CN108064296A - 控制昆虫害虫的spt6核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及核酸分子和使用所述核酸分子控制昆虫害虫的方法，所述方法通过对包括鞘翅目害虫的昆虫害虫中的靶标编码序列和转录的非编码序列进行RNA干扰介导的抑制来实施。本公开还涉及用于制造表达可用于控制昆虫害虫的核酸分子的转基因植物的方法，以及由此获得的植物细胞和植物。

Description

控制昆虫害虫的SPT6核酸分子
优先权声明
本申请要求2015年5月29日提交的美国临时专利申请序列号62/168,606“SPT6NUCLEIC ACID MOLECULES TO CONTROL INSECT PESTS”的提交的权益。
技术领域
本发明整体涉及由昆虫害虫(例如鞘翅目害虫)引起的植物损坏的遗传控制。在特定的实施方案中，本发明涉及鉴定靶标编码多核苷酸和非编码多核苷酸，以及使用重组DNA技术转录后阻遏或抑制靶标编码多核苷酸和非编码多核苷酸在昆虫害虫细胞中的表达，从而提供植物保护效果。
背景技术
西方玉米根虫(WCR)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgiferaLeConte))是北美最具破坏性的玉米根虫物种之一，在美国中西部玉米种植区备受关注。北方玉米根虫(NCR)(巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi Smith and Lawrence))是与WCR在几乎相同的范围内共栖的近缘物种。还有另外几种叶甲属(Diabrotica)的相关亚种是美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(MCR)(墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae Krysan andSmith))；南方玉米根虫(SCR)(十一星根萤叶甲(D.undecimpunctata howardi Barber))；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata LeConte)；黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata tenella)；南美叶甲(D.speciosa Germar)；以及D.u.undecimpunctata Mannerheim。美国农业部已估计玉米根虫每年造成10亿美元收益损失，包括8亿美元的产量损失和2亿美元的治理成本。
WCR卵和NCR卵均在夏季期间沉积于土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵期。卵为椭圆形、白色，且长度小于0.004英寸。幼虫在五月底或六月初孵出，卵孵出的精确时间由于温度差异和位置不同而每年都有所变化。新孵出的幼虫是白色蠕虫，长度小于0.125英寸。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫历经三个幼虫龄期。进食几周后，幼虫蜕皮，进入蛹期。它们在土壤中化蛹，然后在7月和8月以成虫形式从土壤中出现。成体根虫的长度为约0.25英寸。
玉米根虫幼虫在玉米和另外几种禾本科物种上完成发育。在黄色狐尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且比起在玉米上饲养的幼虫，成虫的头壳尺寸较小。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-34。WCR成虫以玉米穗丝、花粉和位于暴露的穗尖上的玉米籽为食。如果WCR成虫在玉米生殖组织存在之前出现，则它们可能以叶组织为食，从而减缓植物生长，并且偶尔会杀死寄主植物。然而，一旦有了偏好的穗丝和花粉，成虫便会快速向其转移。NCR成虫还以玉米植物的生殖组织为食，但相比之下很少以玉米叶为食。
玉米中大部分的根虫损害由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以纤细的玉米根毛为食，并钻入根尖内。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫进食时常导致根修剪，一直到玉米杆的基部。严重的根损伤妨碍根将水和养分运输到植物中的能力、减缓植物生长，并导致籽粒产生减少，从而时常大幅降低总产量。严重的根损伤还时常导致玉米植物倒伏，这使收获变得更加困难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可导致穗尖处的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。
可通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，形成孢子的革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))、表达Bt毒素的转基因植物或这些手段的组合，来尝试控制玉米根虫。作物轮作的缺陷是不必要地限制了农田的用途。另外，一些根虫物种可能在大豆田间产卵，从而降低用玉米和大豆实施的作物轮作的效率。
化学杀虫剂是最为人们所倚重的用于实现玉米根虫控制的策略。尽管如此，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫损害所致的损失相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、暴雨以及杀虫剂应用不当都可导致玉米根虫控制不充分。此外，连续使用杀虫剂可能选择杀虫剂抗性根虫品种，并且由于杀虫剂对非靶标物种存在毒性，所以有严重的影响环境之虞。
RNA干扰(RNAi)是一种利用内源性细胞途径的方法，凭借该方法，对整个靶标基因或靶标基因的尺寸足够大的任何部分有特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如dsRNA分子)引起由其编码的mRNA降解。近年来，在许多物种和实验系统例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、植物、昆虫胚胎和组织培养物中的细胞中，已使用RNAi执行基因“敲低”。参见例如Fire等人，(1998)Nature 391:806-11；Martinez等人，(2002)Cell110:563-74；McManus和Sharp，(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-47。
RNAi通过内源性途径(包括DICER蛋白质复合物)实现mRNA的降解。DICER将长的dsRNA分子切割成大约20个核苷酸的短片段，称之为小干扰RNA(siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：过客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。过客链被降解，引导链则被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。微小核糖核酸(miRNA)是从含有与杂交的过客链和引导链相连接的多核苷酸“环”的前体分子切割下来的在结构上非常相似的分子，这些分子可以类似地掺入RISC中。当引导链特异性地结合到互补mRNA分子并诱导Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割时，发生转录后基因沉默。尽管在一些真核生物诸如植物、线虫类和一些昆虫中，siRNA和/或miRNA的初始浓度有限，但已知该过程系统性地遍布整个生物体。
只有与siRNA和/或miRNA互补的转录物被切割和降解，因此mRNA表达的敲低是序列特异性的。在植物中，存在DICER基因的几个功能组。RNAi的基因沉默效应持续数天，并且在实验条件下，可导致靶向转录物的丰度下降90％或更多，随之发生相应蛋白质的水平降低。在昆虫中，有至少两种DICER基因，其中DICER1促进miRNA在Argonaute1指引下降解。Lee等人，(2004)Cell 117(1):69-81。DICER2促进siRNA在Argonaute2指引下降解。
美国专利号7,612,194以及美国专利公布号2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545公开了自玉米根萤叶甲(D.v.virgifera LeConte)蛹分离的9112种表达序列标签(EST)序列的文库。美国专利号7,612,194和美国专利公布号2007/0050860中提出了将与其中公开的玉米根萤叶甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的几个特定部分序列之一互补的核酸分子可操作地连接到启动子，以便在植物细胞中表达反义RNA。美国专利公布号2010/0192265提出了将启动子可操作地连接到下述核酸分子以便在植物细胞中表达反义RNA，该核酸分子与具有未知且未公开的功能的玉米根萤叶甲基因的特定部分序列互补(该部分序列据称与秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的C56C10.3基因产物58％相同)。美国专利公布号2011/0154545提出了将启动子可操作地连接到下述核酸分子以便在植物细胞中表达反义RNA，该核酸分子与玉米根萤叶甲外被体(coatomer)β亚单位基因的两个特定部分序列互补。另外，美国专利号7,943,819公开了自玉米根萤叶甲幼虫、蛹和切开的中肠分离的906种表达序列标签(EST)序列的文库，并且提出了将启动子可操作地连接到下述核酸分子以便在植物细胞中表达双链RNA，该核酸分子与玉米根萤叶甲带电的多泡体蛋白4b基因的特定部分序列互补。
除了V-ATP酶的几个特定部分序列和具有未知功能的基因的特定部分序列之外，美国专利号7,612,194以及美国专利公布号2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中没有进一步提出使用其中列出的超过9000个序列中的任何特定序列来进行RNA干扰。此外，美国专利号7,612,194以及美国专利公布号2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545都没有教示其提供的超过9000个序列中的哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的，甚至没有教示其有任何其他方面的用处。除了带电多泡体蛋白4b基因的特定部分序列之外，美国专利号7,943,819没有提出使用其中列出的超过900个序列中的任何特定序列来进行RNA干扰。此外，美国专利号7,943,819没有教示其提供的超过900个序列中的哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的，甚至没有教示其有任何其他方面的用处。美国专利申请公布号U.S.2013/040173和PCT申请公布号WO 2013/169923描述了来源于玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)Snf7基因的序列在玉蜀黍中进行RNA干扰的用途。(还公开于Bolognesi等人，(2012)PLoS ONE7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534中)。
与玉米根虫DNA互补的绝大多数序列(诸如前述)在用作dsRNA或siRNA时，并不提供保护植物免受玉米根虫物种损害的作用。例如，Baum等人，(2007)Nature Biotechnology25:1322-1326描述了RNAi抑制几个WCR基因靶标的作用。这些作者报道，在超过520ng/cm2的极高iRNA(例如dsRNA)浓度下，他们测试的26个靶标基因中有8个不能提供实验上显著的鞘翅目害虫死亡率。
美国专利号7,612,194和美国专利公布号2007/0050860的作者首先报道了玉米植物中的靶向西方玉米根虫的植物界RNAi。Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-6。这些作者描述了用来筛选潜在靶标基因以开发转基因RNAi玉蜀黍的高通量活体内饮食RNAi系统。在290个靶标的初始基因池中，只有14个表现出控制幼虫的潜力。最有效的双链RNA(dsRNA)中的一者靶向编码液泡ATP酶亚单位A(V-ATP酶)的基因，从而以低浓度dsRNA引起快速阻抑对应的内源性mRNA并触发特异性RNAi反应。因此，这些作者首次用文件记载了植物界RNAi作为可行的害虫管理工具的潜力，而同时证明了即便从相对小的候选基因组也无法准确地先验鉴定有效靶标。
发明内容
本文公开了核酸分子(例如，靶标基因、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)及其用于控制昆虫害虫的方法，所述昆虫害虫包括例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫，"WCR”)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫，"NCR”)、十一星根萤叶甲(南方玉米根虫，"SCR”)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫，"MCR”)黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、D.u.undecimpunctata Mannerheim和南美叶甲。在特定的实例中，公开了示例性核酸分子，这些分子可与昆虫害虫中的一个或多个天然核酸的至少一部分同源。
在这些和另外的实例中，天然核酸序列可以是靶标基因，其产物可以例如但不限于：参与代谢过程，或参与幼虫的发育。在一些实例中，通过包含与靶标基因同源的多核苷酸的核酸分子对靶标基因的表达进行转录后抑制对于昆虫害虫可能是致命的，或可能造成昆虫害虫生长减缓和/或生存力下降。在具体的实例中，可选择在本文称为例如spt6或spt6同源物的转录延伸因子作为用于转录后沉默的靶标基因。在特定的实例中，可用于转录后抑制的靶标基因是在本文称为玉米根萤叶甲spt6-1(例如SEQ ID NO:1)的基因。本文因此公开了包含SEQ ID NO:1的多核苷酸、SEQ ID NO:1的互补序列和/或前述任一者的片段(例如SEQ ID NO:3-5)的分离的核酸分子。
还公开了包含编码这样的多肽的多核苷酸的核酸分子：该多肽与靶标基因产物(例如spt6基因的产物)内的氨基酸序列至少约85％相同。例如，核酸分子可包含多核苷酸，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:2(叶甲属SPT6-1)至少85％相同的多肽，和/或在叶甲属spt6-1的产物内的氨基酸序列。进一步公开了包含这样的多核苷酸的核酸分子：该多核苷酸为编码下述多肽的多核苷酸的反向互补序列，其中该多肽与靶标基因产物内的氨基酸序列至少85％相同。
还公开了可用于产生iRNA(例如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)分子的cDNA多核苷酸，所述iRNA分子与昆虫害虫靶标基因(例如spt6基因)的全部或部分互补。在特定的实施方案中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA可在体外产生或通过基因修饰生物体(诸如植物或细菌)在活体内产生。在特定的实例中，公开了cDNA分子，其可用于产生与spt6基因的全部或一部分(例如SEQ ID NO:1)互补的iRNA分子。
进一步公开了用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的spt6构件，以及用于向植物提供鞘翅目害虫防护的spt6构件。一种用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的spt6构件是由选自下列的多核苷酸组成的单链或双链RNA分子：SEQ ID NO:81-84及其互补序列。用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的spt6构件的功能等同物包括与从含有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的鞘翅目spt6基因转录的RNA的全部或部分基本上同源的单链或双链RNA分子。一种用于向植物提供鞘翅目害虫防护的spt6构件是这样的DNA分子：该DNA分子包含可操作地连接到启动子且编码用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的spt6构件的多核苷酸，其中该DNA分子能够整合到植物的基因组中。
公开了用于控制昆虫害虫(例如鞘翅目害虫)群体的方法，包括向昆虫害虫(例如鞘翅目害虫)提供iRNA(例如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)分子，该iRNA分子在被所述害虫摄取后发挥作用以抑制所述害虫内的生物功能，其中该iRNA分子包含选自下列的多核苷酸的全部或部分：SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:81的互补序列；SEQ ID NO:82；SEQ IDNO:82的互补序列；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:83的互补序列；SEQ ID NO:84；SEQ ID NO:84的互补序列；与害虫(例如WCR)的天然spt6多核苷酸杂交的多核苷酸；与害虫的天然spt6多核苷酸杂交的多核苷酸的互补序列；与叶甲属生物体(例如WCR)的天然编码多核苷酸杂交的多核苷酸，该天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:1和3-5中任一者的全部或部分；与叶甲属生物体的天然编码多核苷酸杂交的多核苷酸的互补序列，该天然编码多核苷酸包含SEQID NO:1和3-5中任一者的全部或部分。
在特定的实施方案中，从下述DNA转录被昆虫害虫摄取后发挥作用以抑制该害虫内的生物功能的iRNA，该DNA包含选自下列的多核苷酸的全部或部分：SEQ ID NO:1；SEQ IDNO:1的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的互补序列；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:5的互补序列；叶甲属生物体(例如WCR)的天然编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1和3-5中任一者的全部或部分；叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列，所述天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:1和3-5中任一者的全部或部分。
本文还公开了下述方法，其中可在基于食料的测定中，或在表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA的基因修饰植物细胞中，向昆虫害虫提供所述dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA。在这些和另外的实例中，所述dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA可由害虫摄入。摄入本发明的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA随后可引起害虫中的RNAi，RNAi进而可造成害虫的生存力所必需的基因发生沉默，最终引起害虫死亡。因此，公开了其中向昆虫害虫提供包含可用于控制昆虫害虫的示例性多核苷酸的核酸分子的方法。在特定的实例中，通过使用本发明的核酸分子而控制的鞘翅目害虫可以是WCR、NCR、SCR、十一星根萤叶甲、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、南美叶甲和D.u.undecimpunctata。
参考下文结合附图1至2进行的对若干实施方案的详细说明，前述特征和其他特征将变得更加明显。
附图说明
图1包括对用单对引物由单个转录模板提供dsRNA所使用的策略的描述。
图2包括对由两个转录模板提供dsRNA所使用的策略的描述。
序列表
随附序列表中列出的核酸序列是使用如37C.F.R.§1.822中规定的核苷酸碱基的标准字母缩写示出的。列出的核酸序列和氨基酸序列限定具有以所描述方式布置的核苷酸单体和氨基酸单体的分子(即，分别为多核苷酸和多肽)。列出的核酸序列和氨基酸序列还各自限定包含以所描述方式布置的核苷酸单体和氨基酸单体的一类多核苷酸或多肽。考虑到遗传密码的冗余性，应当理解，包含编码序列的核苷酸序列还描述编码与参考序列所组成的多核苷酸相同的多肽的这类多核苷酸。还应当理解，氨基酸序列描述的是编码该多肽的这类多核苷酸ORF。
仅示出了每个核酸序列的一条链，任何对所显示链的提及应当理解为包括互补链在内。由于一级核酸序列的互补序列和反向互补序列必然由该一级序列公开，所以任何对核酸序列的提及也包括该核酸序列的互补序列和反向互补序列在内，除非另有明确说明(或者从其中出现该序列的语境可清楚看出并非如此)。此外，如本领域理解的那样，RNA链的核苷酸序列由转录成该RNA链的DNA的序列决定(但是用尿嘧啶(U)核碱基置换胸腺嘧啶(T))，所以任何对编码RNA序列的DNA序列的提及都包括该RNA序列在内。在随附的序列表中：
SEQ ID NO:1示出了含有示例性WCR spt6 DNA(在本文中的一些地方称之为WCRspt6或WCR spt6-1)的重叠群：
GTCACTTGTCAATTGTCAACCTGGAAAACGACTTGTCGAAGTCGCATAGTTTTTATAAGTTTAAATAAACTAAATTAAATATAAATACTTCGAGAATGCAATAATTATTATTCTTTAACTAGACCCACAGCTTATTAATTAGCAGAAGTAGTAGCAGACTTATACTAACTAGCATAAGGAGAAACATATTAACATAACATGGCAGACTTCATAGATTCTGAAGCAGAAGAAAGTAGTGAGGAGGAGGAATTAGATCATAGGGATCGTAAAAAAGCCCAAAAAGCCAAAGTTGTAGATAGTTCAGATGAAGATGATGAAGATGATGACGAAAGACTGAGAGAGGAATTAAAGGATTTGATTGATGATAATCCTATTGAAGAAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTTCAGGAAGGGAAAAACGTAAGAAATCTGACGACGAGGATTTGGATGATCGACTGGAAGATGAAGATTATGATTTGCTTGAAGAAAATTTGGGTGTTAAAGTTGAAAGAAGGAAATTCAAGCGACTGCGGCGTTTTGAAGATGAAGAAAGTGAAGGAGAAGAAGAACATGATCCTGAACAAGATAGGGAACAAATTGCTATGGATATATTTTCAGATGATGACGATGAAAGACGATCAGAACGAAGTCACAGACCTGCCGTCGAACAAGAAACTTATGGTGTAGGCGAGGAAGAAGAGGAAGGGGAGTACTCGGATGCCGATGATTTTATAGTTGACGATGACGGTAGACCGATAGCTGAAAAGAAGAAGAAGAAAAAACCAATATTTACTGATGCCGCTCTCCAAGAGGCTCAAGAAACCTTCGGTGTCGATTTTGATTATGATGAATTTAGTAAATACGATGAAGATGATTACGAAGATGAAGAGGAGGAGGATGACGAATACGAGGAAGATGATGTAGAGAAAAGGAAACGGCCTAAAAAGACTTCAAAGAAAAAACCGACGAAGAAATCCATTTTTGAAGTGTATGAACCTAGTGAACTTAAAAGAGGGTTCTTTACCGATCTCGATAATGAAATCCGAAACACTGATATTCCCGAAAGAATGCAACTTCGTGATGTTCCAATCACCGCTGTTCCGGATGACTCAACTGAACTTGATGATGAAGCAGAATGGATTTACAGGCAAGCGTTTTGTAACAGAACTGTTTCCAATGTGGATTCTCATTTATCATCAGAGGCAAGAGAGAAATTAAAGAAGACTCATCATGCCATCGGAAAAATCAGAAAAGCATTAGATTTTATAAGAAATCAACAATTAGAAGTACCGTTTATTGCTTTTTATAGAAAGGAGTATGTTCAACCGGAACTTAATATTAACGATTTGTGGAAAGTATATAAATACGATGCAAAGTGGTGCCAATTGAAAACACGCAAAGAAAACCTCTTGAAGCTTTTTGAAAAAATGAGGTCATATCAAACTGACCACATAATGAAAGATCCAGATGCACCAATTCCAGACAACCTTCGTATTATGACTGAGTCCGACATTGAGCGATTGAAAAATGTTCAAACCGCCGAAGAGTTAAATGACGTTCACAATCATTTCATTTTATATTATGCTGCAGATTTGCCAGCCATGCATGCCGCGTGGAGAGTCAAAGAAAGAGAAAGGAGAAGACAGGAAAGAAAGGAGGCTAGACTTAAGCTCATCGCTGAAAGTGAAGAAGGTGCTGAAATTCCTGAAGAGCCTGAGGAAATTGACGATGATGAACCAGAAGCTGAAACCTTAAAATACGCCAATAGATCAGGCAGCTATGCACTATGTAATAAAGGAGGTTTGGGTCCTCTAGCGAAGAAATTTGGTTTAACGCCTGAAGAATTTGCCGAAAACCTGAGAGATAATTATCAGAGGCACGAAGTAGATCAAGAACATATAGAACCTGTAGAAGTCGCTAAAGAATTCGTATCGCCGAAATTTCCTACAGTGGAAGAAGTGTTGCAAGCTACTAAACACATGGTAGCTTTACAAATAGCAAGAGAACCATTAGTAAGGAAATGCGTAAGAGAAATTTTCTTTGAACGAGCTAGATTAAACGTTTATCCAACCAAAAAGGGTGTGAAAGTTATAGATGAAGCTCATAATTGCTATAGTATGAAGTATGTAAAAAATAAACCAGTAAGAGATCTTGCAGGCGACCAATTTTTAAAATTATGTTTAGCCGAAGAGGAGAACCTCCTTACTATTACCATCAATGACCATATTCAAGGAAACACTACTAACAATTACATTGATGAAGTCAAACAATTATATATAAAGGATGAATTCAGCAAACACGTTCAGGATTGGAATGCGCTAAGAATGGAATCGGTAGAAAGGGCTTTAACGAAAAGTGTCTTACCAGATTTAAGATCTGAATTAAAACGAACGTTGCTCACAGAGGCTAAAGAATTCGTATTAAAAGCTTGCTGTAGAAAATTATATAATTGGATAAAGATTGCTCCATACGCAATAACTTTTCCCGATGAAGACGAAGATGATTGGGATACATCCAAAGGTGTTAGAACTATGGGTGTAGCATACGTACCAGAGCACACAGTATCAGCTTTTACCTGTATTTCAGCACCAGACGGAGATATAACTGATTATCTCAGATTACCAAATATTCTAAAAAGAAAAAATAGCTTTCGAACTGAAGAAAAACTTATGAAGGAAGCTGATCTTCAAGCACTGAAAAATTTCATATTCCTTAAAAAGCCTCATGTGATAGCAGTAGGGGGTGAGTCCAGAGAAGCCTTAATGATCGCTGATGATATCAGAGGAGTAATAAGTGAACTAATAGAATCCGACCAATTCCCACAGATTAGGGTTGAAATTATTGATAATGAATTAGCCAAAGTGTACGCAAATTCCATTAAAGGTTCAACTGATTTCAGAGATTATCCAGAGTTGTTAAGGCAAGCTATTTCATTAGCTCGAAGAATGCAAGATCCTTTGGTTGAATTTTCCCAATTATGTAATAGCGATGAGGAAATTTTGAGTCTGAGGTTTCATCCCTTGCAGGAACAAGTCCAGAAAGAAGAACTACTAGAAGCTCTCTGTTTAGAATTTGTCAACAGAACAAATGAAGTAGGTGTAGATATAAATCTTGCCGTTCAGCAGATTCATAAAAGTAGTTTAGTTCAATTCATATGCGGTCTAGGACCGCGTAAAGGTCAAGCGTTACTTAAAGTTCTGAAACAAACTAATCAGAGGCTTGAAAACAGAACCCAATTGGTTACATTTTGTCATATGGGTCCAAAAGTTTTTATTAATTGTTCTGGATTCATAAAGATTGATACCAATAGTTTAGGAGACAGTACTGAGGCATATGTTGAAATATTGGATGGCTCTCGAGTTCATCCCGAAACTTATGAATGGGCACGAAAAATGGCTGTGGATGCTTTAGAATATGACGATGATGAGGGAGCTAATCCGGCGGGAGCTTTAGAGGAAATTCTCGAGGCGCCAGAGAGGTTAAAAGATCTTGACTTGGATGCATTTGCGGAGGAATTGGAAAGACAAGGATTTGGTAACAAGAGTATAACATTGTATGACATTAGAGCAGAACTGAACTCGCGATATAAAGATTTGAGACAACCTTTTCGTTCTGCAAATCCTGAAGAACTATTCGATATGCTTACTAAAGAAACTCCCGAAACATTTTATATTGGAAAAATGGTTACATCTACCGTGTTTGGCATTGCAAGGAGAAAACCAAAGTCAGACCAGCTCGATCAAGCTAATCCGGTCCGTAATGACGAAACTGGTTTGTGGCAGTGCCCCTTCTGTTTGAAAAATGATTTTCCTGAATTATCTGATGTATGGAATCATTTTGATGCAGGAGCATGTCCTGGTCAAGCTACTGGAGTTAAACTAAGACTGGATAATGGTATATTAGGTTATATTTATATAAAAAATATAAGCGACAAACCAGTTGCTAATCCGGAAGAAAGAGTAGGCATAGGACAATTAATTCACTGTAGAATAATAAAAATTGACGTAGAGAAGTTTAGTGTTGATTGTACATCGAAATCTAGCGATCTTGCTGATAAAAATCATGAATGGAGACCTCAACGAGATCCTCATTATGATCAAGAACGTGAAGACAAAGACAATCGATTAGAAGCCGAGAAGAAGAAAGAGAAACAGCGTATGACGTACATCAAGAGGGTTATCGTTCATCCGGCGTTCCATAACATATCCTATGCCGAAGCCGAAAAATGTATGGTTAATATGGACCAGGGTGAAGTTATCATTAGGCCTTCGAGTAAGGGTGCGGATCATTTGACCATTACTTGGAAGGTTACGGATGGAATCTATCAACACATTGATATTAAGGAACAAGGGAAAGTTAACGCTTTTTCTTTAGGAAAATCATTATGGATTGGAAATGAAGAATTTGAAGATCTTGATGAAATAATAGCTAGGCACGTTACACCAATGGCGGCGCATGCTAGAGATTTACTGTATTTTAGGTATTACAAAGATTTCCAAGGTGGTCATAAAGATAAGGCTGAGGAATATCTAAAAGATGAAAAAAAGAAAAATGCTTCTAAAATTCATTATGTAGTTAGTGCTGCTAAGAATATACCTGGTAAATTTCTTCTTTCGTACCTTCCACGCAACAAAGTTAGACACGAATATGTAACAGTTACTCCAGAAGGCTTTCGGTTTAGACAACAAATGTTTGATTCCGTTTCTTCGTTATTTAAATGGTTCAAAGAACATTTCCGGGAGCCTCCACCAGGCGGTGCAACACCAGGTAGCACGCCAAGGATGGCTTCAAGCAGAACTGGATATGGAAGTGCCACACCCGCGTATAGTATGAATAATGAAGCTATTCAAAGAGTTGCTCAAAATTTACCAAGTCATGTAGTTCAAGCGTTATCTGCTGCCACCAACCAAACTCCACATTATCCCCACACCCCTGGTTATGGAGGCAATTATATTAATACGCCTTACACTCCAAGTGGTCAAACTCCATACATGACTCCGTACGCTACACCCCATACGCAGCAAACTCCCCGCTATGGTCATCAAACACCTTCCCAACACATGGCGAGCTCAGCACCACAAGGTCTCAACAATCCCTTTTTACATCCTGGCGCGGTGACTCCCTCCCAACGAACTCCTATTTATCGCAACCATCCTGCACAATCTCCAGTAATGCTTCCTACAAGCCCTGTACCAAGTCCAGGTTCCCAGAGTTCATACAGTAGTCATTTAAGTCATAATCAGCGAAGTGGAAGTTATGCTGAATCCTTAAGATTCCAACCTCCCGAATCGCCGAGAAGCTCAGTGAGTAATAGAAGCTTTCAAACTGATAGATACGGCGGTGATAGGTATGGTAAAGGAGGAAGTCATAGATATGGTGGAAGCTCAAACGAAGATAGATATGGTAAGGGAGGAGGAGGAAATGAAAATACGGATTGGCAGAAAGCTGCAGAAGCATGGGCTCGATCTAGATCTACTCCGAGAAGTGATGGCCGTAATACTCCAAGATCTGTAGGTCAACGAACTCCTAGATACGACAACGACGCCGAACGTTCTAGAATGAAACACCTCAGCAAGAGCCCGAGGTCTGTTAGGTCTACTCCTCGAACCAATACATCTCCACATTCTATGTCCCTAGGTGATGCTACCCCTCTGTATGACGAAAGTATCTAAATTACTTTGTATTTGGTTATATAGTAGGGTAACAGTGATATTGTAAATGCTAAAATCAACAATACAGATTCGCGATATTAAGTCACAATGACGACCTCTCGTGGAGTTCGGTGAAACTAACTTTGAGGGCGTTTTCACTGTCAAACGTCCAGCGCACATGCACCTGAAACAAGTAGGCAATATTCATTATTTATTTTTACAGGTTTTTTATACAAATATTATTTACAACATAGACTTCAACTTTTACTGAAAGGTGAAGCTTTCATATTAATAATTTT
SEQ ID NO:2示出了由示例性WCR spt6 DNA(在本文中的一些地方称之为WCRSPT6或WCR SPT6-1)编码的SPT6多肽的氨基酸序列：
MADFIDSEAEESSEEEELDHRDRKKAQKAKVVDSSDEDDEDDDERLREELKDLIDDNPIEESDAESDASGREKRKKSDDEDLDDRLEDEDYDLLEENLGVKVERRKFKRLRRFEDEESEGEEEHDPEQDREQIAMDIFSDDDDERRSERSHRPAVEQETYGVGEEEEEGEYSDADDFIVDDDGRPIAEKKKKKKPIFTDAALQEAQETFGVDFDYDEFSKYDEDDYEDEEEEDDEYEEDDVEKRKRPKKTSKKKPTKKSIFEVYEPSELKRGFFTDLDNEIRNTDIPERMQLRDVPITAVPDDSTELDDEAEWIYRQAFCNRTVSNVDSHLSSEAREKLKKTHHAIGKIRKALDFIRNQQLEVPFIAFYRKEYVQPELNINDLWKVYKYDAKWCQLKTRKENLLKLFEKMRSYQTDHIMKDPDAPIPDNLRIMTESDIERLKNVQTAEELNDVHNHFILYYAADLPAMHAAWRVKERERRRQERKEARLKLIAESEEGAEIPEEPEEIDDDEPEAETLKYANRSGSYALCNKGGLGPLAKKFGLTPEEFAENLRDNYQRHEVDQEHIEPVEVAKEFVSPKFPTVEEVLQATKHMVALQIAREPLVRKCVREIFFERARLNVYPTKKGVKVIDEAHNCYSMKYVKNKPVRDLAGDQFLKLCLAEEENLLTITINDHIQGNTTNNYIDEVKQLYIKDEFSKHVQDWNALRMESVERALTKSVLPDLRSELKRTLLTEAKEFVLKACCRKLYNWIKIAPYAITFPDEDEDDWDTSKGVRTMGVAYVPEHTVSAFTCISAPDGDITDYLRLPNILKRKNSFRTEEKLMKEADLQALKNFIFLKKPHVIAVGGESREALMIADDIRGVISELIESDQFPQIRVEIIDNELAKVYANSIKGSTDFRDYPELLRQAISLARRMQDPLVEFSQLCNSDEEILSLRFHPLQEQVQKEELLEALCLEFVNRTNEVGVDINLAVQQIHKSSLVQFICGLGPRKGQALLKVLKQTNQRLENRTQLVTFCHMGPKVFINCSGFIKIDTNSLGDSTEAYVEILDGSRVHPETYEWARKMAVDALEYDDDEGANPAGALEEILEAPERLKDLDLDAFAEELERQGFGNKSITLYDIRAELNSRYKDLRQPFRSANPEELFDMLTKETPETFYIGKMVTSTVFGIARRKPKSDQLDQANPVRNDETGLWQCPFCLKNDFPELSDVWNHFDAGACPGQATGVKLRLDNGILGYIYIKNISDKPVANPEERVGIGQLIHCRIIKIDVEKFSVDCTSKSSDLADKNHEWRPQRDPHYDQEREDKDNRLEAEKKKEKQRMTYIKRVIVHPAFHNISYAEAEKCMVNMDQGEVIIRPSSKGADHLTITWKVTDGIYQHIDIKEQGKVNAFSLGKSLWIGNEEFEDLDEIIARHVTPMAAHARDLLYFRYYKDFQGGHKDKAEEYLKDEKKKNASKIHYVVSAAKNIPGKFLLSYLPRNKVRHEYVTVTPEGFRFRQQMFDSVSSLFKWFKEHFREPPPGGATPGSTPRMASSRTGYGSATPAYSMNNEAIQRVAQNLPSHVVQALSAATNQTPHYPHTPGYGGNYINTPYTPSGQTPYMTPYATPHTQQTPRYGHQTPSQHMASSAPQGLNNPFLHPGAVTPSQRTPIYRNHPAQSPVMLPTSPVPSPGSQSSYSSHLSHNQRSGSYAESLRFQPPESPRSSVSNRSFQTDRYGGDRYGKGGSHRYGGSSNEDRYGKGGGGNENTDWQKAAEAWARSRSTPRSDGRNTPRSVGQRTPRYDNDAERSRMKHLSKSPRSVRSTPRTNTSPHSMSLGDATPLYDESI
