CN108048403B - Sd大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系hers-h1和hers-c2及建立方法及应用 - Google Patents

Sd大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系hers-h1和hers-c2及建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑H1（Hertwig`s epithelial root sheath,HERS‑H1）和HERS‑C2（Hertwig`s epithelial root sheath,HERS‑C2）的建立方法及其在牙再生中的应用，其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑H1保藏号为CCTCC NO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑C2保藏号为CCTCCNO.C2017250。本发明中细胞系保存了牙齿发育过程中原代赫特维希上皮根鞘细胞的特性，并且可以至少传代至50代，增殖速率较原代细胞大为提高。建立方法操作简单，稳定、重复性高。

Description

SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2及建立方 法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法及应用。
背景技术
牙齿是人类重要的器官，承担着咀嚼、发音、维持颌面部形态等功能，然而牙齿缺失成为影响人类生活的一大因素。20-64岁的成人平均仅有24.92颗牙齿存留，平均每人缺失了3.08颗牙齿(尽头牙除外)。而其中有3.75％的人全口缺牙。目前修复缺失牙齿的方法主要有桥体修复，种植牙修复以及活动义齿修复。桥体修复和活动义齿修复主要是依赖于余留的牙齿对缺失的牙齿进行修复，往往会对余留的牙齿造成不可逆转的损伤，假牙的舒适度也不尽如人意。目前主流的修复方式为种植义齿修复，既舒适又美观，但种植体周围很容易发生炎症，造成种植义齿松动脱落。因此，构建功能完好的生物牙根以及在生物牙根上安装牙冠，构建能媲美天然牙齿的修复体已成为修复缺失牙齿的趋势。
赫特维希上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath,HERS)是牙冠发育完成后，成釉器内外釉上皮在颈环处增生，向未来根尖孔方向生长，形成的双层上皮结构，牙根是在HERS和周围外胚间充质的相互作用下形成的。因此，HERS作为调控牙根发育的重要结构，对于构建生物牙根以及探究牙根发育过程中的分子机制起到至关重要的作用。然而由于HERS在牙根发育中是暂时性结构，而且仅由两层上皮细胞构成且被外胚间充质细胞包饶，故从牙胚中单独分离HERS细胞非常困难并且细胞数目较少。分离得到的HERS细胞的细胞间连接较紧密，使用常用的胰蛋白酶进行消化，需要消化较长时间才能使细胞离散，而胰蛋白酶长时间作用于细胞，对细胞损伤较大，造成HERS细胞难以培养、扩增、不易诱导及传代效果差等不足，因而为了便于探究牙根发育的分子机制以及利用HERS细胞构建生物牙根，就必须得到能够稳定传代扩增的HERS细胞。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1(Hertwig`s epithelial root sheath,HERS-H1)和HERS-C2(Hertwig`sepithelial root sheath,HERS-C2)的建立方法及应用，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCC NO.C2017249，保藏日期是2017年11月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心；所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCC NO.C2017250，保藏日期是2017年11月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心；建立了SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2，并用该细胞系实现了牙骨质再生，为研究牙根发育的分子机制以及构建生物牙根提供了物质基础。
解决以上技术问题的本发明中的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2，其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCCNO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCC NO.C2017250。
本发明中SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，包括如下步骤：
(1)获取大鼠原代HERS细胞；
(2)编码SV40LT慢病毒转染原代细胞；
(3)制备单细胞悬液及克隆扩增培养即得。
所述步骤(1)中采用混合酶消化法进行赫特维希上皮根鞘细胞的原代培养；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型胶原酶，1-2.5U/mL分散酶和300-800U/mLⅠ型胶原酶的比例为1-1.2：1。
本发明中构建方法的优化方案中还包括以下步骤：
(1)编码SV40LT慢病毒转染原代细胞，进行传代培养；
(2)用含嘌呤霉素的培养基筛选转染阳性的细胞；
(3)阳性转染的单细胞克隆扩增后传代培养至50代或以上，获得HERS-H1和HERS-C2细胞系；
(3)对HERS-H1和HERS-C2细胞系进行表面标记蛋白的免疫荧光检测；
(4)诱导液诱导其上皮间充质转化或成骨分化。
所述步骤(1)中当原代HERS细胞形成集落时用胰蛋白酶消化去除间充质细胞以纯化HERS细胞，纯化后的HERS细胞进行传代培养；当传代的细胞密度达到70％时更换为含编码SV40LT慢病毒的上皮培养基进行培养，慢病毒在培养基中浓度5×105TU/ml。
所述慢病毒中编码SV40LT的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述上皮培养基为在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比胎牛血清和1％体积比的上皮细胞生长因子的培养基，基础培养基为DMEM/F12。
所述上皮细胞生长因子为上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、胰岛素等因子或美国Sciencell公司提供的上皮培养基中的上皮细胞生长因子。
所述嘌呤霉素浓度为1-5μg/ml。
所述诱导液为成骨诱导液或含TGFβ1的成骨诱导液，其中成骨诱导液中包括以下重量的组份：10-8M地塞米松，50μg/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠，3mM CaCl2，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素；所述TGFβ1浓度为2-15ng/ml。
所述免疫荧光检测中将E-cadherin,Vimentin,CK14作为HERS细胞鉴定标记物。
所述扩增引物组及序列如下：
Figure BDA0001483622970000031
所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2在构建生物牙根中的应用。
所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2在构建完整牙胚中的应用。
细胞系HERS-H1及HERS-C2可以发生上皮间充质转化及可以分化为具有形成矿化组织能力的成牙骨质细胞,也可以分化为具有形成牙周膜纤维能力的成纤维细胞及诱导牙乳头细胞分化形成牙本质。
本发明中SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，具体步骤如下：
(1)采用混合酶消化法进行赫特维希上皮根鞘细胞的原代培养；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型胶原酶:
选择出生后6-10天的SD大鼠乳鼠，麻醉后经2道75％乙醇消毒，分离上颌骨和下颌骨，剥离下颌第一磨牙完整牙胚，沿牙冠钙化边缘切下约1mm牙颈部组织，PBS冲洗后剪碎至乳糜状；
用混合酶(胶原酶和Dispase酶混合)消化液对组织进行消化，置于37℃水浴锅中消化30分钟，每隔10分钟摇晃一次；用含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，PBS缓冲液洗涤，离心，去上清；再用培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养；第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块，视细胞生长情况进行适当换液。
(2)当上皮细胞形成集落时用胰蛋白酶消化去除间充质细胞以纯化HERS细胞，细胞密度达到约70-90％的时候进行传代培养：
弃培养液，用1×PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化3-6分钟；PBS洗去间充质细胞，重复2-4次；重新加胰酶，37℃放置5-10分钟；吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打、离心、弃上清，加入适量培养液吹打散；将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述大鼠赫特维希上皮根鞘原代细胞
(3)当传代细胞密度达到70％时更换为含编码SV40LT慢病毒的上皮培养基；
(4)用含嘌呤霉素的上皮培养基筛选转染阳性的HERS细胞；
(5)有限稀释法获得单细胞克隆，将获得的单细胞克隆扩增传代；
(6)获得两株能稳定传代至少50代的单细胞克隆，命名为HERS-H1和HERS-C2；
(7)HERS-H1和HERS-C2经免疫荧光检测，表明细胞既表达上皮细胞标志性蛋白CK14、E-cadherin，又表达间充质细胞标志性蛋白Vimentin；
(8)HERS-H1和HERS-C2经TGFβ1诱导，上皮间充质转化相关标志性基因mRNA水平上调，表明HERS-H1和HERS-C2可以发生上皮间充质转化；HERS-H1和HERS-C2在成骨诱导液及含TGFβ1的成骨诱导液作用下，成牙骨质细胞标志性基因mRNA水平上调，茜素红染色阳性，表明HERS-H1和HERS-C2有向成牙骨质细胞向分化的潜能，并且TGFβ1能促进细胞的分化。
本发明建立了SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2，保存了原代赫特维希上皮根鞘细胞的特性，并且可以传代至至少50代，增殖速率较原代细胞大为提高。且细胞系HERS-H1及HERS-C2可以诱导牙乳头细胞分化生成牙本质，HERS-C2可以分化形成牙周组织，实现了牙骨质再生，为研究牙根发育的分子机制以及构建生物牙根提供了物质基础。建立方法操作简单，重复性高。
附图说明
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
图1为本发明中HERS-H1和HERS-C2细胞的形态图
图2为本发明中免疫荧光检测HERS原代细胞和HERS-H1、HERS-C2细胞的E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达情况图
图3为本发明中HERS-H1和HERS-C2细胞的细胞生长曲线图
图4为本发明中TGFβ1作用7天后HERS-H1和HERS-C2细胞的形态改变
图5-图10为本发明中TGFβ1作用3天和7天后HERS-C2细胞上皮间充质转化相关标志性基因mRNA的改变图
图11-图16为本发明中TGFβ1作用3天和7天后HERS-H1细胞上皮间充质转化相关标志性基因mRNA的改变图
图17-图19为本发明中成骨诱导液及含TGFβ1的成骨诱导液作用3天和7天后原代HERS细胞向成牙骨质细胞分化相关标志性基因mRNA的改变
图20-图22为本发明中成骨诱导液及含TGFβ1的成骨诱导液作用3天和7天后HERS-C2细胞向成牙骨质细胞分化相关标志性基因mRNA的改变
图23-图25为本发明中成骨诱导液及含TGFβ1的成骨诱导液作用3天和7天后HERS-H1细胞向成牙骨质细胞分化相关标志性基因mRNA的改变
图26为本发明中成骨诱导液及含TGFβ1的成骨诱导液作用21天后HERS-H1和HERS-C2细胞茜素红染色显示钙化结节的形成
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细的说明：
实施例1
大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的构建，本发明中赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCC NO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCC NO.C2017250：
(1)原代细胞的培养
选择10只出生后6-10天的SD大鼠乳鼠，麻醉后经2道75％乙醇消毒，分离上颌骨和下颌骨，剥离下颌第一磨牙完整牙胚，沿牙冠钙化边缘切下约1mm牙颈部组织，PBS冲洗后剪碎至乳糜状；
用含1-2.5U/mL的分散酶、300U-800U/mL I型胶原酶的混合酶消化液共同消化组织，37℃水浴锅中消化30-100分钟，每隔10分钟摇晃一次；用含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，用含双抗的PBS洗涤，1000rpm离心5min，去上清；再用上皮培养基重悬细胞和仍未消化组织，置于6cm(φ)培养皿中于37℃、5％CO2条件下培养；培养1天后，补充适量培养液至稍稍浸没组织块或更换新鲜上皮培养基2mL继续培养，以后为隔天换液。
培养3-7天后，当上皮细胞达到复层生长的时候，用0.25％胰蛋白酶差别消化细胞，消化2-8分钟后可使成纤维细胞从混合细胞中脱落，PBS洗去消化下来的间充质细胞，重复2-4次。纯化后的细胞继续用胰酶于37℃消化5-10分钟；用含10％FBS的DMEM培养基终止消化，将上皮细胞从皿底吹打下来，置于离心管中，用含双抗的PBS洗涤、1000rpm离心5min；去上清，用上皮培养基重悬细胞，按照3-5×104个/cm2细胞密度接种于6cm(φ)培养皿，得到所述大鼠赫特维希上皮根鞘原代细胞。
上皮培养基为在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比胎牛血清和1％体积比的上皮细胞生长因子的培养基，基础培养基为DMEM/F12。
当HERS上皮细胞形成集落时用胰蛋白酶消化去除间充质细胞以纯化HERS细胞，细胞密度为70-90％时进行传代培养；当传代细胞密度达到70％时更换为含编码SV40LT慢病毒的上皮培养基进行培养。
(2)编码SV40LT慢病毒转染原代细胞
将3×105个HERS的P1代细胞接种至6孔板的每个孔中，放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。待细胞达到70％的融合率时，弃掉孔中的培养基每孔中加入含1.5μl编码SV40LT慢病毒的上皮培养基1ml。8小时后，弃掉上清及未感染细胞的病毒。使用PBS缓冲液反复洗涤，加入2ml新的上皮培养基。转染48小时后换为含3μg/ml的嘌呤霉素筛选转染阳性的细胞。慢病毒在培养基中浓度为5×105TU/ml。
(3)获得单细胞悬液并单细胞克隆
取处于对数生长期的慢病毒转染阳性的细胞，使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，将消化后的细胞重悬于上皮培养基中，然后将细胞充分吹散并制备成单细胞悬液。细胞计数后调整细胞浓度，获得细胞浓度为10个/ml。使用精密移液器将100μl上述细胞悬液接种至96孔培养板中，放置于细胞培养箱，37℃、5％二氧化碳条件下培养。待细胞贴壁后在倒置显微镜下观察，舍去没有细胞或多于1个细胞的孔，选择并标记只含有单个细胞的孔，然后继续培养。每两天更换一次上皮培养基，每次加入培养基约200μl。待孔中的细胞扩增至占培养孔底面积约1/2～2/3时，使用0.25％的胰蛋白酶消化细胞并转移至24孔板中继续培养，待24孔板中细胞密度达80％后，继续转移至6孔板—25cm2培养瓶—75cm2培养瓶中继续培养扩增,两株细胞形态见图1。
实施例2
细胞系的鉴定：
步骤一 免疫荧光检测
将HERS-H1、HERS-C2细胞接种于共聚焦显微镜专用培养皿中，待细胞生长至细胞密度约50％时，以4％多聚甲醛固定细胞，免疫荧光染色对两株细胞系进行鉴定。
免疫荧光染色步骤为：
a.细胞经4％多聚甲醛固定30min，用PBS洗涤3次；
b.加入0.1％TritionX-100室温作用15min，PBS洗3次；
c.加入山羊血清37℃作用30min；
d.加入一抗，4℃过夜；
e.复温10min，PBS洗3次，每次作用5min，加入荧光二抗，37℃作用2h；
f.PBS洗3次，DAPI染细胞核5min；
g.PBS洗3次，共聚焦显微镜下观察。
免疫荧光检测所使用的一抗主要有：CK14，E-cadherin，Vimentin。免疫荧光染色结果分别如图2所示，结果显示：HERS原代细胞与HERS-H1、HERS-C2细胞均表达上皮细胞标志性蛋白CK14和E-cadherin以及间充质细胞标志性蛋白Vimentin。
实施例3
细胞的生物学特性：
步骤一 HERS-H1和HERS-C2细胞的细胞生长曲线
取生长状态良好的P1代HERS原代细胞以及HERS-H1和HERS-C2的P5代细胞接种于96孔板内，接种细胞密度为1×105个/孔，每组3个重复，置细胞培养箱中培养，每2天换液一次。每天每组细胞分别取三个孔，弃培养液，加入含有10μl的CCK-8的新鲜培养液110μl，避光孵育2小时。取上清液，酶标仪测定450nm处各孔吸光值(optical density,OD值)。连续检测7天，绘制生长曲线，如图3。
实施例4
细胞的生物学功能鉴定：
步骤一 TGFβ1诱导细胞发生上皮间充质转化
a.取对数生长期的HERS-H1和HERS-C2细胞，接种至12孔板，待细胞生长至50％融合率时，换为含10ng/ml TGFβ1的培养基，分别培养3天和7天，倒置相差显微镜观察细胞的形态变化及拍照。倒置相差显微镜下观察，对照组呈正常上皮细胞形态，细胞排列规律呈方形或多边形，具有典型的上皮细胞铺路石样形态特征。TGFβ1干预组加入含TGFβ110ng/ml培养基培养7天，可见HERS-H1和HERS-C2细胞失去典型的铺路石样形态，细胞拉长变形为具有成纤维细胞的梭形外观，如图4。
b.提取细胞RNA
1)各组细胞以PBS清洗3次，在每个孔中分别加入0.5ml RNAiso Plus裂解液，水平静置片刻；
2)转移混合液于1.5ml离心管内，反复吹打至匀浆状态，于室温下静置5min；
3)向匀浆裂解液中加入氯仿0.1ml，于振荡器剧烈振荡15s，充分乳化匀浆裂解液，无分相现象后，静置5min；
4)12000g，4℃，离心15min；
5)离心后可见分为三层：无色上清、中间白色蛋白层及带紫色的下层有机相。RNase-free枪头吸取无色上清液，转移至新的RNase-free的EP管中；
6)吸取等体积异丙醇溶液加入上清液中，混匀，静置15min；
7)12000g，4℃离心20min。离心后注意观察，可见管底白色沉淀物，即为提取的总RNA；
8)清洗RNA：吸去上清，沿EP管壁缓慢地加入RNase-free水配制的75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤EP管；4℃，12000g，离心5min后小心弃去乙醇，室温干燥10min；
9)溶解RNA：移液枪加入10μL RNase-free水，轻轻吹打溶解沉淀；
10)获得的RNA溶液在紫外分光光度计下检测A260/A280，其比值在1.8-2.2之间为合格RNA，于-80℃保存，备用。
c.逆转录反应(Reverse transcription,RT)
1)RT反应配方：反转录按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit说明书进行：冰浴条件下，在PCR管内依次加入下列预混液：8μl 5×Reaction Buffer、4μl 10mM dNTP Mix、2μl Oligo(dT)18Primer、2μl RiboLock RNaseInhibitor(20u/μl)、2μl RevertdAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μ
L)、4μl提取的RNA，混匀后瞬时离心，放入梯度PCR仪反应。
2)反应条件：42℃，60分钟；70℃，5分钟。
3)逆转录的cDNA产物于-20℃保存备用。
d.实时荧光定量PCR
1)反应配方：本实验步骤按照TaKaRa试剂盒操作说明进行，采用10ul反应体系，冰浴条件下在PCR管内各加入预混溶液：5μl
Figure BDA0001483622970000092
Premix Ex TaqTMⅡ(2x)，0.5μl，10μM前引物；0.5μl，10μM后引物；1.0μl DNA模板；3μl ddH2O至总体积为10μl。将混有上述反应液的震荡混匀，瞬时离心。本实验所涉及的引物序列均由生工生物公司设计合成，各引物序列见表1。
表1 引物序列
Figure BDA0001483622970000091
PCR反应条件如下：
先95℃反转录30s,再95℃反应15s,然后40个循环的60℃变性34s，熔点曲线中退火95℃、20s，60℃延伸15s，最后95℃、15s。
Figure BDA0001483622970000101
数据采Eco Real-time PCR system配套的分析模板，以2-ΔΔct计算分析待测基因的相对表达量，各个基因表达水平见图5-图16。
步骤二：成骨诱导液诱导成骨
将大约1×105个细胞植入6孔板每个中，将孔板置于温度为37℃、5％CO2浓度的细胞孵箱中培养，待细胞生长至对数期时取出，弃去原培养液，使用PBS缓冲液漂洗3遍后加入成骨诱导液以及含10ng/ml TGFβ1的成骨诱导液继续培养3天和7天，提取细胞RNA，检测成牙骨质细胞标志性分子BSP，DMP1，Col1a1的表达，结果如图17-图25，可见HERS-H1和HERS-C2在成骨诱导液作用下有向成牙骨质细胞向分化的潜能，TGFβ1能促进这种分化趋势。
成骨诱导液或含TGFβ1的成骨诱导液，其中成骨诱导液中包括以下重量的组份：10-8M地塞米松，50μg/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠，3mM CaCl2，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素；所述TGFβ1浓度为2-15ng/ml。
21天时镜下观察钙结节是否形成。待有大量钙结节形成时，弃去成骨诱导液，使用PBS漂洗3遍，将剩余成骨诱导液清洗干净。然后使用4％多聚甲醛固定30分钟，PBS漂洗去除残留多聚甲醛。将预先配置好的茜素红工作液加入孔板中，在室温下或37℃下染色30分钟，然后使用双蒸水清洗3次，最后保留适量双蒸水于显微镜下观察并采图，结果如图26。可见在成骨诱导液作用下HERS-H1和HERS-C2具有产生钙化结节的能力，并且TGFβ1能促进钙化结节的产生。
Figure BDA0001483622970000111
Figure BDA0001483622970000121
Figure BDA0001483622970000131
Figure BDA0001483622970000141
Figure BDA0001483622970000151
Figure BDA0001483622970000161
Figure BDA0001483622970000171
Figure BDA0001483622970000181
Figure BDA0001483622970000191
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2及建立方法及应用
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 慢病毒中编码SV40LT序列
<400> 1
　　atggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaa 2157
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> E-cadherin
<400> 2
tcctgctcctactgtttctacgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> E-cadherin
<400> 3
tcttcttctccacctccctcttc 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Vimentin
<400> 4
ccctgaacctgagagaaactaacc 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Vimentin
<400> 5
gtcatcgtggtgctgagaagtc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> N-cadherin
<400> 6
atgctgaccactctcactgctc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> N-cadherin
<400> 7
acatttggcgactctctgtcc 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Twist1
<400> 8
accctcacacctctgcattc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Twist1
<400> 9
cagtttgatcccagcgtttt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Snail1
<400> 10
gaggacagtggcaaaagctc 20
<210> 11
<211>
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Snail1
<400> 11
TCGGATGTGCATCTTCAGAG
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Zeb1
<400> 12
aggcaaatggttgaaactgg 20
<210> 13
<211>
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Zeb1
<400> 13
TGCATCTGGTGTTCCATTGT
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Bsp
<400> 14
gaaagagcagcacggttgagta 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Bsp
<400> 15
cgtcctcataagctcggtaagtg 23
<210> 16
<211>
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Dmp1
<400> 16
CCGATAAGGAGGAGGATGAAGA
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Dmp1
<400> 17
actggactgtgtggtgtctgc 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Col1a1
<400> 18
tctgactggaagagcggagag 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> Col1a1
<400> 19
gagtggggaacacacaggtct 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> GAPDH
<400> 20
tatgactctacccacggcaag 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> GAPDH
<400> 21
tactcagcaccagcatcacc 20

Claims (9)

1.SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1(Hertwig`s epithelial root sheath,HERS-H1)和HERS-C2(Hertwig`s epithelial root sheath,HERS-C2)，其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCC NO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCC NO.C2017250；细胞系HERS-H1及HERS-C2保存了原代赫特维希上皮根鞘细胞的特性，并且传代至至少50代，增殖速率较原代细胞提高。
2.根据权利要求1所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获取大鼠原代HERS细胞；其中采用混合酶消化法进行赫特维希上皮根鞘细胞的原代培养；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型胶原酶，分散酶和Ⅰ型胶原酶的比例为1-1.2：1
(2)编码SV40LT慢病毒转染原代细胞，进行传代培养；
(3)制备单细胞悬液及克隆扩增培养，用含嘌呤霉素的培养基筛选转染阳性的细胞；阳性转染的单细胞克隆扩增后传代培养至50代或以上，获得HERS-H1和HERS-C2细胞系；
(4)对HERS-H1和HERS-C2细胞系进行表面标记蛋白的免疫荧光检测；
(5)诱导液诱导其上皮间充质转化或成骨分化。
3.根据权利要求2所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中当原代HERS细胞形成集落时用胰蛋白酶消化去除间充质细胞以纯化HERS细胞，纯化后的HERS细胞进行传代培养；当传代的细胞密度达到70％时更换为含编码SV40LT慢病毒的上皮培养基进行培养，慢病毒在培养基中浓度5×105TU/ml。
4.根据权利要求3所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述慢病毒中编码SV40LT的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求3所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述上皮培养基为在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比胎牛血清和1％体积比的上皮细胞生长因子的培养基，基础培养基为DMEM/F12。
6.根据权利要求2所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述免疫荧光检测中将E-cadherin,Vimentin,CK14作为HERS细胞鉴定标记物。
7.根据权利要求2所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述嘌呤霉素浓度为1-5μg/ml；所述诱导液为成骨诱导液或含TGFβ1的成骨诱导液，其中成骨诱导液中包括以下重量的组份：地塞米松10-8M，维生素C 50μg/ml，β-甘油磷酸钠10mM，CaCl2 3mM，青霉素100U/mL和链霉素100U/mL；所述加入诱导液中TGFβ1浓度为2-15ng/ml。
8.根据权利要求2所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述制备过程中还包括使用引物组，通过实时荧光定量PCR扩增鉴定HERS表型相关基因，其扩增引物组及序列如下：
Figure FDA0002844464230000021
9.根据权利要求1所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2在构建生物牙根中的应用，或在构建完整牙胚中的应用。
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