CN108085377A - 一种高背景下沙门氏菌的检测方法 - Google Patents

一种高背景下沙门氏菌的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108085377A
CN108085377A CN201711468005.7A CN201711468005A CN108085377A CN 108085377 A CN108085377 A CN 108085377A CN 201711468005 A CN201711468005 A CN 201711468005A CN 108085377 A CN108085377 A CN 108085377A
Authority
CN
China
Prior art keywords
salmonella
droplet
detection
magnetic bead
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711468005.7A
Other languages
English (en)
Inventor
葛绍阳
李让
刘松龄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Yiyuan Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Yiyuan Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Yiyuan Biological Technology Co Ltd filed Critical Beijing Yiyuan Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201711468005.7A priority Critical patent/CN108085377A/zh
Publication of CN108085377A publication Critical patent/CN108085377A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种高背景下沙门氏菌的检测方法，所述方法将免疫磁珠法与数字PCR方法相结合，合成了纳米级免疫磁珠，优化了免疫磁珠捕获及分离沙门氏菌的条件，确立了沙门氏菌数字PCR检测体系，优化了检测条件，并在乳品发酵剂高背景条件下进行了验证。本发明实现了3h内对浓度为103CFU/mL沙门氏菌的检出，在乳品发酵剂中进行检测验证，可实现107CFU/mL乳酸菌背景下103CFU/mL沙门氏菌的检出。

Description

一种高背景下沙门氏菌的检测方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，特别涉及一种高背景下沙门氏菌的检测方法。
背景技术
沙门氏菌是危害很大的食源性致病菌，沙门氏菌是一种兼性厌氧型的革兰氏阴性菌，属肠杆菌科，两端钝圆，菌体大小是(0.4～0.9)μm×(1～3)μm，生长温度范围为5～46℃，最适生长温度为35～37℃。最适生长pH为6.5～7.5。我国国家食品药品监督管理总局2015年发布第12期《食品安全风险解析》中特别强调了沙门氏菌的危害与其可能引起的食品安全隐患。由沙门氏菌引起的食源性疾病居细菌性食源性疾病的首位。2006～2010年间报告的细菌食源性疾病暴发事件中，70％～80％是由沙门氏菌所致。
直到20世纪90年代，大多数疾病是由于消费动物性产品：家禽，家禽产品，肉类和乳制品。最近越来越多的疾病已经与食用生的食物、新鲜的即食食品有关，如西红柿，甜瓜，豆芽菜，绿叶蔬菜及浆果等。美国的几项流行病学研究表明，在大多数情况下，污染商品的沙门氏菌数量相对较少，但仍会引发疾病爆发。因此，快速、准确的检测食物、食品发酵剂以及环境来源的沙门氏菌至关重要，可有效维护食品安全，确保公众健康。在过去的25年，开发更快捷的方法用于检测、识别在食物和环境样品中不同亚型的沙门氏菌一直是研究的热点所在。
已有的传统检测沙门氏菌的方法包括：国标GB4789.4-2010《食品微生物学检验-沙门氏菌检验》中采用传统法进行沙门氏菌的检测，此方法步骤繁琐，操作复杂。免疫学检测法，根据酶联免疫吸附测定原理研发了多种试剂盒，检测沙门氏菌一般也采用商业化的试剂盒，病原体的检出限(LOD)通常在104～105CFU/mL的范围内，测定时间可能需要大约48h，因为通常需要预富集步骤以达到细菌的检出限。虽然易于操作，但大多数替代检测方法均需要24h预浓缩，以增加目标细菌的数量使之达到检测限。
另外，乳品发酵剂因其成分较为特殊，主要由高浓度的乳酸菌菌体组成，在菌体形态、菌种生长特性等诸多方面，均与沙门氏菌存在一定的相似度，单纯的采用免疫学的方法易出现较高比例的假阳性，而单纯采用分子生物学的检测方法则因高背景乳酸菌的影响，使得在DNA提取及后续检测均困难重重。
乳品发酵剂在生产过程中的培养温度在37℃，而沙门氏菌的最适生长温度也在37℃左右，一旦被其污染，沙门氏菌将在营养丰富的培养基中大量繁殖，消耗体系中的大量营养物质，改变发酵剂的成分体系，使得发酵剂体系酸度上升，并产生气体，使得发酵剂品质异常，严重影响产品安全性。被污染的乳品发酵剂一旦用于后续乳制品生产中将引起严重的安全性问题，引发一系列的疾病。及时监测可较早的控制发酵剂的污染情况，防止发酵剂工厂面临较大损失。