SEQ ID NO:3示出了在一些实例中用于产生dsRNA的示例性WCR spt6DNA，在本文中的一些地方称之为WCR spt6-1 reg1(区域1)：
CGCCTTACACTCCAAGTGGTCAAACTCCATACATGACTCCGTACGCTACACCCCATACGCAGCAAACTCCCCGCTATGGTCATCAAACACCTTCCCAACACATGGCGAGCTCAGCACCACAAGGTCTCAACAATCCCTTTTTACATCCTGGCGCGGTGACTCCCTCCCAACGAACTCCTATTTATCGCAACCATCCTGCACAATCTCCAGTAATGCTTCCTACAAGCCCTGTACCAAGTCCAGGTTCCCAGAGTTCATACAGTAGTCATTTAAGTCATAATCAGCGAAGTGGAAGTTATGCTGAATCCTTAAGATTCCAACCTCCCGAATCGCCGAGAAGCTCAGTGAGTAATAGAAGCTTTCAAACTGATAGATACGGCGGTGATAGGTATGGTAAAGGAGGAAGTCATAGATATGGTGGAAGCTCAAACGAAGATAGATATGGTAAGGGAGGAGGAGGAAATGAAAATACGGATTGGCAGAAAGCTGCAGAAGCATG
SEQ ID NO:4示出了在一些实例中用于产生dsRNA的另外的示例性WCR spt6 DNA，在本文中的一些地方称之为WCR spt6-1 v1(版本1)：
GACTCCGTACGCTACACCCCATACGCAGCAAACTCCCCGCTATGGTCATCAAACACCTTCCCAACACATGGCGAGCTCAGCACCACAAGGTCTCAACAATCCCTTTTTACATCCTGGCGCGGTGACTCCCTCCCAACGAACTCCT
SEQ ID NO:5示出了在一些实例中用于产生dsRNA的另外的示例性WCR spt6 DNA，在本文中的一些地方称之为WCR spt6-1 v2(版本2)：
AGAGTTCATACAGTAGTCATTTAAGTCATAATCAGCGAAGTGGAAGTTATGCTGAATCCTTAAGATTCCAACCTCCCGAATCGCCGAGAAGCTCAGTGAGTAATAGAA
SEQ ID NO:6示出了T7噬菌体启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7示出了示例性YFP编码区的片段。
SEQ ID NO:8-13示出了用来扩增示例性WCR spt6多核苷酸的部分的引物，所述多核苷酸在一些实例中用于产生dsRNA，包括spt6-1 reg1、spt6-1 v1和spt6-1 v2。
SEQ ID NO:14示出了示例性YFP基因。
SEQ ID NO:15示出了膜联蛋白区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:16示出了膜联蛋白区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:17示出了β血影蛋白2区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:18示出了β血影蛋白2区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:19示出了mtRP-L4区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:20示出了mtRP-L4区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:21-48示出了用来扩增膜联蛋白、β血影蛋白2、mtRP-L4和YFP的基因区域以合成dsRNA的引物。
SEQ ID NO:49示出了编码TIP41样蛋白的玉蜀黍DNA序列。
SEQ ID NO:50示出了T20VN引物寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:51-61示出了用于分析玉蜀黍中的dsRNA转录物表达的引物和探针。
SEQ ID NO:62示出了用于检测二元载体主干的SpecR编码区的一部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO:63示出了用于分析基因组拷贝数的AAD1编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64示出了玉蜀黍转化酶基因的DNA序列。
SEQ ID NO:65-73示出了用于确定基因拷贝数和检测二元载体主干的DNA寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:74-79示出了可在一些实施方案中用于dsRNA转录物玉蜀黍表达分析的引物和探针。
SEQ ID NO:80示出了示例性接头多核苷酸，其在RNA转录物中转录时形成“环”以形成发夹结构：
AGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCATCAGAAAGTCATTGTGTATATCTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTTCCCTTCCGTAGTCAGAGTCATCAATCAGCTGCACCGTGTCGTAAAGCGGGACGTTCGCAAGCTCGT
SEQ ID NOs:81-84示出了从包含示例性spt6多核苷酸及其片段的核酸转录的RNA。
具体实施方式
I.若干实施方案的概述
我们使用表达dsRNA的转基因植物最可能靶向的害虫物种之一西方玉米根虫，将RNA干扰(RNAi)开发为管理昆虫害虫的工具。迄今为止，被提议作为根虫幼虫中RNAi的靶标的大多数基因实际上并没有实现其目的。我们在本文中描述了示例性昆虫害虫西方玉米根虫中由RNAi介导的对转录延伸因子(spt6)的敲低，当例如在经由摄入的spt6 dsRNA来递送iRNA分子时，所述敲低显示出具有致命的表型。在本文的实施方案中，通过进食向昆虫递送spt6 dsRNA的能力赋予了对管理昆虫(例如鞘翅目)害虫非常有用的RNAi效应。通过将spt6介导的RNAi与其他有用的RNAi靶标(例如，ROP RNAi靶标，如美国专利申请号14/577,811中所述；RNA聚合酶I1RNAi靶标，如美国专利申请号62/133,214中所述；RNA聚合酶II140RNAi靶标，如美国专利申请号14/577,854中所述；RNA聚合酶II215RNAi靶标，如美国专利申请号62/133,202中所述；RNA聚合酶II33 RNAi靶标，如美国专利申请号62/133,210中所述，ncmRNAi靶标，如美国专利申请号62/095487中所述；Dre4 RNAi靶标，如美国专利申请号14/705,807中所述；COPIαRNAi靶标，如美国专利申请号62/063,199中所述；COPIβRNAi靶标，如美国专利申请号62/063,203中所述；COPIγRNAi靶标，如美国专利申请号62/063,192中所述；COPIδRNAi靶标，如美国专利申请号62/063,216中所述；以及转录伸长因子spt5 RNAi靶标，如美国专利申请号62/168613中所述)相结合，影响根虫(例如幼虫状态根虫)中的多重靶标序列的潜力可增加开发出涉及RNAi技术的可持续性昆虫害虫管理方法的机会。
本文公开了用于遗传控制昆虫(例如鞘翅目)害虫侵染的方法和组合物。还提供了用于鉴定昆虫害虫的生命周期所必需的一个或多个基因以用作RNAi介导的昆虫害虫群体控制的靶标基因的方法。可以设计编码RNA分子的DNA质粒载体，来阻抑生长、存活和/或发育所必需的一个或多个靶标基因。在一些实施方案中，所述RNA分子可能能够形成dsRNA分子。在一些实施方案中，提供了经由与昆虫害虫中的靶标基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转录后阻遏靶标基因表达或抑制靶标基因的方法。在这些和另外的实施方案中，害虫可摄入一种或多种从与靶标基因的编码或非编码序列互补的核酸分子的全部或一部分转录的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA分子，从而提供植物保护效果。
因此，一些实施方案涉及使用与一个或多个靶标基因的编码序列和/或非编码序列互补的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA对靶标基因产物的表达进行序列特异性抑制，以实现对昆虫(例如鞘翅目)害虫的至少部分控制。公开了一组经分离和纯化的核酸分子，其包含例如如以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的片段和前述各者的互补序列示出的多核苷酸。在一些实施方案中，可由这些多核苷酸、其片段或包含这些多核苷酸中的一者的基因表达稳定化的dsRNA分子，用于转录后沉默或抑制靶标基因。在某些实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:1和3-5和/或其互补序列中任一者的全部或部分。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如dsRNA)分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞(例如植物细胞)。在特定的实施方案中，编码的dsRNA分子可以在被昆虫(例如鞘翅目)害虫摄入时提供，用于转录后沉默或抑制害虫中靶标基因的表达。所述重组DNA可包含例如：SEQ ID NO:1和3-5中的任一者；SEQ ID NO:1和3-5中任一者的片段；以及由包含SEQ ID NO:1和3-5和/或其互补序列中的一者的基因的部分序列组成的多核苷酸。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如dsRNA)分子的重组DNA的重组宿主细胞，所述iRNA分子包含SEQ ID NO:81的全部或部分(例如，选自SEQ IDNO:82-84的至少一种多核苷酸)，或其互补序列。当被昆虫(例如鞘翅目)害虫摄入时，所述一种或多种iRNA分子可沉默或抑制靶标spt6 DNA(例如，包含选自SEQ ID NO:1和3-5的多核苷酸的全部或部分的DNA)在害虫或害虫后代中的表达，从而造成害虫的生长、发育、生存力和/或进食停止。
在一些实施方案中，在其基因组中具有编码能够形成dsRNA分子的至少一种RNA分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞可以是经转化植物细胞。一些实施方案涉及包含这样的经转化植物细胞的转基因植物。除此类转基因植物之外，还提供了任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子和转基因植物产品，它们中的每一者都包含一种或多种重组DNA。在特定的实施方案中，可以在转基因植物细胞中表达能够形成dsRNA分子的RNA分子。因此，在这些和其他实施方案中，可以从转基因植物细胞分离dsRNA分子。在特定的实施方案中，所述转基因植物是选自玉米(Zea mays)和禾本科(Poaceae)植物的植物。
一些实施方案涉及用于调控昆虫(例如鞘翅目)害虫细胞中靶标基因的表达的方法。在这些和其他实施方案中，可提供核酸分子，其中该核酸分子包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸。在特定的实施方案中，编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸可以可操作地连接到启动子，并且还可以可操作地连接到转录终止序列。在特定的实施方案中，用于调控昆虫害虫细胞中靶标基因的表达的方法可包括：(a)用包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸的载体转化植物细胞；(b)在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化植物细胞；(c)选择已将所述载体整合到其基因组中的经转化植物细胞；以及(d)确定选择的经转化植物细胞包含能够形成由所述载体的多核苷酸编码的dsRNA分子的RNA分子。可以从基因组中整合有载体并且包含由该载体的多核苷酸编码的dsRNA分子的植物细胞再生植物。
因此，还公开了在其基因组中整合有载体的转基因植物，所述载体具有编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸，其中所述转基因植物包含由所述载体的多核苷酸编码的dsRNA分子。在特定的实施方案中，在植物中表达能够形成dsRNA分子的RNA分子足以调控接触所述经转化的植物或植物细胞(例如，通过以所述经转化植物、该植物的一部分(例如根)或植物细胞为食)的昆虫(例如鞘翅目)害虫的细胞中靶标基因的表达，使得害虫的生长和/或存活受抑制。本文公开的转基因植物可显示出对昆虫害虫侵染的防护性和/或增强的防护性。特定的转基因植物可显示出对一种或多种选自下列的鞘翅目害虫的防护性和/或增强的防护性：WCR、NCR、SCR、MCR、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、南美叶甲和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
本文还公开了用于将控制剂(诸如iRNA分子)递送到昆虫(例如鞘翅目)害虫的方法。此类控制剂可直接或间接地削弱昆虫害虫群体进食、生长或以其他方式造成宿主损坏的能力。在一些实施方案中，提供了一种方法，包括将稳定化的dsRNA分子递送到昆虫害虫以阻抑该害虫中的至少一种靶标基因，从而造成RNAi并减轻或消除害虫宿主的植物损坏。在一些实施方案中，抑制昆虫害虫中靶标基因的表达的方法可引起害虫的生长、存活和/或发育停止。
在一些实施方案中，提供了包含iRNA(例如dsRNA)分子的组合物(例如局部用组合物)，以供在植物、动物和/或植物或动物的环境中使用，旨在消除或减轻昆虫(例如鞘翅目)害虫侵染。在特定的实施方案中，该组合物可以是要喂食给昆虫害虫的营养组合物或食物来源。一些实施方案包括使害虫可得到所述营养组合物或食物来源。摄入包含iRNA分子的组合物可引起该分子被害虫的一个或多个细胞摄取，进而可引起对害虫一个或多个细胞中的至少一种靶标基因表达的抑制。通过在害虫的宿主中提供一种或多种包含iRNA分子的组合物，可以在任何存在害虫的宿主组织或环境之中或之上，限制或消除由于昆虫害虫侵染造成的对植物或植物细胞的摄入或损害。
将dsRNA与食物或引诱剂或这二者混合时，形成RNAi诱饵。害虫吃下诱饵时，还会吃掉dsRNA。诱饵可采取颗粒、凝胶、可流动粉末、液体或固体的形式。在特定的实施方案中，可将pt6掺入诱饵制剂中，诸如美国专利号8,530,440中所述，该专利据此以引用方式并入本文。一般说来，在使用诱饵的情况下，把诱饵放置在昆虫害虫的环境中或周围，这样，例如WCR就可接触到诱饵并且/或者被诱饵吸引。
本文公开的组合物和方法可与用于控制昆虫(例如鞘翅目)害虫所致损害的其他方法和组合物一同结合使用。例如，如本文所述的用于保护植物免受昆虫害虫损害的iRNA分子可在这样的方法中使用：该方法包括额外使用一种或多种对昆虫害虫有效的化学药剂、对这种害虫有效的生物杀虫剂、作物轮作、表现出与RNAi介导的方法和RNAi组合物的特征不同的特征(例如，在植物中重组产生对昆虫害虫有害的蛋白质(例如Bt毒素)的重组基因技术，和/或重组表达其他iRNA分子。
II.缩写
dsRNA 双链核糖核酸
GI 生长抑制
NCBI 美国国家生物技术信息中心
gDNA 基因组脱氧核糖核酸
iRNA 抑制性核糖核酸
ORF 开放阅读框
RNAi 核糖核酸干扰
miRNA 微小核糖核酸
shRNA 小发夹核糖核酸
siRNA 小抑制性核糖核酸
hpRNA 发夹核糖核酸
UTR 非翻译区
WCR 西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)
NCR 北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)
MCR 墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)
PCR 聚合酶链式反应
qPCR 定量聚合酶链式反应
RISC RNA诱导的沉默复合物
SCR 南方玉米根虫(十一星根萤叶甲)
SEM 平均值标准误差
YFP 黄色荧光蛋白
III.术语
在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚且一致的理解，包括要给予此类术语的范围，提供了以下定义：
鞘翅目害虫：如本文所用，术语“鞘翅目害虫”是指鞘翅目(Coleoptera)的害虫昆虫，包括以农作物和作物产品(包括玉米和其他真正的禾本科)为食的叶甲属害虫昆虫。在特定的实例中，鞘翅目害虫选自以下清单：玉米根萤叶甲(WCR)、巴氏根萤叶甲(NCR)、十一星根萤叶甲(SCR)、墨西哥玉米根萤叶甲(MCR)、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、南美叶甲和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
(与生物体)接触：如本文所用，与生物体(例如鞘翅目害虫)“接触”或被生物体“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括核酸分子内化到生物体中，例如但不限于：生物体摄入所述分子(例如通过进食)；使生物体与包含核酸分子的组合物接触；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物体。
重叠群：如本文所用，术语“重叠群”是指由来源于单个遗传来源的一组重叠DNA区段重建的DNA序列。
玉米植物：如本文所用，术语“玉米植物”是指物种玉蜀黍(Zea mays)的植物。
表达：如本文所用，编码多核苷酸(例如，基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括例如gDNA或cDNA)的编码信息转化为细胞的操作部分、非操作部分或结构性部分，通常包括蛋白质的合成。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调控。调控基因表达例如通过控制对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(诸如mRNA)降解的作用，或通过在特异性蛋白分子已产生之后的活化、失活、区室化或降解，或这些的组合而发生。基因表达可通过本领域已知的任何方法，包括但不限于Northern印迹法、RT-PCR、Western印迹法，或者体外、原位或活体内蛋白质活性测定法，在RNA水平或蛋白质水平测量。
遗传物质：如本文所用，术语“遗传物质”包括所有的基因和核酸分子，诸如DNA与RNA。
抑制：如本文所用，术语“抑制”在用来描述对编码多核苷酸(例如基因)的作用时，是指从该编码多核苷酸转录的mRNA和/或该编码多核苷酸的肽、多肽或蛋白质产物在细胞水平上可测量地减少。在一些实例中，抑制编码多核苷酸的表达可使得表达近似消失。“特异性抑制”是指在正实现特异性抑制的细胞中对靶标编码多核苷酸的抑制不随之对其他编码多核苷酸(例如基因)的表达产生影响。
昆虫：如本文所用，就害虫而言，术语“昆虫害虫”具体包括鞘翅目昆虫害虫。在一些实例中，术语“昆虫害虫”具体指的是选自以下清单的叶甲属鞘翅目害虫：玉米根萤叶甲(WCR)、巴氏根萤叶甲(NCR)、十一星根萤叶甲(SCR)、墨西哥玉米根萤叶甲(MCR)、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、南美叶甲和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
经分离的：“经分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已从该组分所天然存在的生物体细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白质)基本上分开、分开产生或纯化出来，同时实现组分中的化学或功能变化(例如，核酸可通过断开将该核酸连接到染色体中的其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“经分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达而制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：如本文所用，术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合形式，可包括RNA、cDNA、gDNA的有义链和反义链两者，以及上述各项的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核碱基可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或这两种类型核苷酸中任一者的修饰形式。如本文所用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。按照惯例，核酸分子的核苷酸序列从该分子的5’端向3’端阅读。核酸分子的“互补序列”是指具有可与该核酸分子的核碱基形成碱基对(即A-T/U和G-C)的核碱基的多核苷酸。
一些实施方案包括含有转录为RNA分子的模板DNA的核酸，所述RNA分子是mRNA分子的互补序列。在这些实施方案中，转录为mRNA分子的核酸的互补序列以5’至3’取向存在，使得RNA聚合酶(其以5’至3’方向转录DNA)将从互补序列转录出可与mRNA分子杂交的核酸。因此，除非另有明确说明或者从上下文可清楚看出另有所指，术语“互补序列”是指从5’至3’具有可与参考核酸的核碱基形成碱基对的核碱基的多核苷酸。类似地，除非另有明确说明(或者从上下文可清楚看出另有所指)，核酸的“反向互补序列”是指取向相反的互补序列。前述内容在以下图解中演示：
ATGATGATG 多核苷酸
TACTACTAC 多核苷酸的“互补序列”
CATCATCAT 多核苷酸的“反向互补序列”
本发明的一些实施方案可包括形成发夹RNA的RNAi分子。在这些RNAi分子中，RNA干扰所靶向的核酸的互补序列和所述反向互补序列两者可出现在同一个分子中，使得单链RNA分子可以“折叠”到包含互补多核苷酸和反向互补多核苷酸的区域上并在该区域上与自身杂交。
“核酸分子”包括所有的多核苷酸，例如：单链和双链形式的DNA；单链形式的RNA；和双链形式的RNA(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义链和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(小发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转移RNA，无论是装载有还是卸下了相应的酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、gDNA和DNA-RNA杂交体。术语“多核苷酸”和“核酸”及其“片段”，本领域技术人员会将其理解为这样的术语：包括两种gDNA、核糖体RNA、转移RNA、信使RNA、操纵子，以及较小的工程化改造多核苷酸(其编码或可适于编码肽、多肽或蛋白质)。
寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长的核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪允许合成长度多达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核酸结合，所以可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可在PCR(一种用于扩增DNA的技术)中使用。在PCR中，寡核苷酸通常被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
核酸分子可包括天然存在的核苷酸和/或经修饰的核苷酸，它们通过天然存在的核苷酸连接和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。如本领域技术人员易于理解的那样，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物置换天然存在的核苷酸中的一者或多者、核苷酸间修饰(例如不带电连接：例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如肽类；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；以及经修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的、圆形的和挂锁形的(padlocked)构象。
如本文所用，就DNA而言，术语“编码多核苷酸”、“结构性多核苷酸”或“结构性核酸分子”是指这样的多核苷酸：在被置于适当的调控元件控制下时，经由转录和mRNA最终翻译成多肽。就RNA而言，术语“编码多核苷酸”是指翻译成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。编码多核苷酸的边界由5’-末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码子来确定。编码多核苷酸包括但不限于：gDNA、cDNA、EST和重组多核苷酸。
如本文所用，“转录的非编码多核苷酸”是指mRNA分子的未翻译成肽、多肽或蛋白质的区段，诸如5'UTR、3'UTR和内含子区段。另外，“转录的非编码多核苷酸”是指转录成在细胞中起作用的RNA的核酸，所述RNA例如结构性RNA(例如核糖体RNA(rRNA)，举例来说5SrRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和28S rRNA等)、转移RNA(tRNA)，以及snRNA诸如U4、U5、U6等。转录的非编码多核苷酸还包括(例如但不限于)小RNA(sRNA)，该术语通常用来描述小的细菌非编码RNA、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)和长的非编码RNA。还进一步，“转录的非编码多核苷酸”是指这样的多核苷酸：其可天然地在核酸中作为基因内的“间隔序列”存在，并且转录为RNA分子。
致命的RNA干扰：如本文所用，术语“致命的RNA干扰”是指造成向其递送例如dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和/或hpRNA的主体个体死亡或生存力下降的RNA干扰。
基因组：如本文所用，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色体DNA，也指存在于细胞的亚细胞组分内的细胞器DNA。在本发明的一些实施方案中，可将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可整合到植物细胞的核DNA中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。术语“基因组”在应用于细菌时，是指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本发明的一些实施方案中，可将DNA分子导入细菌中，使得该DNA分子整合到细菌的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可整合于染色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
序列同一性：如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽的语境下，是指在指定比较窗口上以最大对应性比对时，这两个分子的序列中相同的残基。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”可以指通过在比较窗口上比较分子的两个最佳比对序列(例如核酸序列或多肽序列)确定的值，其中为了实现这两个序列的最佳比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)。通过确定在两个序列中出现相同的核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认为与参考序列100％相同，反之亦然。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于例如以下文献中：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可从几个源头(包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD))获得并且可在互联网上获得，以便结合几种序列分析程序使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵的BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。在用这种方法评估时，与参考多核苷酸的序列具有甚至更大的序列相似性的核酸将显示同一性百分比增加。
可特异性杂交/特异性互补：如本文所用，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明足够程度的互补性的术语，该互补性足以使得在核酸分子与靶标核酸分子之间发生稳定且特异性的结合。两个核酸分子之间的杂交涉及在这两个核酸分子的核碱基之间形成反平行比对。然后，这两个分子能够与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够稳定，则可使用本领域熟知的方法检出。多核苷酸与其可特异性杂交的靶标核酸不一定是100％互补的。然而，对于特异性杂交必须存在的互补性的量随所使用的杂交条件而变化。
导致特定严格性程度的杂交条件将根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸的组成和长度而变化。一般说来，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交的严格性，但洗涤次数也影响严格性。有关获得特定严格性程度所需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且论述于例如以下文献中：Sambrook等人(编辑)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989年，第9和11章；以及Hames和Higgins(编辑)，Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，1985年。有关核酸杂交的进一步详细说明和指导可在以下文献中找到：例如Tijssen，"Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，载于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，Elsevier，NY，1993年；以及Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NY，1995年。
如本文所用，“严格条件”涵盖仅在杂交分子的序列与靶标核酸分子内的同源多核苷酸之间存在小于20％的错配时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文所用，“中等严格性”条件是序列错配超过20％的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件是错配超过10％的序列不会杂交的条件；而“极高严格性”条件是错配超过5％的序列不会杂交的条件。
以下是代表性的非限制性杂交条件。
高严格性条件(检测出共享至少90％序列同一性的多核苷酸)：在5x SSC缓冲液中在65℃下杂交16小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；以及在0.5x SSC缓冲液中在65℃下洗涤两次，每次20分钟。
中等严格性条件(检测出共享至少80％序列同一性的多核苷酸)：在5x-6x SSC缓冲液中在65-70℃下杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；以及在1x SSC缓冲液中在55-70℃下洗涤两次，每次30分钟。
非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的多核苷酸会杂交)：在6x SSC缓冲液中在室温至55℃下杂交16-20小时；在2x-3x SSC缓冲液中在室温至55℃下至少洗涤两次，每次20-30分钟。
如本文所用，就核酸而言，术语“基本上同源”或“实质性同源性”是指具有在严格条件下与参考核酸杂交的毗连核碱基的多核苷酸。例如，与SEQ ID NO:1和3-5中任一者所代表的参考核酸基本上同源的核酸是在严格条件(例如，前文示出的中等严格性条件)下与所述参考核酸杂交的那些核酸。基本上同源的多核苷酸可具有至少80％的序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可具有约80％至100％的序列同一性，诸如79％、80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交密切相关。例如，当存在足够程度的互补性时，核酸分子可特异性杂交，以避免核酸在期望特异性结合的情况下(例如，在严格杂交条件下)与非靶标多核苷酸非特异性结合。
如本文所用，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共同的祖先核酸演变、并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基因。
如本文所用，当以5’至3’方向阅读的多核苷酸的每个核苷酸与以3’至5’方向阅读时的另一多核苷酸的每个核苷酸互补时，两个核酸分子被认为表现出“完全互补性”。与参考多核苷酸互补的多核苷酸将表现出与所述参考多核苷酸的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中明确定义的，并且是本领域普通技术人员易于理解的。
可操作地连接：当第一多核苷酸与第二多核苷酸具有功能性关系时，则称所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸可操作地连接。以重组方式产生时，可操作地连接的多核苷酸一般是毗连的，并且在必要时可将两个蛋白质编码区连接在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的ORF中)。然而，可操作地连接的核酸不一定是毗连的。
术语“可操作地连接”在有关调控遗传元件和编码多核苷酸的情况下使用时，意味着该调控元件影响连接的编码多核苷酸的表达。“调控元件”或“控制元件”是指影响转录的时机和水平/量、RNA加工或稳定性、或者相关编码多核苷酸的翻译的多核苷酸。调控元件可包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏物结合多核苷酸、具有终止序列的多核苷酸、具有多聚腺苷酸化识别序列的多核苷酸，等等。特定的调控元件可位于与其可操作地连接的编码多核苷酸的上游和/或下游。而且，与编码多核苷酸可操作地连接的特定调控元件可位于双链核酸分子的相关互补链上。
启动子：如本文所用，术语“启动子”是指可以在转录起始上游、并且可能参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录的DNA区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作地连接，或者启动子可与编码信号肽的多核苷酸可操作地连接，所述多核苷酸可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作地连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞中的转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织。此类启动子被称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和存在光。组织特异性启动子、组织优先启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可以在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性的启动子。
在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而增大。示例性诱导型启动子包括但不限于：来自ACEI系统的响应于铜的启动子；来自玉蜀黍的响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的In2基因启动子；来自Tn10的Tet阻遏物；以及来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质类固醇激素诱导(Schena等人，1991年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。
示例性组成型启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，诸如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、来自水稻肌动蛋白基因的启动子、泛素启动子、pEMU、MAS、玉蜀黍H3组蛋白启动子和ALS启动子，欧洲油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段类似的多核苷酸)(国际PCT公布号WO96/30530)。
此外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先启动子。用包含与组织特异性启动子可操作地连接的编码多核苷酸的核酸分子转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码多核苷酸的产物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子优先启动子，诸如来自菜豆素基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，诸如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，诸如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，诸如来自Zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，诸如来自apg的启动子。
