CN108051362B - 一种针对单个纳米颗粒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对单个纳米颗粒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：在盖玻片上附着单个纳米颗粒；光源发出的光经过扩束整形后，聚焦到油浸物镜的后焦平面；调节入射光在所述油浸物镜的后焦平面上的位置，使入射光斜入射到所述盖玻片上，在所述盖玻片表面产生沿表面传播、强度在竖直方向上呈指数衰减的倏逝波；所述倏逝波遇到所述单个纳米颗粒发生散射，沿所述盖玻片表面传播产生径向界面散射；通过CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，并通过所述CCD对所述单个纳米颗粒进行成像。本发明成本低、检测性能稳定、检测速度快、灵敏度高、可用于原位与便携式检测、可扩展到病毒检测、大气中纳米污染物等应用中。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像检测技术领域，尤其涉及一种针对单个纳米颗粒的检测方法。
背景技术
近年来，随着纳米、材料、光学技术的发展，纳米尺度显微成像被广泛应用于生物活细胞标记成像、单分子示踪、病毒检测、构建功能纳米材料等生命科学、生物化学、材料学等领域。
目前广泛应用的成像技术中，普通光学显微镜由于受到衍射极限的限制，分辨率较低，无法检测尺寸小于200nm的物质。电子显微镜，包括透射电子显微镜(TEM)与扫描电子显微镜(SEM)，可以将分辨率提高到纳米量级。然而电子显微镜需要真空的操作环境，设备成本较高，一般需要进行样品预处理，而且无法进行生物活体样本检测，因而限制了其在生命科学、细胞生物学领域的应用。扫描隧道显微镜(STM)与原子力显微镜(AFM)都具有纳米量级的高分辨率，可以扫描原子像，其中原子力显微镜可以观测绝缘体样品。这两种成像方式也存在着需要真空操作环境、扫描时间长以及无法观测生物活体样品的缺陷而限制了其应用范围。
目前广泛应用的单分子光学成像技术中，全内反射荧光显微术(TIRFM)，即利用全内反射产生的倏逝波照明样品，使照明区域限定在样品表面～100nm范围内，具有其他光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度，该技术在细胞生物学领域得到了广泛的应用。全内反射荧光显微术(TIRFM)利用荧光分子对待测样品进行标定，通过全内反射产生的倏逝波激发荧光分子，从而实现对待测样品的成像。但由于传统荧光染料分子的荧光漂白效应导致成像效果存在缺陷，同时，使用荧光分子标记样品也存在需要样品预处理以及对待测生物样品造成潜在功能性影响等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对单个纳米颗粒的检测方法，可对单个纳米颗粒进行无标记、快速成像检测，解决了现有技术中光学显微镜无法对纳米物质成像的不足，同时也补偿了电子显微镜等传统纳米显微仪器检测时间长、成本高、真空操作等缺点，也弥补了全内反射荧光显微术荧光漂白效应带来的成像问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种针对单个纳米颗粒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：在盖玻片上附着单个纳米颗粒；光源发出的光经过扩束整形后，聚焦到油浸物镜的后焦平面；调节入射光在所述油浸物镜的后焦平面上的位置，使入射光斜入射到所述盖玻片上，在所述盖玻片表面产生沿表面传播、强度在竖直方向上呈指数衰减的倏逝波；所述倏逝波遇到所述单个纳米颗粒发生散射，其中一部分散射到空间中呈立体角分布，另一部分沿所述盖玻片表面传播产生径向界面散射；通过CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，并通过所述CCD对所述单个纳米颗粒进行成像。
优选地，所述通过CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，并通过所述CCD对所述单个纳米颗粒进行成像，包括如下步骤：通过所述CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，所述CCD测量所述盖玻片上有单个纳米颗粒的反射光作为当前光斑；采用所述CCD测量所述盖玻片上无任何单个纳米颗粒的反射光作为背景光斑；将所述背景光斑与所述当前光斑相减，进行数据平均降噪处理，除去光斑的背景噪声及所述CCD的噪声，增强散射场与背景的对比度，优化成像效果。
优选地，所述单个纳米颗粒为病毒、纳米颗粒、碳纳米管、量子点中的一种或多种。
优选地，所述光源为激光器，所述光源的波长为633nm。
优选地，所述油浸物镜的数值孔径为1.7。
优选地，所述盖玻片的折射率为1.78。
本发明提供的技术方案，具有如下技术效果或优点：
本发明采用的检测方法是基于全内反射(TIR)产生的倏逝波照明单个纳米颗粒，通过对单个纳米颗粒引起的倏逝波界面散射成像，实现对单个纳米颗粒的无标记快速成像检测。本发明成本低、检测性能稳定、检测速度快、灵敏度高、可用于原位与便携式检测、可扩展到病毒检测、大气中纳米污染物等应用中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种针对单个纳米颗粒的检测方法的工艺流程图；
图2为本发明实施例提供的检测方法使用的检测装置的结构示意图；
图3为本发明实施例中全内反射在盖玻片上产生倏逝波并发生散射的示意图；
图4为本发明对200nm的聚苯乙烯颗粒进行成像的成像图；
