CN105319196A - 一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置及其成像方法 - Google Patents

Abstract

一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置及其成像方法，它涉及一种成像装置及其成像方法。本发明的目的是为了解决现有共焦限位技术的分辨力难以提高，共焦成像不清晰的问题。本发明包括激光光源，沿激光光源光线传播方向依次设有准直扩束器、分光棱镜、1/4波片、扫描系统、照明物镜、荧光样品、收集透镜和CCD探测器，探测面上进行积分，改变对应探测位置的光灵敏度，使系统OTF带宽变大。本发明提高了共焦荧光成像系统的空间截止频率，拓宽空间频域带宽，从而显著改善成像系统横向分辨力，适用于厚生物样品成像的测量领域。

Description

一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置及其成像方法

技术领域

本发明涉及成像装置及其成像方法，具体涉及一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置及其成像方法，属于光学精密测量技术领域。

背景技术

光学显微术是一种历史悠久且十分重要的无破坏性技术，被广泛应用于生物和材料科学等领域。共焦显微测量技术是一种适用于微米及亚微米尺度测量的三维光学显微技术。反射式共焦显微系统的层析能力使之在三维成像领域显得十分重要。

在20世纪50年代中后期，共焦显微镜由Minsky发明，1977年，C.J.R.Sheppard和A.Choudhury首次阐明共焦显微系统在点针孔掩模的作用下，以牺牲视场为代价，使横向分辨率提高到相同孔径普通显微镜的1.4倍。此后，共焦显微测量技术受到普遍关注，成为了显微科学领域的重要分支。

但是，传统共焦技术一直受到探测器尺寸的影响，共焦显微技术的分辨力难以提高。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有共焦显微技术的分辨力难以提高，共焦成像不清晰的问题。

本发明的技术方案是：一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置，包括激光光源，沿激光光源光线传播方向依次设有准直扩束器、分光棱镜、1/4波片、扫描系统、照明物镜、荧光样品、收集透镜和CCD探测器，整个光路成像过程为非相干成像。

所述扫描系统包括扫描振镜，扫描振镜改变光束偏转角在荧光样品的物面进行扫描。

基于所述一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，包括以下步骤：

步骤一、利用CCD探测器的探测函数获得共焦系统的积分光强；

步骤二、根据步骤一所述的积分光强获得共焦系统的三维光强点扩散函数；

步骤三、对步骤二所述的三维光强点扩散函数进行三维傅里叶变换，获得共焦系统的光学传递函数；

所述步骤一具体包括：所述探测面采用非均匀探测方式，使得探测面内探测灵敏度系数成正弦分布，探测光斑光强在半径为艾里斑半径的圆函数内乘以正弦分布的探测系数，得到共焦系统的积分光强。

所述探测面采用非均匀探测方式，在探测面区域内进行积分，改变对应探测位置的光灵敏度系数，进而使探测函数成正弦分布，在该系统中，由于探测函数为正弦分布，探测函数频谱与普通共焦系统相比有效宽度增加，从而能够使系统OTF带宽增大，系统横向分辨力显著提高在能发挥反射式共焦显微系统的层析能力的同时充分发掘共焦系统的横向分辨潜力。

所述步骤二获得共焦系统三维光强点扩散函数的方法包括：将步骤一所述的积分光强转换成三维卷积形式。

所述扫描系统在扫描过程中探测光斑在探测面的位置不变。

所述探测光斑光强乘以半径为艾里斑半径的圆函数并对计算后的圆函数内光强积分实现针孔探测。

本发明与现有技术相比具有以下效果：本发明超分辨结构探测共焦荧光成像装置与中，不需要普通共焦系统中探测面的针孔；在探测面特定区域进行积分，改变对应探测位置的光灵敏度，探测函数成正弦分布，使探测区域和普通共焦中针孔区域相同；本发明创造性的将结构探测成像方法与共焦荧光显微系统相结合，提高了共焦荧光成像系统的空间截止频率，拓宽空间频域带宽，从而显著改善成像系统横向分辨力，可适用于厚生物样品成像的测量领域。

附图说明

图1是本发明超结构探测共焦荧光成像装置结构示意图。

图2是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径时，基本共焦显微系统的探测面频谱归一化仿真图。

图3是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，结构探测共焦系统探测面频谱归一化仿真图。

图4是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径时，基本共焦显微系统的OTF归一化仿真图。

图5是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，结构探测共焦系统OTF归一化仿真图。

图6是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，结构探测共焦系统OTF与基本共焦系统OTF在f_x方向对比归一化仿真图。

图7是x方向和y方向上间隔为3.02um的条纹样品仿真图。

图8是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径时的基本共焦显微系统中所探测到的频谱仿真图。

图9是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径时的基本共焦显微系统中所成像光强归一化仿真图。

图10是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，的结构探测共焦显微系统中所探测到的频谱仿真图。