转化：如本文所用，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。在核酸分子通过将核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由细胞稳定复制的情况下，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文所用，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人，1986年，Nature 319:791-3)；脂质体转染(Felgner等人，1987年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等人，1978年，Cell 15:579-85)；农杆菌(Agrobacterium)介导的转移(Fraley等人，1983年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)；直接DNA摄取；以及微粒轰击(Klein等人，1987年，Nature 327:70)。
转基因：外源性核酸。在一些实例中，转基因可以是编码能够形成dsRNA分子的RNA的一条或两条链的DNA，所述dsRNA分子包含与存在于鞘翅目害虫中的核酸分子互补的多核苷酸。在另外的实例中，转基因可以是反义多核苷酸，其中所述反义多核苷酸的表达抑制靶标核酸的表达，从而产生RNAi表型。在又另外的实例中，转基因可以是基因(例如，除草剂耐受性基因、编码工业或药学上有用的化合物的基因，或者编码期望的农业性状的基因)。在这些和其他实例中，转基因可含有与转基因的编码多核苷酸可操作地连接的调控元件(例如启动子)。
载体：导入细胞中例如以产生经转化细胞的核酸分子。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的遗传元件，诸如复制起点。载体的实例包括但不限于：质粒、粘粒、噬菌体，或携带外源性DNA进入细胞的病毒。载体还可包括一种或多种基因(包括产生反义分子的基因和/或可选择标记基因)以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。载体任选地包括辅助核酸分子实现进入细胞的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对作物有害的鞘翅目害虫(其为本文的组合物和方法所靶向的害虫)的相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％或更大的稳定化产量的栽培种。
除非特别指明或暗示，如本文所用的术语“一个”、“一种”和“该/所述”表示“至少一个/种”。
除非另外特别地解释，否则本文使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可在以下出版物中找到：例如Lewin’s Genes X,Jones&Bartlett Publishers,2009(ISBN100763766321)；Krebs等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Meyers R.A.(编辑)，Molecular Biology andBiotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN
1-56081-569-8)。除非另外指明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。所有温度均以摄氏度计。
IV.包含昆虫害虫序列的核酸分子
A.概述
本文描述了可用于控制昆虫害虫的核酸分子。在一些实例中，昆虫害虫是鞘翅目昆虫害虫(例如，叶甲属中的鞘翅目害虫)。所描述的核酸分子包括靶标多核苷酸(例如，天然基因和非编码多核苷酸)、dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA和miRNA。例如，在一些实施方案中描述了dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子，这些分子可与鞘翅目害虫中的一种或多种天然核酸的全部或部分特异性互补。在这些和另外的实施方案中，一种或多种天然核酸可以是一种或多种靶标基因，其产物可以例如但不限于：参与代谢过程，或参与幼虫的发育。本文描述的核酸分子在导入包含与所述核酸分子特异性互补的至少一种天然核酸的细胞中时，可以在细胞中启动RNAi，因此降低或消除所述天然核酸的表达。在一些实例中，借助与靶标基因特异性互补的核酸分子降低或消除靶标基因的表达可造成害虫的生长、发育、生存力和/或进食减缓或停止。
在一些实施方案中，可以选择昆虫害虫中的至少一种靶标基因，其中该靶标基因包含spt6多核苷酸。在特定实例中，选择鞘翅目害虫中的靶标基因，其中该靶标基因包含选自SEQ ID NO:1和3-5的多核苷酸。
在一些实施方案中，靶标基因可以是包含这样的多核苷酸的核酸分子：该多核苷酸可以在硅片上(in silico)反向翻译为包含连续氨基酸序列的多肽，所述连续氨基酸序列与spt6多核苷酸的蛋白质产物的氨基酸序列至少约85％相同(例如，至少84％、85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或100％相同)。靶标基因可以是昆虫害虫中的任何spt6多核苷酸，转录后抑制该多核苷酸对害虫的生长、存活和/或生存力造成有害影响，例如旨在为植物提供对抗害虫的保护益处。在特定的实例中，靶标基因是包含这样的多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸可以在硅片上反向翻译为包含连续氨基酸序列的多肽，所述连续氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同或100％相同。
根据本发明提供了DNA，其表达产生包含多核苷酸的RNA分子，该多核苷酸与由昆虫(例如鞘翅目)害虫中的编码多核苷酸编码的天然RNA分子的全部或部分特异性互补。在一些实施方案中，在昆虫害虫摄入表达的RNA分子之后，可获得害虫细胞中的编码多核苷酸的下调。在特定的实施方案中，可获得害虫细胞中的编码多核苷酸的下调。在特定的实施方案中，昆虫害虫细胞中的编码多核苷酸的下调对害虫的生长和/或发育造成有害影响。
在一些实施方案中，靶标多核苷酸包括转录的非编码RNA(诸如5'UTR、3'UTR)、剪接前导序列、内含子、末端内含子(例如，随后在反式剪接中修饰的5'UTR RNA)、donatron(例如，提供反式剪接的供体序列所需要的非编码RNA)以及靶标昆虫害虫基因的其他非编码转录RNA。此类多核苷酸可来源于单顺反子基因和多顺反子基因两者。
因此，本文结合一些实施方案还描述了包含至少一种多核苷酸的iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，所述多核苷酸与昆虫(例如鞘翅目)害虫中的靶标核酸的全部或部分特异性互补。在一些实施方案中，iRNA分子可包含与多个靶标核酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个靶标核酸)的全部或部分互补的一种或多种多核苷酸。在特定的实施方案中，iRNA分子可在体外产生，或通过基因修饰生物体(诸如植物或细菌)在活体内产生。还公开了cDNA，其可用于产生与昆虫害虫中的靶标核酸的全部或部分特异性互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子和/或hpRNA分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体。经转化宿主靶标可从该重组DNA构建体表达有效水平的dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子。因此，还描述了一种植物转化载体，其包含与在植物细胞中具有功能的异源性启动子可操作地连接的至少一种多核苷酸，其中所述一种或多种多核苷酸的表达产生包含一串毗连核碱基且与昆虫害虫中的靶标核酸的全部或部分特异性互补的RNA分子。
在特定的实例中，可用于昆虫(例如鞘翅目)害虫的核酸分子可包括：从叶甲属生物体分离的天然核酸的全部或部分，其包含spt6多核苷酸(例如，SEQ ID NO:1和3-5中的任一者)；在表达时产生这样的RNA分子的DNA，所述RNA分子包含与由spt6编码的天然RNA分子的全部或部分特异性互补的多核苷酸；包含与spt6的全部或部分特异性互补的至少一种多核苷酸的iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)；可用于产生与spt6的全部或部分特异性互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子和/或hpRNA分子的cDNA；以及在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体，其中经转化宿主靶标包含前述核酸分子中的一种或多种。
B.核酸分子
本发明尤其提供了抑制昆虫(例如鞘翅目)害虫的细胞、组织或器官中的靶标基因表达的iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子；以及能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制昆虫害虫的细胞、组织或器官中的靶标基因表达的DNA分子。
本发明的一些实施方案提供了一种经分离的核酸分子，其包含选自下列的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段(例如SEQ ID NO:3-5中的任一者)；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体(例如WCR)的天然编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列，该天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；以及叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:3-5中的任一者。
在特定的实施方案中，昆虫(例如鞘翅目)害虫接触或摄取从该经分离的多核苷酸转录的iRNA抑制了害虫的生长、发育和/或进食。在一些实施方案中，昆虫接触或摄取经由以包含该iRNA的植物材料为食而发生。在一些实施方案中，昆虫接触或摄取经由用包含该iRNA的组合物喷洒含有该昆虫的植物而发生。
在一些实施方案中，本发明的经分离的核酸分子可包含选自下列的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:81；SEQ ID NO:81的互补序列；SEQ IDNO:82；SEQ ID NO:82的互补序列；SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:83的互补序列；SEQ ID NO:84；SEQ ID NO:84的互补序列；SEQ ID NO:81-84中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:81-84中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:81-84中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:81-84中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:81-84中的任一者；以及叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:81-84中的任一者。
在特定的实施方案中，鞘翅目害虫接触或摄取该经分离的多核苷酸抑制了害虫的生长、发育和/或进食。
在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含与来自靶标基因的转录物互补的多核苷酸，该靶标基因包含SEQ ID NO:1或其片段，抑制昆虫害虫中的该靶标基因造成害虫的生长、发育或其他生物功能所必需的多肽或多核苷酸剂减少或移除。选择的多核苷酸可与下列任一者表现出约80％至约100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的连续片段以及前述中任一者的互补序列。例如，选择的多核苷酸可与下列各项表现出79％、80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的连续片段(例如，SEQ ID NO:3-5)或前述中任一者的互补序列。
在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制靶标基因表达的DNA分子可包含与存在于一个或多个靶标昆虫害虫物种(例如鞘翅目害虫物种)中的天然多核苷酸的全部或部分特异性互补的单个多核苷酸，或者DNA分子可以是由多个此类特异性互补的多核苷酸构建而成的嵌合体。
在一些实施方案中，核酸分子可包含由“间隔序列”分开的第一多核苷酸和第二多核苷酸。间隔序列可以是包含促进第一多核苷酸和第二多核苷酸之间的二级结构形成(在期望的情况下)的任何核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，间隔序列是mRNA的有义编码多核苷酸或反义编码多核苷酸的一部分。作为替代，间隔序列可包含能够共价连接到核酸分子的核苷酸或其同源物的任何组合。在一些实例中，间隔序列可以是环或内含子(例如，作为ST-LS1内含子)。
例如，在一些实施方案中，DNA分子可包含编码一种或多种不同iRNA分子的多核苷酸，其中所述不同iRNA分子中的每一种都包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸彼此互补。所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在RNA分子内可通过间隔序列连接。间隔序列可构成所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸的一部分。包含所述第一核苷酸多核苷酸和所述第二核苷酸多核苷酸的RNA分子的表达可通过所述第一核苷酸多核苷酸和所述第二核苷酸多核苷酸的特异性分子内碱基配对而引起dsRNA分子形成。所述第一多核苷酸或所述第二多核苷酸可与对于昆虫害虫(例如鞘翅目害虫)而言天然的多核苷酸(例如，靶标基因或转录的非编码多核苷酸)、其衍生物或其互补多核苷酸基本上相同。
dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸的双链，并且可包含对磷酸根-糖主干或核苷的修饰。可以适当调整RNA结构的修饰以使特异性抑制能够发生。在一个实施方案中，可通过普遍存在的酶促过程来修饰dsRNA分子，以便可以生成siRNA分子。该酶促过程可利用体外或活体内的RNA酶III酶，诸如真核生物中的DICER。参见Elbashir等人，(2001)Nature411:494-8；以及Hamilton和Baulcombe，(1999)Science 286(5441):950-2。DICER或功能上等同的RNA酶III酶将较大的dsRNA链和/或hpRNA分子切割成较小的寡核苷酸(例如siRNA)，所述寡核苷酸中每一者的长度为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的siRNA分子具有2至3个核苷酸3’突出，以及5’磷酸根末端和3’羟基末端。由RNA酶III酶生成的siRNA分子在细胞中解旋并分成单链RNA。然后，siRNA分子与从靶标基因转录的RNA特异性杂交，这两种RNA分子随后通过固有的细胞RNA降解机制得到降解。该过程可引起由靶标生物体中的靶标基因编码的RNA有效降解或移除。结果是所靶向的基因发生转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源性RNA酶III酶由异源性核酸分子产生的siRNA分子可有效介导昆虫害虫中的靶标基因的下调。
在一些实施方案中，核酸分子可包括至少一种可被转录成单链RNA分子的非天然存在的多核苷酸，所述单链RNA分子能够在活体内通过分子间杂交形成dsRNA分子。此类dsRNA通常自组装，并且可在昆虫(例如鞘翅目)害虫的营养来源中提供，以实现靶标基因的转录后抑制。在这些和另外的实施方案中，核酸分子可包含两种不同的非天然存在的多核苷酸，其中每种多核苷酸与昆虫害虫中的不同靶标基因特异性互补。当向例如鞘翅目害虫以dsRNA分子的形式提供这样的核酸分子时，dsRNA分子抑制害虫中至少两种不同靶标基因的表达。
C.获得核酸分子
可使用昆虫(例如鞘翅目)害虫中的多种多核苷酸作为靶标来设计核酸分子，诸如iRNA和编码iRNA的DNA分子。然而，天然多核苷酸的选择并非是直截了当的过程。例如，鞘翅目害虫中的天然多核苷酸中只有少数会是有效的靶标。无法肯定地预测特定的天然多核苷酸是否可被本发明的核酸分子有效下调，或者特定的天然多核苷酸的下调是否会对昆虫害虫的生长、生存力和/或发育有不利影响。绝大多数的天然鞘翅目害虫多核苷酸，诸如自其分离的EST(例如，美国专利号7,612,194中列出的鞘翅目害虫多核苷酸)，对害虫的生长和/或生存力没有不利影响。也无法预测，在可以对昆虫害虫有不利影响的天然多核苷酸中，哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与此类天然多核苷酸互补的核酸分子，并且在害虫进食后对其造成不利影响，同时不对宿主植物造成危害。
在一些实施方案中，核酸分子(例如，要在昆虫(例如鞘翅目)害虫的宿主植物中提供的dsRNA分子)被选择为靶向这样的cDNA，其编码害虫生长和/或发育所必需的蛋白质或蛋白质部分(诸如涉及代谢或分解代谢生物化学途径、细胞分裂、能量代谢、消化、宿主植物识别等的多肽)。如本文所述，靶标害虫生物体摄入含有一种或多种dsRNA(所述dsRNA的至少一个区段与靶标害虫生物体的细胞中产生的RNA的至少一个基本上相同的区段特异性互补)的组合物，可导致该靶标的死亡或其他抑制作用。可使用来源于昆虫害虫的多核苷酸(DNA或RNA)来构建免受害虫侵染的植物细胞。例如，可以转化鞘翅目害虫的宿主植物(例如玉蜀黍)，使其含有来源于鞘翅目害虫的如本文所提供的一种或多种多核苷酸。转化到宿主中的多核苷酸可编码在经转化宿主内的细胞或生物流体中形成dsRNA结构的一种或多种RNA，因此，如果害虫与转基因宿主形成营养关系或者当害虫与转基因宿主形成营养关系时，使得dsRNA可用。这可引起对害虫细胞中一种或多种基因的表达的阻抑，并最终造成死亡或者对害虫生长或发育的抑制。
因此，在一些实施方案中，靶向实质上参与昆虫(例如鞘翅目)害虫的生长和发育的基因。本发明中使用的其他靶标基因可包括例如那些在害虫的生存力、运动、迀移、生长、发育、感染性和进食部位的建立中发挥重要作用的靶标基因。因此，靶标基因可以是管家基因或转录因子。此外，本发明中使用的天然昆虫害虫多核苷酸也可来源于植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例如直系同源物)，该同源物的功能是本领域技术人员已知的，并且其多核苷酸与靶标害虫的基因组中的靶标基因可特异性杂交。通过杂交鉴定具有已知核苷酸序列的基因的同源物的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，本发明提供了用于获得核酸分子的方法，该核酸分子包含用于产生iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子的多核苷酸。一种这样的实施方案包括：(a)分析一种或多种靶标基因在昆虫(例如鞘翅目)害虫中，在dsRNA介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自所靶向害虫的多核苷酸的全部或部分或者其同源物，所靶向害虫在dsRNA介导的阻抑分析中显示出改变的(例如减弱的)生长或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的DNA克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；(e)对包含步骤(d)中所分离的克隆的cDNA或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子包含所述RNA的全部或大部分或者其同源物；以及(f)化学合成基因或者siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或dsRNA的全部或大部分。
在另外的实施方案中，用于获得包含用于产生大部分的iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子的多核苷酸的核酸片段的方法包括：(a)合成第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，它们与来自所靶向的昆虫(例如鞘翅目)害虫的天然多核苷酸的一部分特异性互补；以及(b)使用步骤(a)的第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA插入物，其中扩增的核酸分子包含siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或dsRNA分子的大部分。
核酸可通过多种方法分离、扩增或产生。例如，可通过PCR扩增来源于gDNA或cDNA文库的靶标多核苷酸(例如，靶标基因或转录的靶标非编码多核苷酸)或其部分来获得iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子。可从靶标生物体提取DNA或RNA，并且可使用本领域普通技术人员已知的方法从所述DNA或RNA制备核酸文库。可使用由靶标生物体生成的gDNA文库或cDNA文库对靶标基因进行PCR扩增和测序。可使用确认的PCR产物作为体外转录的模板，以在最低限度启动子的情况下生成有义和反义RNA。作为替代，核酸分子可通过许多技术中的任一种合成(参见例如Ozaki等人，(1992)Nucleic Acids Research,20:5205-5214；以及Agrawal等人，(1990)Nucleic Acids Research,18:5419-5423)，包括使用自动DNA合成仪(例如，P.E.Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)的392或394型DNA/RNA合成仪)、使用标准化学品(诸如亚磷酰胺化学品)。参见例如Beaucage等人，(1992)Tetrahedron,48:2223-2311；美国专利号4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066和4,973,679。还可采用引起非天然主干基团的替代性化学品，诸如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。
本发明的RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子可由本领域技术人员通过手动反应或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含含有编码RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子的多核苷酸的核酸分子的细胞中于活体内产生。还可通过部分或完全有机合成产生RNA，可通过体外酶促或有机合成导入任何经修饰的核糖核苷酸。可通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶)合成RNA分子。可用于克隆和表达多核苷酸的表达构建体是本领域已知的。参见例如国际PCT公布号WO97/32016，以及美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693。可以先纯化化学合成的或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，再将其导入细胞中。例如，可通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法或这些手段的组合从混合物纯化RNA分子。作为替代，可以在不纯化或最小程度纯化的情况下使用化学合成的或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可将RNA分子干燥以贮存，或溶解在水溶液中。该溶液可含有缓冲剂或盐，以促进dsRNA分子双链体链退火和/或稳定化。
在实施方案中，可通过单条自身互补的RNA链或者由两条互补的RNA链形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在活体内或在体外合成。细胞的内源性RNA聚合酶可在活体内介导一条或两条RNA链的转录，或者可使用克隆的RNA聚合酶在活体内或在体外介导转录。转录后抑制昆虫害虫中的靶标基因，通过宿主的器官、组织或细胞类型中的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子进行)；刺激宿主中的环境条件(例如，通过使用响应于感染、应激、温度和/或化学诱导物的诱导型启动子进行)；和/或工程化改造宿主的某个发育期或发育龄的转录(例如，通过使用发育期特异性启动子进行)，可以是宿主靶向的。形成dsRNA分子的RNA链(不论是体外还是活体内转录的)可以是也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可能能够也可能不能够被细胞的翻译装置翻译成多肽。
D.重组载体和宿主细胞转化
在一些实施方案中，本发明还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞或植物细胞)中的DNA分子，其中该DNA分子包含这样的多核苷酸，该多核苷酸在表达为RNA并被昆虫(例如鞘翅目)害虫摄取后，可实现对害虫的细胞、组织或器官中的靶标基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包含能够在植物细胞中表达为iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子以抑制昆虫害虫中的靶标基因表达的多核苷酸。为了启动或增强表达，此类重组核酸分子可包含一种或多种调控元件，所述调控元件可以与能够表达为iRNA的多核苷酸可操作地连接。在植物中表达基因阻抑分子的方法是已知的，并且可用于表达本发明的多核苷酸。参见例如国际PCT公布号WO06/073727；以及美国专利公布号2006/0200878 Al)。
在具体的实施方案中，本发明的重组DNA分子可包含编码可形成dsRNA分子的RNA的多核苷酸。此类重组DNA分子可以编码可形成这样的dsRNA分子的RNA，所述dsRNA分子在被摄入后能够抑制昆虫(例如鞘翅目)害虫细胞中一种或多种内源性靶标基因的表达。在许多实施方案中，转录的RNA可形成这样的dsRNA分子，所述dsRNA分子可按稳定化形式提供；例如，以发夹和茎环结构的形式提供。
在一些实施方案中，dsRNA分子的一条链可通过从与选自下列的多核苷酸基本上同源的多核苷酸转录而形成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段(例如SEQ ID NO:3-5)；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体(例如WCR)的天然编码多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列，该天然编码多核苷酸包含SEQ IDNO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然编码多核苷酸包含SEQ ID NO:3-5中的任一者。
在一些实施方案中，dsRNA分子的一条链可通过从与选自下列的多核苷酸基本上同源的多核苷酸转录而形成：SEQ ID NO:3-5；SEQ ID NO:3-5中任一者的互补序列；SEQ IDNO:1的至少15个毗连核苷酸的片段；以及SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列。
在特定的实施方案中，编码可形成dsRNA分子的RNA的重组DNA分子可包含这样的编码区：其中至少两个多核苷酸被排列成使得相对于至少一个启动子，一个多核苷酸处于有义取向，并且另一个多核苷酸处于反义取向，其中有义多核苷酸和反义多核苷酸通过例如约五(约5)至约一千(约1000)个核苷酸的间隔序列连接或相连。间隔序列可以在有义多核苷酸和反义多核苷酸之间形成环。有义多核苷酸或反义多核苷酸可与靶标基因(例如，包含SEQ ID NO:1和3-5中任一者的spt6基因)或其片段基本上同源。然而，在一些实施方案中，重组DNA分子可以编码可形成不含间隔序列的dsRNA分子的RNA。在实施方案中，有义编码多核苷酸和反义编码多核苷酸可具有不同长度。
通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒，可容易地将鉴定为对昆虫害虫存在有害影响或者具有就害虫而言的植物保护效果的多核苷酸掺入表达的dsRNA分子中。例如，可通过以下步骤将此类多核苷酸表达为具有茎环结构的发夹：取得对应于靶标基因多核苷酸(例如，包含SEQ ID NO:1和3-5中的任一者，以及前述中任一者的片段的spt6基因)的第一区段；将该多核苷酸连接到第二区段间隔序列区，所述第二区段间隔序列区与第一区段不是同源或互补的；然后将该连接物连接到第三区段，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的分子内碱基配对而形成茎环结构，其中所述环结构形式包含第二区段。参见例如美国专利公布号2002/0048814和2003/0018993；以及国际PCT公布号WO94/01550和WO98/05770。可例如以双链结构诸如茎环结构(例如发夹)的形式生成dsRNA分子，由此通过共表达靶标基因的片段(例如在额外的植物可表达盒上的靶标基因的片段)而增强靶向天然昆虫(例如鞘翅目)害虫多核苷酸的siRNA的产生，这造成siRNA产生增强，或者减轻甲基化以防止dsRNA发夹启动子的转录基因沉默。
本发明的某些实施方案包括将本发明的重组核酸分子导入植物中(即转化)，以实现一种或多种iRNA分子的昆虫(例如鞘翅目)害虫抑制水平的表达。重组DNA分子可以例如是载体，诸如线性或闭合环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如在合适启动子的控制下将本发明的核酸适当地插入载体中，所述启动子在一种或多种宿主中发挥功能以驱动连接的编码多核苷酸或其他DNA元件表达。许多载体可用于该目的，并且对适当载体的选择主要将取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。根据每种载体的功能(例如，扩增DNA或表达DNA)及与其相容的特定宿主细胞，每种载体含有各种组分。
为了赋予转基因植物对昆虫(例如鞘翅目)害虫的防护性，例如可以在重组植物的组织或流体内将重组DNA转录成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分子)。iRNA分子可包含与可对宿主植物物种造成损害的昆虫害虫内的相应转录多核苷酸基本上同源且可特异性杂交的多核苷酸。所述害虫可例如通过摄入包含所述iRNA分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿主植物细胞中转录的所述iRNA分子。因此，在特定的实例中，靶标基因的表达在侵染转基因宿主植物的鞘翅目害虫内受到iRNA分子阻抑。在一些实施方案中，对靶标鞘翅目害虫中靶标基因表达的阻抑可保护植物免受害虫攻击。
为了使iRNA分子能够被递送给与已用本发明的重组核酸分子转化的植物细胞处于营养关系的昆虫害虫，需要在植物细胞中表达(即转录)iRNA分子。因此，重组核酸分子可包含与一种或多种调控元件(诸如在宿主细胞中发挥作用的异源性启动子元件)可操作地连接的本发明的多核苷酸，所述宿主细胞诸如其中要扩增核酸分子的细菌细胞，以及其中要表达核酸分子的植物细胞。
适合用于本发明的核酸分子的启动子包括诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子或组成型启动子，它们都是本领域熟知的。描述此类启动子的非限制性实例包括美国专利号6,437,217(玉蜀黍RS81启动子)、5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)、6,426,446(玉蜀黍RS324启动子)、6,429,362(玉蜀黍PR-1启动子)、6,232,526(玉蜀黍A3启动子)、6,177,611(玉蜀黍组成型启动子)，5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(CaMV 35S启动子)，6,433,252(玉蜀黍L3油质蛋白启动子)、6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和水稻肌动蛋白2内含子)、6,294,714(光诱导型启动子)、6,140,078(盐诱导型启动子)、6,252,138(病原体诱导型启动子)、6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、6,388,170(双向启动子)、6,635,806(γ-薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子)，以及美国专利公布号2009/757,089(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)。额外的启动子包括胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)和章鱼碱合酶(OCS)启动子(两者都在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:810-2)；玄参花叶病毒35S-启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合体启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利号5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196)；FMV 35S(美国专利号6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利号5,850,019)；SCP1启动子(美国专利号6,677,503)；以及AGRtu.nos启动子(GenBankTM登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子包含组织特异性启动子，诸如根特异性启动子。根特异性启动子驱动唯一地或优先地在根组织中表达可操作连接的编码多核苷酸。根特异性启动子的实例是本领域已知的。参见例如美国专利号5,110,732、5,459,252和5,837,848；Opperman等人，(1994)Science 263:221-3；以及Hirel等人，(1992)PlantMol.Biol.20:207-18。在一些实施方案中，可以在两个根特异性启动子之间克隆根据本发明的用于鞘翅目害虫控制的多核苷酸或片段，所述根特异性启动子相对于所述多核苷酸或片段以相反的转录方向取向、在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达从而在其中产生RNA分子，这些RNA分子随后可形成dsRNA分子，如前文所述。昆虫害虫可以摄入植物组织中表达的iRNA分子，从而实现对靶标基因表达的阻抑。
可任选地与核酸可操作地连接的额外的调控元件包括5'UTR，5'UTR位于启动子元件和编码多核苷酸之间充当翻译前导序列元件。翻译前导序列元件存在于完全加工的mRNA中，并且可影响初级转录物的加工和/或RNA的稳定性。翻译前导序列元件的实例包括玉蜀黍和矮牵牛花热休克蛋白前导序列(美国专利号5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)前导序列等。参见例如Turner和Foster，(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性实例包括GmHsp(美国专利号5,659,122)、PhDnaK(美国专利号5,362,865)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed，(1990)J.Virol.64:1590-7)和AGRtunos(GenBankTM登录号V00087；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
可任选地与核酸可操作地连接的额外的调控元件还包括3’非翻译元件、3’转录终止区或多聚腺苷酸化区。这些是位于多核苷酸下游的遗传元件，包括提供多聚腺苷酸化信号和/或能够影响转录或mRNA加工的其他调控信号的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号在植物中发挥作用，引起多聚腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前体的3’端。多聚腺苷酸化元件可以来源于多种植物基因或T-DNA基因。3’转录终止区的一个非限制性实例是胭脂碱合酶3’区(nos 3’；Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。使用不同的3’非翻译区的一个实例在Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1:671-80中提供。多聚腺苷酸化信号的非限制性实例包括来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因的信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBankTM登录号E01312)。
一些实施方案可包括植物转化载体，该植物转化载体包含经分离和纯化的DNA分子，该DNA分子包含与本发明的一种或多种多核苷酸可操作地连接的上述调控元件中的至少一者。所述一种或多种多核苷酸在表达时生成一种或多种包含多核苷酸的iRNA分子，所述多核苷酸与昆虫(例如鞘翅目)害虫中的天然RNA分子的全部或部分特异性互补。因此，所述一种或多种多核苷酸可包含编码所靶向的鞘翅目害虫RNA转录物内存在的多聚核糖核苷酸的全部或部分的区段，并且可包含所靶向的害虫转录物的全部或部分的反向重复序列。植物转化载体可含有与超过一种靶标多核苷酸特异性互补的多核苷酸，从而允许产生超过一种dsRNA以抑制靶标昆虫害虫的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。可将与不同基因中存在的多核苷酸特异性互补的多核苷酸的区段组合成单个复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续的，或由间隔序列分开。
在一些实施方案中，已含有本发明的至少一种多核苷酸的本发明的质粒可通过在同一质粒中相继插入额外的一种或多种多核苷酸来修饰，其中所述额外的一种或多种多核苷酸与原有的至少一种多核苷酸可操作地连接于相同的调控元件。在一些实施方案中，核酸分子可设计用于抑制多种靶标基因。在一些实施方案中，要抑制的多种基因可获自相同的昆虫(例如鞘翅目)害虫物种，这样可增强核酸分子的有效性。在其他实施方案中，基因可来源于不同的昆虫害虫，这样可拓宽一种或多种药剂对其有效的害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑或者表达和阻抑的组合时，可以工程化改造多顺反子DNA元件。
