

(7)文库质检

(8)本研究共建立6个cDNA文库，分别为D_JN_1、D_JN_2、D_JN_3(大白猪肌内脂肪组织cDNA文库)以及L_JN_1、L_JN_2、L_JN_3(莱芜猪肌内脂肪组织cDNA文库)。

RNA-Seq(Illumina Sequence)

文库质检合格之后，应用Illumina HiSeqTM 2500测序平台，采用双端测序(Paired-end Sequence)，对cDNA文库进行测序分析，下机数据为原始测序数据raw reads。

实施例4 原始数据质控及过滤

原始测序数据(raw reads)，存在低质量和被污染的序列，必须经过质量控制和过滤，才能进行后续的生物信息学分析过程，保证结果的准确性和可靠性。主要应用cutadapt(v1.12)和FASTX_toolkit(v0.0.14)软件对raw reads进行质量控制，后续的分析均基于得到clean reads。具体操作如下：

(1)去除带有接头(adapter)序列污染的reads；

(2)过滤掉序列中无法确定碱基(N)比例大于10％的reads；

(3)去除质量值Q<20的碱基占序列总碱基数大于15％的低质量reads；

结果见表格1，通过质控，每个样本中均得到约90百万条的clean reads，且reads中Q-score≥30碱基比例均约在95％，同时GC碱基含量均约占50％，表明测序数据结果可靠，质控之后可用于进一步分析。

表1 原始数据质量控制结果

实施例5 参考基因组比对与转录本拼接

将clean reads比对到参考基因组，对reads进行定位。首先从Ensembl数据库下载猪的参考基因组Sscrofa10.2(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/fasta/sus_scrofa/dna/)以及注释文件Sscrofa10.2.87.chr.gtf(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/gtf/sus_scrofa)。然后运用bowtie软件(v2.2.5)(Langmead&Salzberg,2012)bowtie-build建立参考基因组索引，运用TopHat(v2.0.12)(Trapnell et al.,2009；Kimet al.,2013)软件将每个样本得到的clean reads比对到参考基因组上，mismatch限制为2，其它选用默认参数。

为了预测新的转录本，需要对转录本进行重建和组装。以TopHat2软件将cleanreads比对到基因组之后得到的序列比对文件accepted_hit.bam(the resultingalignment files)为输入，利用Cufflinks(v2.1.1)(Trapnell et al.,2012；Trapnell etal.,2010)软件对每一个样本进行转录本组装，得到transcript.gtf注释文件。利用Cuffmerge将12个样本的gtf文件组装，合并生成merged_transcript.gtf注释文件。利用Cuffcompare将merged_transcript.gtf与参考注释文件Sscrofa10.2.87.chr.gtf进行逐一比对，筛选与其他已知的ncRNA、mRNA等完全匹配或相似的转录本，同时明确定位转录本的位置信息，鉴定预测潜在的新mRNA和lncRNA。

结果：利用生物信息学软件将Clean reads比对到猪的参考基因组，结果如表2所示。

表2 Clean reads比对参考基因组结果

实施例6 可变剪接事件分析

利用ASprofile(v1.0)(Florea et al.,2013)软件分析每个样本的组装文件，对可变剪切事件进行分类统计。根据外显子的结构及内含子滞留情况，将可变剪切事件(alternative splicing,AS)定义成12个不同的类别，包括TSS、TTS、SKIP、XSKIP、MSKIP、XMSKIP、IR、XIR、MIR、XMIR、AE、XAE。

实施例7 潜在lncRNA挖掘鉴定

LncRNA是一类长度大于200bp，不编码蛋白质的RNA，基于这两个主要的特征，对潜在的lncRNA进行鉴定，主要筛选基因间lncRNA(intergenic lncRNA,lincRNA)、内含子间lncRNA(intronic lncRNA)、正义lncRNA(sense lncRNA)和反义lncRNA(antisenselncRNA)。具体操作如下：