体系中出现污染致病菌的现象如果检测用时较长，将导致污染十分严重不可逆转，工厂都会选择弃掉所有有问题的发酵剂，以保证发酵剂的品质，这对工厂带来的损失是十分巨大的。因此，采用快速的检测发酵剂中致病菌的方法十分重要。
为了获得较好品质的发酵剂，对生产环节发酵剂的品质监测至关重要。而检测手段的快速、便捷、灵敏则较大程度上保证了对生产过程的控制。能及时对出现问题的发酵剂进行处理可减少生产企业的损失，降低风险水平。安全稳定的乳品发酵剂品质也为后续产品的推广和应用夯实了基础，为应用乳品发酵剂的下游企业提供了保障。
我国轻工行业标准QB/T 4575-2013《食品加工用乳酸菌》中规定，对乳品发酵剂中的的沙门氏菌采用GB4789.4-2010《食品微生物学检验-沙门氏菌检验》的方法进行检测。需进行前增菌、选择性增菌、菌体分离、生化试验及血清学鉴定等诸多复杂步骤。整个过程至少需要5天才能获得准确的检测结果。无法进行实时监测，一旦污染，损失惨重。因检测时间较长，使得不能进行发酵剂生产过程中沙门氏菌污染情况的实时监测，一旦在产品中检出存在沙门氏菌污染，同一批次的产品均无法销售，使得发酵剂的生产商遭受重大损失。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高背景下沙门氏菌的检测方法，建立纳米级免疫磁珠联合第三代数字PCR检测技术，缩短了沙门氏菌的检测时间、降低检出限，可有效解决因为检测时间长为企业带来的库存积压，运营成本增加的问题，也降低了漏检的风险，为工业化的生产检测奠定基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高背景下沙门氏菌的检测方法，所述检测方法将免疫磁珠法和数字PCR法联合使用，用于食物基质中沙门氏菌的分离与检测。
进一步的，所述检测方法中免疫磁珠法包括以下步骤：
1)磁珠清洗：用PBS溶液对Ocean的200nm的磁珠进行清洗，磁珠吸取到用BSA溶液封闭的离心管中；
2)抗体稀释：取10μL浓度为1mg/mL，4℃的抗体加入到上述离心管中，用PBS进行稀释，稀释到浓度为0.5mg/mL；
3)磁珠与抗体偶联：取4℃保存40μL的磁珠，加入10μL浓度为1mg/mL的抗体，加入90μL PBS溶液，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠3min，用PBS清洗两次后，磁珠重悬于100μL链霉亲和素磁珠终浓度为250μg/mL的PBS中，即得到沙门氏菌免疫磁珠，4℃冰箱保存备用；
4)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备所得的沙门氏菌免疫磁珠40μL，与沙门氏菌待测液100μL混合，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠，磁分离时间5min，将富集得到的磁珠-菌体复合物进行后续DNA提取及数字PCR检测。
进一步的，步骤4)中所述DNA提取的方法为热裂解法。
进一步的，所述热裂解法的具体步骤包括：取1mL所述的磁珠-菌体复合物于1.5mLEP管，在4℃条件下，以12000r/min离心5min，弃去上清液，再向管中加入1mL ddH2O，12000r/min，5min，4℃，离心，弃去上清液，再加入50μLddH2O、混匀，并置于电热恒温水浴锅中99℃煮沸10min后，立即置冰上20min，然后以12000r/min，4℃离心5min，取上清，-20℃保存，DNA模板提取完成，可用于进一步的检测。
进一步的，所述检测方法中数字PCR法包括以下步骤：
①配置反应液：将引物、探针、ddPCR supermix配置成22μL反应液，PCR反应液中加入样本DNA 2.2μL，将配置好的ddPCR反应液加入到微滴发生板上，在微滴发生板上加皮套；
所述PCR反应液如下表所示：
②制备微滴：将微滴发生板装放入一个8通道微滴制生成器中，在每个孔中加入70μL微滴生成油来形成微滴；
③PCR扩增：将样本生成的微滴取40μL手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封，然后置于热循环中扩增；
热循环模式如下所示：
95℃ 6min PCR
95℃30s
57.6℃ 60s变温速率：2℃/s
加固油滴
98℃ 10min降温
20℃保持变温速率：1℃/s；
④检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；
⑤分析数据、显示结果：采用QuantaSo任软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性，并显示出检测结果。
进一步的，所述上游引物序列Salm-F为5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’，下游引物序列Salm-R为5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’，探针序列Salm-P为5’-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-3’。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明所述的沙门氏菌检测方法，构建了沙门氏菌免疫磁珠-数字PCR检测方法，实现了乳品发酵剂高背景条件下对沙门氏菌的特异性捕获，降低了背景对检测的干扰；