本发明的重组核酸分子或载体可包含赋予经转化细胞(诸如植物细胞)可选择表型的可选择标记。也可使用可选择标记来选择包含本发明的重组核酸分子的植物或植物细胞。所述标记可编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素等)或除草剂耐受性(例如草甘膦等)。可选择标记的实例包括但不限于：编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等选择的neo基因；编码双丙氨膦抗性的bar基因；编码草甘膦耐受性的突变EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲耐性的突变乙酰乳酸合酶(ALS)基因；以及甲氨蝶呤抗性DHFR基因。有多种可选择标记可供使用，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素、壮观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。此类可选择标记的实例例示于例如美国专利号5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中。
本发明的重组核酸分子或载体还可包含可筛选标记。可使用可筛选标记来监测表达。示例性可筛选标记包括：β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码已知各种生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)；R-基因座基因，其编码调控植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，(1988)"Molecularcloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac”，载于第18届斯塔 德勒遗传学研讨会(Stadler Genetics Symposium)，P.Gustafson和R.Appels编辑，NewYork:Plenum，第263-82页)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3737-41)；编码已知各种生色底物的酶(例如PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；荧光素酶基因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因，其编码可转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene 46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14)；以及α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源性核酸的方法中，可使用如前文所述的重组核酸分子来制备表现出对昆虫(例如鞘翅目)害虫的易感性降低的转基因植物。可以例如通过将编码iRNA分子的核酸分子插入植物转化载体中，然后将这些导入植物中来制备植物转化载体。
用于转化宿主细胞的合适方法包括可将DNA导入细胞中的任何方法，诸如通过转化原生质体(参见例如美国专利号5,508,184)、通过干燥/抑制介导的DNA摄取(参见例如Potrykus等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)、通过电穿孔(参见例如美国专利号5,384,253)、通过用碳化硅纤维搅拌(参见例如美国专利号5,302,523和5,464,765)、通过农杆菌介导的转化(参见例如美国专利号5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840和6,384,301)以及通过加速DNA包被的粒子(参见例如美国专利号5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865)，等等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利号7,060,876和5,591,616，以及国际PCT公布号WO95/06722中。通过应用诸如这些的技术，可稳定地转化几乎任何物种的细胞。在一些实施方案中，将转化DNA整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，可将转基因细胞再生为转基因生物体。可使用这些技术中的任一种来产生转基因植物，例如在其基因组中包含编码一种或多种iRNA分子的一种或多种核酸的转基因植物。
用于将表达载体导入植物中的最广泛使用的方法以农杆菌的天然转化系统为基础。根癌农杆菌和发根农杆菌(A.rhizogenes)是遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒分别携带负责遗传转化植物的基因。Ti(肿瘤诱导)质粒含有转移到经转化植物的大区段，称为T-DNA。Ti质粒的另一个区段Vir区负责T-DNA转移。T-DNA区以末端重复序列为边界。在经修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，Vir区的功能用来转移以T-DNA边界元件为边界的外来DNA。T-区还可含有用于有效回收转基因细胞和植物的可选择标记，以及用于插入转移多核苷酸诸如dsRNA编码核酸的多克隆位点。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌农杆菌的Ti质粒(参见例如美国专利号4,536,475、4,693,977、4,886,937和5,501,967，以及欧洲专利号EP 0 122 791)或发根农杆菌的Ri质粒。额外的植物转化载体包括(例如但不限于)由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及欧洲专利号EP 0 120 516描述的那些，以及来源于前述载体中的任一者的那些。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌，诸如中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)，以介导到许多各种各样的植物的基因转移。通过获取卸甲Ti质粒和合适的二元载体这两者，可使这些植物相关的共生细菌能够胜任基因转移。
在向受体细胞提供外源性DNA之后，通常鉴定经转化的细胞以供进一步培养和植物再生。为了提高鉴定经转化细胞的能力，技术人员可能期望采用如前提出的可选择或可筛选标记基因，其中转化载体用来生成转化体。在使用可选择标记的情况下，通过使细胞暴露于一种或多种选择剂而在潜在经转化的细胞群体内鉴定出经转化细胞。在使用可筛选标记的情况下，可针对期望的标记基因性状来筛选细胞。
可将暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞置于支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可通过包含另外的物质(诸如生长调节剂)来改良任何合适的植物组织培养基(例如MS培养基和N6培养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基础培养基上，直到可得到足够的组织用于启动植物再生工作时为止，或者在重复多轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生时为止(例如，至少2周)，然后转移到有益于芽形成的培养基中。定期转移培养物，直到已出现充分的芽形成时为止。一旦形成芽，就将其转移到有益于根形成的培养基中。一旦形成足够的根，就可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了确认再生植物中存在感兴趣的核酸分子(例如，编码一种或多种iRNA分子的DNA，所述iRNA分子抑制鞘翅目害虫中的靶标基因表达)，可执行多种测定。此类测定包括例如：分子生物学测定，诸如Southern印迹和Northern印迹、PCR和核酸测序；生物化学测定，诸如检测是否存在蛋白质产物，例如通过免疫学手段(ELISA和/或Western印迹)或借助酶功能；植物部分测定，诸如叶或根测定；以及对再生全植物的表型的分析。
可例如通过使用例如对感兴趣的核酸分子有特异性的寡核苷酸引物进行PCR扩增来分析整合事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于：来源于经分离的宿主植物愈伤组织的gDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，所述愈伤组织预测含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子，接着是PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。PCR基因分型的方法已得到充分描述(例如Rios,G.等人，(2002)Plant J.32:243-53)，并且可应用于来源于任何植物物种(例如玉蜀黍)或组织类型的gDNA，包括来源于细胞培养物的gDNA。
使用农杆菌依赖性转化方法形成的转基因植物通常含有插入一条染色体中的单个重组DNA。这单个重组DNA的多核苷酸被称为“转基因事件”或“整合事件”。此类转基因植物对于插入的外源性多核苷酸而言是杂合的。在一些实施方案中，通过将含有单个外源性基因的独立的分离转基因植物与自身(例如T0植物)有性交配(自交)以产生T1种子，可获得相对于转基因为纯合的转基因植物。所产生的T1种子的四分之一相对于所述转基因会是纯合的。萌发T1种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试通常使用SNP测定或热扩增测定，使得允许区分杂合子和纯合子(即接合性测定)。
在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有昆虫(例如鞘翅目)害虫抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种、或者更多种不同的iRNA分子。可以从导入不同转化事件中的多种核酸、或从导入单个转化事件中的单个核酸表达iRNA分子(例如dsRNA分子)。在一些实施方案中，在单个启动子的控制下表达多个iRNA分子。在其他实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个iRNA分子。可以表达包含多个多核苷酸的单一iRNA分子，所述多核苷酸各自与在相同的昆虫害虫物种的不同群体中或在不同的昆虫害虫物种中的一个或多个昆虫害虫内的不同基因座(例如，由SEQ ID NO:1限定的基因座)同源。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将包含编码iRNA分子的多核苷酸的重组核酸分子导入易于转化的第一植物品系中以产生转基因植物，该转基因植物可与第二植物品系杂交，以使编码iRNA分子的多核苷酸渗入到第二植物品系中。
在一些方面，包括由来源于经转化植物细胞的转基因植物产生的种子和商品产品，其中所述种子或商品产品包含可检出量的本发明的核酸。在一些实施方案中，可例如通过获得转基因植物并由其制备食物或饲料来生产此类商品产品。包含本发明的多核苷酸中的一者或多者的商品产品包括(例如但不限于)：植物的粗粉、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，以及包含含有本发明的核酸中的一者或多者的重组植物或种子的任何粗粉、油或者碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品。在一种或多种商品或商品产品中检出本发明的多核苷酸中的一者或多者，实际上证明了该商品或商品产品是由出于控制昆虫(例如鞘翅目)害虫的目的被设计为表达本发明的iRNA分子中的一者或多者的转基因植物产生的。
在一些实施方案中，包含本发明的核酸分子的转基因植物或种子也可在其基因组中包含至少一个其他的转基因事件，包括但不限于：自其转录靶向鞘翅目害虫中与由SEQID NO:1限定的基因座不同的基因座的iRNA分子的转基因事件，所述不同的基因座诸如选自下列的一种或多种基因座：Caf1-180(美国专利申请公布号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公布号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公布号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公布号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公布号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公布号2013/0091601)、RPS6(美国专利申请公布号2013/0097730)、ROP(美国专利申请号14/577,811)、RNA聚合酶II140(美国专利申请号14/577,854)、Dre4(美国专利申请号14/705,807)、ncm(美国专利申请号62/095487)、COPIα(美国专利申请号62/063,199)、COPIβ(美国专利申请号62/063,203)、COPIγ(美国专利申请号62/063,192)、COIPδ(美国专利申请号62/063,216)、RNA聚合酶I1(美国专利申请号62/133214)、RNA聚合酶II-215(美国专利申请号62/133,202)、RNA聚合酶33(美国专利申请号62/133210)和组蛋白伴侣spt5(美国专利申请号62/168613)；自其转录靶向与鞘翅目害虫不同的生物体(例如植物寄生性线虫)中的基因的iRNA分子的转基因事件；编码杀虫蛋白(例如苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白)的基因；除草剂耐受性基因(例如，提供对草甘膦的耐受性的基因)；以及促成转基因植物中期望的表型(诸如产量增加、脂肪酸代谢改变或细胞质雄性不育性恢复)的基因。在特定的实施方案中，可以在植物中将编码本发明iRNA分子的多核苷酸与其他昆虫控制性状和疾病控制性状组合，以实现增强对植物疾病和昆虫损害的控制的期望性状。将采用独特作用模式的昆虫控制性状组合由于例如对所述一种或多种性状的抗性会在田间形成的概率降低，可以提供具有优于含单一控制性状的植物的出色耐久性的受保护转基因植物。
V.昆虫害虫中的靶标基因阻抑
A.概述
在本发明的一些实施方案中，可向昆虫(例如鞘翅目)害虫提供至少一种可用于控制昆虫害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在所述害虫中引起RNAi介导的基因沉默。在特定的实施方案中，可向鞘翅目害虫提供iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)。在一些实施方案中，可通过使可用于控制昆虫害虫的核酸分子与害虫接触，来向所述害虫提供所述核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以在昆虫害虫的进食基质(例如营养组合物)中提供可用于控制所述害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可通过摄入被昆虫害虫摄入的包含可用于控制所述害虫的核酸分子的植物材料，来提供所述核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子通过表达导入植物材料中的重组核酸而存在于所述植物材料中，所述表达例如通过用包含重组核酸的载体转化植物细胞，然后从经转化植物细胞再生植物材料或全植物而进行。
B.RNAi介导的靶标基因阻抑
在一些实施方案中，本发明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，可设计此类分子使之靶向昆虫害虫(例如鞘翅目(例如WCR、NCR和SCR)害虫)的转录组中的必需天然多核苷酸(例如必需基因)，例如通过设计有至少一条链包含与靶标多核苷酸特异性互补的多核苷酸的iRNA分子。如此设计的iRNA分子的序列可以与靶标多核苷酸的序列相同，或者可以掺入不阻止iRNA分子与其靶标多核苷酸之间的特异性杂交的错配。
本发明的iRNA分子可以在用于昆虫(例如鞘翅目)害虫中的基因阻抑的方法中使用，从而降低由害虫对植物(例如，包含iRNA分子的受保护的经转化植物)造成的损害的水平或发生率。如本文所用，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因转录成mRNA及随后mRNA翻译而产生的蛋白质的水平的任一种熟知方法，包括降低由基因或编码多核苷酸表达的蛋白质，包括转录后抑制表达和转录阻抑。转录后抑制通过从被靶向以受阻抑的基因转录的mRNA的全部或部分与用于阻抑的相应iRNA分子之间的特异性同源性来介导。此外，转录后抑制是指细胞中用于被核糖体结合的可用mRNA的量出现实质性及可测量的下降。
在其中iRNA分子为dsRNA分子的一些实施方案中，酶DICER可将dsRNA分子切割成短siRNA分子(长度大约为20个核苷酸)。借助DICER对dsRNA分子的活性而生成的双链siRNA分子可分成两个单链siRNA：“过客链”和“引导链”。过客链可降解，引导链则可掺入RISC中。转录后抑制通过引导链与mRNA分子的特异性互补多核苷酸的特异性杂交，随后通过酶Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割而发生。
在本发明的一些实施方案中，可使用任何形式的iRNA分子。本领域的技术人员会理解，在制备过程中以及在对细胞提供iRNA分子的步骤过程中，dsRNA分子通常比单链RNA分子更稳定，并且在细胞中通常也是更稳定的。因此，例如，虽然在一些实施方案中siRNA分子和miRNA分子可能是同等有效的，但dsRNA分子可能由于其稳定性而被选用。
在特定的实施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸可在体外表达以产生iRNA分子，该iRNA分子与昆虫(例如鞘翅目)害虫基因组内的多核苷酸所编码的核酸分子基本上同源。在某些实施方案中，体外转录的iRNA分子可以是包含茎环结构的稳定化dsRNA分子。在昆虫害虫接触体外转录的iRNA分子之后，可发生对该害虫中的靶标基因(例如必需基因)的转录后抑制。
在本发明的一些实施方案中，在用于转录后抑制昆虫(例如鞘翅目)害虫中的靶标基因的方法中使用包含多核苷酸的至少15个毗连核苷酸(例如，至少19个毗连核苷酸)的核酸分子的表达，其中所述多核苷酸选自：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ IDNO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的互补序列；SEQ ID NO:5；SEQID NO:5的互补序列；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者。在某些实施方案中，可以使用与前述中任一者至少约80％(例如，79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％和100％)相同的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于昆虫(例如鞘翅目)害虫的至少一个细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
本文的一些实施方案的重要特征在于，RNAi转录后抑制系统能够容忍靶标基因中预期由于遗传突变、株系多态性或进化趋异而可能发生的序列变异。导入的核酸分子可以不必与靶标基因的初级转录产物或完全加工的mRNA绝对同源，只要导入的核酸分子与靶标基因的初级转录产物或完全加工的mRNA可特异性杂交即可。另外，相对于靶标基因的初级转录产物或完全加工的mRNA，导入的核酸分子可以不必是全长的。
使用本发明的iRNA技术抑制靶标基因是序列特异性的；也就是说，靶向与一种或多种iRNA分子基本上同源的多核苷酸进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用包含核苷酸序列与靶标基因的一部分的核苷酸序列相同的多核苷酸的RNA分子进行抑制。在这些和另外的实施方案中，可以使用包含相对于靶标多核苷酸具有一个或多个插入、缺失和/或点突变的多核苷酸的RNA分子。在特定的实施方案中，iRNA分子和靶标基因的一部分可共享例如至少从约80％、至少从约81％、至少从约82％、至少从约83％、至少从约84％、至少从约85％、至少从约86％、至少从约87％、至少从约88％、至少从约89％、至少从约90％、至少从约91％、至少从约92％、至少从约93％、至少从约94％、至少从约95％、至少从约96％、至少从约97％、至少从约98％、至少从约99％、至少从约100％以及100％的序列同一性。作为替代，dsRNA分子的双链体区可与靶标基因转录物的一部分可特异性杂交。在可特异性杂交的分子中，表现出较大同源性的小于全长的多核苷酸补偿较长的、同源性较小的多核苷酸。dsRNA分子的双链体区中与靶标基因转录物的一部分相同的多核苷酸的长度可以是至少约25、50、100、200、300、400、500个或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于20个至100个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，可以使用大于约100-500个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，根据靶标基因的大小，可以使用大于约500个至1000个核苷酸的多核苷酸。
在某些实施方案中，可以将害虫(例如鞘翅目)中靶标基因的表达在该害虫的细胞内抑制至少10％、至少33％、至少50％或至少80％，使得发生显著抑制。显著抑制是指高于阈值的抑制，该抑制造成可检出的表型(例如，生长停止、进食停止、发育停止、诱导性死亡等)，或与正在抑制的靶标基因对应的RNA和/或基因产物出现可检出的减少。虽然在本发明的某些实施方案中，在所述害虫的基本上所有细胞中均发生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶标基因的细胞子集中发生抑制。
在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由表现出与启动子DNA或其互补序列的实质性序列同一性的dsRNA分子的存在所介导，从而实现所谓的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可摄入或接触此类dsRNA分子的昆虫害虫中(例如通过摄入或接触含有所述dsRNA分子的植物材料)针对靶标基因起效。在启动子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特异性地设计为抑制或阻抑昆虫害虫细胞中的一种或多种同源多核苷酸或互补多核苷酸的表达。美国专利号5,107,065、5,759,829、5,283,184和5,231,020中公开了通过反义或有义取向的RNA进行转录后基因阻抑以调控植物细胞中的基因表达。
C.提供给昆虫害虫的iRNA分子的表达
可按许多体外形式或活体内形式中的任一种表达用于在昆虫(例如鞘翅目)害虫中进行RNAi介导的基因抑制的iRNA分子。然后可向昆虫害虫提供iRNA分子，例如通过使iRNA分子与害虫接触，或通过引起害虫摄入或以其他方式内化iRNA分子。一些实施方案包括鞘翅目害虫的经转化宿主植物、经转化植物细胞和经转化植物的后代。经转化植物细胞和经转化植物可工程化改造为例如在异源性启动子的控制下表达所述iRNA分子中的一者或多者，以提供害虫保护效果。因此，当昆虫害虫在进食期间食用转基因植物或植物细胞时，该害虫可摄入转基因植物或细胞中表达的iRNA分子。也可将本发明的多核苷酸导入多种多样的原核微生物宿主和真核微生物宿主中以产生iRNA分子。术语“微生物”包括原核物种和真核物种，诸如细菌和真菌。
调控基因表达可包括对这种表达的部分或完全阻抑。在另一个实施方案中，用于阻抑昆虫(例如鞘翅目)害虫中的基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提供基因阻抑量的由如本文所述的多核苷酸在转录后形成的至少一种dsRNA分子，其至少一个区段与昆虫害虫细胞内的mRNA互补。昆虫害虫所摄入的dsRNA分子，包括其经修饰形式诸如siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子，可以与从例如包含选自SEQ ID NO:1和3-5的多核苷酸的spt6DNA分子转录的RNA分子至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％相同。因此，提供了用于制备dsRNA分子的经分离和基本上纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的多核苷酸和重组DNA构建体，其在导入昆虫害虫时阻抑或抑制其中的内源性编码多核苷酸或靶标编码多核苷酸的表达。
特定的实施方案提供了用于递送iRNA分子以便转录后抑制昆虫(例如鞘翅目)植物害虫中的一种或多种靶标基因并且控制所述植物害虫的群体的递送系统。在一些实施方案中，所述递送系统包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转录的RNA分子的宿主细胞内容物的摄入。在这些和另外的实施方案中，创建转基因植物细胞或转基因植物，其含有用于提供本发明的稳定化dsRNA分子的重组DNA构建体。包含编码特定iRNA分子的核酸的转基因植物细胞和转基因植物可通过下述方式产生：采用重组DNA技术(这些基础技术是本领域熟知的)构建包含编码本发明的iRNA分子(例如，稳定化的dsRNA分子)的多核苷酸的植物转化载体，以此转化植物细胞或植物，并以此生成含有转录的iRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。
为了赋予转基因植物对昆虫(例如鞘翅目)害虫的防护性，可以例如将重组DNA分子转录成iRNA分子，诸如dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子或hpRNA分子。在一些实施方案中，从重组DNA分子转录的RNA分子可以在重组植物的组织或流体内形成dsRNA分子。这样的dsRNA分子可以包含在多核苷酸的一部分中，所述多核苷酸与从可侵染宿主植物的类型的昆虫害虫内的DNA转录的相应多核苷酸相同。所述害虫内靶标基因的表达受到dsRNA分子阻抑，并且对所述害虫中靶标基因的表达的阻抑保护转基因植物免受害虫损害。已显示dsRNA分子的调控作用适用于害虫中表达的多种基因，包括例如负责细胞代谢或细胞转化的内源性基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；以及编码涉及细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
为了从活体内转基因或表达构建体转录，可以在一些实施方案中使用调控区(例如，启动子、增强子、沉默子和多聚腺苷酸化信号)来转录一条或多条RNA链。因此，在一些实施方案中，如前文示出的，在产生iRNA分子中使用的多核苷酸可以与在植物宿主细胞中具有功能的一种或多种启动子元件可操作地连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源性启动子。在可操作地连接的启动子元件控制下的本发明的多核苷酸可进一步侧接有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的额外元件。此类元件可位于可操作地连接的启动子上游、表达构建体3’端下游，并且可既存在于所述启动子上游、又存在于表达构建体3’端下游。
一些实施方案提供了用于减轻由以植物为食的昆虫(例如鞘翅目)害虫引起的对宿主植物(例如玉米植物)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表达本发明的至少一种核酸分子的经转化植物细胞，其中所述核酸分子在被所述害虫摄取后发挥作用以抑制所述害虫内靶标多核苷酸的表达，该表达抑制造成所述害虫死亡和/或生长减缓，从而减轻由所述害虫引起的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，所述核酸分子包括dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，所述核酸分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目昆虫害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子由一种多核苷酸组成，所述多核苷酸与昆虫害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交。
在一些实施方案中，提供了用于提高作物产量的方法，其中所述方法包括将本发明的至少一种核酸分子导入玉米植物中；栽培该玉米植物，以允许表达包含所述核酸的iRNA分子，其中包含所述核酸的iRNA分子的表达抑制昆虫(例如鞘翅目)害虫损害和/或生长，从而降低或消除由于害虫侵染所致的产量损失。在一些实施方案中，所述iRNA分子为dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，所述核酸分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与昆虫害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子包含与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核苷酸。
在替代性实施方案中，提供了用于调控昆虫(例如鞘翅目)害虫中靶标基因的表达的方法，所述方法包括：用包含编码本发明的至少一种iRNA分子的多核苷酸的载体转化植物细胞，其中所述多核苷酸与启动子和转录终止元件可操作地连接；在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养经转化植物细胞；选择已将所述多核苷酸整合到其基因组中的经转化植物细胞；针对由整合的多核苷酸编码的iRNA分子的表达，筛选经转化植物细胞；选择表达iRNA分子的转基因植物细胞；然后用选择的转基因植物细胞饲喂所述昆虫害虫。还可从表达由整合的核酸分子编码的iRNA分子的经转化植物细胞再生植物。在一些实施方案中，所述iRNA分子为dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，所述核酸分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与昆虫害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子包含与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核苷酸。
可将本发明的iRNA分子以来自掺入植物细胞基因组中的重组基因的表达产物、或者以掺入应用于种植前种子的包衣或种子处理中，而掺入植物物种(例如玉米)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。本发明的实施方案中还包括用于将iRNA分子递送到昆虫(例如鞘翅目)害虫的递送系统。例如，可将本发明的iRNA分子直接导入害虫的细胞中。用于导入的方法可包括将iRNA与来自昆虫害虫宿主的植物组织直接混合，以及向宿主植物组织应用包含本发明的iRNA分子的组合物。例如，可将iRNA分子喷洒到植物表面上。作为替代，可通过微生物表达iRNA分子，然后可将微生物施用到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入根或茎中。如前文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以足以杀死已知要侵染植物的昆虫害虫的量表达至少一种iRNA分子。通过化学方法或酶促合成方法产生的iRNA分子也可按符合常见农业实践的方式配制，并且作为喷雾产品或诱饵产品使用以控制昆虫害虫所致的植物损害。配制剂可包含有效叶覆盖所需的适当粘着剂和湿润剂，以及保护iRNA分子(例如dsRNA分子)免受紫外线损害的紫外线保护剂。此类添加剂常用于生物杀虫剂产业中，并且是本领域技术人员熟知的。此类应用可与其他喷雾杀虫剂应用(基于生物学或其他方面)组合，以增强植物对所述害虫的防护性。
本文引用的全部参考文献(包括出版物、专利和专利申请)据此以引用方式并入，并入程度与本公开的明确细节不冲突，并且以与下述相同的程度这样并入：如同单独地和具体地指明每篇参考文献均以引用方式并入且在本文中全文示出。提供本文论述的参考文献仅仅是为了参考其在本申请提交日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被理解为承认发明人由于在先发明而无权先于这样的公开内容。
提供以下实施例是为了例示某些特定的特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限于所描述的特定特征或方面。
实施例
实施例1：材料和方法
样品制备和生物测定
使用RNAi试剂盒或T7体外转录试剂盒合成并纯化了多种dsRNA分子(包括对应于spt6-1 reg1(SEQ ID NO:3)、spt6-1 v1(SEQ ID NO:4)和spt6-1 v2(SEQ ID NO:5)的那些分子)。在TE缓冲液中准备经纯化的dsRNA分子，所有生物测定均含有由该缓冲液组成的对照处理，其充当WCR(玉米根萤叶甲)的死亡率或生长抑制的背景检查。使用NANODROPTM 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量生物测定缓冲液中dsRNA分子的浓度。
在使用饲喂人工昆虫食料的新生昆虫幼虫进行的生物测定中测试样品的昆虫活性。WCR卵获自CROP CHARACTERISTICS,INC.(Farmington,MN)。
生物测定在特别为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘(C-D INTERNATIONAL,Pitman,NJ)中进行。每个孔装有约1.0mL设计用于支持鞘翅目昆虫生长的人工食料。用移液管将60μL等份的dsRNA样品递送到每个孔的食料的表面上(40μL/cm2)。dsRNA样品浓度作为孔中每平方厘米表面积(1.5cm2)的dsRNA量(ng/cm2)来计算。将经处理的托盘保持在通风橱中，直到食料表面上的液体蒸发或吸收到食料中为止。
在孵化后的几个小时内，用湿润的骆驼毛刷拾取幼虫个体，将其放置在经处理的食料上(每孔一个或两个幼虫)。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盘上带虫的孔，并通气以允许气体交换。使生物测定托盘在受控环境条件(28℃，约40％相对湿度，16:8(光照：黑暗))下保持9天，之后记录暴露于每个样品的昆虫总数、死亡昆虫数以及存活昆虫的重量。计算每个处理的平均死亡率百分比和平均生长抑制。生长抑制(GI)如下计算：
GI＝[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，
其中TWIT是处理中的活昆虫的总重量；
TNIT是处理中的昆虫的总数；
TWIBC是背景检查(缓冲液对照)中的活昆虫的总重量；
TNIBC是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫的总数。
使用JMPTM软件(SAS,Cary,NC)进行统计分析。
LC50(致死浓度)定义为50％的测试昆虫被杀死时的剂量。GI50(生长抑制)定义为测试昆虫的平均生长(例如活体重)为背景检查样品中观察到的平均值的50％时的剂量。
重复的生物测定证明，摄入特定的样品造成了玉米根虫幼虫的令人惊讶且意想不到的死亡率和生长抑制。
实施例2：鉴定候选靶标基因
选择来自多个WCR(玉米根萤叶甲)发育期的昆虫进行汇集的转录组分析，以提供通过RNAi转基因植物昆虫防护技术控制的候选靶标基因序列。
在一个范例中，从约0.9g的完整第一龄WCR幼虫(孵化后4到5天；保持在16℃)分离总RNA，并使用下述基于苯酚/TRI的方法(MOLECULAR RESEARCH CENTER,Cincinnati,OH)纯化：
室温下将幼虫置于装有10mL TRI的15mL匀浆器中均质化，直到获得均匀的悬浮液为止。室温下温育5分钟后，将匀浆分配到1.5mL微量离心管中(每管1mL)，添加200μL氯仿后强力振摇混合物15秒。让提取过程在室温下静置10分钟之后，通过在4℃下以12,000x g离心而分离各相。将上层相(包含约0.6mL)小心转移到另一根无菌的1.5mL管中，添加等体积的室温异丙醇。室温下温育5至10分钟之后，以12,000x g(4℃或25℃)将混合物离心8分钟。
小心取出并弃去上清液，然后通过用75％乙醇涡旋将RNA沉淀洗涤两次，每次洗涤后通过以7,500x g(4℃或25℃)离心5分钟加以回收。小心地除去乙醇，让沉淀风干3至5分钟，然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过在260nm和280nm处测量吸光度(A)来测定RNA浓度。从约0.9g幼虫的典型提取过程产生超过1mg的总RNA，其中A260与A280的比值为1.9。如此提取的RNA在-80℃储存，直到进一步加工。
通过使等份跑过1％琼脂糖凝胶来测定RNA质量。在经高温灭菌的容器中，使用由经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水稀释的经高温灭菌10x TAE缓冲液(Tris乙酸盐EDTA；1x浓度为0.04M Tris乙酸盐、1mM EDTA(乙二胺四乙酸钠盐)，pH 8.0)制成琼脂糖凝胶溶液。使用1x TAE作为运行缓冲液。使用前，用RNaseAwayTM(INVITROGEN INC.,Carlsbad,CA)清洁电泳槽和造孔梳。取2μL RNA样品与8μL TE缓冲液(10mM Tris HCl，pH 7.0；1mM EDTA)和10μLRNA样品缓冲液(目录号70606；EMD4 Bioscience,Gibbstown,NJ)混合。70℃下加热样品3分钟，冷却至室温后每孔上样5μL(含1μg至2μg RNA)。将市售的RNA分子量标记置于分离的孔中同时运行，以比较分子大小。60伏下运行凝胶2小时。
由商业服务提供商(EUROFINS MWG Operon,Huntsville,AL)利用随机引发自幼虫总RNA制备标准化的cDNA文库。在EUROFINS MWG Operon通过GS FLX 454 TitaniumTM系列化学品以1/2板规模对标准化的幼虫cDNA文库进行测序，产生平均读段长度为348bp的超过600,000个读段。将350,000个读段组装成超过50,000个重叠群。使用公众可得到的程序FORMATDB(可获自NCBI)将未组装的读段和重叠群这两者都转换成可BLAST的数据库。
类似地由在其他WCR发育期收获的材料制备了总RNA和标准化的cDNA文库。合并代表各发育期的cDNA文库成员，由此构建用于筛选靶标基因的汇集的转录组文库。