(1)外显子个数和转录本长度筛选：阈值为exon个数≥2，length>200bp，过滤掉低可信度的单外显子转录本。

(2)编码潜能筛选：对于以上筛选到的转录本，利用PLEK(Li et al.,2014)、CNCI(Sun et al.,2013b)、CPC(Kong et al.,2007)、Pfam(Finn et al.,2014)这四种软件预测其蛋白编码潜能，取交集得到lncRNA的最终结果。PLEK是基于优化k-mer策略，阈值score<0，CNCI基于序列相邻核苷酸三联体频谱，阈值score<0，CPC基于转录本开放阅读框序列特征，并与UniProt参考数据库BLASTX比对，阈值score<0，Pfam是一个蛋白家族数据库，将转录本编码框同源比对到数据库，比对不到的转录本为lncRNA。

(3)已知lncRNA的鉴定，ALDB(A Domestic-Animal Long Noncoding RNADatabase)(Li et al.,2015a)是一个家畜动物lncRNA数据库，通过BLASTN工具将候选lncRNA与数据库中的lncRNA比对，以Identity＝100％，mismatch＝0，E-value<1e-10，gap_opening＝0为条件严格鉴定已知lncRNA。

主要对lncRNA的分类，长度分布及外显子个数进行分析，同时与鉴定得到的已知mRNA进行比较分析。lncRNA和编码蛋白基因的长度总体上分布趋势比较一致，较短mRNA转录本密度相对高于lncRNA，本研究中鉴定到的lncRNA平均长度为2263nt，mRNA平均长度为2028nt。

实施例8 不同样品间基因差异表达分析

构建已知mRNA、预测新转录本和lncRNA数据集，利用bowtie和eXpress软件比对统计分析各转录本在每个样本中的表达丰度(read count)。应用每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目(fragments Per kb per Million reads,FPKM)算法对基因的表达水平进行校正，消除因测序深度、基因长度不同及样本差异对基因表达量的影响。实验具有生物学重复，应用R语言包DESeq2(Anders&Huber,2010)，基于负二项分布，对不同样品间基因(包括lncRNA，mRNA)进行差异表达分析，Benjamini-Hochberg算法用于对P值进行多重假设检验校正，得到校正P值(padj)，以|log₂FoldChange|≥1(L_JN vs D_JN)且padj≤0.05为条件筛选差异表达基因。

基于转录本表达量FPKM值，通过构建FPKM值箱线图和密度图，在整体上对不同脂肪组织样本中的转录本表达量进行分析。组内两品种猪肌内脂肪组织的转录本的表达量分布比较一致，组间大白猪脂肪组织中转录本相比于莱芜猪，低表达量转录本较多。样本间转录本表达量分析，可以看出实验数据整体上符合要求。同时对鉴定得到的lncRNA和mRNA的表达量进行分析，发现mRNA具有相对高的表达水平，lncRNA的表达量较低，FPKM值主要集中在(0-10]之间，FPKM值在(0-100]之间的mRNA呈现出均匀分布。

通过对肌内脂肪组织((L_JN vs D_JN)基因进行差异表达分析(图1)，共鉴定得到56个差异表达lncRNAs(34个上调，22个下调)，715个差异表达mRNAs(371个上调，344个下调)，其中具有4倍以上差异的基因约占48.4％。其中以WNT11为代表的差异表达基因和以XLOC_064336为代表的差异表达长链非编码RNA纳入我们的研究对象。

实施例9 差异表达基因GO及KEGG Pathway富集分析

基因本体论(Gene Ontology,GO,http://www.geneontology.org/)是基因功能国际分类标准，由分子功能(molecular function)、生物学过程(biological process)和细胞组分(cellular component)组成。通路富集分析能确定差异表达基因参与的主要代谢途径和信号通路，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,http://www.genome.jp/kegg)数据库(Kanehisa et al.,2008)作为相关的主要公共数据库，是进行代谢分析、调控网络研究的主要工具。为了进一步研究差异表达基因的主要生物学功能，本实验应用CluGO(Bindea et al.,2009)软件，基于超几何分布检验计算差异表达基因显著富集的GO条目和信号通路，Benjamini-Hochberg算法校正得到的P值(Q_value)，当Q_value≤0.05时，则富集显著。