2、本发明所述的沙门氏菌检测方法，与传统方法相比，论文建立的免疫磁珠-数字PCR方法有效缩短了沙门氏菌检测时间，与商品化沙门氏菌免疫磁珠相比，有效提高了磁珠捕获效率；
3、本发明所述的沙门氏菌检测方法，可实现3h内对浓度为103CFU/mL沙门氏菌的检出，在乳品发酵剂中进行检测验证，可实现107CFU/mL乳酸菌背景下103CFU/mL沙门氏菌的检出。
附图说明
图1为本发明所述检测方法对沙门氏菌检测灵敏度一维散点图；
图2为本发明所述检测方法在高背景干扰下下对沙门氏菌检测灵敏度评价；
图3为本发明所述检测方法在高菌体背景沙门氏菌抗干扰性评价。
具体实施方式
实施例1
一种高背景下沙门氏菌的检测方法(免疫磁珠-数字PCR法)，所述检测方法将免疫磁珠法和数字PCR法联合使用，用于食物基质中沙门氏菌的分离与检测。
进一步的，所述检测方法中免疫磁珠法包括以下步骤：
1)磁珠清洗：用PBS溶液对ocean的200nm的磁珠进行清洗，磁珠吸取到用BSA溶液封闭的离心管中；
2)抗体稀释：取10μL浓度为1mg/mL，4℃的抗体加入到上述离心管中，用PBS进行稀释，稀释到浓度为0.5mg/mL；
3)磁珠与抗体偶联：取4℃保存40μL的磁珠，加入10μL浓度为1mg/mL的抗体，加入90μL PBS溶液，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠3min，用PBS清洗两次后，磁珠重悬于100μL链霉亲和素磁珠终浓度为250μg/mL的PBS中，即得到沙门氏菌免疫磁珠，4℃冰箱保存备用；
所用纳米级免疫磁珠合成材料如表1所示。
表1 免疫磁珠实验抗体及磁珠
4)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备所得的沙门氏菌免疫磁珠40μL，与沙门氏菌待测液100μL混合，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠，磁分离时间5min，将富集得到的磁珠-菌体复合物进行后续DNA提取及数字PCR检测。
所述沙门氏菌待测液为副干酪乳杆菌发酵剂样品溶液与浓度为103CFU/mL的沙门氏菌的混合液，发酵剂样品溶液根据轻工发酵剂的检测步骤，进行发酵剂样品溶液的制备。称取对应每100L奶接种量的菌粉，溶解于100mL相应发酵温度的乳酸菌培养液中，摇动10min直到完全溶解。从上述菌液中用无菌移液枪均匀抽取10mL菌液，转移至90mL的乳酸菌培养液中，摇动1min直到分散均匀，副干酪乳杆菌发酵剂样品梯度稀释至107CFU/mL。
进一步的，步骤4)中所述DNA提取的方法为热裂解法。
进一步的，所述热裂解法的具体步骤包括：取1mL所述的磁珠-菌体复合物于1.5mLEP管，在4℃条件下，以12000r/min离心5min，弃去上清液，再向管中加入1mL ddH2O，12000r/min，5min，4℃，离心，弃去上清液，再加入50μLddH2O、混匀，并置于电热恒温水浴锅中99℃煮沸10min后，立即置冰上20min，然后以12000r/min，4℃离心5min，取上清，-20℃保存，DNA模板提取完成，可用于进一步的检测。
进一步的，所述检测方法中数字PCR法包括以下步骤：
①配置反应液：将引物、探针、ddPCR supermix配置成22μL反应液，PCR反应液中加入样本DNA 2.2μL，将配置好的ddPCR反应液加入到微滴发生板上，在微滴发生板上加皮套；
所述PCR反应液如下表所示：
②制备微滴：将微滴发生板装放入一个8通道微滴制生成器中，在每个孔中加入70μL微滴生成油来形成微滴；
③PCR扩增：将样本生成的微滴取40μL手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封，然后置于热循环中扩增；
热循环模式如下所示：
95℃ 6min PCR
95℃ 30s
57.6℃ 60s变温速率：2℃/s
加固油滴
98℃ 10min降温
20℃保持变温速率：1℃/s；
④检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；
⑤分析数据、显示结果：采用QuantaSo任软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性，并显示出检测结果。
进一步的，所述上游引物序列Salm-F为5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’，下游引物序列Salm-R为5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’，探针序列Salm-P为5’-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-3’。
实施例2
本实施例对本发明所述的高背景下沙门氏菌的检测方法进行灵敏度、抗干扰性、重复性的评价：
1免疫磁珠-数字PCR法检测沙门氏菌灵敏度评价
由于免疫磁珠富集沙门氏菌的同时，也会对发酵剂中乳酸菌有一定程度的捕获，而捕获的乳酸菌，在后续检测过程中仍会对沙门氏菌的检测产生干扰和抑制。因此，免疫磁珠捕获得到的菌体仍需进行发酵剂背景干扰的进一步降低。采用定量PCR方法进行检测，沙门氏菌的DNA则易受到高背景的乳酸菌菌体DNA的影响，出现标准曲线不标准的问题。同时由于检测体系中的沙门氏菌菌体量较少，因此对检测精度也提出了较高的要求，而数字PCR的优势也就尤为显著。
