发明内容
本发明的目的之一是从自然界筛选出具有好氧反硝化效能的菌株,为污水生物脱氮工艺的生物强化提供高效的菌制剂,对氮等污染物进行生物处理。
本发明的另一目的在于提供嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17在水处理中的应用效能。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:一株好氧反硝化细菌,其特征属于属嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),已在中国微生物菌种保藏中心保藏,保藏日期为2017年5月27号,保藏编号为CGMCC No.14206。
本发明所提供的好氧反硝化细菌Aeromonas hydrophila ZJ-17,其特征在于经鉴定为革兰氏阴性杆菌,专性需氧菌,生长温度范围25-42℃,最适生长温度为25-30℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长,菌体长度为1.5-2.0 μm,宽度为1-1.5 μm,呈球杆状或线状,成对或短链状排列,菌体一端有单鞭毛,无芽孢。
好氧反硝化菌培养基配制如下:丁二酸钠,4.7g/L;Na2HPO4·7H2O, 7.9g/L;MgSO4·7H2O, 0.1g/L; KNO3, 1. 5g/L; NH4C1,0. 3g/L; KH2PO4, 1. 5g/L,微量元素,2mL/L。
其中微量元素为:EDTA, 50g/L ;ZnSO4, 2.2g/L ;CaCl2, 5.5g/L ;MnCl2·4H2O,
5.06g/L ;FeSO4·7H2O, 5.0g/L ;(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1 g; L;CuSO4·5H2O,1.57g/L;
CoCl2·6H2O, 1.61g/L。
处理方法为:挑取ZJ-17菌落,富集24小时后,以每1L水样接种100ml菌液的比例接种至含氮培养基中,培养时间为24小时。
本发明所提供的好氧反硝化菌株的可用在含氮废水处理中的脱氮效能应用。
本发明所提供的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17的基因具有较高的好氧反硝化性能。在适当条件下,硝氮去除率高达100%,这些特点在水处理领域具有重大意义。
具体实施方式
本发明中Aeromonas hydrophila ZJ-17是通过以下步骤获得:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17的分离和纯化。SBR反应器采取先间歇曝气后连续曝气运行方式,取运行稳定时某周期好氧段末的活性污泥作为分离用泥。采用稀释混合平板法进行分离。使用反硝化培养基进行分离。
对己分离出来的菌株在好氧条件下在反硝化培养基中进行脱氮试验。同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)检验。对于硝酸还原性为阳性并产气,并在好氧条件下能降低TN浓度的细菌即为好氧反硝化菌种属。
具体试验如下:将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17按照具体实施方法进行活化,富集培养。富集培养完成后移取10ml悬浊液至含有100 ml不含琼脂的好氧反硝化培养基的250 ml锥形瓶中,在30℃,160 rpm条件下培养24h。培养完成后再离心(10000rpm,5 min),取上清液测定氨氮、硝态氮、亚硝氮及TN的含量。结果如表1。硝酸盐还原产气试验:取各斜面菌种,接种在带杜氏小管的硝酸盐还原培养基(牛肉膏,3 g/L;蛋白陈,5 g/L;KNO3,1 g/L;pH,7.4;121℃高压蒸汽灭菌20 min)中,每个菌株作2个平行试验,同时另外留2管不接种做对照。30℃恒温培养,分别在1天、3天、5天后检测结果:检查杜氏小管内是否产气,如有气泡表明有氮气产生;在比色瓷盘中加入少量培养液,滴入1-2滴格里斯试剂A液(对氨基苯磺酸,0.5g;10%左右稀醋酸,150ml)和B液(a-苯胺,0.1g;10%左右稀醋酸,150ml;H2O,20ml)。在对照管中同样加入A液和B液各1-2滴。若溶液变为红色,橙色,或棕色等,表示有亚硝酸盐存在,为硝酸盐还原阳性;如无红色出现则可加入1-2滴二苯胺试剂(0.5g二苯胺溶于100ml浓H2SO4,并加20ml蒸馏水稀释,存于棕色瓶中),如不呈蓝色反应,则仍为阳性反应。若呈蓝色反应,则为阴性反应。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17的生理生化分析:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17的生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版操作,鉴定结果为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17为非发酵革兰氏阴性菌,专性需氧菌,生长温度范围25-42℃,最适生长温度为25-30℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长。原子力显微镜观察显示该菌体长度为1.5-2.0μm,宽度为1-1.5μm,呈球杆状或线状,成对或短链状排列,菌体一端有单鞭毛,无芽孢。该菌株不需要有机生长因素。营养多样化:单个菌株的生长可利用76-82种或更多的不同有机化合物。对菌株进行革兰氏染色,氧化酶,接触酶,葡萄糖氧化发酵,产吲哚,V.P.测定,M.R.测定,明胶液化,淀粉水解,柠檬酸盐利用,硝酸盐还原等主要生理生化指标试验,结果如表2所示。
本发明嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17能以多种有机物为碳源,可用于污水生物脱氮。对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17生物脱氮能力进行检测:
Aeromonas hydrophila ZJ-17生长曲线测定。按照测定细菌生长曲线的标准方法对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17的生长曲线进行测定,每隔2h取培养液,采用光电比浊法,在660nm波长处测定菌液的OD660(Optical Density),然后经0.22pm微孔滤膜过滤,检测滤液氨氮、亚硝氮、硝氮和 pH值等指标。获得嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZJ-17生长曲线如图3所示。从图3中可以看出,该嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZJ-17的生长曲线比较特殊,潜伏期较长,为4-6h左右,这可能是因为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17接种后的培养基中无氨氮,接入后仅能以硝氮为氮源进行细胞合成。菌株的对数生长期约为8-16h,18h以后开始进入稳定期和衰亡期。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17脱氮效能测定:将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17按照实施方法进行活化,富集培养。富集培养完成后移取10ml悬浊液至含有100ml不含琼脂的好氧反硝化培养基的250ml锥形瓶中,在30℃,160rpm条件下培养24h。每隔2h取培养液,离心(10000rpm,5min),取上清液测定氨氮、硝氮、亚硝氮及TN的含量。从图3和表1中可以看出,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17有良好的好氧反硝化效果。一般来说传统反硝化理论认为,由于溶解氧会与硝酸盐氮竞争电子受体,溶解氧(DO)的存在会对反硝化过程起到抑制作用,从而抑制反硝化的进行。但是,好氧反硝化理论的提出转变了传统观念,其理论认为由于菌体中存在周质硝酸盐还原酶,因此菌株可利用硝态氮和氧气同时作为电子受体进行协同呼吸。综上,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17为高效的好氧反硝化菌。
表1嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17脱氮性能
表2嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ZJ-17生理生化鉴定结果
序列表
<110> 彭昆国
庞长泷
杨林锋
余锦龙
<120> 一株好氧反硝化菌Aeromonas hydrophila ZJ-17及其应用
<141> 2018-01-31
<150> 2017104912838
<151> 2017-06-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 957
<212> DNA
<213> 好氧反硝化菌ZJ-17(Aeromonas hydrophila ZJ-17)
<400> 2
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