大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织中共鉴定出513个数据库已注释的差异表达基因，分别有210、144、62个基因富集到生物学过程、分子功能和细胞组分的一个或多个条目，其中大量与脂质代谢和沉积密切相关的GO条目显著富集。依据生物过程，较多的基因(≥15)富集到脂质生物合成过程(lipid biosynthetic process)、脂质代谢过程(lipidmetabolic process)、细胞脂质代谢过程(cellular lipid metabolic process)、脂质应答反应(response to lipid)、MAPK级联反应(MAPK cascade)、MAPK级联反应正调控(positive regulation of MAPK cascade)及MAPK级联反应调控(regulation of MAPKcascade)。对于分子功能部分，仅显著富集于酶抑制剂活性(enzyme inhibitor activity)条目。在细胞组分，显著富集于细胞外基质(extracellular matrix)、轴突(axon)等相关GO条目中。大白猪和莱芜猪肌内脂肪沉积存在显著差异，通过GO注释发现，差异表达基因显著富集于与脂质代谢和细胞分化的生物过程，表明二者肌内脂肪沉积、代谢的分子机制存在差异，受到不同基因调控。

实施例10 差异表达基因蛋白-蛋白互作网络分析

蛋白互作研究可以从分子水平揭示蛋白质的功能。因此，基于STRING(http://string-db.org/)蛋白质互作数据库中的互作关系，对差异表达基因进行蛋白互作网络分析，以更进一步探究大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织差异表达基因编码蛋白间复杂的相互作用关系。STRING数据库中包含物种猪(Sus scrofa)，直接从数据库中提取出差异基因集列表的互作关系，利用Cytoscape软件对得到的差异基因编码蛋白互作网络数据文件进行可视化分析。蛋白互作网络图中，节点(Node)为蛋白质，边缘(Edge)为蛋白之间的相互作用关系，度(Degree)代表与特定节点相互作用的蛋白质数量，节点大小与此节点的度成正比，节点的颜色表示差异表达基因的log2FoldChange值。

实施例11 差异表达lncRNA的靶基因预测

lncRNA作为一种非编码RNA，其功能主要体现在对靶基因的调控上，主要包括对距离较远蛋白编码基因的反式作用调控(trans-regulation)，同时，具有相同表达模式的基因，在功能上具有强的相关性。因此通过对lncRNA与mRNA共表达、trans分析研究lncRNA的靶基因。

通过计算差异表达lncRNA和mRNA表达量的皮尔森相关系数(Pearsoncorrelation coefficient，PCC)，分析lncRNA和mRNA的共表达关系，以|PCC|>0.8且P_value<0.05为阈值筛选共表达的lncRNA-mRNA。

lncRNA trans作用靶基因分析，通过lncRNA和mRNA序列间的相互作用关系，对差异表达lncRNA的trans作用靶基因进行预测，RNAplex(Tafer et al.,2011)软件用于计算lncRNA和mRNA序列之间的结合自由能(Energy)，结合共表达结果，以Energy<-20且|PCC|≥0.9鉴定lncRNA trans作用靶基因。

通过分析寻找到XLOC_064336与脂肪代谢相关trans作用靶基因WNT11，相对于大白猪二者在莱芜猪肌内脂肪含量均较低。

实施例12 差异表达lncRNA的荧光定量PCR验证

本研究随机选取在L_JN(莱芜猪肌内组织)vs D_JN(大白猪肌内组织)9个差异表达基因(lncRNA 4个，mRNA 5个)，每个基因设置3个生物学重复，以猪肌动蛋白β(actinbeta,ACTB)基因为内参，应用qRT-PCR方法验证基因的表达水平。应用 PCRSystem 9700(Applied Biosystems,USA)，取约0.5μg的RNA样品反转录合成cDNA模板。利用 Green PCR Kit(Qiagen,Germany)和480ⅡReal-timePCR Instrument(Roche,Swiss)进行qRT-PCR分析。

利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)将待测RNA逆转录成cDNA。

(1)取出存放于-80℃冰箱下提取好的总RNA样品，室温解冻，0.2mL PCR管中如下配置反转录体系。

(2)逆转录体系(10μL)：总RNA，0.5μg；4×gDNA wiper Mix，2μL；Nuclease-freeH₂O加至8μL，反应条件：42℃2min。加入5×HiScript II Q RT SuperMix IIa，2μL，反应条件：25℃10min，50℃30min，85℃5min。