采用免疫磁珠-数字PCR法对梯度稀释的沙门氏菌进行检测，选择沙门氏菌浓度为103、104CFU/mL进行磁珠捕获、DNA提取及数字PCR检测，实验结果如图1所示，从如图1中可以看出，对103CFU/mL浓度的沙门氏菌可实现检出。
2高背景菌体下灵敏度评价
探究高背景菌体对沙门氏菌检测的抑制影响，将副干酪乳杆菌的菌体浓度为107CFU/mL，与菌体浓度梯度稀释至103、104CFU/mL的沙门氏菌进行混合，采用免疫磁珠-数字PCR的检测方法进行检测，从图2的结果可得，可实现107CFU/mL菌体背景下103CFU/mL沙门氏菌的检测。DNA的拷贝数梯度变化趋势，与菌体浓度梯度变化趋势一致，可实现体系中单拷贝DNA检出。
3抗干扰性评价
选择副干酪乳杆菌浓度为0、107、106、105、104、103CFU/mL的菌体与浓度为103CFU/mL的沙门氏菌进行混合，采用免疫磁珠-数字PCR法进行检测，数字PCR检测得到的DNA浓度结果如图3所示，空白组未检测到信号，说明体系不存在非特异性扩增，且无沙门氏菌DNA污染。背景菌体浓度为0与107CFU/mL时，对103CFU/mL的沙门氏菌检测的结果不存在显著性差异。在背景菌体浓度为106、105、104、103CFU/mL时，对103CFU/mL的沙门氏菌检测的结果也不存在显著性差异。
4重复性评价
选择副干酪乳杆菌浓度为0、107、106CFU/mL的菌体与浓度为103CFU/mL的沙门氏菌进行混合采用免疫磁珠-数字PCR法进行检测，进行组内和组间重复实验，结果如表2所示，组内重复的变异系数在3.85～9.83％，小于10％，组间重复的变异系数6.00％～11.22％，说明组内重复性较好。
表2 免疫磁珠-数字PCR法检测高背景下沙门氏菌重复性评价

Claims (6)

1.一种高背景下沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法将免疫磁珠法和数字PCR法联合使用，用于食物基质中沙门氏菌的分离与检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中免疫磁珠法包括以下步骤：
1)磁珠清洗：用PBS溶液对Ocean的200nm的磁珠进行清洗，磁珠吸取到用BSA溶液封闭的离心管中；
2)抗体稀释：取10μL浓度为1mg/mL，4℃的抗体加入到上述离心管中，用PBS进行稀释，稀释到浓度为0.5mg/mL；
3)磁珠与抗体偶联：取4℃保存40μL的磁珠，加入10μL浓度为1mg/mL的抗体，加入90μLPBS溶液，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠3min，用PBS清洗体系中多余的抗体，清洗两次后，磁珠重悬于100μL链霉亲和素磁珠终浓度为250μg/mL的PBS中，即得到沙门氏菌免疫磁珠，4℃冰箱保存备用；
4)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备所得的沙门氏菌免疫磁珠40μL，与沙门氏菌待测液100μL混合，置于混匀仪上室温孵育45min，采用磁力架回收磁珠，磁分离时间5min，将富集得到的磁珠-菌体复合物进行后续DNA提取及数字PCR检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中所述DNA提取的方法为热裂解法。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述热裂解法的具体步骤包括：取1mL所述的磁珠-菌体复合物于1.5mLEP管，在4℃条件下，以12000r/min离心5min，弃去上清液，再向管中加入1mL ddH2O，12000r/min，5min，4℃，离心，弃去上清液，再加入50μLddH2O、混匀，并置于电热恒温水浴锅中99℃煮沸10min后，立即置冰上20min，然后以12000r/min，4℃离心5min，取上清，-20℃保存，DNA模板提取完成，可用于进一步的检测。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中数字PCR法包括以下步骤：
①配置反应液：将引物、探针、ddPCR supermix配置成22μL反应液，PCR反应液中加入样本DNA 2.2μL，将配置好的ddPCR反应液加入到微滴发生板上，在微滴发生板上加皮套；
所述PCR反应液如下表所示：
②制备微滴：将微滴发生板装放入一个8通道微滴制生成器中，在每个孔中加入70μL微滴生成油来形成微滴；
③PCR扩增：将样本生成的微滴取40μL手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封，然后置于热循环中扩增；
热循环模式如下所示：
95℃ 6min PCR
95℃ 30s
57.6℃ 60s变温速率：2℃/s
加固油滴
98℃ 10min降温
20℃保持变温速率：1℃/s；
④检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；