假设用于RNAi靶向的候选基因对于鞘翅目昆虫的存活和生长是必需的。对于选择的靶标基因，在转录组序列数据库中鉴定其同源物，如下所述。通过PCR扩增靶标基因的全长或部分序列，来制备用于产生双链RNA(dsRNA)的模板。
使用候选蛋白质编码序列针对含有未组装的叶甲属序列读段或已组装的重叠群的可BLAST数据库运行TBLASTN搜索。使用BLASTX针对NCBI非冗余数据库确认对叶甲属序列的显著命中(定义为：对于重叠群同源性，优于e-20；对于未组装的序列读段同源性，优于e-10)。此BLASTX搜索的结果确认，在TBLASTN搜索中鉴定的叶甲属同源物候选基因序列确实包含叶甲属基因，或者是针对叶甲属序列中存在的非叶甲属候选基因序列的最佳命中。在少数情况下可明显看出，一些基于与非叶甲属候选基因的同源性选择的叶甲属重叠群或未组装的序列读段有重叠，并且对重叠群的组装未能连接起这些重叠。在这些情况下，使用SequencherTMv4.9(GENE CODES CORPORATION,Ann Arbor,MI)将序列组装成更长的重叠群。
编码叶甲属spt6的候选靶标基因(SEQ ID NO:1)被鉴定为可造成鞘翅目害虫死亡、生长抑制或WCR发育抑制的基因。
高度保守和多功能的组蛋白伴侣spt6蛋白在控制果蝇属转录方面发挥着显著作用。它涉及多个转录步骤，包括起始、延伸和终止。它与多种重要的因子相互作用，这些因子包括RNA聚合酶II(RNAPII)、组蛋白和转录因子。Spt6可经由其与核小体的H3/H4四聚体的相互作用而组装核小体并跟随着RNAPII转录而恢复正常染色质结构。
SEQ ID NO:1是新颖的。该序列未在公共数据库中提供，也未在PCT国际专利公布号WO/2011/025860、美国专利申请号20070124836、美国专利申请号20090306189、美国专利申请号US20070050860、美国专利申请号20100192265、美国专利号7,612,194和美国专利申请号2013192256中公开。WCR spt6-1(SEQ ID NO:1)与来自地人体虱(Pediculus humanuscorporis)的序列的片段(GENBANK登录号XM_002424131.1)在一定程度上相关。WCR SPT6-1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的最接近的同源物为赤拟谷盗(Tribolium casetanum)蛋白，其GENBANK登录号为XP_008196911.1(88％相似；在同源区上79％相同)。
Spt6 dsRNA转基因可与其他dsRNA分子组合，以提供冗余的RNAi靶向和协同的RNAi效应。表达靶向spt6的dsRNA的转基因玉米事件可用于防止玉米根虫引起的噬根性损害。Spt6 dsRNA转基因代表新的作用模式，可用来与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术在昆虫抗性管理基因累加(Insect Resistance Management gene pyramid)中结合，以减缓根虫群体对这些根虫控制技术中的任一者产生抗性。
使用叶甲属候选基因(本文称为spt6)的序列的全长或部分克隆来生成PCR扩增物以供dsRNA合成。
实施例3：扩增靶标基因以产生dsRNA
使用叶甲属候选基因(本文称为spt6)的序列的全长或部分克隆来生成PCR扩增物以供dsRNA合成。设计引物，以便通过PCR扩增每个靶标基因的编码区部分。参见表1。在适当情况下，将T7噬菌体启动子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQ ID NO:6)掺入经扩增的有义链或反义链的5’端。参见表1。使用(Life Technologies,Grand Island,NY)从WCR提取总DNA，然后使用总DNA，采用第一链合成系统和制造商提供的寡dT引发说明(Life Technologies,Grand Island,NY)来制造第一链cDNA。使用第一链cDNA作为PCR反应的模板，所述PCR反应采用反向定位的引物来扩增天然靶标基因序列的全部或部分。还从DNA克隆扩增dsRNA，该DNA克隆包含黄色荧光蛋白(YFP)的编码区(SEQ ID NO:7；Shagin等人，(2004)Mol.Biol.Evol.21(5):841-50)。
表1.用来扩增示例性spt6靶标基因和YFP阴性对照基因的编码区部分的引物和引物对。
实施例4：RNAi构建体
通过PCR制备模板以及dsRNA合成
图1中示出了用于提供特异性模板以产生spt6和YFP dsRNA的策略。使用表1中的引物对，以及由分离自WCR卵、第一龄幼虫或成虫的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，通过PCR制备了意图在spt6 dsRNA合成中使用的模板DNA。对于每个选定的spt6和YFP靶标基因区，PCR扩增在经扩增的有义链和反义链的5’端导入了一个T7启动子序列(YFP区段扩增自YFP编码区的DNA克隆)。然后将每个靶标基因区的两个经PCR扩增的片段以大致相等的量混合，并将混合物用作产生dsRNA的转录模板。参见图1。用特定引物对扩增的dsRNA模板的序列为：SEQ ID NO:3(spt6-1 reg1)、SEQ ID NO:4(spt6-1 v1)、SEQ ID NO:5(spt6-1 v2)和SEQ ID NO:7(YFP)。使用RNAi试剂盒遵循制造商的说明(INVITROGEN)，或使用体外转录试剂盒遵循制造商的说明(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA)，合成并纯化了用于昆虫生物测定的双链RNA。使用NANODROPTM8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。
构建植物转化载体
使用化学合成片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)的组合以及标准分子克隆方法，组装了入门载体，该入门载体包含具有spt6的区段(SEQ ID NO:1)的用于形成发夹的靶标基因构建体。通过(在单个转录单位内)以彼此相反的取向排布spt6靶标基因区段的两个拷贝来易化RNA初级转录物形成分子内发夹，所述两个区段被一个接头多核苷酸(例如，环(诸如SEQ ID NO:80)和ST-LS1内含子(Vancanneyt等人，(1990)Mol.Gen.Genet.220(2):245-50))分开。因此，初级mRNA转录物含有被所述接头序列分开的两个spt6基因区段序列，这两个区段序列互为大的反向重复序列。使用启动子(例如，玉蜀黍泛素1，美国专利5,510,474；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S；甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子、pEMU、MAS、玉蜀黍H3组蛋白启动子、ALS启动子、菜豆素基因启动子、cab、rubisco、LAT52、Zm13和/或apg)的拷贝来驱动初级mRNA发夹转录物的产生，并用一个包含3’非翻译区(例如，玉蜀黍过氧化物酶5基因(ZmPer5 3'UTR v2；美国专利6,699,984)、AtUbi10、AtEf1或StPinII)的片段来终止表达发夹RNA的基因的转录。
在标准的重组反应中使用上述入门载体与典型的二元目的载体，产生了用于农杆菌介导的玉蜀黍胚转化的spt6发夹RNA表达转化载体。
二元目的载体包含处于植物可操作启动子(例如，甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子(Schenk等人，(1999)Plant Mol.Biol.39:1221-30)或ZmUbi1(美国专利5,510,474))的调控之下的除草剂耐受性基因(芳氧基链烷酸酯加双氧酶；AAD-1 v3)(美国专利7,838,733(B2)，以及Wright等人，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。5'UTR和接头定位在所述启动子区段的3’端与AAD-1编码区的起始密码子之间。使用一个包含来自玉蜀黍脂肪酶基因的3’非翻译区(ZmLip 3'UTR；美国专利号7,179,902)的片段来终止AAD-1mRNA的转录。
借助使用典型的二元目的载体与入门载体的标准重组反应，构建包含表达YFP蛋白质的基因的阴性对照二元载体。所述二元目的载体包含处于玉蜀黍泛素1启动子(如上文)的表达调控之下的除草剂耐受性基因(芳氧基链烷酸酯加双氧酶；AAD-1v3)(如上文)和一个包含来自玉蜀黍脂肪酶基因的3’非翻译区(ZmLip 3'UTR；如上文)的片段。所述入门载体包含处于玉蜀黍泛素1启动子(如上文)的表达控制之下的YFP编码区(SEQID NO:14)和一个包含来自玉蜀黍过氧化物酶5基因的3’非翻译区(如上文)的片段。
实施例5：筛选候选靶标基因
在基于食料的测定中，将设计为抑制实施例2中鉴定的靶标基因序列的合成dsRNA施用于WCR时，引起了死亡和生长抑制。
重复的生物测定证明，摄入来源于spt6-1 reg1、spt6-1 v1和spt6-1 v2的dsRNA制备物造成了西方玉米根虫幼虫的死亡和生长抑制。表2示出了在WCR幼虫暴露于spt6-1reg1、spt6-1 v1和spt6-1 v2 dsRNA 9天之后的基于食料的饲喂生物测定的结果，以及由黄色荧光蛋白(YFP)编码区(SEQ ID NO:7)制备的dsRNA阴性对照样品获得的结果。表3示出了暴露于spt6-1 v1和spt6-1 v2 dsRNA的LC50和GI50结果。
表2.利用西方玉米根虫幼虫进食9天之后获得的spt6 dsRNA食料饲喂测定的结果。ANOVA分析发现了平均死亡率％和平均生长抑制(GI)％上的显著差异。使用Tukey-Kramer检验分离平均值。
*SEM＝平均值标准误差括号中的字母指明统计水平。不是由同一字母连接的水平存在显著差异(P<0.05)。
**TE＝Tris HCl(1mM)加EDTA(0.1mM)缓冲液，pH7.2。
***YFP＝黄色荧光蛋白
表3.spt6 dsRNA对WCR幼虫的口服效力(ng/cm2)汇总。
以前有人提出，某些叶甲属物种基因可用于RNAi介导的昆虫控制。参见美国专利公布号2007/0124836(其公开了906个序列)和美国专利号7,612,194(其公开了9,112个序列)。然而，技术人员确定，许多被提出对RNAi介导的昆虫控制有效用的基因并不能有效地控制叶甲属。还确定，与被提出对RNAi介导的昆虫控制有效用的其他基因相比，序列spt6-1reg1、spt6-1 v1和spt6-1 v2 dsRNA提供了令人惊讶且意想不到的对叶甲属的出色控制。
例如，美国专利号7,612,194中提出，膜联蛋白、β血影蛋白2和mtRP-L4在RNAi介导的昆虫控制中全都有效。SEQ ID NO:15为膜联蛋白区域1(Reg 1)的DNA序列，而SEQ ID NO:16为膜联蛋白区域2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO:17为β血影蛋白2区域1(Reg 1)的DNA序列，而SEQ ID NO:18为β血影蛋白2区域2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO:19为mtRP-L4区域1(Reg1)的DNA序列，而SEQ ID NO:20为mtRP-L4区域2(Reg 2)的DNA序列。还使用YFP序列(SEQ ID NO:7)来产生作为阴性对照的dsRNA。
使用前述序列中的每一个通过实施例3的方法来产生dsRNA。图2中示出了用于提供特异性模板以产生dsRNA的策略。使用表4中的引物对，以及由分离自WCR第一龄幼虫的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，通过PCR制备了意图在dsRNA合成中使用的模板DNA。(YFP从DNA克隆扩增。)对于每个选择的靶标基因区，执行两次单独的PCR扩增。第一次PCR扩增在经扩增有义链的5’端导入T7启动子序列。第二次反应在反义链的5’端掺入T7启动子序列。然后将每个靶标基因区的两个经PCR扩增的片段以大致相等的量混合，并将混合物用作产生dsRNA的转录模板。参见图2。使用RNAi试剂盒，遵循制造商的说明(INVITROGEN)合成并纯化双链RNA。使用NANODROPTM8000分光光度计(THERMOSCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度，并通过与上述相同的基于食料的生物测定方法测试每一种dsRNA。表4列出了用来产生膜联蛋白Reg 1、膜联蛋白Reg 2、β血影蛋白2Reg 1、β血影蛋白2 Reg 2、mtRP-L4 Reg 1、mtRP-L4 Reg 2和YFP dsRNA分子的引物的序列。表5呈现了WCR幼虫在暴露于这些dsRNA分子9天之后的基于食料的饲喂生物测定的结果。重复的生物测定证明，摄入这些dsRNA未造成西方玉米根虫幼虫出现超过使用TE缓冲液、水或YFP蛋白质等对照样品时所见的死亡率或生长抑制。
表4.用来扩增基因的编码区部分的引物和
引物对。
表5.利用9天之后的西方玉米根虫幼虫获得的食料饲喂测定的结果。
*TE＝Tris HCl(10mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH8。
**YFP＝黄色荧光蛋白
实施例6：产生包含杀虫dsRNA的
转基因玉蜀黍组织
农杆菌介导的转化。在农杆菌介导的转化之后，制成了通过表达稳定地整合到植物基因组中的嵌合基因而产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含spt6的基因(例如SEQ ID NO:1))的dsRNA分子)的转基因玉蜀黍细胞、组织和植物。采用超二元转化载体或二元转化载体的玉蜀黍转化方法是本领域已知的，如例如美国专利号8,304,604中所述，该专利全文以引用方式并入本文。根据在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力来选择经转化组织，并酌情筛选经转化组织来产生dsRNA。可将一部分这样的经转化组织培养物提供给新生玉米根虫幼虫以执行生物测定，大体上如实施例1中所述。
农杆菌培养启动。将包含上述(实施例4)二元转化载体的农杆菌菌株DAt13192细胞(PCT国际公布号WO 2012/016222A2)的甘油储备液划线接种在含有适当抗生素的AB基本培养基平板(Watson等人，(1975)J.Bacteriol.123:255-264)上，并在20℃下生长3天。然后将培养物划线接种到含有相同抗生素的YEP平板(酵母提取物，10g/L；蛋白胨，10g/L；NaCl，5g/L)上，并在20℃下温育1天。
农杆菌培养。实验当天，以适合于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的储备液，并将其吸移到250mL一次性无菌烧瓶中。接种培养基(Frame等人，(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos，载于PlantEmbryo Culture Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology。T.A.Thorpe和E.C.Yeung(编辑)，Springer Science and Business Media,LLC.，第327-341页)含有：2.2g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素(Frame等人，出处同上)，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，115mg/L L-脯氨酸，以及100mg/L肌醇；pH为5.4。将乙酰丁香酮从100％二甲基亚砜中的1M储备液添加到装有接种培养基的烧瓶中，达到200μM的最终浓度，并充分混合溶液。
对于每种构建体，将来自YEP平板的1或2个满接种环的农杆菌悬浮在50mL一次性无菌离心管内的15mL接种培养基/乙酰丁香酮储备液中，然后在分光光度计中测量溶液在550nm处的光密度(OD550)。然后使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮液稀释到0.3至0.4的OD550。然后将装有农杆菌悬浮液的管水平放置在平台摇床(设置在室温下，约75rpm)上，在进行胚切开的同时振摇1至4小时。
穗消毒和胚分离。从玉米近交系B104(Hallauer等人，(1997)Crop Science37:1405-1406)植物获得未成熟玉蜀黍胚，所述植物在温室中培养，并进行自花授粉或近缘授粉以产生穗。在授粉后大约10至12天收获穗。实验当天，将穗脱壳，通过浸没在市售漂白剂(ULTRA杀菌漂白剂，6.15％次氯酸钠；加两滴TWEEN 20)的20％溶液中并振摇20至30分钟来进行表面消毒，随后置于层流罩内在无菌去离子水中漂洗三次。从每个穗无菌地切下未成熟合子胚(1.8至2.2mm长)并随机分配到微量离心管中，每根微量离心管装有液体接种培养基中的适当农杆菌细胞的2.0mL悬浮液，其中含200μM乙酰丁香酮并添加了2μL的10％S233表面活性剂(EVONIK INDUSTRIES；Essen,Germany)。对于一套给定的实验，每次转化均使用来自汇集的穗的胚。
农杆菌共培养。分离之后，将胚在摇动平台上放置5分钟。然后将管的内容物倾倒在共培养培养基的平板上，所述培养基含有4.33g/L MS盐、1X ISU改良的MS维生素、30g/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、3.3mg/L麦草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的KOH溶液、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶水解物、15mg/L AgNO3、200μM乙酰丁香酮的DMSO溶液和3g/L GELZANTM，pH为5.8。用一次性无菌移液管移除液态农杆菌悬浮液。然后借助显微镜，使用无菌镊子使胚取向为盾片面朝上。盖上平板，用3MTMMICROPORETM医用胶带密封，然后放置在具有大约60μmol m-2s-1光合有效辐射(PAR)的连续光照的25℃培养箱中。
选择愈伤组织和再生转基因事件。在共培养期之后，将胚转移到静息培养基上，静息培养基的组成为：4.33g/L MS盐、1X ISU改良的MS维生素、30g/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、3.3mg/L麦草畏的KOH溶液、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶水解物、15mg/L AgNO3、0.5g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa,KS)、250mg/L羧苄青霉素和2.3g/L GELZANTM，pH为5.8。将不超过36个胚移到每个平板上。将平板放置在透明的塑料盒中，在27℃和大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7至10天。然后将愈伤的胚转移(<18个/板)到选择培养基I上，该培养基由具有100nM R-吡氟氯禾灵酸(0.0362mg/L；用于选择包含AAD-1基因的愈伤组织)的静息培养基(如上文)组成。将平板放回透明盒中，在27℃和大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将愈伤的胚转移(<12个/板)到选择培养基II上，该培养基由具有500nM R-吡氟氯禾灵酸(0.181mg/L)的静息培养基(如上文)组成。将平板返回到透明盒中，在27℃和大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
将增殖中的胚性愈伤组织转移(<9个/板)到预再生培养基上。预再生培养基含有4.33g/L MS盐、1X ISU改良的MS维生素、45g/L蔗糖、350mg/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、50mg/L酪蛋白酶水解物、1.0mg/L AgNO3、0.25g/L MES、0.5mg/L萘乙酸的NaOH溶液、2.5mg/L脱落酸的乙醇溶液、1mg/L 6-苄基氨基嘌呤、250mg/L羧苄青霉素、2.5g/L GELZANTM和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸，pH为5.8。将平板保存在透明盒中，在27℃和大约50μmol m-2s- 1PAR的连续光照下温育7天。然后将再生中的愈伤组织转移(<6个/板)到PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)中的再生培养基上，在28℃下以每天16小时光照/8小时黑暗(大约160μmol m-2s-1PAR)温育14天，或直到发出芽和根为止。再生培养基含有4.33g/L MS盐、1X ISU改良的MS维生素、60g/L蔗糖、100mg/L肌醇、125mg/L羧苄青霉素、3g/L GELLANTM胶和0.181mg/L R-吡氟氯禾灵酸，pH为5.8。然后分离具有初生根的小芽，不经选择直接转移到伸长培养基上。伸长培养基含有4.33g/L MS盐、1X ISU改良的MS维生素、30g/L蔗糖和3.5g/L GELRITETM，pH为5.8。
根据在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力来选择经转化的植物芽，将这些芽从PHYTATRAYSTM移栽到填充生长培养基(PROMIX BX；PREMIER TECH HORTICULTURE)的小盆中，小盆用杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆盖，然后在CONVIRON生长室中炼苗(白天27℃/夜晚24℃，16小时光周期，50-70％RH，200μmol m-2s-1PAR)。在一些情况下，分析推定的转基因小植物的转基因相对拷贝数，这使用被设计为检测整合到玉蜀黍基因组中的AAD1除草剂耐受性基因的引物通过定量实时PCR测定来完成。另外，利用qPCR测定来检测推定的转化体中是否存在接头序列和/或靶标序列。然后将选择的经转化小植物移到温室中，以便进一步生长和测试。
转移T0植物并在温室中定植，以进行生物测定和产生种子。当植物达到V3-V4期时，将其移栽到IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物中，在温室中(光暴露类型：光合或同化；高光限值：1200PAR；16小时昼长；白天27℃/夜晚24℃)培植到开花。
将要用于昆虫生物测定的植物从小盆移栽到TINUSTM350-4(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES,Acheson,Alberta,Canada)(每个每个事件一个植物)。在移栽到约四天后，侵染植物以进行生物测定。
通过对T0转基因植物的穗丝授粉(其中花粉从非转基因近交系B104植物或其他适当的花粉供体采集而来)并种植所得的种子而获得T1世代植物。在可能时执行互交。
实施例7：转基因玉蜀黍组织的分子分析
对在评估噬根性损害前一天或同一天从温室培植的植物采集的叶和/或根的样品执行了玉蜀黍组织的分子分析(例如RT-qPCR)。
使用靶标基因的RT-qPCR测定的结果来验证转基因的表达。也可以使用表达的RNA中重复序列之间的间插序列(为形成dsRNA发夹分子必不可少的)的RT-qPCR测定结果来验证是否存在发夹转录物。测量了相对于内源性玉蜀黍基因的RNA水平的转基因RNA表达水平。
通过DNA qPCR分析检测gDNA中AAD1编码区的一部分，用来估计转基因插入拷贝数。从培植在环境室中的植物采集样品用于这些分析。将结果与被设计为检测单拷贝天然基因的一部分的测定法的DNA qPCR结果进行比较，并且将简单事件(具有spt6转基因的一个或两个拷贝)推进到温室中的进一步研究。
此外，使用被设计为检测壮观霉素抗性基因(SpecR；包含在T-DNA外部的二元载体质粒上)的一部分的qPCR测定来确定转基因植物是否含有外来的整合质粒主干序列。
RNA转录物表达水平：靶向qPCR。通过靶标序列的实时定量PCR(qPCR)来分析愈伤组织细胞事件或转基因植物以确定转基因的相对表达水平，与内部玉蜀黍基因(例如，GENBANK登录号BT069734)的转录物水平比较，所述内部玉蜀黍基因编码TIP41样蛋白(即，GENBANK登录号AT4G34270的玉蜀黍同源物；tBLASTX得分为74％同一性)。使用NorgenBioTekTM总RNA分离试剂盒(Norgen,Thorold,ON)分离RNA。按照试剂盒建议的方案对总RNA进行柱上DNase1处理。然后在NANODROP 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC)上将RNA定量，并将浓度归一化为50ng/μL。基本上按照制造商推荐的方案，使用高容量cDNA合成试剂盒(INVITROGEN)制备第一链cDNA，反应体积为10μL，含有5μL变性RNA。略微修改该方案，包括将10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V是A、C或G，N是A、C、G或T；SEQ ID NO:50)添加到随机引物储备混合物的1mL管中，以制备随机引物和寡dT混合的工作储备液。
在cDNA合成后，用无核酸酶的水将样品以1:3稀释，并储存在-20℃直到测定时为止。
在LIGHTCYCLERTM480(ROCHE DIAGNOSTICS,Indianapolis,IN)上以10μL反应体积分别执行对靶标基因和TIP41样转录物的实时PCR测定。对于靶标基因测定，利用引物spt6-1 v1_62 F(SEQ ID NO:58)和spt6-1v1_360R(SEQ ID NO:56)，以及IDT定制寡核苷酸(Oligo)探针spt6PRB Set1(用FAM标记，并用Zen和Iowa Black淬灭剂予以双重淬灭)进行反应。对于TIP41样参考基因测定，使用引物TIPmxF(SEQ ID NO:53)和TIPmxR(SEQ ID NO:54)，以及用HEX(六氯荧光素)标记的探针HXTIP(SEQ ID NO:55)。
所有测定都包括没有模板的阴性对照(仅有混合物)。为制备标准曲线，在源板中还包括空白(源孔中加水)，以检查样品交叉污染。引物和探针的序列在表6中示出。用于检测各种转录物的反应组分配方在表7中公开，PCR反应条件汇总于表8中。在465nm处激发FAM(6-羧基荧光素亚磷酰胺)荧光部分，并测量510nm处的荧光；HEX(六氯荧光素)荧光部分的对应值为533nm和580nm。
表6.用于转基因玉蜀黍中转录物水平的分子分析的寡核苷酸序列。
*TIP41样蛋白。
表7.用于检测转录物的PCR反应配方。
表8.用于RNA qPCR的热循环仪条件。
使用LIGHTCYCLERTM软件v1.5，根据供应商的推荐利用二阶导数最大算法计算Cq值，通过相对定量分析数据。对于表达分析，使用ΔΔCt方法(即2-(Cq TARGET–Cq REF))计算表达值，该方法依赖于比较两个靶标之间的Cq值的差异，其中假定对于优化的PCR反应，每个循环产物都加倍，基值选择为2。
转录物大小和完整性：Northern印迹测定。在一些情况下，使用Northern印迹(RNA印迹)分析来确定在表达spt6发夹dsRNA的转基因植物中spt6发夹dsRNA的分子大小，从而获得转基因植物的额外的分子表征。
所有的材料和设备在使用之前用RNaseZAP(AMBION/INVITROGEN)处理。将组织样品(100mg至500mg)采集到2mL SAFELOCK EPPENDORF管中，用配备三颗钨珠的KLECKOTM组织粉碎器(GARCIA MANUFACTURING,Visalia,CA)在1mL TRIZOL(INVITROGEN)中破碎5分钟，然后在室温(RT)下温育10分钟。任选地，将样品在4℃下以11,000rpm离心10分钟，然后将上清液转移到新鲜的2mL SAFELOCK EPPENDORF管中。在将200μL氯仿添加到匀浆中之后，通过翻转该管2至5分钟进行混合，在RT下温育10分钟，然后在4℃下以12,000x g离心15分钟。将上层相转移到无菌的1.5mL EPPENDORF管中，添加600μL的100％异丙醇，在RT下温育10分钟至2小时之后，在4℃至25℃下以12,000x g离心10分钟。弃去上清液，用1mL的70％乙醇将RNA沉淀洗涤两次，在两次洗涤之间，在4℃至25℃下以7,500x g离心10分钟。弃去乙醇，将沉淀短暂风干3至5分钟，然后重悬在50μL无核酸酶的水中。
使用(THERMO-FISHER)对总RNA定量，并将样品归一化为5μg/10μL。然后向每个样品中添加10μL乙二醛(AMBION/INVITROGEN)。将5至14ng的DIG RNA标准标记混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,IN)分配并添加到等体积的乙二醛中。在50℃下使样品和标记RNA变性45分钟，然后保存在冰上，直到上样到在NORTHERNMAX10X乙二醛运行缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25％SEAKEMGOLD琼脂糖(LONZA,Allendale,NJ)凝胶上为止。通过在65V/30mA下电泳2小时15分钟来分离RNA。
电泳之后，在2X SSC中将凝胶漂洗5分钟，然后在GEL DOC工作站(BIORAD,Hercules,CA)上成像，接着在RT下过夜，使RNA被动地转移到尼龙膜(MILLIPORE)上，其中使用10X SSC作为转移缓冲液(由3M氯化钠和300M梓檬酸三钠组成的20X SSC，pH 7.0)。转移后，在2X SSC中将膜漂洗5分钟，利用紫外线使RNA与膜交联(AGILENT/STRATAGENE)，然后使膜在室温下干燥最多2天。
使膜在ULTRAHYBTM缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中预杂交1至2小时。探针由含有感兴趣序列(例如，SEQ ID NO:3-5的反义序列部分，视情况而定)的PCR扩增产物组成，其借助ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序用地高辛配基标记。在杂交管中推荐的缓冲液中，于60℃的温度下杂交过夜。杂交后，对印迹进行DIG洗涤，包装，暴露于胶片1至30分钟，然后将胶片显影，所有这些操作都通过DIG试剂盒的供应商所推荐的方法来进行。
确定转基因拷贝数。将大约等同于2个叶冲孔块(punch)的玉蜀黍叶片收集在96孔的收集平板(QIAGEN)中。用配备一颗不锈钢珠的KLECKOTM组织粉碎器(GARCIAMANUFACTURING,Visalia,CA)在BIOSPRINT96AP1裂解缓冲液(与BIOSPRINT96PLANT KIT一起提供；QIAGEN)中进行组织破碎。组织浸软之后，使用BIOSPRINT96PLANT KIT和BIOSPRINT96提取机器人以高通量形式分离gDNA。在设立qPCR反应之前，以1:3的DNA:水稀释gDNA。
qPCR分析。通过使用系统的实时PCR，借助水解探针测定来执行转基因检测。使用探针设计软件2.0设计了要在水解探针测定中用于检测靶标基因(例如spt6)、接头序列(例如环，SEQ ID NO:80)并且/或者用于检测SpecR基因(即，负载在二元载体质粒上的壮观霉素抗性基因；SEQ ID NO:62；在表9中的SPC1寡核苷酸)的一部分的寡核苷酸。另外，使用PRIMER EXPRESS软件(APPLIEDBIOSYSTEMS)设计了要在水解探针测定中用于检测AAD-1除草剂耐受性基因(SEQ ID NO:63；在表9中的GAAD1寡核苷酸)的区段的寡核苷酸。表9示出了引物和探针的序列。用内源性玉蜀黍染色体基因(转化酶(SEQ ID NO:64；GENBANK登录号U16123；在本文中称为IVR1)的试剂将测定多重化，所述基因用作内部参考序列以确保在每个测定中都存在gDNA。为了扩增，制备了在10μL体积的多重反应物中的1x最终浓度的探针母液混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)，其含有每种引物各0.4μM，以及每种探针各0.2μM(表10)。如表11中概述的那样执行两步扩增反应。FAM标记探针和HEX标记探针的荧光团活化和发射如上文所述；CY5缀合物在650nm处最大激发，并且在670nm处发最大荧光。
使用拟合点算法(软件发行版本1.5)和相对定量模块(基于ΔΔCt方法)，由实时PCR数据确定Cp得分(荧光信号与背景阈值相交的点)。如前所述处理数据(上文；RNAqPCR)。
表9.用于确定基因拷贝数和检测二元载体质粒主干的引物和探针(具有荧光缀合物)的序列。
*CY5＝青色素-5
表10.用于分析基因拷贝数和检测质粒主干的反应组分。
*NA＝不适用
**ND＝未确定
表11.用于qPCR的热循环仪条件。
实施例8：转基因玉蜀黍的生物测定
昆虫生物测定。通过生物测定方法来证实在植物细胞中产生的本主题发明的dsRNA的生物活性。参见例如Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-1326。技术人员能够例如通过在受控的饲喂环境下给靶标昆虫喂食来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织或组织片来证实效力。作为替代，由来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织制备提取物，并将提取的核酸分配在用于如本文之前描述的生物测定的人工食料上面。将这样的饲喂测定的结果与类似进行的采用来自不产生杀虫dsRNA的宿主植物的适当对照组织、或其他对照样品的生物测定进行比较。相比于对照组，测试食料上的靶标昆虫的生长减缓且存活率降低。
使用转基因玉蜀黍事件的昆虫生物测定。选择从经洗涤的卵孵化的两条西方玉米根虫幼虫(1至3日龄)，并将其置于生物测定托盘的每个孔中。然后将这些孔用“拉-揭”(PULL N'PEEL)护盖(BIO-CV-16,BIO-SERV)覆盖，并置于具有18小时/6小时的光照/黑暗周期的28℃培养箱中。在初始侵染9天之后，评估幼虫死亡率，其按照每个处理中死亡昆虫在昆虫总数中所占的百分比来计算。将昆虫样品在-20℃冷冻两天，然后汇集来自每个处理的昆虫幼虫并称重。生长抑制百分比按照实验处理的平均重量除以两个对照孔处理的平均重量的均值来计算。数据表示为(阴性对照的)生长抑制百分比。将超过对照平均重量的平均重量归一化为零。
温室中的昆虫生物测定。从CROP CHARACTERISTICS(Farmington,MN)收到带有西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲)卵的土壤。在28℃下温育WCR卵10至11天。洗掉卵上的土壤，将卵置于0.15％琼脂溶液中，把浓度调节至每0.25mL等份大约75至100个卵。将一份卵悬浮液加入培养皿中以设置孵化平板，用于监测孵化速率。
用150至200个WCR卵侵染中生长的玉蜀黍植物周围的土壤。允许昆虫进食2周，在这段时间之后，针对每个植物给出“根评级”。利用节损伤量表进行分级，大体上根据Oleson等人，(2005)J.Econ.Entomol.98:1-8。将通过了该生物测定、显示损伤减轻的植物移栽到5加仑的盆中供产生种子。用杀虫剂处理移栽物，以防止进一步的根虫损害和昆虫释放到温室中。对植物手工授粉以产生种子。保存由这些植物产生的种子以评估植物的T1世代和后续世代。
转基因阴性对照植物通过用包含被设计为产生黄色荧光蛋白(YFP)的基因的载体转化而生成。非转化的阴性对照植物由产生转基因植物的亲代玉米品种的种子培植而来。进行生物测定，其中每一组植物材料中均包括阴性对照。
实施例9：包含鞘翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例6中所述生成10至20株转基因T0玉米植物。获得另外的10至20个表达RNAi构建体的发夹dsRNA的T1玉米独立品系用于玉米根虫攻击。发夹dsRNA包含SEQ ID NO:1的一部分。额外的发夹dsRNA来源于例如鞘翅目害虫序列，诸如Caf1-180(美国专利申请公布号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公布号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公布号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公布号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公布号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公布号2013/0091601)、RPS6(美国专利申请公布号2013/0097730)、ROP(美国专利申请号14/577,811)、RNA聚合酶II140(美国专利申请号14/577,854)、Dre4(美国专利申请号14/705,807)、ncm(美国专利申请号62/095487)、COPIα(美国专利申请号62/063,199)、COPIβ(美国专利申请号62/063,203)、COPIγ(美国专利申请号62/063,192)或COPIδ(美国专利申请号62/063,216)、RNA聚合酶I1(美国专利申请号62/133,214)、RNA聚合酶II-215(美国专利申请号62/133,202)、RNA聚合酶33(美国专利申请号62/133,210)和spt5(美国专利申请号62/168613)。这些通过RT-PCR或其他分子分析方法得到确认。
来自选择的独立T1品系的总RNA制备物任选地用于RT-PCR，其中引物被设计为在每个RNAi构建体中的发夹表达盒的接头中结合。另外，用于RNAi构建体中每个靶标基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内产生siRNA所需要的预加工mRNA，并用于确认产生了所述预加工的mRNA。对于每个靶标基因的期望条带的扩增确认每个转基因玉米植物中表达了发夹RNA。随后任选地利用RNA印迹杂交在独立的转基因品系中确认靶标基因的dsRNA发夹加工成了siRNA。
另外，具有与靶标基因存在80％以上序列同一性的错配序列的RNAi分子影响玉米根虫的方式类似于使用与靶标基因具有100％序列同一性的RNAi分子时所见的方式。错配序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，由此递送能够影响进食中的鞘翅目害虫的生长、发育和生存力的经植物加工的siRNA。
在植物内递送对应于靶标基因的dsRNA、siRNA或miRNA，随后被鞘翅目害虫通过进食而摄取，造成鞘翅目害虫中的靶标基因由于RNA介导的基因沉默而下调。当靶标基因在发育的一个或多个阶段发挥重要作用时，鞘翅目害虫的生长和/或发育受到影响，并且就WCR、NCR、SCR、MCR、黄瓜条根萤叶甲、南美叶甲、黄瓜十一星叶甲和D.u.undecimpunctataMannerheim中的至少一者而言，造成鞘翅目害虫无法成功地侵染、进食和/或发育，或造成鞘翅目害虫死亡。然后通过选择靶标基因和成功应用RNAi来控制鞘翅目害虫。
