CN108061715A - 一种快速定量评价中药注射液质量稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速定量评价中药注射液质量稳定性的方法，属于制药技术以及中药评价技术领域。该方法步骤是：1)将中药注射剂溶液进行一定倍数的稀释，设定中药注射剂的标准吸收曲线；2)根据稳定实验求出该中药注射剂该稀释倍数下吸收曲线的等吸光点；3)计算吸收曲线等吸光点前、后的吸收曲线下面积；4)根据可接受的活性物质变化程度进而确定等吸光点前、后吸收曲线下面积参考值和/或等吸光点前后吸收曲线下面积比值的参考值；5)确定标准后，即可用等吸光点前、后吸收曲线下面积和/或等吸光点前后吸收曲线下面积比值是否超出范围进行稳定性变化判断。
Description
技术领域
本发明一种快速定量评价方法，尤其涉及一种中药注射液质量稳定性的快速定量评价方法，属于制药技术以及中药评价技术领域。
背景技术
中药注射液是我国特有的制剂，诞生在上世纪40年代。经过半个多世纪的发展，中药注射液从最早的柴胡注射液发展到现在132个上市品种。中药注射液的独特疗效得到了医药界和社会的公认，但安全性问题也时有发生。中药注射液根据所含物质的复杂程度，从简单到复杂依次可分为：1)活性单体或准单体中药注射液；2)活性部位中药注射液；3)单方总提取物中药注射液；和4)复方总提取物中药注射液四大类。根据中医药“君臣佐使”的配伍理论，复方最能反映中医药防治疾病的理论，而活性单体或准单体中药注射液则接近化学药。然而，对于中药注射液而言，成分的复杂性在安全性方面和稳定性方面对制药界提出了挑战。
安全、有效是药品的基本要求，而质量稳定则是药品安全性和有效性的保障。如何快速有效地综合地定量评价药物的内在质量一直是制药界关心的课题。复杂成分中药注射液的质量稳定性定量评价技术目前主要依赖高效液相(HPLC)-指纹图谱技术或其他色谱技术。但色谱技术往往涉及到条件摸索、仪器环境以及仪器本身的稳定问题，检测时间较长，对技术人员要求也较高；特别地，色谱技术优势还涉及到反复的分离操作，或检测波长选择的局限性，“指纹图谱”并不包含中药注射液成分的全部信息，甚至有很多信息的人为丢失(比如波长的选择就人为地丢失了其他波长下的信号)，因此，指纹图谱的信息并不能完整地反映药品的内在质量。
一般来说，药物的性状和外观是药品内在质量的综合反映。然而，目前大多药品检测，特别是中药注射的性状和外观检测相对简单，几乎都是定性描述和定性检测(肉眼别观察)，或者是1-2个单一波长下的定量检测，或者即使有采用吸收光谱下面积来定量反应中药注射液的颜色变化，但在评价中药注射液稳定性方面，波长范围选择存在盲目性而导致通用性差，因此，并不能很好地利用中药注射液的外观性状来充分定量反映中药注射液的稳定性变化。
等吸光点曾用于单一成分的含量测定，故认为也可以用于单一成分的稳定性评价。由于复合样品特别是中药注射液溶液复杂样品是否会存在等吸光点现象，一直未见报道，也无法从理论上证实其存在。
发明内容
有鉴于此，本发明克服现有技术之缺陷，为中药注射液的稳定性变化提供一种快速定量评价方法。
本申请从大量的中药注射液溶液稳定性变化的吸收曲线意外发现了等吸光点现象，并进一步发现等吸光点前、后的吸收曲线下面积发生规律性变化，而该变化有望用于中药注射液稳定性的快速定量评价，最后通过HPLC指纹图谱证实了该方法的可行性，甚至该方法比传统的HPLC指纹图谱还要灵敏。
由于指纹图谱的检测需要消耗较多的有机溶剂(流动相)，检测的周期也较长(直接操作至少1小时)，而光谱扫描和吸收光谱曲线下面积的计算可以在几分钟完成，因此本申请发明的方法对中药注射液的稳定性定量评价具有快捷优势。
本发明充分利用我们中药注射液稳定性试验新发现的等吸光点现象进行实施。中药注射液往往都有一定范围内的波长吸收，在存放过程中往往也会发生颜色加深现象，表现为较长波长下的吸收光谱增强；而同时一定较短波长下的吸收光谱变弱；这种吸收光谱中发生的一强一弱变化会出现一个连接点，该连接点(波长)即为等吸光点。因此，可以根据等吸光点将中药注射液的吸收曲线分为两部分，即等吸光点前的吸收曲线和等吸光点后的吸收曲线。分别计算等吸光点前后吸收曲线下面积，根据等吸光点前吸收曲线下面积的减少情况和等吸光点后吸收曲线下面积的增加情况即可判断中药注射液的稳定性变化情况。由于测定中药注射液的吸收曲线测定较快，所需要的仪器设备较简单，而且能完整反映中药注射液的综合信息，因此这是一种快速评价中药注射液质量稳定性的方法，在评价具体中药注射液的稳定性时，相应的具体指标或指标的变化程度可以根据实际情况确定。
本发明提供一种快速定量评价中药注射液稳定性的方法，其特征是，按照以下步骤进行：