⑤分析数据、显示结果：采用QuantaSo任软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性，并显示出检测结果。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述上游引物序列Salm-F为5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’，下游引物序列Salm-R为5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’，探针序列Salm-P为5’-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-3’。
CN201711468005.7A 2017-12-29 2017-12-29 一种高背景下沙门氏菌的检测方法 Pending CN108085377A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711468005.7A CN108085377A (zh) 2017-12-29 2017-12-29 一种高背景下沙门氏菌的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711468005.7A CN108085377A (zh) 2017-12-29 2017-12-29 一种高背景下沙门氏菌的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108085377A true CN108085377A (zh) 2018-05-29

Family

ID=62181043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711468005.7A Pending CN108085377A (zh) 2017-12-29 2017-12-29 一种高背景下沙门氏菌的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108085377A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1743459A (zh) * 2004-08-20 2006-03-08 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测沙门氏菌核苷酸片段的引物和探针序列
CN102816850A (zh) * 2012-08-28 2012-12-12 无锡中德伯尔生物技术有限公司 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌o157:h7、单核增生李斯特菌的方法
CN103952487A (zh) * 2014-04-30 2014-07-30 华南农业大学 空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光pcr检测方法
CN104459126A (zh) * 2014-12-16 2015-03-25 四川大学 一种基于免疫磁珠富集沙门氏菌的方法
CN106244691A (zh) * 2016-08-03 2016-12-21 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种基于微滴数字pcr方法快速定量筛查草莓中沙门氏菌的方法
CN106702016A (zh) * 2014-08-14 2017-05-24 北京市理化分析测试中心 一种快速检测沙门氏菌的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1743459A (zh) * 2004-08-20 2006-03-08 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测沙门氏菌核苷酸片段的引物和探针序列
CN102816850A (zh) * 2012-08-28 2012-12-12 无锡中德伯尔生物技术有限公司 同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌o157:h7、单核增生李斯特菌的方法
CN103952487A (zh) * 2014-04-30 2014-07-30 华南农业大学 空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光pcr检测方法
CN106702016A (zh) * 2014-08-14 2017-05-24 北京市理化分析测试中心 一种快速检测沙门氏菌的方法
CN104459126A (zh) * 2014-12-16 2015-03-25 四川大学 一种基于免疫磁珠富集沙门氏菌的方法
CN106244691A (zh) * 2016-08-03 2016-12-21 天津市农业质量标准与检测技术研究所 一种基于微滴数字pcr方法快速定量筛查草莓中沙门氏菌的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李亚茹等: "免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌", 《现代食品科技》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wilkinson Flow cytometry as a potential method of measuring bacterial viability in probiotic products: A review