图5为本发明对100nm的聚苯乙烯颗粒进行成像的成像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明实施例提供一种针对单个纳米颗粒的检测方法，所述检测方法通过图2所示检测装置来实现，所述检测装置包括光源210、线偏振器220、薄膜分束器230、油浸物镜240、盖玻片250和CCD260。所述检测方法包括如下步骤：
步骤110，在盖玻片250上附着单个纳米颗粒；本实施例中所述单个纳米颗粒为病毒、纳米颗粒、碳纳米管、量子点中的一种或多种。
步骤120，光源210发出的光经过扩束整形后，聚焦到油浸物镜的后焦平面；本实施例中，所述光源为激光器，所述光源的波长为633nm；所述油浸物镜的数值孔径为1.7；
具体地，所述光源210发出的光经由所述线偏振器220后，再由所述薄膜分束器230反射。步骤120和步骤130的顺序可以进行交换，或者同时进行。
步骤130，调节入射光在所述油浸物镜240的后焦平面上的位置，使入射光斜入射到所述盖玻片250上，在所述盖玻片250表面产生沿表面传播、强度在竖直方向上呈指数衰减的倏逝波；所述倏逝波遇到所述单个纳米颗粒发生散射，其中一部分散射到空间中呈立体角分布，另一部分沿所述盖玻片250表面传播产生径向界面散射；本实施例中，所述入射光的角度大于全内反射临界角，所述盖玻片250的折射率为1.78；
具体地，所述油浸物镜240的全内反射(TIR)照明方式的优点是使入射光与反射光平行，通过改变入射光在油浸物镜240后焦平面上的位置，调节入射光角度，将角度调节转化为简便的一维长度调节，使检测装置的结构紧凑、稳定；沿所述盖玻片250表面传播的界面散射与全内反射(TIR)照明产生的倏逝波之间发生干涉，在所述盖玻片250表面产生明暗相间的条纹分布，并呈同心抛物线形状。
步骤140，通过CCD260收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，并通过所述CCD260对所述单个纳米颗粒进行成像；
具体地，如果用CCD对包含单个纳米颗粒界面散射信号的反射光直接进行成像，所得到的图像包含了散射光与反射光的总和，由于反射光会带来很强的背景噪声使成像对比度较差，所以需要对直接采集的数据进行处理，降低背景噪声对信号的影响。所述通过CCD260收集所述界面散射的信号和所述盖玻片250上的反射光，并通过所述CCD260对所述单个纳米颗粒进行成像，包括如下步骤：通过所述CCD260收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，所述CCD测量所述盖玻片250上有单个纳米颗粒的反射光作为当前光斑；采用所述CCD260测量所述盖玻片250上无任何单个纳米颗粒的反射光作为背景光斑；将所述背景光斑与所述当前光斑相减，进行数据平均降噪处理，除去光斑的背景噪声及所述CCD260的噪声，增强散射场与背景的对比度，优化成像效果。
本发明实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明采用的检测方法是基于全内反射(TIR)产生的倏逝波照明单个纳米颗粒，通过对单个纳米颗粒引起的倏逝波界面散射成像，实现对单个纳米颗粒的无标记快速成像检测。本发明成本低、检测性能稳定、检测速度快、灵敏度高、可用于原位与便携式检测、可扩展到病毒检测、大气中纳米污染物等应用中。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种针对单个纳米颗粒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
在盖玻片上附着单个纳米颗粒；
光源发出的光经过线偏振器扩束整形、聚焦后，经薄膜分束器反射到油浸物镜的后焦平面；
调节入射光在所述油浸物镜的后焦平面上的位置，使入射光斜入射到所述盖玻片上，在所述盖玻片表面产生沿表面传播、强度在竖直方向上呈指数衰减的倏逝波；所述倏逝波遇到所述单个纳米颗粒发生散射，其中一部分散射到空间中呈立体角分布，另一部分沿所述盖玻片表面传播产生径向界面散射；
通过CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，并通过所述CCD对所述单个纳米颗粒进行成像；
其中，所述通过CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，并通过所述CCD对所述单个纳米颗粒进行成像，包括如下步骤：
通过所述CCD收集所述界面散射的信号和所述盖玻片上的反射光，所述CCD测量所述盖玻片上有单个纳米颗粒的反射光作为当前光斑；
采用所述CCD测量所述盖玻片上无任何单个纳米颗粒的反射光作为背景光斑；
将所述背景光斑与所述当前光斑相减，进行数据平均降噪处理，除去光斑的背景噪声及所述CCD的噪声，增强散射场与背景的对比度，优化成像效果；
所述入射光线在盖玻片表面发生界面散射和全内反射；
其中，沿所述盖玻片表面传播的界面散射与所述倏逝波发生干涉，在所述盖玻片表面产生明暗相间的条纹，且呈同心抛物线形状。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单个纳米颗粒为病毒、纳米颗粒、碳纳米管、量子点中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述光源为激光器，所述光源的波长为633nm。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述油浸物镜的数值孔径为1.7。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述盖玻片为的折射率为1.78。
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