1)将合格的中药注射液溶液进行稀释，在200～800nm波长范围内扫描，得到该中药注射液的标准吸收曲线；
2)根据热稳定加速实验扫描不同时间点该中药注射液同稀释倍数下的吸收曲线；
3)定义1)与2)中多条吸收曲线的交点为等吸光点；
4)分别计算各条吸收曲线等吸光点前、后吸收曲线下面积；
5)将1)中标准吸收曲线等吸光点前、后吸收曲线下面积之比记为A0；将2)中各条吸收曲线等吸光点前、后吸收曲线下面积之比分别记为An；
6)分别计算不同时间点的An与A0的比值；
7)若An/A0小于或等于一定值，则判断该注射液稳定性符合要求，若An/A0大于该值，则判断该注射液因稳定性变化而不符合要求。
其中，步骤7)中的“一定值”是90％。
或者，其中步骤7)中的“一定值”据具体品种确定。
其中，步骤1)涉及的中药注射液为液体。
其中步骤1)涉及的中药注射液为以固体物为主要活性物质的中药活性部位、单方或复方制成的注射液。
其中步骤1)涉及的中药注射液为按照使用说明书溶解稀释的注射用粉末。
其中步骤1)中涉及的中药注射液溶液稀释倍数不限定，以吸收光谱的最大吸收值在1～3为度。
其中步骤1)中波长范围为230-800nm，步进波长为1nm。
其中，所述的中药注射液为清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液、灯盏细辛注射液或舒血宁注射液。
其中，所述的热稳定加速实验是指将中药注射液置于60℃水浴恒温。
本发明的创造性在于首次发现了复杂成分中药注射液稳定性变化过程中存在等吸光点，然后考察等吸光点前后吸收曲线下面积，发现等吸光点前的曲线下面积发生减少，等吸光点后的曲线下面积发生增加。通过比较等吸光点前后曲线下面积的绝对变化或相对变化，从而建立了一种可以快速定量评价中药注射液稳定性变化的方法。其中以等吸光点前后曲线下面积比值包含的信息全面，特别适用于复杂成分中药注射液，如活性部位中药注射液、单方中药注射液和复方中药注射液。
考虑到等吸光点前后曲线下面积比是相对值，检测操作的稳定性会更好，且信息覆盖全面，因此等吸光点前后曲线下面积比是一个较好的评价指标。HPLC-指纹图谱是目前公认评价中药注射液稳定性变化的方法，本发明实施例均得到了HPLC指纹图谱验证。
从技术原理上讲，如果检测指标覆盖的信息越全面，越有利于全面评价。绝大多数中药注射液的活性成分和杂质具有紫外可见吸收，中药注射液的成分变化必然会体现在紫外可见吸收光谱上。HPLC指纹图谱多采用单一波长进行信号检测，只关注“活性”成分的变化，这样人为地丢失了其他信号，这对综合评价中药注射液的稳定性变化是不利的。这似乎可以解释本方法略优于HPLC指纹图谱变化的原因。
附图说明
下述“处理”是指置于60℃水浴恒温。
图1清开灵注射液热稳定加速试验吸收曲线变化(230-800nm)。检测条件：96孔透紫外板，稀释128倍，200μl，等吸光点为346nm。Q0：清开灵注射液60℃处理0周；Q1：清开灵注射液60℃处理1周；Q2：清开灵注射液60℃处理2周；Q3：清开灵注射液60℃处理3周；Q4：清开灵注射液60℃处理4周；Q8：清开灵注射液60℃处理8周。
图2清开灵注射液热稳定加速试验等吸光点前(230-346nmnm)后(347-800nmnm)曲线下面积变化。230-346：等吸光点前(含)的曲线下面积；347-800：等吸光点后的曲线下面积。
图3与第0周比较，清开灵注射液等吸光点前(230-346nm)后(347-800nm)曲线下面积的增减变化。
图4清开灵注射液等吸光点前(230-346nm)后(347-800nm)曲线下面积的比值变化。
图5双黄连注射液热稳定加速试验吸收曲线变化(230-800nm)。检测条件：96孔透紫外板，稀释128倍，200μl，等吸光点为346nm。S0：双黄连注射液60℃处理0周；S1：双黄连注射液60℃处理1周；S2：双黄连注射液60℃处理2周；S3：双黄连注射液60℃处理3周；S4：双黄连注射液60℃处理4周；S8：双黄连注射液60℃处理8周。
图6双黄连注射液热稳定加速试验等吸光点前(230-346nmnm)后(347-800nmnm)曲线下面积变化。230-346：等吸光点前(含)的曲线下面积；347-800：等吸光点后的曲线下面积。
图7与第0周比较，双黄连注射液等吸光点前(230-346nm)后(347-800nm)曲线下面积的增减变化。
图8双黄连注射液等吸光点前(230-346nm)后(347-800nm)曲线下面积的比值变化。
图9丹参注射注液热稳定加速试验吸收曲线变化(230-800nm)。检测条件：96孔透紫外板，稀释32倍，200μl，等吸光点为360nm。D0：丹参注射液60℃处理0周；D1：丹参注射液60℃处理1周；D2：丹参注射液60℃处理2周；D3：丹参注射液60℃处理3周；D4：丹参注射液60℃处理4周；D8：丹参注射液60℃处理8周。
图10丹参注射液热稳定加速试验等吸光点前(230-360nmnm)后(361-800nmnm)曲线下面积变化。230-360：等吸光点前(含)的曲线下面积；361-800：等吸光点后的曲线下面积。
图11与第0周比较，丹参注射液等吸光点前(230-360nm)后(361-800nm)曲线下面积的增减变化。
图12丹参注射液等吸光点前(230-360nm)后(361-800nm)曲线下面积的比值变化。
图13灯盏细辛注射液热稳定加速试验吸收曲线变化(230-800nm)。检测条件：96孔透紫外板，稀释32倍，200μl，等吸光点为380nm。Dz0：灯盏细辛注射液60℃处理0周；Dz1：灯盏细辛注射液60℃处理1周；Dz2：灯盏细辛注射液60℃处理2周；Dz3：灯盏细辛注射液60℃处理3周；Dz4：灯盏细辛注射液60℃处理4周；Dz8：灯盏细辛注射液60℃处理8周。
图14灯盏细辛注射液热稳定加速试验等吸光点前(230-380nmnm)后(381-800nmnm)曲线下面积变化。230-380：等吸光点前(含)的曲线下面积；381-800：等吸光点后的曲线下面积。
图15与第0周比较，灯盏细辛注射液等吸光点前(230-380nm)后(381-800nm)曲线下面积的增减变化。
图16灯盏细辛注射液等吸光点前(230-380nm)后(381-800nm)曲线下面积的比值变化。
图17红花注射液热稳定加速试验吸收曲线变化(230-800nm)。检测条件：96孔透紫外板，稀释32倍，200μl，等吸光点为480nm。H0：红花注射液60℃处理0周；H1：红花注射液60℃处理1周；H2：红花注射液60℃处理2周；H3：红花注射液60℃处理3周；H4：红花注射液60℃处理4周；H8：红花注射液60℃处理8周。
图18红花注射液热稳定加速试验等吸光点前(230-480nmnm)后(481-800nmnm)曲线下面积变化。230-480：等吸光点前(含)的曲线下面积；481-800：等吸光点后的曲线下面积。
图19与第0周比较，红花注射液等吸光点前(230-480nm)后(481-800nm)曲线下面积的增减变化。
图20红花注射液等吸光点前(230-480nm)后(481-800nm)曲线下面积的比值变化。
图21舒血宁注射液热稳定加速试验吸收曲线变化(230-800nm)。检测条件：96孔透紫外板，稀释16倍，200μl，等吸光点为380nm。Sx0：舒血宁注射液60℃处理0周；Sx1：舒血宁注射液60℃处理1周；Sx2：舒血宁注射液60℃处理2周；Sx3：舒血宁注射液60℃处理3周；Sx4：舒血宁注射液60℃处理4周；Sx8：舒血宁注射液60℃处理8周。
图22舒血宁注射液热稳定加速试验等吸光点前(230-380nmnm)后(381-800nmnm)曲线下面积变化。230-380：等吸光点前(含)的曲线下面积；381-800：等吸光点后的曲线下面积。
图23与第0周比较，舒血宁注射液等吸光点前(230-380nm)后(381-800nm)曲线下面积的增减变化。
图24舒血宁注射液等吸光点前(230-380nm)后(381-800nm)曲线下面积的比值变化。
具体实施方式
为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，下面结合实施例，对本发明的技术方案进一步阐述。需要说明的是，以下描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，本领域普通技术人员基于本发明实施例，在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1清开灵注射液的等吸光点和曲线下面积变化。
取购于市场的清开灵注射液(批号1003272)10ml，取样1.0ml备用(记为标准样Q0)，剩余注射液加入到15ml带盖离心管中，盖紧盖子后置于60℃水浴恒温。1、2、3、4、8周后固定时间点分别取样1.0ml(样品分别记为Q1、Q2、Q3、Q4和Q8)。样品取好后密封置于-20℃保存，待样品取全后进行吸收光谱检测，另平行进行指纹图谱检测以从侧面进行验证(参照文献：王志红,赵绪元,姚金成.清开灵注射液指纹图谱的HPLC研究.中华中医药学刊2008；26:868-70)。