(3)逆转录完毕后加入Nuclease-free H₂O稀释至100μL，-20℃保存。

Real-time RCR反应

(1)体系配置

表3 PCR体系中组分和体积

组分	体积(μl)
		2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix	5
Forward primer(10μM)	0.2
		Reverse primer(10μM)	0.2
Nuclease-free H2O	3.6
		cDNA	1
共计	10

(2)循环条件

表4 PCR循环条件

3)将PCR体系混合均匀，反应后离心，分到384孔板，在480 Ⅱ Real-time PCR Instrument(Roche,Swiss)上进行qRT-PCR反应和分析。

2-△△Ct法计算各组样本间基因的相对表达量，t-检验对相对表达量进行统计分析，数据表示为平均数±标准差(Mean±SD)，P<0.05表示差异显著

FASN、XLOC_002561、XLOC_053194、CD36、MAP3K4在大白猪肌内脂肪中显著上调，XLOC_027632、SCD在莱芜猪肌内脂肪中显著上调表达(图2)。以上结果与测序结果一致，表明测序结果可靠。

收集10例大白猪肌内组织样本和10例莱芜猪肌内组织样本进行备选基因XLOC_064336、WNT11(XM_005667138.3)基因荧光定量验证，具体步骤同上。

引物设计：

XLOC_064336：

上游引物：5’-GCAACTCCAATCTCTGAT-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物：5’-GAAGGTGACTGACTACTC-3’(SEQ ID NO.3)

WNT11基因：

上游引物：5’-ATCCCAAGCCAATAAACT-3’(SEQ ID NO.4)

下游引物：5’-TTACACTTCATCTCCAGAG-3’(SEQ ID NO.5)

结果见图3和图4，WNT11基因在莱芜猪肌内脂肪中表达量约为大白猪肌内脂肪组织的二分之一，XLOC_064336在莱芜猪肌内脂肪中表达量不足大白猪肌内脂肪组织的三分之一。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> lncRNA及其反式调控基因WNT11的新用途