转基因RNAi品系和非转化玉米的表型比较。选择用于创建发夹dsRNA的靶标鞘翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此，预期由靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体产生或活化(系统性)RNAi不会对转基因植物产生任何有害影响。然而，将转基因品系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的那些转基因品系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长度和生长模式上没有可观察到的差异。记录植物的芽特征，诸如高度、叶片数和大小、开花时间、花的大小和外观。一般说来，当在体外和在温室土壤中培养时，在转基因品系和未表达靶标iRNA分子的那些品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例10：包含鞘翅目害虫序列和额外的RNAi构建体的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含异源性编码序列，该异源性编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物体的iRNA分子，对这样的转基因玉米植物经由农杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold，(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ IDNO:1的基因的dsRNA分子)。大体上如实施例4中所述制备植物转化质粒载体，经由农杆菌或WHISKERSTM介导的转化方法递送到获自转基因Hi II或B104玉米植物的玉蜀黍悬浮细胞或未成熟玉蜀黍胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源性编码序列，所述异源性编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物体的iRNA分子。
实施例11：包含RNAi构建体和额外的鞘翅目害虫控制序列的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物体的iRNA分子的异源性编码序列(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1的基因的dsRNA分子)，对这样的转基因玉米植物经由农杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold，(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫蛋白分子，例如Cry3、Cry34Cry35、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C杀虫蛋白。大体上如实施例4中所述制备植物转化质粒载体，经由农杆菌或WHISKERSTM介导的转化方法递送到获自转基因B104玉米植物的玉蜀黍悬浮细胞或未成熟玉蜀黍胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源性编码序列，所述异源性编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫生物体的iRNA分子。获得产生用于控制鞘翅目害虫的iRNA分子和杀虫蛋白的双重转化植物。
实施例12：昆虫管理中的spt6 dsRNA
将Spt6 dsRNA转基因与转基因植物中的其他dsRNA分子组合，以提供冗余的RNAi靶向和协同的RNAi效应。表达靶向spt6的dsRNA的转基因植物包括(例如但不限于玉米)可用于预防鞘翅目昆虫造成的进食损害。Spt6 dsRNA转基因还在植物中与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术结合，以代表昆虫抗性管理基因累加中的新作用模式。当在转基因植物中与靶向昆虫害虫的其他dsRNA分子和/或杀虫蛋白结合时，观察到协同的杀虫效应，该效应还减缓了抗性昆虫群体壮大的速度。
序列表
<110> Dow AgroSciences, LLC
FIME
Narva, Kenneth E
Worden, Sarah
Frey, Meghan
Rangasamy, Murugesan
Gandra, Premchand
Lo, Wendy
Fishilevich, Elane
Vilcinskas, Andreas
Knorr, Eileen
<120> 控制昆虫害虫的SPT6核酸分子
<130> 2971-P12796.1US (77541-US-NP)
<150> US 62/168,606
<151> 2015-05-29
<160> 84
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5948
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 1
gtcacttgtc aattgtcaac ctggaaaacg acttgtcgaa gtcgcatagt ttttataagt 60
ttaaataaac taaattaaat ataaatactt cgagaatgca ataattatta ttctttaact 120
agacccacag cttattaatt agcagaagta gtagcagact tatactaact agcataagga 180
gaaacatatt aacataacat ggcagacttc atagattctg aagcagaaga aagtagtgag 240
gaggaggaat tagatcatag ggatcgtaaa aaagcccaaa aagccaaagt tgtagatagt 300
tcagatgaag atgatgaaga tgatgacgaa agactgagag aggaattaaa ggatttgatt 360
gatgataatc ctattgaaga aagtgatgct gagtctgatg cttcaggaag ggaaaaacgt 420
aagaaatctg acgacgagga tttggatgat cgactggaag atgaagatta tgatttgctt 480
gaagaaaatt tgggtgttaa agttgaaaga aggaaattca agcgactgcg gcgttttgaa 540
gatgaagaaa gtgaaggaga agaagaacat gatcctgaac aagataggga acaaattgct 600
atggatatat tttcagatga tgacgatgaa agacgatcag aacgaagtca cagacctgcc 660
gtcgaacaag aaacttatgg tgtaggcgag gaagaagagg aaggggagta ctcggatgcc 720
gatgatttta tagttgacga tgacggtaga ccgatagctg aaaagaagaa gaagaaaaaa 780
ccaatattta ctgatgccgc tctccaagag gctcaagaaa ccttcggtgt cgattttgat 840
tatgatgaat ttagtaaata cgatgaagat gattacgaag atgaagagga ggaggatgac 900
gaatacgagg aagatgatgt agagaaaagg aaacggccta aaaagacttc aaagaaaaaa 960
ccgacgaaga aatccatttt tgaagtgtat gaacctagtg aacttaaaag agggttcttt 1020
accgatctcg ataatgaaat ccgaaacact gatattcccg aaagaatgca acttcgtgat 1080
gttccaatca ccgctgttcc ggatgactca actgaacttg atgatgaagc agaatggatt 1140
tacaggcaag cgttttgtaa cagaactgtt tccaatgtgg attctcattt atcatcagag 1200
gcaagagaga aattaaagaa gactcatcat gccatcggaa aaatcagaaa agcattagat 1260
tttataagaa atcaacaatt agaagtaccg tttattgctt tttatagaaa ggagtatgtt 1320
caaccggaac ttaatattaa cgatttgtgg aaagtatata aatacgatgc aaagtggtgc 1380
caattgaaaa cacgcaaaga aaacctcttg aagctttttg aaaaaatgag gtcatatcaa 1440
actgaccaca taatgaaaga tccagatgca ccaattccag acaaccttcg tattatgact 1500
gagtccgaca ttgagcgatt gaaaaatgtt caaaccgccg aagagttaaa tgacgttcac 1560
aatcatttca ttttatatta tgctgcagat ttgccagcca tgcatgccgc gtggagagtc 1620
aaagaaagag aaaggagaag acaggaaaga aaggaggcta gacttaagct catcgctgaa 1680
agtgaagaag gtgctgaaat tcctgaagag cctgaggaaa ttgacgatga tgaaccagaa 1740
gctgaaacct taaaatacgc caatagatca ggcagctatg cactatgtaa taaaggaggt 1800
ttgggtcctc tagcgaagaa atttggttta acgcctgaag aatttgccga aaacctgaga 1860
gataattatc agaggcacga agtagatcaa gaacatatag aacctgtaga agtcgctaaa 1920
gaattcgtat cgccgaaatt tcctacagtg gaagaagtgt tgcaagctac taaacacatg 1980
gtagctttac aaatagcaag agaaccatta gtaaggaaat gcgtaagaga aattttcttt 2040
gaacgagcta gattaaacgt ttatccaacc aaaaagggtg tgaaagttat agatgaagct 2100
cataattgct atagtatgaa gtatgtaaaa aataaaccag taagagatct tgcaggcgac 2160
caatttttaa aattatgttt agccgaagag gagaacctcc ttactattac catcaatgac 2220
catattcaag gaaacactac taacaattac attgatgaag tcaaacaatt atatataaag 2280
gatgaattca gcaaacacgt tcaggattgg aatgcgctaa gaatggaatc ggtagaaagg 2340
gctttaacga aaagtgtctt accagattta agatctgaat taaaacgaac gttgctcaca 2400
gaggctaaag aattcgtatt aaaagcttgc tgtagaaaat tatataattg gataaagatt 2460
gctccatacg caataacttt tcccgatgaa gacgaagatg attgggatac atccaaaggt 2520
gttagaacta tgggtgtagc atacgtacca gagcacacag tatcagcttt tacctgtatt 2580
tcagcaccag acggagatat aactgattat ctcagattac caaatattct aaaaagaaaa 2640
aatagctttc gaactgaaga aaaacttatg aaggaagctg atcttcaagc actgaaaaat 2700
ttcatattcc ttaaaaagcc tcatgtgata gcagtagggg gtgagtccag agaagcctta 2760
atgatcgctg atgatatcag aggagtaata agtgaactaa tagaatccga ccaattccca 2820
cagattaggg ttgaaattat tgataatgaa ttagccaaag tgtacgcaaa ttccattaaa 2880
ggttcaactg atttcagaga ttatccagag ttgttaaggc aagctatttc attagctcga 2940
agaatgcaag atcctttggt tgaattttcc caattatgta atagcgatga ggaaattttg 3000
agtctgaggt ttcatccctt gcaggaacaa gtccagaaag aagaactact agaagctctc 3060
tgtttagaat ttgtcaacag aacaaatgaa gtaggtgtag atataaatct tgccgttcag 3120
cagattcata aaagtagttt agttcaattc atatgcggtc taggaccgcg taaaggtcaa 3180
gcgttactta aagttctgaa acaaactaat cagaggcttg aaaacagaac ccaattggtt 3240
acattttgtc atatgggtcc aaaagttttt attaattgtt ctggattcat aaagattgat 3300
accaatagtt taggagacag tactgaggca tatgttgaaa tattggatgg ctctcgagtt 3360
catcccgaaa cttatgaatg ggcacgaaaa atggctgtgg atgctttaga atatgacgat 3420
gatgagggag ctaatccggc gggagcttta gaggaaattc tcgaggcgcc agagaggtta 3480
aaagatcttg acttggatgc atttgcggag gaattggaaa gacaaggatt tggtaacaag 3540
agtataacat tgtatgacat tagagcagaa ctgaactcgc gatataaaga tttgagacaa 3600
ccttttcgtt ctgcaaatcc tgaagaacta ttcgatatgc ttactaaaga aactcccgaa 3660
acattttata ttggaaaaat ggttacatct accgtgtttg gcattgcaag gagaaaacca 3720
aagtcagacc agctcgatca agctaatccg gtccgtaatg acgaaactgg tttgtggcag 3780
tgccccttct gtttgaaaaa tgattttcct gaattatctg atgtatggaa tcattttgat 3840
gcaggagcat gtcctggtca agctactgga gttaaactaa gactggataa tggtatatta 3900
ggttatattt atataaaaaa tataagcgac aaaccagttg ctaatccgga agaaagagta 3960
ggcataggac aattaattca ctgtagaata ataaaaattg acgtagagaa gtttagtgtt 4020
gattgtacat cgaaatctag cgatcttgct gataaaaatc atgaatggag acctcaacga 4080
gatcctcatt atgatcaaga acgtgaagac aaagacaatc gattagaagc cgagaagaag 4140
aaagagaaac agcgtatgac gtacatcaag agggttatcg ttcatccggc gttccataac 4200
atatcctatg ccgaagccga aaaatgtatg gttaatatgg accagggtga agttatcatt 4260
aggccttcga gtaagggtgc ggatcatttg accattactt ggaaggttac ggatggaatc 4320
tatcaacaca ttgatattaa ggaacaaggg aaagttaacg ctttttcttt aggaaaatca 4380
ttatggattg gaaatgaaga atttgaagat cttgatgaaa taatagctag gcacgttaca 4440
ccaatggcgg cgcatgctag agatttactg tattttaggt attacaaaga tttccaaggt 4500
ggtcataaag ataaggctga ggaatatcta aaagatgaaa aaaagaaaaa tgcttctaaa 4560
attcattatg tagttagtgc tgctaagaat atacctggta aatttcttct ttcgtacctt 4620
ccacgcaaca aagttagaca cgaatatgta acagttactc cagaaggctt tcggtttaga 4680
caacaaatgt ttgattccgt ttcttcgtta tttaaatggt tcaaagaaca tttccgggag 4740
cctccaccag gcggtgcaac accaggtagc acgccaagga tggcttcaag cagaactgga 4800
tatggaagtg ccacacccgc gtatagtatg aataatgaag ctattcaaag agttgctcaa 4860
aatttaccaa gtcatgtagt tcaagcgtta tctgctgcca ccaaccaaac tccacattat 4920
ccccacaccc ctggttatgg aggcaattat attaatacgc cttacactcc aagtggtcaa 4980
actccataca tgactccgta cgctacaccc catacgcagc aaactccccg ctatggtcat 5040
caaacacctt cccaacacat ggcgagctca gcaccacaag gtctcaacaa tcccttttta 5100
catcctggcg cggtgactcc ctcccaacga actcctattt atcgcaacca tcctgcacaa 5160
tctccagtaa tgcttcctac aagccctgta ccaagtccag gttcccagag ttcatacagt 5220
agtcatttaa gtcataatca gcgaagtgga agttatgctg aatccttaag attccaacct 5280
cccgaatcgc cgagaagctc agtgagtaat agaagctttc aaactgatag atacggcggt 5340
gataggtatg gtaaaggagg aagtcataga tatggtggaa gctcaaacga agatagatat 5400
ggtaagggag gaggaggaaa tgaaaatacg gattggcaga aagctgcaga agcatgggct 5460
cgatctagat ctactccgag aagtgatggc cgtaatactc caagatctgt aggtcaacga 5520
actcctagat acgacaacga cgccgaacgt tctagaatga aacacctcag caagagcccg 5580
aggtctgtta ggtctactcc tcgaaccaat acatctccac attctatgtc cctaggtgat 5640
gctacccctc tgtatgacga aagtatctaa attactttgt atttggttat atagtagggt 5700
aacagtgata ttgtaaatgc taaaatcaac aatacagatt cgcgatatta agtcacaatg 5760
acgacctctc gtggagttcg gtgaaactaa ctttgagggc gttttcactg tcaaacgtcc 5820
agcgcacatg cacctgaaac aagtaggcaa tattcattat ttatttttac aggtttttta 5880
tacaaatatt atttacaaca tagacttcaa cttttactga aaggtgaagc tttcatatta 5940
ataatttt 5948
<210> 2
<211> 1823
<212> PRT
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 2
Met Ala Asp Phe Ile Asp Ser Glu Ala Glu Glu Ser Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Leu Asp His Arg Asp Arg Lys Lys Ala Gln Lys Ala Lys Val Val
20 25 30
Asp Ser Ser Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Glu Arg Leu Arg Glu
35 40 45
Glu Leu Lys Asp Leu Ile Asp Asp Asn Pro Ile Glu Glu Ser Asp Ala
50 55 60
Glu Ser Asp Ala Ser Gly Arg Glu Lys Arg Lys Lys Ser Asp Asp Glu
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Arg Leu Glu Asp Glu Asp Tyr Asp Leu Leu Glu Glu
85 90 95
Asn Leu Gly Val Lys Val Glu Arg Arg Lys Phe Lys Arg Leu Arg Arg
100 105 110
Phe Glu Asp Glu Glu Ser Glu Gly Glu Glu Glu His Asp Pro Glu Gln
115 120 125
Asp Arg Glu Gln Ile Ala Met Asp Ile Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu
130 135 140
Arg Arg Ser Glu Arg Ser His Arg Pro Ala Val Glu Gln Glu Thr Tyr
145 150 155 160
Gly Val Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Tyr Ser Asp Ala Asp Asp
165 170 175
Phe Ile Val Asp Asp Asp Gly Arg Pro Ile Ala Glu Lys Lys Lys Lys
180 185 190
Lys Lys Pro Ile Phe Thr Asp Ala Ala Leu Gln Glu Ala Gln Glu Thr
195 200 205
Phe Gly Val Asp Phe Asp Tyr Asp Glu Phe Ser Lys Tyr Asp Glu Asp
210 215 220
Asp Tyr Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Asp
225 230 235 240
Val Glu Lys Arg Lys Arg Pro Lys Lys Thr Ser Lys Lys Lys Pro Thr
245 250 255
Lys Lys Ser Ile Phe Glu Val Tyr Glu Pro Ser Glu Leu Lys Arg Gly
260 265 270
Phe Phe Thr Asp Leu Asp Asn Glu Ile Arg Asn Thr Asp Ile Pro Glu
275 280 285
Arg Met Gln Leu Arg Asp Val Pro Ile Thr Ala Val Pro Asp Asp Ser
290 295 300
Thr Glu Leu Asp Asp Glu Ala Glu Trp Ile Tyr Arg Gln Ala Phe Cys
305 310 315 320
Asn Arg Thr Val Ser Asn Val Asp Ser His Leu Ser Ser Glu Ala Arg
325 330 335
Glu Lys Leu Lys Lys Thr His His Ala Ile Gly Lys Ile Arg Lys Ala
340 345 350
Leu Asp Phe Ile Arg Asn Gln Gln Leu Glu Val Pro Phe Ile Ala Phe
355 360 365
Tyr Arg Lys Glu Tyr Val Gln Pro Glu Leu Asn Ile Asn Asp Leu Trp
370 375 380
Lys Val Tyr Lys Tyr Asp Ala Lys Trp Cys Gln Leu Lys Thr Arg Lys
385 390 395 400
Glu Asn Leu Leu Lys Leu Phe Glu Lys Met Arg Ser Tyr Gln Thr Asp
405 410 415
His Ile Met Lys Asp Pro Asp Ala Pro Ile Pro Asp Asn Leu Arg Ile
420 425 430
Met Thr Glu Ser Asp Ile Glu Arg Leu Lys Asn Val Gln Thr Ala Glu
435 440 445
Glu Leu Asn Asp Val His Asn His Phe Ile Leu Tyr Tyr Ala Ala Asp
450 455 460
Leu Pro Ala Met His Ala Ala Trp Arg Val Lys Glu Arg Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gln Glu Arg Lys Glu Ala Arg Leu Lys Leu Ile Ala Glu Ser Glu
485 490 495
Glu Gly Ala Glu Ile Pro Glu Glu Pro Glu Glu Ile Asp Asp Asp Glu
500 505 510
Pro Glu Ala Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Asn Arg Ser Gly Ser Tyr Ala
515 520 525
Leu Cys Asn Lys Gly Gly Leu Gly Pro Leu Ala Lys Lys Phe Gly Leu
530 535 540
Thr Pro Glu Glu Phe Ala Glu Asn Leu Arg Asp Asn Tyr Gln Arg His
545 550 555 560
Glu Val Asp Gln Glu His Ile Glu Pro Val Glu Val Ala Lys Glu Phe
565 570 575
Val Ser Pro Lys Phe Pro Thr Val Glu Glu Val Leu Gln Ala Thr Lys
580 585 590
His Met Val Ala Leu Gln Ile Ala Arg Glu Pro Leu Val Arg Lys Cys
595 600 605
Val Arg Glu Ile Phe Phe Glu Arg Ala Arg Leu Asn Val Tyr Pro Thr
610 615 620
Lys Lys Gly Val Lys Val Ile Asp Glu Ala His Asn Cys Tyr Ser Met
625 630 635 640
Lys Tyr Val Lys Asn Lys Pro Val Arg Asp Leu Ala Gly Asp Gln Phe
645 650 655
Leu Lys Leu Cys Leu Ala Glu Glu Glu Asn Leu Leu Thr Ile Thr Ile
660 665 670
Asn Asp His Ile Gln Gly Asn Thr Thr Asn Asn Tyr Ile Asp Glu Val
675 680 685
Lys Gln Leu Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Ser Lys His Val Gln Asp Trp
690 695 700
Asn Ala Leu Arg Met Glu Ser Val Glu Arg Ala Leu Thr Lys Ser Val
705 710 715 720
Leu Pro Asp Leu Arg Ser Glu Leu Lys Arg Thr Leu Leu Thr Glu Ala
725 730 735
Lys Glu Phe Val Leu Lys Ala Cys Cys Arg Lys Leu Tyr Asn Trp Ile
740 745 750
Lys Ile Ala Pro Tyr Ala Ile Thr Phe Pro Asp Glu Asp Glu Asp Asp
755 760 765
Trp Asp Thr Ser Lys Gly Val Arg Thr Met Gly Val Ala Tyr Val Pro
770 775 780
Glu His Thr Val Ser Ala Phe Thr Cys Ile Ser Ala Pro Asp Gly Asp
785 790 795 800
Ile Thr Asp Tyr Leu Arg Leu Pro Asn Ile Leu Lys Arg Lys Asn Ser
805 810 815
Phe Arg Thr Glu Glu Lys Leu Met Lys Glu Ala Asp Leu Gln Ala Leu
820 825 830
Lys Asn Phe Ile Phe Leu Lys Lys Pro His Val Ile Ala Val Gly Gly
835 840 845
Glu Ser Arg Glu Ala Leu Met Ile Ala Asp Asp Ile Arg Gly Val Ile
850 855 860
Ser Glu Leu Ile Glu Ser Asp Gln Phe Pro Gln Ile Arg Val Glu Ile
865 870 875 880
Ile Asp Asn Glu Leu Ala Lys Val Tyr Ala Asn Ser Ile Lys Gly Ser
885 890 895
Thr Asp Phe Arg Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Arg Gln Ala Ile Ser Leu
900 905 910
Ala Arg Arg Met Gln Asp Pro Leu Val Glu Phe Ser Gln Leu Cys Asn
915 920 925
Ser Asp Glu Glu Ile Leu Ser Leu Arg Phe His Pro Leu Gln Glu Gln
930 935 940
Val Gln Lys Glu Glu Leu Leu Glu Ala Leu Cys Leu Glu Phe Val Asn
945 950 955 960
Arg Thr Asn Glu Val Gly Val Asp Ile Asn Leu Ala Val Gln Gln Ile
965 970 975
His Lys Ser Ser Leu Val Gln Phe Ile Cys Gly Leu Gly Pro Arg Lys
980 985 990
Gly Gln Ala Leu Leu Lys Val Leu Lys Gln Thr Asn Gln Arg Leu Glu
995 1000 1005
Asn Arg Thr Gln Leu Val Thr Phe Cys His Met Gly Pro Lys Val
1010 1015 1020
Phe Ile Asn Cys Ser Gly Phe Ile Lys Ile Asp Thr Asn Ser Leu
1025 1030 1035
Gly Asp Ser Thr Glu Ala Tyr Val Glu Ile Leu Asp Gly Ser Arg
1040 1045 1050
Val His Pro Glu Thr Tyr Glu Trp Ala Arg Lys Met Ala Val Asp
1055 1060 1065
Ala Leu Glu Tyr Asp Asp Asp Glu Gly Ala Asn Pro Ala Gly Ala
1070 1075 1080
Leu Glu Glu Ile Leu Glu Ala Pro Glu Arg Leu Lys Asp Leu Asp
1085 1090 1095
Leu Asp Ala Phe Ala Glu Glu Leu Glu Arg Gln Gly Phe Gly Asn
1100 1105 1110
Lys Ser Ile Thr Leu Tyr Asp Ile Arg Ala Glu Leu Asn Ser Arg
1115 1120 1125
Tyr Lys Asp Leu Arg Gln Pro Phe Arg Ser Ala Asn Pro Glu Glu
1130 1135 1140
Leu Phe Asp Met Leu Thr Lys Glu Thr Pro Glu Thr Phe Tyr Ile
1145 1150 1155
Gly Lys Met Val Thr Ser Thr Val Phe Gly Ile Ala Arg Arg Lys
1160 1165 1170
Pro Lys Ser Asp Gln Leu Asp Gln Ala Asn Pro Val Arg Asn Asp
1175 1180 1185
Glu Thr Gly Leu Trp Gln Cys Pro Phe Cys Leu Lys Asn Asp Phe
1190 1195 1200
Pro Glu Leu Ser Asp Val Trp Asn His Phe Asp Ala Gly Ala Cys
1205 1210 1215
Pro Gly Gln Ala Thr Gly Val Lys Leu Arg Leu Asp Asn Gly Ile
1220 1225 1230
Leu Gly Tyr Ile Tyr Ile Lys Asn Ile Ser Asp Lys Pro Val Ala
1235 1240 1245
Asn Pro Glu Glu Arg Val Gly Ile Gly Gln Leu Ile His Cys Arg
1250 1255 1260
Ile Ile Lys Ile Asp Val Glu Lys Phe Ser Val Asp Cys Thr Ser
1265 1270 1275
Lys Ser Ser Asp Leu Ala Asp Lys Asn His Glu Trp Arg Pro Gln
1280 1285 1290
Arg Asp Pro His Tyr Asp Gln Glu Arg Glu Asp Lys Asp Asn Arg
1295 1300 1305
Leu Glu Ala Glu Lys Lys Lys Glu Lys Gln Arg Met Thr Tyr Ile
1310 1315 1320
Lys Arg Val Ile Val His Pro Ala Phe His Asn Ile Ser Tyr Ala
1325 1330 1335
Glu Ala Glu Lys Cys Met Val Asn Met Asp Gln Gly Glu Val Ile
1340 1345 1350
Ile Arg Pro Ser Ser Lys Gly Ala Asp His Leu Thr Ile Thr Trp
1355 1360 1365
Lys Val Thr Asp Gly Ile Tyr Gln His Ile Asp Ile Lys Glu Gln
1370 1375 1380
Gly Lys Val Asn Ala Phe Ser Leu Gly Lys Ser Leu Trp Ile Gly
1385 1390 1395
Asn Glu Glu Phe Glu Asp Leu Asp Glu Ile Ile Ala Arg His Val
1400 1405 1410
Thr Pro Met Ala Ala His Ala Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Arg Tyr
1415 1420 1425
Tyr Lys Asp Phe Gln Gly Gly His Lys Asp Lys Ala Glu Glu Tyr
1430 1435 1440
Leu Lys Asp Glu Lys Lys Lys Asn Ala Ser Lys Ile His Tyr Val
1445 1450 1455
Val Ser Ala Ala Lys Asn Ile Pro Gly Lys Phe Leu Leu Ser Tyr
1460 1465 1470
Leu Pro Arg Asn Lys Val Arg His Glu Tyr Val Thr Val Thr Pro
1475 1480 1485
Glu Gly Phe Arg Phe Arg Gln Gln Met Phe Asp Ser Val Ser Ser
1490 1495 1500
Leu Phe Lys Trp Phe Lys Glu His Phe Arg Glu Pro Pro Pro Gly
1505 1510 1515
Gly Ala Thr Pro Gly Ser Thr Pro Arg Met Ala Ser Ser Arg Thr
1520 1525 1530
Gly Tyr Gly Ser Ala Thr Pro Ala Tyr Ser Met Asn Asn Glu Ala
1535 1540 1545
Ile Gln Arg Val Ala Gln Asn Leu Pro Ser His Val Val Gln Ala
1550 1555 1560
Leu Ser Ala Ala Thr Asn Gln Thr Pro His Tyr Pro His Thr Pro
1565 1570 1575
Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Ile Asn Thr Pro Tyr Thr Pro Ser Gly
1580 1585 1590
Gln Thr Pro Tyr Met Thr Pro Tyr Ala Thr Pro His Thr Gln Gln
1595 1600 1605
Thr Pro Arg Tyr Gly His Gln Thr Pro Ser Gln His Met Ala Ser
1610 1615 1620
Ser Ala Pro Gln Gly Leu Asn Asn Pro Phe Leu His Pro Gly Ala
1625 1630 1635
Val Thr Pro Ser Gln Arg Thr Pro Ile Tyr Arg Asn His Pro Ala
1640 1645 1650
Gln Ser Pro Val Met Leu Pro Thr Ser Pro Val Pro Ser Pro Gly
1655 1660 1665
Ser Gln Ser Ser Tyr Ser Ser His Leu Ser His Asn Gln Arg Ser
1670 1675 1680
Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Leu Arg Phe Gln Pro Pro Glu Ser Pro
1685 1690 1695
Arg Ser Ser Val Ser Asn Arg Ser Phe Gln Thr Asp Arg Tyr Gly
1700 1705 1710
Gly Asp Arg Tyr Gly Lys Gly Gly Ser His Arg Tyr Gly Gly Ser
1715 1720 1725
Ser Asn Glu Asp Arg Tyr Gly Lys Gly Gly Gly Gly Asn Glu Asn
1730 1735 1740
Thr Asp Trp Gln Lys Ala Ala Glu Ala Trp Ala Arg Ser Arg Ser
1745 1750 1755
Thr Pro Arg Ser Asp Gly Arg Asn Thr Pro Arg Ser Val Gly Gln
1760 1765 1770
Arg Thr Pro Arg Tyr Asp Asn Asp Ala Glu Arg Ser Arg Met Lys
1775 1780 1785
His Leu Ser Lys Ser Pro Arg Ser Val Arg Ser Thr Pro Arg Thr
1790 1795 1800
Asn Thr Ser Pro His Ser Met Ser Leu Gly Asp Ala Thr Pro Leu
1805 1810 1815
Tyr Asp Glu Ser Ile
1820
<210> 3
<211> 499
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 3
cgccttacac tccaagtggt caaactccat acatgactcc gtacgctaca ccccatacgc 60
agcaaactcc ccgctatggt catcaaacac cttcccaaca catggcgagc tcagcaccac 120
aaggtctcaa caatcccttt ttacatcctg gcgcggtgac tccctcccaa cgaactccta 180
tttatcgcaa ccatcctgca caatctccag taatgcttcc tacaagccct gtaccaagtc 240
caggttccca gagttcatac agtagtcatt taagtcataa tcagcgaagt ggaagttatg 300
ctgaatcctt aagattccaa cctcccgaat cgccgagaag ctcagtgagt aatagaagct 360
ttcaaactga tagatacggc ggtgataggt atggtaaagg aggaagtcat agatatggtg 420
gaagctcaaa cgaagataga tatggtaagg gaggaggagg aaatgaaaat acggattggc 480
agaaagctgc agaagcatg 499
<210> 4
<211> 145
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 4
gactccgtac gctacacccc atacgcagca aactccccgc tatggtcatc aaacaccttc 60
ccaacacatg gcgagctcag caccacaagg tctcaacaat ccctttttac atcctggcgc 120
ggtgactccc tcccaacgaa ctcct 145
<210> 5
<211> 108
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 5
agagttcata cagtagtcat ttaagtcata atcagcgaag tggaagttat gctgaatcct 60
taagattcca acctcccgaa tcgccgagaa gctcagtgag taatagaa 108
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7噬菌体启动子
<400> 6
ttaatacgac tcactatagg gaga 24
<210> 7
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分YFP编码序列
<400> 7
caccatgggc tccagcggcg ccctgctgtt ccacggcaag atcccctacg tggtggagat 60
ggagggcaat gtggatggcc acaccttcag catccgcggc aagggctacg gcgatgccag 120
cgtgggcaag gtggatgccc agttcatctg caccaccggc gatgtgcccg tgccctggag 180
caccctggtg accaccctga cctacggcgc ccagtgcttc gccaagtacg gccccgagct 240
gaaggatttc tacaagagct gcatgcccga tggctacgtg caggagcgca ccatcacctt 300
cgagggcgat ggcaatttca agacccgcgc cgaggtgacc ttcgagaatg gcagcgtgta 360
caatcgcgtg aagctgaatg gccagggctt caagaaggat ggccacgtgc tgggcaagaa 420
tctggagttc aatttcaccc cccactgcct gtacatctgg ggcgatcagg ccaatcacgg 480
cctgaagagc gccttcaaga tct 503
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Dvv-spt6-1_For
<400> 8
ttaatacgac tcactatagg gagacgcctt acactccaag tggtcaaac 49
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Dvv-spt6-1_Rev
<400> 9
ttaatacgac tcactatagg gagacatgct tctgcagctt tctgccaatc 50
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Dvv-spt6_v1_For
<400> 10
ttaatacgac tcactatagg gagagactcc gtacgctaca ccccatac 48
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Dvv-spt6-1_v1_Rev
<400> 11
ttaatacgac tcactatagg gagaaggagt tcgttgggag ggagtcac 48
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Dvv-spt6-1_v2_For
<400> 12
ttaatacgac tcactatagg gagaagagtt catacagtag tcatttaagt c 51
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Dvv-spt6-1_v2_Rev
<400> 13
ttaatacgac tcactatagg gagattctat tactcactga gcttctcg 48
<210> 14
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的YFP编码序列
<400> 14
atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60
aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120
aaggttgatg cacagttcat ctgcacaact ggtgatgttc ctgtgccttg gagcacactt 180
gtcaccactc tcacctatgg agcacagtgc tttgccaagt atggtccaga gttgaaggac 240
ttctacaagt cctgtatgcc agatggctat gtgcaagagc gcacaatcac ctttgaagga 300
gatggcaact tcaagactag ggctgaagtc acctttgaga atgggtctgt ctacaatagg 360
gtcaaactca atggtcaagg cttcaagaaa gatggtcatg tgttgggaaa gaacttggag 420
ttcaacttca ctccccactg cctctacatc tggggtgacc aagccaacca cggtctcaag 480
tcagccttca agatctgtca tgagattact ggcagcaaag gcgacttcat agtggctgac 540
cacacccaga tgaacactcc cattggtgga ggtccagttc atgttccaga gtatcatcac 600
atgtcttacc atgtgaaact ttccaaagat gtgacagacc acagagacaa catgtccttg 660
aaagaaactg tcagagctgt tgactgtcgc aagacctacc tttga 705
<210> 15
<211> 218
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 15
tagctctgat gacagagccc atcgagtttc aagccaaaca gttgcataaa gctatcagcg 60
gattgggaac tgatgaaagt acaatmgtmg aaattttaag tgtmcacaac aacgatgaga 120
ttataagaat ttcccaggcc tatgaaggat tgtaccaacg mtcattggaa tctgatatca 180
aaggagatac ctcaggaaca ttaaaaaaga attattag 218
<210> 16
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<220>
<221> misc_feature
<222> (393)..(395)
<223> n为a、c、g或t
<400> 16
ttgttacaag ctggagaact tctctttgct ggaaccgaag agtcagtatt taatgctgta 60
ttctgtcaaa gaaataaacc acaattgaat ttgatattcg acaaatatga agaaattgtt 120
gggcatccca ttgaaaaagc cattgaaaac gagttttcag gaaatgctaa acaagccatg 180
ttacacctta tccagagcgt aagagatcaa gttgcatatt tggtaaccag gctgcatgat 240
tcaatggcag gcgtcggtac tgacgataga actttaatca gaattgttgt ttcgagatct 300
gaaatcgatc tagaggaaat caaacaatgc tatgaagaaa tctacagtaa aaccttggct 360
gataggatag cggatgacac atctggcgac tannnaaaag ccttattagc cgttgttggt 420
taag 424
<210> 17
<211> 397
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 17
agatgttggc tgcatctaga gaattacaca agttcttcca tgattgcaag gatgtactga 60
gcagaatagt ggaaaaacag gtatccatgt ctgatgaatt gggaagggac gcaggagctg 120
tcaatgccct tcaacgcaaa caccagaact tcctccaaga cctacaaaca ctccaatcga 180
acgtccaaca aatccaagaa gaatcagcta aacttcaagc tagctatgcc ggtgatagag 240
ctaaagaaat caccaacagg gagcaggaag tggtagcagc ctgggcagcc ttgcagatcg 300
cttgcgatca gagacacgga aaattgagcg atactggtga tctattcaaa ttctttaact 360
tggtacgaac gttgatgcag tggatggacg aatggac 397
<210> 18
<211> 490
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 18
gcagatgaac accagcgaga aaccaagaga tgttagtggt gttgaattgt tgatgaacaa 60
ccatcagaca ctcaaggctg agatcgaagc cagagaagac aactttacgg cttgtatttc 120
tttaggaaag gaattgttga gccgtaatca ctatgctagt gctgatatta aggataaatt 180
ggtcgcgttg acgaatcaaa ggaatgctgt actacagagg tgggaagaaa gatgggagaa 240
cttgcaactc atcctcgagg tataccaatt cgccagagat gcggccgtcg ccgaagcatg 300
gttgatcgca caagaacctt acttgatgag ccaagaacta ggacacacca ttgacgacgt 360
tgaaaacttg ataaagaaac acgaagcgtt cgaaaaatcg gcagcggcgc aagaagagag 420
attcagtgct ttggagagac tgacgacgtt cgaattgaga gaaataaaga ggaaacaaga 480
agctgcccag 490
<210> 19
<211> 330
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 19
agtgaaatgt tagcaaatat aacatccaag tttcgtaatt gtacttgctc agttagaaaa 60
tattctgtag tttcactatc ttcaaccgaa aatagaataa atgtagaacc tcgcgaactt 120
gcctttcctc caaaatatca agaacctcga caagtttggt tggagagttt agatacgata 180
gacgacaaaa aattgggtat tcttgagctg catcctgatg tttttgctac taatccaaga 240
atagatatta tacatcaaaa tgttagatgg caaagtttat atagatatgt aagctatgct 300
catacaaagt caagatttga agtgagaggt 330
<210> 20
<211> 320
<212> DNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 20
caaagtcaag atttgaagtg agaggtggag gtcgaaaacc gtggccgcaa aagggattgg 60
gacgtgctcg acatggttca attagaagtc cactttggag aggtggagga gttgttcatg 120
gaccaaaatc tccaacccct catttttaca tgattccatt ctacacccgt ttgctgggtt 180
tgactagcgc actttcagta aaatttgccc aagatgactt gcacgttgtg gatagtctag 240
atctgccaac tgacgaacaa agttatatag aagagctggt caaaagccgc ttttgggggt 300
ccttcttgtt ttatttgtag 320
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-F_T7
<400> 21
ttaatacgac tcactatagg gagacaccat gggctccagc ggcgccc 47
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-R
<400> 22
agatcttgaa ggcgctcttc agg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-F
<400> 23
caccatgggc tccagcggcg ccc 23
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFP-R_T7
<400> 24
ttaatacgac tcactatagg gagaagatct tgaaggcgct cttcagg 47
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F1_T7
<400> 25
ttaatacgac tcactatagg gagagctcca acagtggttc cttatc 46
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R1
<400> 26
ctaataattc ttttttaatg ttcctgagg 29
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F1
<400> 27
gctccaacag tggttcctta tc 22
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R1_T7
<400> 28
ttaatacgac tcactatagg gagactaata attctttttt aatgttcctg agg 53
<210> 29
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F2_T7
<400> 29
ttaatacgac tcactatagg gagattgtta caagctggag aacttctc 48
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R2
<400> 30
cttaaccaac aacggctaat aagg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-F2
<400> 31
ttgttacaag ctggagaact tctc 24
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ann-R2T7
<400> 32
ttaatacgac tcactatagg gagacttaac caacaacggc taataagg 48
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F1_T7
<400> 33
ttaatacgac tcactatagg gagaagatgt tggctgcatc tagagaa 47
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R1
<400> 34
gtccattcgt ccatccactg ca 22
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F1
<400> 35
agatgttggc tgcatctaga gaa 23
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R1_T7
<400> 36
ttaatacgac tcactatagg gagagtccat tcgtccatcc actgca 46
<210> 37
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F2_T7
<400> 37
ttaatacgac tcactatagg gagagcagat gaacaccagc gagaaa 46
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R2
<400> 38
ctgggcagct tcttgtttcc tc 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-F2
<400> 39
gcagatgaac accagcgaga aa 22
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Betasp2-R2_T7
<400> 40
ttaatacgac tcactatagg gagactgggc agcttcttgt ttcctc 46
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F1_T7
<400> 41
ttaatacgac tcactatagg gagaagtgaa atgttagcaa atataacatc c 51
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R1
<400> 42
acctctcact tcaaatcttg actttg 26
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F1
<400> 43
agtgaaatgt tagcaaatat aacatcc 27
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R1_T7
<400> 44
ttaatacgac tcactatagg gagaacctct cacttcaaat cttgactttg 50
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F2_T7
<400> 45
ttaatacgac tcactatagg gagacaaagt caagatttga agtgagaggt 50
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R2
<400> 46
ctacaaataa aacaagaagg acccc 25
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-F2
<400> 47
caaagtcaag atttgaagtg agaggt 26
<210> 48
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物L4-R2_T7
<400> 48
ttaatacgac tcactatagg gagactacaa ataaaacaag aaggacccc 49
<210> 49
<211> 1150
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 49
caacggggca gcactgcact gcactgcaac tgcgaatttc cgtcagcttg gagcggtcca 60
agcgccctgc gaagcaaact acgccgatgg cttcggcggc ggcgtgggag ggtccgacgg 120
ccgcggagct gaagacagcg ggggcggagg tgattcccgg cggcgtgcga gtgaaggggt 180
gggtcatcca gtcccacaaa ggccctatcc tcaacgccgc ctctctgcaa cgctttgaag 240
atgaacttca aacaacacat ttacctgaga tggtttttgg agagagtttc ttgtcacttc 300
aacatacaca aactggcatc aaatttcatt ttaatgcgct tgatgcactc aaggcatgga 360
agaaagaggc actgccacct gttgaggttc ctgctgcagc aaaatggaag ttcagaagta 420
agccttctga ccaggttata cttgactacg actatacatt tacgacacca tattgtggga 480
gtgatgctgt ggttgtgaac tctggcactc cacaaacaag tttagatgga tgcggcactt 540
tgtgttggga ggatactaat gatcggattg acattgttgc cctttcagca aaagaaccca 600
ttcttttcta cgacgaggtt atcttgtatg aagatgagtt agctgacaat ggtatctcat 660
ttcttactgt gcgagtgagg gtaatgccaa ctggttggtt tctgcttttg cgtttttggc 720
ttagagttga tggtgtactg atgaggttga gagacactcg gttacattgc ctgtttggaa 780
acggcgacgg agccaagcca gtggtacttc gtgagtgctg ctggagggaa gcaacatttg 840
ctactttgtc tgcgaaagga tatccttcgg actctgcagc gtacgcggac ccgaacctta 900
ttgcccataa gcttcctatt gtgacgcaga agacccaaaa gctgaaaaat cctacctgac 960
tgacacaaag gcgccctacc gcgtgtacat catgactgtc ctgtcctatc gttgcctttt 1020
gtgtttgcca catgttgtgg atgtacgttt ctatgacgaa acaccatagt ccatttcgcc 1080
tgggccgaac agagatagct gattgtcatg tcacgtttga attagaccat tccttagccc 1140
tttttccccc 1150
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸T20VN
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n为a、c、g或t
<400> 50
tttttttttt tttttttttt vn 22
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P5U76S (F)
<400> 51
ttgtgatgtt ggtggcgtat 20
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P5U76A (R)
<400> 52
tgttaaataa aaccccaaag atcg 24
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物TIPmxF
<400> 53
tgagggtaat gccaactggt t 21
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物TIPmxR
<400> 54
gcaatgtaac cgagtgtctc tcaa 24
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针HXTIP
<400> 55
tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Spt6v1_360 R
<400> 56
ggaaatacgc aagcagctcg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针Spt6v1_224 P
<400> 57
catcctggcg cggtgactcc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Spt6-1v1_62 F
<400> 58
aagatcctgc ctgaacctgc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Spt6-1v2_323 R
<400> 59
ggaaatacgc aagcagctcg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针Spt6-1v2_182 P
<400> 60
ccaacctccc gaatcgccga 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Spt6-1v2_86 F
<400> 61
tcctgcaaga acgtgggtac 20
<210> 62
<211> 151
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 62
gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60
ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120
cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151
<210> 63
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAD1编码区的部分
<400> 63
tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60
tggatgttg 69
<210> 64
<211> 4233
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 64
agcctggtgt ttccggagga gacagacatg atccctgccg ttgctgatcc gacgacgctg 60
gacggcgggg gcgcgcgcag gccgttgctc ccggagacgg accctcgggg gcgtgctgcc 120
gccggcgccg agcagaagcg gccgccggct acgccgaccg ttctcaccgc cgtcgtctcc 180
gccgtgctcc tgctcgtcct cgtggcggtc acagtcctcg cgtcgcagca cgtcgacggg 240
caggctgggg gcgttcccgc gggcgaagat gccgtcgtcg tcgaggtggc cgcctcccgt 300
ggcgtggctg agggcgtgtc ggagaagtcc acggccccgc tcctcggctc cggcgcgctc 360
caggacttct cctggaccaa cgcgatgctg gcgtggcagc gcacggcgtt ccacttccag 420
ccccccaaga actggatgaa cggttagttg gacccgtcgc catcggtgac gacgcgcgga 480
tcgttttttt cttttttcct ctcgttctgg ctctaacttg gttccgcgtt tctgtcacgg 540
acgcctcgtg cacatggcga tacccgatcc gccggccgcg tatatctatc tacctcgacc 600
ggcttctcca gatccgaacg gtaagttgtt ggctccgata cgatcgatca catgtgagct 660
cggcatgctg cttttctgcg cgtgcatgcg gctcctagca ttccacgtcc acgggtcgtg 720
acatcaatgc acgatataat cgtatcggta cagagatatt gtcccatcag ctgctagctt 780
tcgcgtattg atgtcgtgac attttgcacg caggtccgct gtatcacaag ggctggtacc 840
acctcttcta ccagtggaac ccggactccg cggtatgggg caacatcacc tggggccacg 900
ccgtctcgcg cgacctcctc cactggctgc acctaccgct ggccatggtg cccgatcacc 960
cgtacgacgc caacggcgtc tggtccgggt cggcgacgcg cctgcccgac ggccggatcg 1020
tcatgctcta cacgggctcc acggcggagt cgtcggcgca ggtgcagaac ctcgcggagc 1080
cggccgacgc gtccgacccg ctgctgcggg agtgggtcaa gtcggacgcc aacccggtgc 1140
tggtgccgcc gccgggcatc gggccgacgg acttccgcga cccgacgacg gcgtgtcgga 1200
cgccggccgg caacgacacg gcgtggcggg tcgccatcgg gtccaaggac cgggaccacg 1260
cggggctggc gctggtgtac cggacggagg acttcgtgcg gtacgacccg gcgccggcgc 1320
tgatgcacgc cgtgccgggc accggcatgt gggagtgcgt ggacttctac ccggtggccg 1380
cgggatcagg cgccgcggcg ggcagcgggg acgggctgga gacgtccgcg gcgccgggac 1440
ccggggtgaa gcacgtgctc aaggctagcc tcgacgacga caagcacgac tactacgcga 1500
tcggcaccta cgacccggcg acggacacct ggacccccga cagcgcggag gacgacgtcg 1560
ggatcggcct ccggtacgac tatggcaagt actacgcgtc gaagaccttc tacgaccccg 1620
tccttcgccg gcgggtgctc tgggggtggg tcggcgagac cgacagcgag cgcgcggaca 1680
tcctcaaggg ctgggcatcc gtgcaggtac gtctcagggt ttgaggctag catggcttca 1740
atcttgctgg catcgaatca ttaatgggca gatattataa cttgataatc tgggttggtt 1800
gtgtgtggtg gggatggtga cacacgcgcg gtaataatgt agctaagctg gttaaggatg 1860
agtaatgggg ttgcgtataa acgacagctc tgctaccatt acttctgaca cccgattgaa 1920
ggagacaaca gtaggggtag ccggtagggt tcgtcgactt gccttttctt ttttcctttg 1980
ttttgttgtg gatcgtccaa cacaaggaaa ataggatcat ccaacaaaca tggaagtaat 2040
cccgtaaaac atttctcaag gaaccatcta gctagacgag cgtggcatga tccatgcatg 2100
cacaaacact agataggtct ctgcagctgt gatgttcctt tacatatacc accgtccaaa 2160
ctgaatccgg tctgaaaatt gttcaagcag agaggccccg atcctcacac ctgtacacgt 2220
ccctgtacgc gccgtcgtgg tctcccgtga tcctgccccg tcccctccac gcggccacgc 2280
ctgctgcagc gctctgtaca agcgtgcacc acgtgagaat ttccgtctac tcgagcctag 2340
tagttagacg ggaaaacgag aggaagcgca cggtccaagc acaacacttt gcgcgggccc 2400
gtgacttgtc tccggttggc tgagggcgcg cgacagagat gtatggcgcc gcggcgtgtc 2460
ttgtgtcttg tcttgcctat acaccgtagt cagagactgt gtcaaagccg tccaacgaca 2520
atgagctagg aaacgggttg gagagctggg ttcttgcctt gcctcctgtg atgtctttgc 2580
cttgcatagg gggcgcagta tgtagctttg cgttttactt cacgccaaag gatactgctg 2640
atcgtgaatt attattatta tatatatatc gaatatcgat ttcgtcgctc tcgtggggtt 2700
ttattttcca gactcaaact tttcaaaagg cctgtgtttt agttcttttc ttccaattga 2760
gtaggcaagg cgtgtgagtg tgaccaacgc atgcatggat atcgtggtag actggtagag 2820
ctgtcgttac cagcgcgatg cttgtatatg tttgcagtat tttcaaatga atgtctcagc 2880
tagcgtacag ttgaccaagt cgacgtggag ggcgcacaac agacctctga cattattcac 2940
ttttttttta ccatgccgtg cacgtgcagt caatccccag gacggtcctc ctggacacga 3000
agacgggcag caacctgctc cagtggccgg tggtggaggt ggagaacctc cggatgagcg 3060
gcaagagctt cgacggcgtc gcgctggacc gcggatccgt cgtgcccctc gacgtcggca 3120
aggcgacgca ggtgacgccg cacgcagcct gctgcagcga acgaactcgc gcgttgccgg 3180
cccgcggcca gctgacttag tttctctggc tgatcgaccg tgtgcctgcg tgcgtgcagt 3240
tggacatcga ggctgtgttc gaggtggacg cgtcggacgc ggcgggcgtc acggaggccg 3300
acgtgacgtt caactgcagc accagcgcag gcgcggcggg ccggggcctg ctcggcccgt 3360
tcggccttct cgtgctggcg gacgacgact tgtccgagca gaccgccgtg tacttctacc 3420
tgctcaaggg cacggacggc agcctccaaa ctttcttctg ccaagacgag ctcaggtatg 3480
tatgttatga cttatgacca tgcatgcatg cgcatttctt agctaggctg tgaagcttct 3540
tgttgagttg tttcacagat gcttaccgtc tgctttgttt cgtatttcga ctaggcatcc 3600
aaggcgaacg atctggttaa gagagtatac gggagcttgg tccctgtgct agatggggag 3660
aatctctcgg tcagaatact ggtaagtttt tacagcgcca gccatgcatg tgttggccag 3720
ccagctgctg gtactttgga cactcgttct tctcgcactg ctcattattg cttctgatct 3780
ggatgcacta caaattgaag gttgaccact ccatcgtgga gagctttgct caaggcggga 3840
ggacgtgcat cacgtcgcga gtgtacccca cacgagccat ctacgactcc gcccgcgtct 3900
tcctcttcaa caacgccaca catgctcacg tcaaagcaaa atccgtcaag atctggcagc 3960
tcaactccgc ctacatccgg ccatatccgg caacgacgac ttctctatga ctaaattaag 4020
tgacggacag ataggcgata ttgcatactt gcatcatgaa ctcatttgta caacagtgat 4080
tgtttaattt atttgctgcc ttccttatcc ttcttgtgaa actatatggt acacacatgt 4140
atcattaggt ctagtagtgt tgttgcaaag acacttagac accagaggtt ccaggagtat 4200
cagagataag gtataagagg gagcagggag cag 4233
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAAD1-F
<400> 65
tgttcggttc cctctaccaa 20
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAAD1-R
<400> 66
caacatccat caccttgact ga 22
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针GAAD1-P (FAM)
<400> 67
cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物IVR1-F
<400> 68
tggcggacga cgacttgt 18
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物IVR1-R
<400> 69
aaagtttgga ggctgccgt 19
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针IVR1-P (HEX)
<400> 70
cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SPC1A
<400> 71
cttagctgga taacgccac 19
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SPC1S
<400> 72
gaccgtaagg cttgatgaa 19
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针TQSPEC (CY5*)
<400> 73
cgagattctc cgcgctgtag a 21
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ST-LS1-F
<400> 74
gtatgtttct gcttctacct ttgat 25
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ST-LS1- R
<400> 75
ccatgttttg gtcatatatt agaaaagtt 29
<210> 76
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针ST-LS1-P (FAM)
<400> 76
agtaatatag tatttcaagt atttttttca aaat 34
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Loop_F
<400> 77
ggaacgagct gcttgcgtat 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Loop_R
<400> 78
cacggtgcag ctgattgatg 20
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针Loop_FAM
<400> 79
tcccttccgt agtcagag 18
<210> 80
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 环接头多核苷酸
<400> 80
agtcatcacg ctggagcgca catataggcc ctccatcaga aagtcattgt gtatatctct 60
catagggaac gagctgcttg cgtatttccc ttccgtagtc agagtcatca atcagctgca 120
ccgtgtcgta aagcgggacg ttcgcaagct cgt 153
<210> 81
<211> 5948
<212> RNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 81
gucacuuguc aauugucaac cuggaaaacg acuugucgaa gucgcauagu uuuuauaagu 60
uuaaauaaac uaaauuaaau auaaauacuu cgagaaugca auaauuauua uucuuuaacu 120
agacccacag cuuauuaauu agcagaagua guagcagacu uauacuaacu agcauaagga 180
gaaacauauu aacauaacau ggcagacuuc auagauucug aagcagaaga aaguagugag 240
gaggaggaau uagaucauag ggaucguaaa aaagcccaaa aagccaaagu uguagauagu 300
ucagaugaag augaugaaga ugaugacgaa agacugagag aggaauuaaa ggauuugauu 360
gaugauaauc cuauugaaga aagugaugcu gagucugaug cuucaggaag ggaaaaacgu 420
aagaaaucug acgacgagga uuuggaugau cgacuggaag augaagauua ugauuugcuu 480
gaagaaaauu uggguguuaa aguugaaaga aggaaauuca agcgacugcg gcguuuugaa 540
gaugaagaaa gugaaggaga agaagaacau gauccugaac aagauaggga acaaauugcu 600
auggauauau uuucagauga ugacgaugaa agacgaucag aacgaaguca cagaccugcc 660
gucgaacaag aaacuuaugg uguaggcgag gaagaagagg aaggggagua cucggaugcc 720
gaugauuuua uaguugacga ugacgguaga ccgauagcug aaaagaagaa gaagaaaaaa 780
ccaauauuua cugaugccgc ucuccaagag gcucaagaaa ccuucggugu cgauuuugau 840
uaugaugaau uuaguaaaua cgaugaagau gauuacgaag augaagagga ggaggaugac 900
gaauacgagg aagaugaugu agagaaaagg aaacggccua aaaagacuuc aaagaaaaaa 960
ccgacgaaga aauccauuuu ugaaguguau gaaccuagug aacuuaaaag aggguucuuu 1020
accgaucucg auaaugaaau ccgaaacacu gauauucccg aaagaaugca acuucgugau 1080
guuccaauca ccgcuguucc ggaugacuca acugaacuug augaugaagc agaauggauu 1140
uacaggcaag cguuuuguaa cagaacuguu uccaaugugg auucucauuu aucaucagag 1200
gcaagagaga aauuaaagaa gacucaucau gccaucggaa aaaucagaaa agcauuagau 1260
uuuauaagaa aucaacaauu agaaguaccg uuuauugcuu uuuauagaaa ggaguauguu 1320
caaccggaac uuaauauuaa cgauuugugg aaaguauaua aauacgaugc aaaguggugc 1380
caauugaaaa cacgcaaaga aaaccucuug aagcuuuuug aaaaaaugag gucauaucaa 1440
acugaccaca uaaugaaaga uccagaugca ccaauuccag acaaccuucg uauuaugacu 1500
gaguccgaca uugagcgauu gaaaaauguu caaaccgccg aagaguuaaa ugacguucac 1560
aaucauuuca uuuuauauua ugcugcagau uugccagcca ugcaugccgc guggagaguc 1620
aaagaaagag aaaggagaag acaggaaaga aaggaggcua gacuuaagcu caucgcugaa 1680
agugaagaag gugcugaaau uccugaagag ccugaggaaa uugacgauga ugaaccagaa 1740
gcugaaaccu uaaaauacgc caauagauca ggcagcuaug cacuauguaa uaaaggaggu 1800
uuggguccuc uagcgaagaa auuugguuua acgccugaag aauuugccga aaaccugaga 1860
gauaauuauc agaggcacga aguagaucaa gaacauauag aaccuguaga agucgcuaaa 1920
gaauucguau cgccgaaauu uccuacagug gaagaagugu ugcaagcuac uaaacacaug 1980
guagcuuuac aaauagcaag agaaccauua guaaggaaau gcguaagaga aauuuucuuu 2040
gaacgagcua gauuaaacgu uuauccaacc aaaaagggug ugaaaguuau agaugaagcu 2100
cauaauugcu auaguaugaa guauguaaaa aauaaaccag uaagagaucu ugcaggcgac 2160
caauuuuuaa aauuauguuu agccgaagag gagaaccucc uuacuauuac caucaaugac 2220
cauauucaag gaaacacuac uaacaauuac auugaugaag ucaaacaauu auauauaaag 2280
gaugaauuca gcaaacacgu ucaggauugg aaugcgcuaa gaauggaauc gguagaaagg 2340
gcuuuaacga aaagugucuu accagauuua agaucugaau uaaaacgaac guugcucaca 2400
gaggcuaaag aauucguauu aaaagcuugc uguagaaaau uauauaauug gauaaagauu 2460
gcuccauacg caauaacuuu ucccgaugaa gacgaagaug auugggauac auccaaaggu 2520
guuagaacua uggguguagc auacguacca gagcacacag uaucagcuuu uaccuguauu 2580
ucagcaccag acggagauau aacugauuau cucagauuac caaauauucu aaaaagaaaa 2640
aauagcuuuc gaacugaaga aaaacuuaug aaggaagcug aucuucaagc acugaaaaau 2700
uucauauucc uuaaaaagcc ucaugugaua gcaguagggg gugaguccag agaagccuua 2760
augaucgcug augauaucag aggaguaaua agugaacuaa uagaauccga ccaauuccca 2820
cagauuaggg uugaaauuau ugauaaugaa uuagccaaag uguacgcaaa uuccauuaaa 2880
gguucaacug auuucagaga uuauccagag uuguuaaggc aagcuauuuc auuagcucga 2940
agaaugcaag auccuuuggu ugaauuuucc caauuaugua auagcgauga ggaaauuuug 3000
agucugaggu uucaucccuu gcaggaacaa guccagaaag aagaacuacu agaagcucuc 3060
uguuuagaau uugucaacag aacaaaugaa guagguguag auauaaaucu ugccguucag 3120
cagauucaua aaaguaguuu aguucaauuc auaugcgguc uaggaccgcg uaaaggucaa 3180
gcguuacuua aaguucugaa acaaacuaau cagaggcuug aaaacagaac ccaauugguu 3240
acauuuuguc auaugggucc aaaaguuuuu auuaauuguu cuggauucau aaagauugau 3300
accaauaguu uaggagacag uacugaggca uauguugaaa uauuggaugg cucucgaguu 3360
caucccgaaa cuuaugaaug ggcacgaaaa auggcugugg augcuuuaga auaugacgau 3420
gaugagggag cuaauccggc gggagcuuua gaggaaauuc ucgaggcgcc agagagguua 3480
aaagaucuug acuuggaugc auuugcggag gaauuggaaa gacaaggauu ugguaacaag 3540
aguauaacau uguaugacau uagagcagaa cugaacucgc gauauaaaga uuugagacaa 3600
ccuuuucguu cugcaaaucc ugaagaacua uucgauaugc uuacuaaaga aacucccgaa 3660
acauuuuaua uuggaaaaau gguuacaucu accguguuug gcauugcaag gagaaaacca 3720
aagucagacc agcucgauca agcuaauccg guccguaaug acgaaacugg uuuguggcag 3780
ugccccuucu guuugaaaaa ugauuuuccu gaauuaucug auguauggaa ucauuuugau 3840
gcaggagcau guccugguca agcuacugga guuaaacuaa gacuggauaa ugguauauua 3900
gguuauauuu auauaaaaaa uauaagcgac aaaccaguug cuaauccgga agaaagagua 3960
ggcauaggac aauuaauuca cuguagaaua auaaaaauug acguagagaa guuuaguguu 4020
gauuguacau cgaaaucuag cgaucuugcu gauaaaaauc augaauggag accucaacga 4080
gauccucauu augaucaaga acgugaagac aaagacaauc gauuagaagc cgagaagaag 4140
aaagagaaac agcguaugac guacaucaag aggguuaucg uucauccggc guuccauaac 4200
auauccuaug ccgaagccga aaaauguaug guuaauaugg accaggguga aguuaucauu 4260
aggccuucga guaagggugc ggaucauuug accauuacuu ggaagguuac ggauggaauc 4320
uaucaacaca uugauauuaa ggaacaaggg aaaguuaacg cuuuuucuuu aggaaaauca 4380
uuauggauug gaaaugaaga auuugaagau cuugaugaaa uaauagcuag gcacguuaca 4440
ccaauggcgg cgcaugcuag agauuuacug uauuuuaggu auuacaaaga uuuccaaggu 4500
ggucauaaag auaaggcuga ggaauaucua aaagaugaaa aaaagaaaaa ugcuucuaaa 4560
auucauuaug uaguuagugc ugcuaagaau auaccuggua aauuucuucu uucguaccuu 4620
ccacgcaaca aaguuagaca cgaauaugua acaguuacuc cagaaggcuu ucgguuuaga 4680
caacaaaugu uugauuccgu uucuucguua uuuaaauggu ucaaagaaca uuuccgggag 4740
ccuccaccag gcggugcaac accagguagc acgccaagga uggcuucaag cagaacugga 4800
uauggaagug ccacacccgc guauaguaug aauaaugaag cuauucaaag aguugcucaa 4860
aauuuaccaa gucauguagu ucaagcguua ucugcugcca ccaaccaaac uccacauuau 4920
ccccacaccc cugguuaugg aggcaauuau auuaauacgc cuuacacucc aaguggucaa 4980
acuccauaca ugacuccgua cgcuacaccc cauacgcagc aaacuccccg cuauggucau 5040
caaacaccuu cccaacacau ggcgagcuca gcaccacaag gucucaacaa ucccuuuuua 5100
cauccuggcg cggugacucc cucccaacga acuccuauuu aucgcaacca uccugcacaa 5160
ucuccaguaa ugcuuccuac aagcccugua ccaaguccag guucccagag uucauacagu 5220
agucauuuaa gucauaauca gcgaagugga aguuaugcug aauccuuaag auuccaaccu 5280
cccgaaucgc cgagaagcuc agugaguaau agaagcuuuc aaacugauag auacggcggu 5340
gauagguaug guaaaggagg aagucauaga uaugguggaa gcucaaacga agauagauau 5400
gguaagggag gaggaggaaa ugaaaauacg gauuggcaga aagcugcaga agcaugggcu 5460
cgaucuagau cuacuccgag aagugauggc cguaauacuc caagaucugu aggucaacga 5520
acuccuagau acgacaacga cgccgaacgu ucuagaauga aacaccucag caagagcccg 5580
aggucuguua ggucuacucc ucgaaccaau acaucuccac auucuauguc ccuaggugau 5640
gcuaccccuc uguaugacga aaguaucuaa auuacuuugu auuugguuau auaguagggu 5700
aacagugaua uuguaaaugc uaaaaucaac aauacagauu cgcgauauua agucacaaug 5760
acgaccucuc guggaguucg gugaaacuaa cuuugagggc guuuucacug ucaaacgucc 5820
agcgcacaug caccugaaac aaguaggcaa uauucauuau uuauuuuuac agguuuuuua 5880
uacaaauauu auuuacaaca uagacuucaa cuuuuacuga aaggugaagc uuucauauua 5940
auaauuuu 5948
<210> 82
<211> 499
<212> RNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 82
cgccuuacac uccaaguggu caaacuccau acaugacucc guacgcuaca ccccauacgc 60
agcaaacucc ccgcuauggu caucaaacac cuucccaaca cauggcgagc ucagcaccac 120
aaggucucaa caaucccuuu uuacauccug gcgcggugac ucccucccaa cgaacuccua 180
uuuaucgcaa ccauccugca caaucuccag uaaugcuucc uacaagcccu guaccaaguc 240
cagguuccca gaguucauac aguagucauu uaagucauaa ucagcgaagu ggaaguuaug 300
cugaauccuu aagauuccaa ccucccgaau cgccgagaag cucagugagu aauagaagcu 360
uucaaacuga uagauacggc ggugauaggu augguaaagg aggaagucau agauauggug 420
gaagcucaaa cgaagauaga uaugguaagg gaggaggagg aaaugaaaau acggauuggc 480
agaaagcugc agaagcaug 499
<210> 83
<211> 145
<212> RNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 83
gacuccguac gcuacacccc auacgcagca aacuccccgc uauggucauc aaacaccuuc 60
ccaacacaug gcgagcucag caccacaagg ucucaacaau cccuuuuuac auccuggcgc 120
ggugacuccc ucccaacgaa cuccu 145
<210> 84
<211> 108
<212> RNA
<213> 玉米根萤叶甲
<400> 84
agaguucaua caguagucau uuaagucaua aucagcgaag uggaaguuau gcugaauccu 60
uaagauucca accucccgaa ucgccgagaa gcucagugag uaauagaa 108

Claims (51)

1.一种经分离的核酸分子，其包含与异源性启动子可操作地连接的至少一种多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：
SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；以及叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述多核苷酸选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，以及前述中任一者的互补序列。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述叶甲属生物体选自：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、十一星根萤叶甲、墨西哥玉米根萤叶甲、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、南美叶甲和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述分子是植物转化载体。
5.一种核糖核酸(RNA)分子，其从根据权利要求1所述的核酸分子转录。
6.一种双链核糖核酸(dsRNA)分子，其从根据权利要求1所述的核酸分子表达而产生。
7.根据权利要求6所述的dsRNA分子，其中从所述多核苷酸转录的所述多聚核糖核苷酸与鞘翅目昆虫的接触抑制与所述多聚核糖核苷酸特异性互补的内源性核苷酸序列的表达。
8.根据权利要求7所述的dsRNA分子，其中所述dsRNA分子与鞘翅目昆虫的接触杀死所述昆虫，或者抑制所述昆虫的生长、生存力和/或进食。
9.根据权利要求6所述的dsRNA，包含第一多聚核糖核苷酸、第二多聚核糖核苷酸和第三多聚核糖核苷酸，其中所述第一多聚核糖核苷酸由所述多核苷酸转录，其中所述第三多聚核糖核苷酸通过所述第二多聚核糖核苷酸连接到所述第一多聚核糖核苷酸，并且其中所述第三多聚核糖核苷酸基本上为所述第一多聚核糖核苷酸的反向互补序列，以使得所述第一多聚核糖核苷酸和所述第三多聚核糖核苷酸在转录成核糖核酸分子时杂交以形成所述dsRNA。
10.根据权利要求5所述的RNA，其选自：长度介于约15个核苷酸和约30个核苷酸之间的双链核糖核酸分子和单链核糖核酸分子。
11.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述异源性启动子在植物细胞中具有功能。
12.一种细胞，其用权利要求1所述的多核苷酸转化。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞为原核细胞。
14.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞为真核细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述细胞为植物细胞。
16.一种植物，其用根据权利要求1所述的核酸分子转化。
17.权利要求16所述的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。
18.一种由权利要求16所述的植物产生的商品产品，其中所述商品产品包含可检出量的所述多核苷酸。
19.根据权利要求16所述的植物，其中所述至少一种多核苷酸在所述植物中表达为双链核糖核酸分子。
20.根据权利要求15所述的细胞，其中所述细胞为玉米细胞。
21.根据权利要求16所述的植物，其中所述植物是玉米。
22.根据权利要求16所述的植物，其中所述至少一种多核苷酸在所述植物中表达为核糖核酸分子，并且当鞘翅目昆虫摄入所述植物的一部分时，所述核糖核酸分子抑制与所述至少一种多核苷酸特异性互补的内源性多核苷酸的表达。
23.根据权利要求1所述的核酸分子，其还包含至少一种额外的多核苷酸，所述额外的多核苷酸编码抑制内源性害虫基因表达的RNA分子。
24.根据权利要求23所述的核酸分子，其中所述分子是植物转化载体，并且其中所述额外的多核苷酸各自与在植物细胞中具有功能的异源性启动子可操作地连接。
25.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括提供包含核糖核酸(RNA)分子的药剂，所述核糖核酸分子与所述害虫接触后发挥作用以抑制所述害虫内的生物功能，其中所述RNA与选自下列的多聚核糖核苷酸可特异性杂交：SEQ ID NO:71-74中的任一者；SEQID NO:81-84中的任一者的互补序列；SEQ ID NO:81-84中的任一者的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:81-84中的任一者的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；SEQ IDNO:1和3-5中的任一者的转录物；SEQ ID NO:1和3-5中的任一者的转录物的互补序列；SEQID NO:1的转录物的至少15个毗连核苷酸的片段；以及SEQ ID NO:1的转录物的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述药剂的所述RNA与选自下列的多聚核糖核苷酸可特异性杂交：SEQ ID NO:82-84中的任一者；SEQ ID NO:82-84中任一者的互补序列；SEQ ID NO:82-84中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段；以及SEQ ID NO:82-84中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述药剂为双链RNA分子。
28.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
提供包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的药剂，所述多核苷酸序列与所述鞘翅目害虫接触后发挥作用以抑制所述鞘翅目害虫内的生物功能，其中所述第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:81的约15个至约30个毗连核苷酸表现出约90％至约100％序列同一性的区域，并且其中所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列特异性杂交。
29.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
在鞘翅目害虫的宿主植物中提供包含根据权利要求1所述的核酸分子的经转化植物细胞，其中所述多核苷酸被表达以产生这样的核糖核酸分子：所述核糖核酸分子与属于所述群体的鞘翅目害虫接触后发挥作用以抑制所述鞘翅目害虫内靶标序列的表达，并造成所述鞘翅目害虫或害虫群体相对于在相同宿主植物物种的不含所述多核苷酸的植物上的相同害虫物种的繁殖情况，出现生长减缓和/或存活率降低。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述核糖核酸分子为双链核糖核酸分子。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述鞘翅目害虫群体相对于侵染相同宿主植物物种的缺乏所述经转化植物细胞的宿主植物的相同害虫物种群体减小。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述鞘翅目害虫群体相对于侵染相同物种的缺乏所述经转化植物细胞的宿主植物的鞘翅目害虫群体减小。
33.一种控制植物中鞘翅目害虫侵染的方法，所述方法包括在鞘翅目害虫的食料中提供核糖核酸(RNA)，所述核糖核酸与选自下列的多核苷酸可特异性杂交：
SEQ ID NO:81-84；
SEQ ID NO:81-84中任一者的互补序列；
SEQ ID NO:81-84中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段；
SEQ ID NO:81-84中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；
SEQ ID NO:1和3-5中任一者的转录物；
SEQ ID NO:1和3-5中任一者的转录物的互补序列；
SEQ ID NO:1的转录物的至少15个毗连核苷酸的片段；以及
SEQ ID NO:1的转录物的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述食料包含经转化以表达所述RNA的植物细胞。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述可特异性杂交的RNA被包含在双链RNA分子中。
36.一种用于提高玉米作物产量的方法，所述方法包括：
将根据权利要求1所述的核酸分子导入玉米植物内，以产生转基因玉米植物；以及
栽培所述玉米植物，以允许表达所述至少一种多核苷酸；其中所述至少一种多核苷酸的表达抑制鞘翅目害虫的生存力或生长，以及由于鞘翅目害虫侵染所致的产量损失。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一种多核苷酸的表达产生RNA分子，所述RNA分子至少抑制已接触所述玉米植物的一部分的鞘翅目害虫中的第一靶标基因。
38.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用包含根据权利要求1所述的核酸分子的载体转化植物细胞；
在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下，培养所述经转化植物细胞；
选择已将所述至少一种多核苷酸整合到其基因组中的经转化植物细胞；
针对由所述至少一种多核苷酸编码的核糖核酸(RNA)分子的表达，筛选所述经转化植物细胞；以及
选择表达所述RNA分子的植物细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述载体包含选自以下的多核苷酸：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ IDNO:3-5中的任一者；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者；以及叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:3-5中的任一者。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述RNA分子为双链RNA分子。
41.一种用于产生免受鞘翅目害虫损害的转基因植物的方法，所述方法包括：
提供由权利要求39所述的方法产生的转基因植物细胞；以及
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中由所述至少一种多核苷酸编码的所述核糖核酸分子的表达足以调控接触所述经转化植物的鞘翅目害虫中的靶标基因的表达。
42.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用包含用于向植物提供鞘翅目害虫防护的spt6构件的载体转化植物细胞；
在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下，培养所述经转化植物细胞；
选择已将用于向植物提供鞘翅目害虫防护的所述spt6构件整合到其基因组中的经转化植物细胞；
针对用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的spt6构件的表达，筛选所述经转化植物细胞；以及
选择表达用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的所述spt6构件的植物细胞。
43.一种用于产生免受鞘翅目害虫损害的转基因植物的方法，所述方法包括：
提供由权利要求42所述的方法产生的转基因植物细胞；以及
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中用于抑制鞘翅目害虫中的必需基因表达的所述spt6构件的表达足以调控接触所述经转化植物的鞘翅目害虫中的靶标基因的表达。
44.根据权利要求1所述的核酸，其还包含多核苷酸，所述多核苷酸编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属物种或假单胞菌属物种的多肽。
45.根据权利要求44所述的核酸，其中来自苏云金芽孢杆菌的所述多肽选自Cry1B、Cry3、Cry34、Cry35、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
46.根据权利要求15所述的细胞，其中所述细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属物种或假单胞菌属物种的多肽。
47.根据权利要求46所述的细胞，其中来自苏云金芽孢杆菌的所述多肽选自Cry1B、Cry3、Cry34、Cry35、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
48.根据权利要求16所述的植物，其中所述植物包含多核苷酸，所述多核苷酸编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属物种或假单胞菌属物种的多肽。
49.根据权利要求48所述的植物，其中来自苏云金芽孢杆菌的所述多肽选自Cry1B、Cry3、Cry34、Cry35、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
50.根据权利要求38所述的方法，其中所述经转化植物细胞包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属物种或假单胞菌属物种的多肽。
51.根据权利要求50所述的方法，其中来自苏云金芽孢杆菌的所述多肽选自Cry1B、Cry3、Cry34、Cry35、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C。
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