吸收光谱检测：取样品100μl加入到透紫外96孔板，再加入100μl蒸馏水混匀后置于Tecan酶标仪扫描吸收光谱，扫描波长为230-800nm，1nm步进。如果有吸收值溢出，则对样品进行一次2倍稀释(测定体积保持在200μl)，直到吸收光谱中的最大吸收值处于1.0-3.0的范围。进行128倍稀释后，各样品的吸收曲线符合要求，结果见图1。以Q0为参照，从图1中可见清开灵注射液在60℃恒温后部分吸收曲线增强，部分也减弱；在246nm处可见等吸光点。根据微分梯形法(即梯形的高为1nm，上底为n nm的吸收值，下底为(n+1)nm的吸收值)分别计算230-246nm和247-800nm的吸收曲线下面积(图2)，发现60℃恒温后等吸光点前的曲线下面积呈下降趋势，恒温越久下降越多；而246nm后的曲线下面积则增强，恒温越久则增加越多。以Q0为参照，第三周后，等吸光点前的曲线下面积则明显减少，其后的曲线下面积则明显增加(图3)。将等吸光点前的曲线下面积和等吸光点后的曲线下面积进行对比后(图4)，发现60℃恒温时间越长比值下降越明显。
清开灵注射液原液吸收曲线(标准曲线)等吸光点前的曲线下面积为108.56(OD.nm)，等吸光点后的曲线下面积为16.37(OD.nm)，前后面积比A0为6.63。因此，以指标值变化超出10％(即An/A0小于等于90％)为不合格，那么用等吸光点前的曲线下面积判断，60℃恒温处理1-8周的样品均属于“合格”；如果用等吸光点后的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周的样品就“不合格”；用前后面积比An/A0判断，60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。数据见表1。
表1清开灵注射液的等吸光点前后曲线下面积比值变化
将处理后的样品进行HPLC指纹图谱分析(条件：色谱柱：C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：(A)甲醇-(B)0.5％醋酸，梯度洗脱：0min：10％甲醇，50min：100％甲醇，65min：100％甲醇；检测波长：255nm；流速：1.0ml/min；柱温：24℃；进样量20μl)，检测发现，60℃处理3周后，总峰面积明显减小(表1)。支持清开灵注射液热处理稳定性加速试验后紫外区吸收值发生明显变小。
当以指纹图谱中峰面积变化超过10％为不合格，HPLC指纹图谱也提示60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。因此，也验证了本发明的方法与HPLC指纹图谱分析具有等同的效果。
表2清开灵注射液热处理稳定性加速试验指纹图谱变化
实施例2双黄连注射液的等吸光点和曲线下面积变化。
取购于市场的双黄连注射液(批号20100324)10ml，取样1.0ml备用(记为标准样S0)，剩余注射液加入到15ml带盖离心管中，盖紧盖子后置于60℃水浴恒温。1、2、3、4、8周后固定时间点分别取样1.0ml(样品分别记为S1、S2、S3、S4和S8)。样品取好后密封置于-20℃保存，待样品取全后进行吸收光谱检测，另平行进行指纹图谱检测以从侧面进行验证(参照文献：李方,姜文红,刘丽娟,仲昭庆.注射用双黄连(冻干)指纹图谱的建立及其在质量控制中的应用.中成药2007；29:1196-8)。
吸收光谱检测：取样品100μl加入到透紫外96孔板，再加入100μl蒸馏水混匀后置于Tecan酶标仪扫描吸收光谱，扫描波长为230-800nm，1nm步进。如果有吸收值溢出，则对样品进行一次2倍稀释(测定体积保持在200μl)，直到吸收光谱中的最大吸收值处于1.0-3.0的范围。进行128倍稀释后，各样品的吸收曲线符合要求，结果见图5。以S0为参照，从图5中可见双黄连注射液在60℃恒温后部分吸收曲线增强，部分也减弱；也在246nm处可见等吸光点。根据微分梯形法(即梯形的高为1nm，上底为n nm的吸收值，下底为(n+1)nm的吸收值)分别计算230-246nm和247-800nm的吸收曲线下面积(图6)，发现60℃恒温后等吸光点前的曲线下面积呈下降趋势，恒温越久下降越多；而246nm后的曲线下面积则增强，恒温越久则增加越多。以S0为参照，第三周后，等吸光点前的曲线下面积则明显减少，其后的曲线下面积则明显增加(图7)。将等吸光点前的曲线下面积和等吸光点后的曲线下面积进行对比后(图8)，发现60℃恒温时间越长比值下降越明显。
双黄连注射液原液等吸光点前的曲线下面积为135.26(OD.nm)，等吸光点后的曲线下面积为13.41(OD.nm)，前后面积比为10.09。因此，如果以指标值变化超出10％为不合格，那么用等吸光点前的曲线下面积判断，60℃恒温处理1-8周的样品均属于“合格”；如果用等吸光点后的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周的样品就“不合格”；如果用前后面积比判断，60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。因此，用等吸光点后的曲线下面积和前后面积比较为敏感，考虑到前后面积比利用的信息较全面，前后面积比比等吸光点后曲线下面积更具有优势。
表3双黄连注射液的等吸光点前后曲线下面积比值变化
将处理后的样品进行HPLC指纹图谱分析(条件：色谱柱：C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：A相为0.25％冰醋酸(V/V)，B相为甲醇；检测波长：350nm；流速：1.0ml/min；柱温：24℃；进样量20μl，洗脱流程参见表4)，检测发现，60℃处理3周后，总峰面积明显减小(表5)。支持双黄连注射液热处理稳定性加速试验后紫外区吸收值发生明显变小。
表4双黄连注射液指纹图谱洗脱程序表
表5双黄连注射液热处理稳定性加速试验指纹图谱变化
如果以峰面积变化超过10％为不合格，HPLC指纹图谱也提示60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。因此，前后面积比与HPLC指纹图谱分析具有等同的效果。
实施例3丹参注射液的等吸光点和曲线下面积变化。
取购于市场的丹参注射液(批号1005104)10ml，取样1.0ml备用(记为标准样D0)，剩余注射液加入到15ml带盖离心管中，盖紧盖子后置于60℃水浴恒温。1、2、3、4、8周后固定时间点分别取样1.0ml(样品分别记为D1、D2、D3、D4和D8)。样品取好后密封置于-20℃保存，待样品取全后进行吸收光谱检测，另平行进行指纹图谱检测以从侧面进行验证(参照文献：徐曼,刘爱华,崔亚君,张金兰,果德安.不同厂家生产的香丹注射液中丹参色谱指纹图谱的比对研究.中国天然药物2007:120-6)。
吸收光谱检测：取样品100μl加入到透紫外96孔板，再加入100μl蒸馏水混匀后置于Tecan酶标仪扫描吸收光谱，扫描波长为230-800nm，1nm步进。如果有吸收值溢出，则对样品进行一次2倍稀释(测定体积保持在200μl)，直到吸收光谱中的最大吸收值处于1.0-3.0的范围。进行32倍稀释后，各样品的吸收曲线符合要求，结果见图9。以D0为参照，从图9中可见丹参注射液在60℃恒温后部分吸收曲线增强，部分也减弱；在360nm处可见等吸光点。根据微分梯形法(即梯形的高为1nm，上底为n nm的吸收值，下底为(n+1)nm的吸收值)分别计算230-360nm和361-800nm的吸收曲线下面积(图10)，发现60℃恒温后等吸光点前的曲线下面积呈下降趋势，恒温越久下降越多；而361nm后的曲线下面积则增强，恒温越久则增加越多。以D0为参照，第一周后，等吸光点前的曲线下面积则明显减少，其后的曲线下面积则明显增加(图11)。将等吸光点前的曲线下面积和等吸光点后的曲线下面积进行对比后(图12)，发现60℃恒温时间越长比值下降越明显。
丹参注射液原液等吸光点前的曲线下面积为154.78(OD.nm)，等吸光点后的曲线下面积为16.16(OD.nm)，前后面积比为10.21。因此，如果以指标值变化超出10％为不合格，那么用等吸光点前的曲线下面积判断，60℃恒温处理1-2周的样品均属于“合格”，处理3周后才不合格；如果用等吸光点后的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周的样品就“不合格”；如果用前后面积比判断，60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。因此，用等吸光点后的曲线下面积和前后面积比较为敏感，考虑到前后面积比利用的信息较全面，前后面积比比等吸光点后曲线下面积更具有优势
表6丹参注射液的等吸光点前后曲线下面积比值变化
将处理后的样品进行HPLC指纹图谱分析(条件：色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：采用乙腈(A)0.05％三氟乙酸水溶液(B)进行梯度洗脱：0～7min由2％A升至10％A，7～20min由10％A升至23％A，20～35min由23％A升至27％A，35～50min由27％A升至60％A；流速：0.8ml/min；检测波长：288nm；柱温：20℃；进样量：20μl)，检测发现，60℃处理1周后，总峰面积明显减小(表7)。支持丹参注射液热处理稳定性加速试验后紫外区吸收值发生明显变小。
表7丹参注射液热处理稳定性加速试验指纹图谱变化
如果以峰面积变化超过10％为不合格，HPLC指纹图谱也提示60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。因此，前后面积比与HPLC指纹图谱分析具有等同的效果。
实施例4灯盏细辛注射液的等吸光点和曲线下面积变化。
取购于市场的灯盏细辛注射液(批号20130533)10ml，取样1.0ml备用(记为标准样Dz0)，剩余注射液加入到15ml带盖离心管中，盖紧盖子后置于60℃水浴恒温。1、2、3、4、8周后固定时间点分别取样1.0ml(样品分别记为Dz1、Dz2、Dz3、Dz4和Dz8)。样品取好后密封置于-20℃保存，待样品取全后进行吸收光谱检测，另平行进行指纹图谱检测以从侧面进行验证(参照文献：Zhang Y,Shi P,Qu H,Cheng Y.Characterization of phenolic compoundsin Erigeron breviscapus by liquid chromatography coupled to electrosprayionization mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom 2007；21:2971-84)。
吸收光谱检测：取样品100μl加入到透紫外96孔板，再加入100μl蒸馏水混匀后置于Tecan酶标仪扫描吸收光谱，扫描波长为230-800nm，1nm步进。如果有吸收值溢出，则对样品进行一次2倍稀释(测定体积保持在200μl)，直到吸收光谱中的最大吸收值处于1.0-3.0的范围。进行32倍稀释后，各样品的吸收曲线符合要求，结果见图13。以Dz0为参照，从图13中可见灯盏细辛注射液在60℃恒温后部分吸收曲线增强，部分也减弱；在380nm处可见等吸光点。根据微分梯形法(即梯形的高为1nm，上底为n nm的吸收值，下底为(n+1)nm的吸收值)分别计算230-380nm和381-800nm的吸收曲线下面积(图14)，发现60℃恒温后等吸光点前的曲线下面积呈下降趋势，恒温越久下降越多；而381nm后的曲线下面积则增强，恒温越久则增加越多。以Dz0为参照，第一周后，等吸光点前的曲线下面积则明显减少，其后的曲线下面积则明显增加(图15)。将等吸光点前的曲线下面积和等吸光点后的曲线下面积进行对比后(图16)，发现60℃恒温时间越长比值下降越明显。
灯盏细辛注射液原液等吸光点前的曲线下面积为232.08(OD.nm)，等吸光点后的曲线下面积为10.29(OD.nm)，前后面积比为22.56。因此，如果以指标值变化超出10％为不合格，那么用等吸光点前的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周后的样品均“不合格”；如果用等吸光点后的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周的样品就“不合格”；如果用前后面积比判断，60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的。考虑到前后面积比利用的信息较全面，前后面积比比等吸光点后曲线下面积更具有优势。
表8灯盏细辛注射液的等吸光点前后曲线下面积比值变化
将处理后的样品进行HPLC指纹图谱分析(条件：色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5μm；梯度洗脱：参见表9；检测波长：330nm；柱温：22℃)，检测发现，60℃处理1周后，总峰面积明显减小(表10)。支持灯盏细辛注射液热处理稳定性加速试验后紫外区吸收值发生明显变小。
表9灯盏细辛注射液洗脱梯度
表10灯盏细辛注射液热处理稳定性加速试验指纹图谱变化
如果以指纹图谱中峰面积变化超过10％为不合格，HPLC指纹图谱也提示60℃恒温处理1周后的样品也是“不合格”的。因此，前后面积比与HPLC指纹图谱分析具有等同的效果。
实施例5红花注射液的等吸光点和曲线下面积变化。
取购于市场的红花注射液(批号1031504213)10ml，取样1.0ml备用(记为标准样H0)，剩余注射液加入到15ml带盖离心管中，盖紧盖子后置于60℃水浴恒温。1、2、3、4、8周后固定时间点分别取样1.0ml(样品分别记为H1、H2、H3、H4和H8)。样品取好后密封置于-20℃保存，待样品取全后进行吸收光谱检测，另平行进行指纹图谱检测以从侧面进行验证(参照文献：彭燕,苗爱东,王本富,胡辉,马超,何二龙.红花注射液HPLC指纹图谱分析方法研究.西北药学杂志2003；18:249-51)。
吸收光谱检测：取样品100μl加入到透紫外96孔板，再加入100μl蒸馏水混匀后置于Tecan酶标仪扫描吸收光谱，扫描波长为230-800nm，1nm步进。如果有吸收值溢出，则对样品进行一次2倍稀释(测定体积保持在200μl)，直到吸收光谱中的最大吸收值处于1.0-3.0的范围。进行64倍稀释后，各样品的吸收曲线符合要求，结果见图17。以H0为参照，从图17中可见灯盏细辛注射液在60℃恒温后部分吸收曲线增强，部分也减弱；在480nm处可见等吸光点。根据微分梯形法(即梯形的高为1nm，上底为n nm的吸收值，下底为(n+1)nm的吸收值)分别计算230-480nm和481-800nm的吸收曲线下面积(图18)，发现60℃恒温后等吸光点前的曲线下面积呈下降趋势，恒温越久下降越多；而481nm后的曲线下面积则增强，恒温越久则增加越多。以H0为参照，第一周后，等吸光点前的曲线下面积则明显减少，其后的曲线下面积则明显增加(图19)。将等吸光点前的曲线下面积和等吸光点后的曲线下面积进行对比后(图20)，发现60℃恒温时间越长比值下降越明显。
红花注射液原液等吸光点前的曲线下面积为281.57(OD.nm)，等吸光点后的曲线下面积为112.96(OD.nm)，前后面积比为2.49。因此，如果以指标值变化超出10％为不合格，那么用等吸光点前的曲线下面积判断，60℃恒温处理2周后的样品仍属“合格”，3周后才“不合格”；如果用等吸光点后的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周的样品就“不合格”；如果用前后面积比判断，60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的(表11)。考虑到前后面积比利用的信息较全面，前后面积比比等吸光点后曲线下面积更具有优势。
表11红花注射液的等吸光点前后曲线下面积比值变化
将处理后的样品进行HPLC指纹图谱分析(条件：色谱柱C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为10ml/l冰醋酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0min→60min，A(100％→30％)；检测波长：270nm；流速：1ml/min；柱温22℃；进样量20μL)，检测发现，60℃处理1周后，总峰面积明显减小(表12)。支持红花注射液热处理稳定性加速试验后紫外区吸收值发生明显变小。
表12红花注射液热处理稳定性加速试验指纹图谱变化
如果以峰面积变化超过10％为不合格，HPLC指纹图谱也提示60℃恒温处理1周的样品是“合格”的，处理2周后才“不合格”。因此，前后面积比(An/A0)与比HPLC指纹图谱分析更敏感。
实施例6舒血宁注射液的等吸光点和曲线下面积变化。
取购于市场的舒血宁注射液(批号1041611272)10ml，取样1.0ml备用(记为标准样Sx0)，剩余注射液加入到15ml带盖离心管中，盖紧盖子后置于60℃水浴恒温。1、2、3、4、8周后固定时间点分别取样1.0ml(样品分别记为Sx1、Sx2、Sx3、Sx4和Sx8)。样品取好后密封置于-20℃保存，待样品取全后进行吸收光谱检测，另平行进行指纹图谱检测以从侧面进行验证(参照文献：王京辉,杜小伟,王萌萌,张小茜,荆芳,房秀霞,et al.舒血宁注射液、银杏叶提取物及银杏叶指纹图谱研究.药物分析杂志2008；28:1026-30)。
吸收光谱检测：取样品100μl加入到透紫外96孔板，再加入100μl蒸馏水混匀后置于Tecan酶标仪扫描吸收光谱，扫描波长为230-800nm，1nm步进。如果有吸收值溢出，则对样品进行一次2倍稀释(测定体积保持在200μl)，直到吸收光谱中的最大吸收值处于1.0-3.0的范围。进行16倍稀释后，各样品的吸收曲线符合要求，结果见图21。以Sx0为参照，从图21中可见灯盏细辛注射液在60℃恒温后部分吸收曲线增强，部分也减弱；在380nm处可见等吸光点。根据微分梯形法(即梯形的高为1nm，上底为n nm的吸收值，下底为(n+1)nm的吸收值)分别计算230-380nm和381-800nm的吸收曲线下面积(图22)，发现60℃恒温后等吸光点前的曲线下面积呈下降趋势，恒温越久下降越多；而381nm后的曲线下面积则增强，恒温越久则增加越多。以Sx0为参照，第一周后，等吸光点前的曲线下面积则明显减少，其后的曲线下面积则明显增加(图23)。将等吸光点前的曲线下面积和等吸光点后的曲线下面积进行对比后(图24)，发现60℃恒温时间越长比值下降越明显。
舒血宁注射液原液等吸光点前的曲线下面积为218.51(OD.nm)，等吸光点后的曲线下面积为1.21626(OD.nm)，前后面积比为179.67。因此，如果以指标值变化超出10％为不合格，那么用等吸光点前的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周后即“不合格”；如果用等吸光点后的曲线下面积判断，60℃恒温处理1周的样品也就“不合格”；如果用前后面积比判断，60℃恒温处理1周的样品也是“不合格”的(表13)。考虑到前后面积比利用的信息较全面，前后面积比比等吸光点后曲线下面积更具有优势。
表13舒血宁注射液的等吸光点前后曲线下面积比值变化
将处理后的样品进行HPLC指纹图谱分析(条件：色谱柱：C18(250mm x 4.6mm,5um)；以流动相A为水-乙腈-异丙醇-柠檬酸(1000:470:50:6.08)，流动相B为水-乙腈-异丙醇-柠檬酸(1400:200:30:6.88)；进行梯度洗脱：0-10min：A与B比例为10:90，10-30min：A与B比例由10:90线性变化至25:75，30-45min：A与B比例为25:75，45-80min：A与B比例由25:75线性变化至70:30，80-100min：A与B比例由70:30线性变化至100:0，流速为1.0ml/min，检测波长为360nm；柱温22℃)，检测发现，60℃处理1周后，总峰面积明显减小(表14)。支持舒血宁注射液热处理稳定性加速试验后紫外区吸收值发生明显变小。
表14舒血宁注射液热处理稳定性加速试验指纹图谱变化
如果以峰面积变化超过10％为不合格，HPLC指纹图谱也提示60℃恒温处理1周后也是“不合格”。因此，前后面积比得到了HPLC指纹图谱分析的验证。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种快速定量评价中药注射液稳定性的方法，其特征是，按照以下步骤进行：
1)将合格的中药注射剂溶液进行稀释，在200～800nm波长范围内扫描，得到该中药注射剂的标准吸收曲线；
2)根据热稳定加速实验扫描不同时间点该中药注射剂同稀释倍数下的吸收曲线；
3)定义1)与2)中多条吸收曲线的交点为等吸光点；
4)分别计算各条吸收曲线等吸光点前、后吸收曲线下面积；
5)将1)中标准吸收曲线等吸光点前、后吸收曲线下面积之比记为A0；将2)中各条吸收曲线等吸光点前、后吸收曲线下面积之比分别记为An；
6)分别计算不同时间点的An与A0的比值；
7)若An/A0小于或等于一定值，则判断该时间点注射剂稳定性符合要求，若An/A0大于一定值，则判断该时间点注射剂稳定性不符合要求。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤7)中的“一定值”是90％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤7)中的“一定值”据具体品种确定。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是步骤1)涉及的中药注射液为液体。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是步骤1)涉及的中药注射液为以固体物为主要活性物质的中药活性部位、单方或复方制成的注射液。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是步骤1)涉及的中药注射液为按照使用说明书溶解稀释的注射用粉末。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是步骤1)中涉及的中药注射液稀释倍数不限定，以吸收光谱的最大吸收值在1～3为度。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是步骤1)中波长范围为230-800nm，步进波长为1nm。
9.如权利要求1或2项所述的方法，其特征是所述的中药注射液为清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液、灯盏细辛注射液或舒血宁注射液。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是所述的热稳定加速实验是指将中药注射液置于60℃水浴恒温。
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