Chaisowwong et al. Physiological characterization of Campylobacter jejuni under cold stresses conditions: its potential for public threat
Xiong et al. Development of an immunomagnetic separation method for efficient enrichment of Escherichia coli O157: H7
Wang et al. Development and evaluation of an immunomagnetic separation–ELISA for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple juice
Zheng et al. Real-time PCR method combined with immunomagnetic separation for detecting healthy and heat-injured Salmonella Typhimurium on raw duck wings
Du et al. Effective pre-treatment technique based on immune-magnetic separation for rapid detection of trace levels of Salmonella in milk
Du et al. Rapid detection of trace Salmonella in milk using an effective pretreatment combined with droplet digital polymerase chain reaction
CN103713104B (zh) 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法
Huang et al. A phage-based magnetic relaxation switching biosensor using bioorthogonal reaction signal amplification for salmonella detection in foods
CN105936935B (zh) 一种快速鉴定特定血清型沙门菌的pcr检测试剂盒
Fan et al. Rapid and simultaneous detection of Salmonella spp., Escherichia coli O157: H7, and Listeria monocytogenes in meat using multiplex immunomagnetic separation and multiplex real-time PCR
WO2019140618A1 (zh) 一种定量检测vbnc状态细菌的方法
CN115786543A (zh) 一种鉴定和区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重pcr检测试剂盒
EP1104484A2 (en) Composition and methods for exposing antigenic epitopes on cultured microorganisms
CN106244690B (zh) 一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重pcr检测试剂盒
CN106771217A (zh) 一种单增李斯特氏菌的快速检测方法
CN106086209B (zh) 一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的pcr检测试剂盒
CN108424973A (zh) 一种用于rna恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法
CN108085377A (zh) 一种高背景下沙门氏菌的检测方法
CN106244691A (zh) 一种基于微滴数字pcr方法快速定量筛查草莓中沙门氏菌的方法
CN106702016A (zh) 一种快速检测沙门氏菌的方法
CN107236783A (zh) 乳粉中沙门氏菌标准样品及其制备方法
CN104593516A (zh) 一种恒温快速扩增检测单核细胞增生李斯特菌的方法
Wyatt et al. Comparison of a microtitration plate ELISA with a standard cultural procedure for the detection of Salmonella spp. in chicken
AU2019100071A4 (en) Pcr detection kit for rapidly identifying salmonella of specific serotypes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180529

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication