CN108033874B - 一种白藜芦醇的生物萃取方法 - Google Patents

一种白藜芦醇的生物萃取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白藜芦醇的生物萃取方法,属于药物成分萃取技术领域。所述的白藜芦醇的生物萃取方法,包括原料处理、微波处理、发酵、酶解、萃取等步骤。本发明白藜芦醇的生物萃取方法步骤少,操作简单,且萃取的白藜芦醇得率和纯度都较高。

Description

一种白藜芦醇的生物萃取方法
技术领域
本发明属于药物成分萃取技术领域,具体涉及一种白藜芦醇的生物萃取方法。
背景技术
白藜芦醇是多酚类化合物,主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质,又称为芪三酚,是肿瘤的化学预防剂,也是对降低血小板聚集,预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂。美国农业部的研究结果表明,花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦醇。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂,可降低血液粘稠度,抑制血小板凝结和血管舒张,保持血液畅通,可预防癌症的发生及发展,具有抗动脉粥样硬化和冠心病,缺血性心脏病,高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用还具有雌激素样作用,可用于治疗乳腺癌等疾病。
从虎杖中提取白藜芦醇工艺已经有较多的报道,由于虎杖中的白藜芦醇大多以白藜芦醇苷的形式存在,因而现有的白藜芦醇生产工艺一般都是先通过微生物发酵将白藜芦醇苷(又称虎杖苷)转化为白藜芦醇再进行提取,由于微生物转化白藜芦醇的同时也产生了较多的糖类物质,因而物料的粘度增强,提取过程中溶剂的穿透性变差,造成提取率低和提取时间长;提取完白藜芦醇后的纯化大多需要使用三氯甲烷,并且是两次上柱,需要经过白藜芦醇含量为20%和50%的两次中间产品环节,因而产品生产周期长,损耗大,成本高。
中国专利文献“中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法(专利号:ZL201510747682.7)”公开了一种中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法,该方法通过分离前的离心处理、初步萃取、洗脱分离步骤,去除了提取液中的颗粒状杂质以及极性较大的其它化学成分;利用中压氧化铝层析柱进行三次洗脱分离,达到梯度洗脱的效果,去除制得的上清液中依然可能存在的极性较大和中等极性的化学成分,分离出极性相对较小的白藜芦醇成分,再用超临界CO2对白藜芦醇进行精致纯化。该发明具有使用设备少,白藜芦醇产品纯净安全的特点,但是提取的白藜芦醇需要反复结晶才能得到纯度较高的白藜芦醇,存在制备工艺较复杂,且得率不高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种白藜芦醇的生物提取方法,以解决在中国专利文献“中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法(专利号:ZL 201510747682.7)”公开的从虎杖中提取白藜芦醇的方法上,如何优化提取工艺、设置提取参数等,提高白藜芦醇的萃取效率的技术问题。
为了解决以上技术问题,本发明采用以下技术方案:
一种白藜芦醇的生物萃取方法,包括以下步骤:
S1:原料处理:将花生红衣干燥,粉碎成0.35-0.45mm的粉末,然后加入30-50%的水浸润10-20h;
S2:微波处理:将步骤S1处理的花生红衣用微波处理,调节微波功率为780-810w,温度为60-80℃,处理时间为5-10min;
S3:发酵、酶解:将步骤S2处理过的花生红衣加入0.2-0.6%的木霉菌,发酵2天,得到发酵液,再在发酵液中加入5倍量乙酸乙酯溶液,然后添加纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合,酶解8-12h,过滤得酶解液;
S4:萃取:将酶解液添加到乙醇溶液中,再添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚制成的混合溶液,采用超临界CO2流体萃取,调节萃取温度为40-50℃,压强为20-24MPa,提取2-3次,每次10-12min,将制得的白藜芦醇在低温下真空干燥即得成品;所述丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚以(1-2):(0.2-0.5):(0.1-0.4)的重量比混合。
2.优选地,所述步骤S3中纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶以(2-3):(1-2):(0.2-0.6):(0.3-0.5)的重量比混合,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合物的用量为花生红衣的1-3%。
优选地,所述步骤S4中丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚的用量为酶解液的50-80%。
优选地,所述步骤S4中CO2流体的流量为15-20L/h。
本发明具有以下有益效果:
(1)由实施例1-3和对比例5的数据可见,采用实施例1-3的微生物萃取方法萃取白藜芦醇,得到的白藜芦醇得率和纯度都明显提高;同时由实施例1-3的数据可见,实施例2为最优实施例。
(2)由实施例1和对比例1-5的数据可见,步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚,在提取白藜芦醇过程中起到了协同作用,协同提高了白藜芦醇的得率和纯度,这是:
1)木霉菌在发酵过程中能产生小分子的抗生素和大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类,生成几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶来分解植物细胞壁或分泌葡萄糖苷酶等胞外酶,促进细胞壁的破裂,利于白藜芦醇的溶解和扩散;添加的曲化酶能够能将木霉菌发酵生成的葡萄糖催化发酵成乙醇和二氧化碳,降低溶液中的杂质含量,提高纯度,且生成的乙醇能够促进白藜芦醇的溶解,进一步增大白藜芦醇在溶液中的溶解度,提高得率。
2)二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮不仅具有一定增溶作用,同时还能在一定条件下使CO2流体、乙醇和水形成超临界微乳体系,提高乙醇对白藜芦醇的溶解性,从而实现较好的提取效果;二酸二异辛酯磺酸钠的润湿性、渗透性和乳化性能较好,形成低浓度的微乳液临界胶束,增大有效成分的溶解度;脂肪醇聚氧乙烯醚具有促进花生红衣中白藜芦醇、糖类等物质溶解的功能,能与共混的白藜芦醇、糖类之间形成了新的化学键而使白藜芦醇在乙醇溶液中溶解度增大,提高超临界CO2流体萃取的得率。
(3)本发明中步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚作为补强体系,实施例1-3通过在步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚,实现在补强体系中以步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚为主导的微生物萃取方法,利用木霉菌在发酵过程中能产生小分子的抗生素和大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类,利于白藜芦醇的溶解和扩散;添加的曲化酶能够能将木霉菌发酵生成的葡萄糖催化发酵成乙醇和二氧化碳,降低溶液中的杂质含量,提高纯度,且生成的乙醇能够促进白藜芦醇的溶解;二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮不仅具有一定增溶作用,同时还能在一定条件下使CO2流体、乙醇和水形成超临界微乳体系,提高乙醇对白藜芦醇的溶解性;脂肪醇聚氧乙烯醚具有促进花生红衣中白藜芦醇、糖类等物质溶解的功能,能与共混的白藜芦醇、糖类之间形成了新的化学键而使白藜芦醇在乙醇溶液中溶解度增大,从而提高了白藜芦醇的得率;使得补强体系运用到本发明的微生物萃取白藜芦醇中,提高了白藜芦醇的得率和纯度。
具体实施方式
为便于更好地理解本发明,通过以下实例加以说明,这些实例属于本发明的保护范围,但不限制本发明的保护范围。
实施例中,所述白藜芦醇的生物萃取方法,包括以下步骤:
S1:原料处理:将花生红衣干燥,粉碎成0.35-0.45mm的粉末,然后加入30-50%的水浸润10-20h;
S2:微波处理:将步骤S1处理的花生红衣用微波处理,调节微波功率为780-810w,温度为60-80℃,处理时间为5-10min;
3.S3:发酵、酶解:将步骤S2处理过的花生红衣加入0.2-0.6%的木霉菌,发酵2天,得到发酵液,再在发酵液中加入5倍量乙酸乙酯溶液,然后添加纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合,酶解8-12h,过滤得酶解液;所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶以(2-3):(1-2):(0.2-0.6):(0.3-0.5)的重量比混合,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合物的用量为花生红衣的1-3%;
S4:萃取:将酶解液添加到乙醇溶液中,再添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚制成的混合溶液,采用超临界CO2流体萃取,调节萃取温度为40-50℃,压强为20-24MPa,提取2-3次,每次10-12min,将制得的白藜芦醇在低温下真空干燥即得成品;所述丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚以(1-2):(0.2-0.5):(0.1-0.4)的重量比混合,其用量为酶解液的50-80%;所述CO2流体的流量为15-20L/h。
实施例1
一种白藜芦醇的生物萃取方法,包括以下步骤:
S1:原料处理:将花生红衣干燥,粉碎成0.35-0.45mm的粉末,然后加入50%的水浸润15h;
S2:微波处理:将步骤S1处理的花生红衣用微波处理,调节微波功率为800w,温度为60℃,处理时间为10min;
S3:发酵、酶解:将步骤S2处理过的花生红衣加入0.6%的木霉菌,发酵2天,得到发酵液,再在发酵液中加入5倍量乙酸乙酯溶液,然后添加纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合,酶解8h,过滤得酶解液;所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶的重量比为2.5:2:0.2:0.3,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合物的用量为花生红衣的3%;
S4:萃取:将酶解液添加到乙醇溶液中,再添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚制成的混合溶液,采用超临界CO2流体萃取,调节萃取温度为48℃,压强为224MPa,提取3次,每次10min,将制得的白藜芦醇在低温下真空干燥即得成品;所述丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚以2:0.3:0.1的重量比混合,其用量为酶解液的70%;所述CO2流体的流量为18L/h。
实施例2
一种白藜芦醇的生物萃取方法,包括以下步骤:
S1:原料处理:将花生红衣干燥,粉碎成0.35-0.45mm的粉末,然后加入30%的水浸润20h;
S2:微波处理:将步骤S1处理的花生红衣用微波处理,调节微波功率为810w,温度为70℃,处理时间为5min;
S3:发酵、酶解:将步骤S2处理过的花生红衣加入0.2%的木霉菌,发酵2天,得到发酵液,再在发酵液中加入5倍量乙酸乙酯溶液,然后添加纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合,酶解10h,过滤得酶解液;所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶的重量比为3:1:0.6:0.5,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合物的用量为花生红衣的1%;
S4:萃取:将酶解液添加到乙醇溶液中,再添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚制成的混合溶液,采用超临界CO2流体萃取,调节萃取温度为50℃,压强为24MPa,提取3次,每次11min,将制得的白藜芦醇在低温下真空干燥即得成品;所述丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚以1:0.5:0.3的重量比混合,其用量为酶解液的80%;所述CO2流体的流量为20L/h。
实施例3
一种白藜芦醇的生物萃取方法,包括以下步骤:
S1:原料处理:将花生红衣干燥,粉碎成0.35-0.45mm的粉末,然后加入40%的水浸润10h;
S2:微波处理:将步骤S1处理的花生红衣用微波处理,调节微波功率为780w,温度为80℃,处理时间为8min;
S3:发酵、酶解:将步骤S2处理过的花生红衣加入0.4%的木霉菌,发酵2天,得到发酵液,再在发酵液中加入5倍量乙酸乙酯溶液,然后添加纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合,酶解12h,过滤得酶解液;所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶的重量比为2:1.5:0.4:0.4,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合物的用量为花生红衣的2%;
S4:萃取:将酶解液添加到乙醇溶液中,再添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚制成的混合溶液,采用超临界CO2流体萃取,调节萃取温度为40℃,压强为20MPa,提取2次,每次12min,将制得的白藜芦醇在低温下真空干燥即得成品;所述丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚以1.5:0.2:0.4的重量比混合,其用量为酶解液的50%;所述CO2流体的流量为15L/h。
对比例1
与实施例2的白藜芦醇生物萃取方法基本相同,唯有不同的是生物萃取方法步骤S3中不添加木霉菌发酵、不添加曲化酶,步骤S4中不添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚。
对比例2
与实施例2的白藜芦醇生物萃取方法基本相同,唯有不同的是生物萃取方法步骤S3中不添加木霉菌发酵。
对比例3
与实施例2的白藜芦醇生物萃取方法基本相同,唯有不同的是生物萃取方法步骤S3中不添加曲化酶。
对比例4
与实施例2的白藜芦醇生物萃取方法基本相同,唯有不同的是生物萃取方法步骤S3中不添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚。
对比例5
采用中国专利文献“中药虎杖提取液中分离纯化白藜芦醇的方法(专利号:ZL201510747682.7)”中实施例2-4中的工艺提取白藜芦醇。
按照实施例1-3和对比例1-5所述的萃取方法萃取白藜芦醇,对白藜芦醇的得率和纯度进行检测,结果如下表所示:
实验组别 得率(%) 纯度(%)
实施例1 1.54 99.23
实施例2 1.62 99.32
实施例3 1.57 99.34
对比例1 0.71 97.24
对比例2 1.47 98.88
对比例3 1.46 98.94
对比例4 1.44 98.86
对比例5 0.42-0.54 95.03-97.96
由上表可知:(1)由实施例1-3和对比例5的数据可见,采用实施例1-3的微生物萃取方法萃取白藜芦醇,得到的白藜芦醇得率和纯度都明显提高;同时由实施例1-3的数据可见,实施例2为最优实施例。
(2)由实施例1和对比例1-5的数据可见,步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚,在提取白藜芦醇过程中起到了协同作用,协同提高了白藜芦醇的得率和纯度,这是:
1)木霉菌在发酵过程中能产生小分子的抗生素和大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类,生成几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶来分解植物细胞壁或分泌葡萄糖苷酶等胞外酶,促进细胞壁的破裂,利于白藜芦醇的溶解和扩散;添加的曲化酶能够能将木霉菌发酵生成的葡萄糖催化发酵成乙醇和二氧化碳,降低溶液中的杂质含量,提高纯度,且生成的乙醇能够促进白藜芦醇的溶解,进一步增大白藜芦醇在溶液中的溶解度,提高得率。
2)二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮不仅具有一定增溶作用,同时还能在一定条件下使CO2流体、乙醇和水形成超临界微乳体系,提高乙醇对白藜芦醇的溶解性,从而实现较好的提取效果;二酸二异辛酯磺酸钠的润湿性、渗透性和乳化性能较好,形成低浓度的微乳液临界胶束,增大有效成分的溶解度;脂肪醇聚氧乙烯醚具有促进花生红衣中白藜芦醇、糖类等物质溶解的功能,能与共混的白藜芦醇、糖类之间形成了新的化学键而使白藜芦醇在乙醇溶液中溶解度增大,提高超临界CO2流体萃取的得率。
(3)本发明中步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚作为补强体系,实施例1-3通过在步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚,实现在补强体系中以步骤S3中添加木霉菌发酵、添加曲化酶进行酶解,步骤S4中添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚为主导的微生物萃取方法,利用木霉菌在发酵过程中能产生小分子的抗生素和大分子的抗菌蛋白或细胞壁降解酶类,利于白藜芦醇的溶解和扩散;添加的曲化酶能够能将木霉菌发酵生成的葡萄糖催化发酵成乙醇和二氧化碳,降低溶液中的杂质含量,提高纯度,且生成的乙醇能够促进白藜芦醇的溶解;二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮不仅具有一定增溶作用,同时还能在一定条件下使CO2流体、乙醇和水形成超临界微乳体系,提高乙醇对白藜芦醇的溶解性;脂肪醇聚氧乙烯醚具有促进花生红衣中白藜芦醇、糖类等物质溶解的功能,能与共混的白藜芦醇、糖类之间形成了新的化学键而使白藜芦醇在乙醇溶液中溶解度增大,从而提高了白藜芦醇的得率;使得补强体系运用到本发明的微生物萃取白藜芦醇中,提高了白藜芦醇的得率和纯度。
以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明,对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (3)

1.一种白藜芦醇的生物萃取方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:原料处理:将花生红衣干燥,粉碎成0.35-0.45mm的粉末,然后加入30-50%的水浸润10-20h;
S2:微波处理:将步骤S1处理的花生红衣用微波处理,调节微波功率为780-810w,温度为60-80℃,处理时间为5-10min;
S3:发酵、酶解:将步骤S2处理过的花生红衣加入0.2-0.6%的木霉菌,发酵2天,得到发酵液,再在发酵液中加入5倍量乙酸乙酯溶液,然后添加纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合,酶解8-12h,过滤得酶解液,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶以(2-3):(1-2):(0.2-0.6):(0.3-0.5)的重量比混合,所述纤维素酶、β-葡聚糖苷酶、糖化酶、曲化酶混合物的用量为花生红衣的1-3%;
S4:萃取:将酶解液添加到乙醇溶液中,再添加丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚制成的混合溶液,采用超临界CO2流体萃取,调节萃取温度为40-50℃,压强为20-24MPa,提取2-3次,每次10-12min,将制得的白藜芦醇在低温下真空干燥即得成品;所述丁二酸二异辛酯 磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚以(1-2):(0.2-0.5):(0.1-0.4)的重量比混合。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇的生物萃取方法,其特征在于,所述步骤S4中丁二酸二异辛酯磺酸钠、聚维酮、脂肪醇聚氧乙烯醚的用量为酶解液的50-80%。
3.根据权利要求1所述的白藜芦醇的生物萃取方法,其特征在于,所述步骤S4中CO2流体的流量为15-20L/h。
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