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2494

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

ccggcctttc tcagccacag tcttatcctg tgtagaaaga aagcggtgac acttccttcc 60

aattaacgtc ctgcaaggaa aagtgaccta tgggctaggg ggcctggcac aggacctggt 120

cacagcaaag agcttcacga atgtcatttc cccgtcccct ccctcccggc cctgtcccca 180

gcatcttctg tagacacggt caaatcccag atctaactgc aactctgccg gacgccctca 240

aacaggctgc tgagcctccc gggaccgcag tttcctcccg tttaaaacgg agacattcgg 300

acttcacctg aaagtattaa ctacggtaac aggaatgtgc agggcattta acaggacagt 360

tttgggccga ggattctaca ggggaggtgg cggggaggct gtgtttgggg tccagcagac 420

tcaggcggcc acttgccatc actccctcgc tggctcgcct cttctgggaa acctctgccc 480

atcccaaatc tccaaggaca tgcagtgaca acccagggtg atgacacaga agaggcctcg 540

gacccagtct gagctggagg agcggtctgg tgaggcggca gagggtctcc aggcccggcc 600

ccctccctgg gcctcagctt ccctgtgtgc aaatggaggg ctctggaact ttcgaccctg 660

accttcaagg attctgagtg tatctacagg tgagcctcag tttacccttc cccctagagc 720

ggtcactgag tcgtgactca gcagagactc caaacgctcg gctgaggcct cagagactaa 780

gcaacagaag agtgtgcaag gaaggcgacc tctgcgggat tttgacacac ggacctgctg 840

ggagccaagg cgaacctctc cttcaaccca ccggctttga cggaccttta gctgactggc 900

caattaccac ctgagggccc ggctgggggg aggcctggga cctggcacct tccttgggta 960

gctcggacgt ctccttaaaa gcgatacaca aatgaggcag gacgagtgca tgaaaaccag 1020

gacaaccgac caaagagatg caccgccctg aggcggaaag attttgtcaa cgatcagacc 1080

ggtcctaagt aaggatactg ggcacctctg agggaggtga gctccccggt tcctgggggg 1140

cgggaggggc tggggtgttt gcctttttgg ggtactgcag ggatgacttc tgcctggggc 1200

cacaggcagg aatccgtgat ctctgagatg ccttgtagcc caatactgtt gttctaagat 1260

tgagattcaa cattctaaga ttccttagat gaattcagag atcccgtagg gatatcatat 1320

aggaggacga tcaccttaag atctaagtaa tctctgattc ttttctttct ttcttttttc 1380

ttttttcttt tttctttttt tttttttttg tcttttttgc tatttcttgg gctgctcctg 1440

cggcatatgg aggttcccag gctaggggtc gaattagagc tgtagccacc ggcctatgcc 1500

agagccacag caacgctgga tccgagccgc gtctgcaacc tacaccacag ctcacggcaa 1560

cgccagatcg ttaacccact gagcaagggc agggaccgaa cctgcaacct catggttcct 1620

agtcggattc attaaccact gcgccacgac gggaactcct ctttctttct tttaagggcc 1680

atactcgagg catatggaag ttctaggcta ggggttgaat tggagctaca gctcctggcc 1740

tacgccagag ccacagcaat gcgggatccg agccgcgtct gcaacctaca ccacagctca 1800

tggcaacgct ggacccttaa cccactaagc gaggccaggg attgaacctg tgtcctcatg 1860

gatgctagca gagttcctta ccactgagcc acaacagcaa ctccaatctc tgattcttag 1920

accctgatta gaagaatcta aagctcttgg gatctaagat ttcccacagt ccctgaaatc 1980

ggacttcgaa cgtcagcagc ctaagactga gtagtcagtc accttcgcca ccaggctggg 2040

ggggccagaa agggccagcc agcccctcaa ctccgctgcc agggtcccag atgattcatc 2100

tgctgggtgc tgggtttcat ttgcttcctc agatccagag atgcacccgg aagaaagaag 2160

atcctcagca cagtttgttg attgaataaa tgagcaaagt gcctttttac gctgtccctt 2220

cttctttgaa ttgggcctac tggtcagcta tcatttcaca gtaaagctct gggagaagaa 2280

aggggatgaa agaaccttct gccttcctga gttccctact gagatggcac atacgcacct 2340

catatggtcc atcctaagag cagggacttt gtcctgttct tggctgtgtc ctcaggacct 2400

agaacagaaa tgaatacccc agcttagctc agagctccag aggctatcag ctgtgggagg 2460

gtgcggcagg aggagttgat agggagacct ggag 2494

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

gcaactccaa tctctgat 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 3

gaaggtgact gactactc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

atcccaagcc aataaact 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

ttacacttca tctccagag 19

Claims

1.XLOC_064336靶基因及其表达产物在预测或辅助预测家畜肌肉品质中的应用，所述XLOC_064336靶基因为WNT家族基因，优选的，WNT家族基因为WNT11基因。

2.XLOC_064336靶基因及其表达产物在选育具有不同肌肉品质家畜中的应用，所述XLOC_064336靶基因为WNT家族基因，优选的，WNT家族基因为WNT11基因。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的应用，其特征在于，使用特异性引物对扩增XLOC_064336靶基因表达情况，引物对序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对。

4.一种与猪肌内脂肪相关lncRNA，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

5.根据权利要求4所述的lncRNA，其特征在于，lncRNA序列与SEQ ID NO.1具有95％以上序列同源性，优选的，lncRNA序列为SEQ ID NO.1。

6.下述任意一项应用：

权利要求4或5任意一项所述的lncRNA在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求4或5任意一项所述的lncRNA在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求4或5任意一项所述的lncRNA在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

7.一种检测肌内脂肪的试剂，其特征在于，试剂通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测权利要求4或5所述的lncRNA的表达水平。

8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，核酸扩增检测lncRNA的表达水平的试剂含有一对特异性扩增XlncRNA的引物；核酸杂交检测lncRNA的表达水平的试剂包括与lncRNA的核酸序列杂交的探针，优选的，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

9.根据权利要求7或8任意一项所述的试剂，其特征在于，试剂检测的样本为猪，优选为猪的肌内脂肪组织。

10.下述任意一项应用：

权利要求7-9任意一项所述的试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求7-9任意一项所述的试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求7-9任意一项所述的试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。