图11是条纹样品在NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，结构探测共焦显微系统中所成像光强归一化仿真图。

图12是条纹样品与其在基本共焦显微系统和结构探测共焦显微系统中所成像在x方向光强对比归一化仿真图。

图中：1、激光光源，2、准直扩束器，3、分光棱镜，4、收集透镜，5、1/4波片，6、CCD探测器，7、扫描系统，8、照明物镜，9、荧光样品。

具体实施方式

结合附图说明本发明的具体实施方式，本发明的一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置，包括激光光源1，沿激光光源1光线传播方向依次设有准直扩束器2、分光棱镜3、1/4波片5、扫描系统7、照明物镜8、荧光样品9、收集透镜4和CCD探测器6。

所述扫描系统包括扫描振镜，扫描振镜改变光束偏转角在荧光样品的物面进行扫描。

基于所述一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，包括以下步骤：

步骤一、所述步骤一具体包括：所述探测面采用非均匀探测方式，使得探测面内探测灵敏度系数成正弦分布，探测光斑光强在半径为艾里斑半径的圆函数内乘以正弦分布的探测系数，得到共焦系统的积分光强；

$I\left(r_s\right)={\∫}_{-\mathrm{\∞}}^{\mathrm{\∞}}\[{\∫}_{-\mathrm{\∞}}^{\mathrm{\∞}}{\left|h_1\left(M_1{r}_1\right)\right|}^{2}o(r_s-r_1){\left|h_2(r_1+M_2{r}_2)\right|}^2{\mathrm{dr}}_1\]D\left(r_2\right){\mathrm{dr}}_2---\left(1\right);$

其中D(r)为探测函数，式中r₁,r_s,r₂分别表示物空间坐标；M₁,M₂分别表示照明系统和探测系统放大倍率；扫描位置坐标和像空间坐标，h₁(r)、o(r)、h₂(r)分别表示照明系统点扩散函数，物函数和探测系统点扩散函数。

所述探测面采用非均匀探测方式，在探测面区域内进行积分，改变对应探测位置的光灵敏度系数，进而使探测函数成正弦分布。

步骤二、将步骤一所述的积分光强转换成三维卷积形式：

$I\left(r_s\right)=h\left(r_s\right){\⊗}_{3}o\left(r_s\right)---\left(2\right);$

式中为三维卷积符号，通过(2)式得到三维光强点扩散函数(IPSF)h(r)为：

$h\left(r\right)={\left|h_1\left(M_{1}r\right)\right|}^2\[{\∫}_{-\mathrm{\∞}}^{\mathrm{\∞}}{\left|h_2(r+M_2{r}_2)\right|}^{2}D\left(r_2\right){\mathrm{dr}}_2\]---\left(3\right);$

步骤三、对三维光强点扩散函数(IPSF)h(r)进行三维傅里叶变换，即可获得系统的光学传递函数(OTF)：

$C\left(m\right)=F_3\[{\left|h_1\left(M_{1}r\right)\right|}^2\]{\⊗}_3\{F_3\[{\left|h_2\left(r\right)\right|}^2\]F_3\[D(r/M_2)\]\}---\left(4\right);$

从OTF角度分析，收集物镜的OTF与探测函数频谱乘积导致收集物镜的等效OTF带宽变小，从而整个系统OTF带宽变小。点探测条件下，系统OTF带宽最大，为普通显微镜的2倍。探测面积无穷大条件下，系统OTF带宽最最小。

在基本共焦系统中，探测函数为D(r)＝circ(r/r_d)δ(z)，其傅里叶变换归一化仿真图如图2所示。

所述扫描系统7在扫描过程中探测光斑在探测面的位置不变。

所述探测面采用非均匀探测方式，使得探测面内探测灵敏度系数成正弦分布，在探测面区域内进行积分，改变对应探测位置的光灵敏度系数，进而使探测函数成正弦分布。

本实施例中取探测函数为：

D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)(5)；

式中f₀表示探测函数中余弦分量的空间频率；r_d表示探测函数的半径。

式中，NA＝0.1，λ＝660nm，通过(5)式获得积分光强，化成卷积形式，并进行傅里叶变换:

$\tilde{D}(m,n)=\left(r_d\frac{J_1\left(2{\mathrm{\πr}}_{d}l\right)}{l}\right){\⊗}_2\[\mathrm{\δ}(m,n)+\mathrm{\δ}(m-f_0,n)+\mathrm{\δ}(m+f_0,n)\]---\left(6\right);$

式中的表示探测函数频谱；m，n分别表示x，y方向频率成分。

所述探测光斑光强乘以半径为艾里斑半径的圆函数并对计算后的圆函数内光强积分实现针孔探测，通过该方法替代现有技术中探测器前的针孔，实现了针孔探测功能。

图3是探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)的傅里叶变换归一化仿真图。

此时，共焦系统的OTF变为：

$\begin{array}{c}C(m,n)=C_1(m,n){\⊗}_2\{C_2(m,n)r_d\\ (\frac{2}{25}\frac{J_1\left(2{\mathrm{\πr}}_d\sqrt{m^2+n^2}\right)}{\sqrt{m^2+n^2}}+\frac{1}{2}\frac{J_1\left(2{\mathrm{\πr}}_d\sqrt{{(m-f_0)}^2+n^2}\right)}{\sqrt{{(m-f_0)}^2+n^2}})\\ +\frac{1}{2}\frac{J_1\left(2{\mathrm{\πr}}_d\sqrt{{(m+f_0)}^2+n^2}\right)}{\sqrt{{(m+f_0)}^2+n^2}}+\frac{1}{2}\frac{J_1\left(2{\mathrm{\πr}}_d\sqrt{m^2+{(n-f_0)}^2}\right)}{\sqrt{m^2+{(n-f_0)}^2)}}\\ +\frac{1}{2}\frac{J_1\left(2{\mathrm{\πr}}_d\sqrt{m^2+{(n+f_0)}^2}\right)}{\sqrt{m^2+{(n+f_0)}^2}}\}\end{array}$

图4是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径时，基本共焦显微系统的OTF归一化仿真图。

图5是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，结构探测共焦系统OTF归一化仿真图。

图6是NA＝0.1，λ＝660nm，探测面针孔半径探测函数D(r)＝(2/25+cos(2πf₀x)+cos(2πf₀y))circ(r/r_d)δ(z)，时，结构探测共焦系统OTF与基本共焦系统OTF在fx方向对比归一化仿真图。

通过对比图6中两条曲线，可明显看出，结构探测共焦显微系统OTF截止频率相对于基本共焦显微系统得到提高。

图7是x方向和y方向上间隔为3.02um的条纹样品仿真图。

图8和图9分别是基本共焦显微系统中所探测到的样品频谱信息，及样品在基本共焦显微系统中所成像仿真图。

图10和图11分别是结构探测共焦显微系统中所探测到的样品频谱信息，及样品在结构探测共焦显微系统中所成像仿真图。

通过对比图8和图10可看出本实施例能探测到的最高样品频率明显高于基本共焦显微系统。

通过对比图9和图11，可看出结构探测共焦超分辨方法得到的积分光强图像分辨力明显高于基本共焦显微系统，结合图12的对比结果，本实施例实现了共焦显微系统的二维超分辨，共焦显微系统的等效OTF带宽得到拓展。

Claims (8)

1.一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置，包括激光光源(1)，其特征在于：沿激光光源(1)光线传播方向依次设有准直扩束器(2)、分光棱镜(3)、1/4波片(5)、扫描系统(7)、照明物镜(8)、荧光样品(9)、收集透镜(4)和CCD探测器(6)。

2.根据权利要求1所述一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置，其特征在于：所述扫描系统(7)包括扫描振镜，扫描振镜改变光束偏转角在荧光样品的物面进行扫描。

3.基于权利要求1所述一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、利用CCD探测器的探测函数获得共焦系统的积分光强；

步骤二、根据步骤一所述的积分光强获得共焦系统的三维光强点扩散函数；

步骤三、对步骤二所述的三维光强点扩散函数进行三维傅里叶变换，获得共焦系统的光学传递函数。

4.根据权利要求3所述的一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，其特征在于：所述步骤一具体包括：所述探测面采用非均匀探测方式，使得探测面内探测灵敏度系数成正弦分布，探测光斑光强在半径为艾里斑半径的圆函数内乘以正弦分布的探测系数，得到共焦系统的积分光强。

5.根据权利要求4所述的一种超分辨结构探测共焦相干成像装置的成像方法，其特征在于：所述探测面采用非均匀探测方式，改变对应探测位置的光灵敏度系数，进而使探测函数成正弦分布。

6.根据权利要求3所述的一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，其特征在于：所述步骤二获得共焦系统三维光强点扩散函数的方法包括：将步骤一所述的积分光强转换成三维卷积形式。

7.根据权利要求3所述的一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，其特征在于：所述扫描系统(7)在扫描过程中探测光斑在探测面的位置不变。

8.根据权利要求3所述的一种超分辨结构探测共焦荧光成像装置的成像方法，其特征在于：所述探测光斑光强乘以半径为艾里斑半径的圆函数并对计算后的圆函数内光强积分实现针孔探测。