CN108024951A - 环孢菌素a/环糊精纳米颗粒的形成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及形成环孢菌素/环糊精络合物纳米颗粒和微米颗粒的方法，以适用于引起或增强泪液形成的水性滴眼剂的形式向人或动物的眼睛施用所形成的纳米悬浮液和微米悬浮液的方法以及用于治疗眼睛和周围区域的疾病的方法。水性滴眼剂组合物含有环孢菌素和α‑环糊精与γ‑环糊精的混合物以及一种或多种稳定化聚合物。α‑环糊精溶解环孢菌素，而γ‑环糊精促进环孢菌素/环糊精络合物聚集体的形成。聚合物稳定水性纳米悬浮液和微米悬浮液。

Description

环孢菌素A/环糊精纳米颗粒的形成
背景技术
本发明涉及新的水性滴眼剂组合物，其中活性成分是环孢菌素A(cyclosporinA)。
由于滴眼剂相比于其他眼科药物施用途径如玻璃体腔内注射和植入的方便性和安全性，局部施用滴眼剂是优选的递送至眼睛的药物施用方式(Le Bourlais,C.,Acar,L.,Zia,H.,Sado,P.A.,Needham,T.,Leverge,R.,1998.Ophthalmic drug deliverysystems—Recent advances.Progress in Retinal and Eye Research 17,33-58)。药物主要通过被动扩散从眼睛表面运输到眼睛和周围组织中，其中，根据菲克定律(Fick’slaw)，该药物通过溶解的药物分子的梯度被驱动进入眼睛中。药物被动扩散到眼睛中受到三种主要障碍的阻碍(Gan,L.,Wang,J.,Jiang,M.,Bartlett,H.,Ouyang,D.,Eperjesi,F.,Liu,J.,Gan,Y.,2013.Recent advances in topical ophthalmic drug delivery withlipid-based nanocarriers.Drug Discov.Today 18,290-297；Loftsson,T.,Sigurdsson,H.H.,Konradsdottir,F.,Gisladottir,S.,Jansook,P.,Stefansson,E.,2008.Topicaldrug delivery to the posterior segment of the eye:anatomical andphysiological considerations.Pharmazie 63,171-179；Urtti,A.,2006.Challengesand obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery.Adv.DrugDel.Rev.58,1131-1135)。
首先是药物的水溶性。只有溶解的药物分子能够扩散到眼睛中，因此药物必须在水性泪液流体中具有足够的溶解度以扩散到眼睛中。通过例如环糊精络合增加溶解性差的药物的溶解度将增加它们的浓度梯度，随后增加其被动扩散进入到眼睛中(Loftsson,T.,T.,1999.Cyclodextrins in ophthalmic drug delivery.Advanced DrugDelivery Reviews 36,59-79)。
第二个障碍是泪液流体的快速更新速率(turnover rate)以及随之而来的溶解的药物分子的浓度降低。在将滴眼剂(25-50μl)滴到眼睛的角膜前区域之后，较大部分的药物溶液从眼睛表面被快速地排出，泪液体积回到正常驻留体积，即约7μl。此后，泪液体积保持不变，但药物浓度由于泪液更新引起的稀释以及角膜和非角膜吸收而降低。在人体中从表面区域排出滴眼剂的一级速率常数值通常为约1.5min-1。人体中正常的泪液更新为约1.2μl/min，局部施加的药物的角膜前半衰期为1至3分钟(Sugrue,M.F.,1989.Thepharmacology of antiglaucoma drugs.Pharmacology&Therapeutics 43,91-138)。局部施加的药物的角膜前半衰期需要通过例如形成小的药物/环糊精微米颗粒来提高以增强其生物利用度(Johannesson,G.,Moya-Ortega,M.D.,Asgrimsdottir,G.M.,Lund,S.H.,Thorsteinsdottir,M.,Loftsson,T.,Stefansson,E.,2014.Kinetics ofγ-cyclodextrinnanoparticle suspension eye drops in tear fluid.Acta Ophthalmologica 92,550-556；Loftsson,T.,Jansook,P.,Stefansson,E.,2012.Topical drug delivery to theeye:dorzolamide.Acta Ophthalmologica 90,603-608)。
第三个障碍是缓慢的药物渗透通过膜屏障(即角膜和/或结膜/巩膜)。在药物分子能被动地透过膜屏障之前，药物分子必须从水性外部分配到膜中。结果是通常只有很少百分比的施加药物剂量被递送到眼组织中。施用剂量的主要部分(50-100％)将从鼻腔被吸收到全身药物循环中，这能引起各种副作用。
干眼综合征是由泪液产生减少引起的常见眼部病症，其导致不适和视觉障碍。干眼综合征具有多因素病因，包括泪膜不稳定、泪膜渗透压(osmolality)增加和眼表面炎症，并且对眼表面具有潜在的损伤。对于这种疾病，几乎没有可用的治疗方法。
环孢菌素是从真菌中分离出来的一组肽，其中最为知名的是环孢菌素A。存在许多其他天然和半合成的环孢菌素，包括环孢菌素B、C、D、E、F、G和H(Lawen,A.,2015.Biosynthesis of cyclosporins and other natural peptidyl prolyl cis/transisomerase inhibitors.Biochimica et Biophysica Acta1850,2111–2120；Peel,M.,Sctiber,A.,2015.Semi-synthesis of cyclosporins.Biochimica et Biophysica Acta1850,2121–2144)。
环孢菌素A是从两种真菌多孢木霉菌(Trichoderma polysporum)和光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)的发酵液获得的一种环状多肽药物(Laupacis,A.,Keown,P.A.,Ulan,R.A.,McKenzie,N.,Stiller,C.R.,1982.Cyclosporin A:a powerfulimmunosuppressant.Canadian Medical Association Journal 126,1041-1046)。其分子量为1202.6Da，在环境温度下的水溶解度为0.008mg/ml，在21℃下的LogP辛醇/水＝2.92(ElTayar,N.,Mark,A.E.,Vallat,P.,Brunne,R.M.,Testa,B.,Gunsteren,W.F.v.,1993.Solvent-dependent conformation and hydrogen-bonding capacity ofcyclosporin A:evidence from partition coefficients and molecular dynamicssimulations.J.Med.Chem.36,3753-3764；Loftsson,T.,Hreinsdottir,D.,2006.Determination of aqueous solubility by heating and equilibration:Atechnical note.Aaps Pharmscitech 7,文章编号4)。
环孢菌素A具有多种生物活性，包括免疫抑制、抗炎和抗真菌特性，其他环孢菌素具有相似的性质。在眼科学中，环孢菌素A主要被证明可用于患有各种炎症性眼表面病症(包括干眼)的患者，但是其也用于全身给药以治疗眼内炎症性和自身免疫性疾病，例如葡萄膜炎。在2003年，0.05％(w/v)环孢菌素A的基于油的滴眼剂(Alcon,Texas)成为商业上可用的，用于局部治疗干眼综合征(Utine,C.A.,Stern,M.,Akpek,E.K.,2010.Clinical Review:Topical Ophthalmic Use of Cyclosporin A.OcularImmunology&Inflammation 18,352-361)。然而，使用油和表面活性剂来局部递送环孢菌素A，药物生物利用度低，并且可导致视力模糊、烧灼感、瘙痒和结膜刺激。可以通过以水性滴眼剂形式递送环孢菌素A来避免这些副作用。
环孢菌素A的水溶性可通过形成环糊精络合而增加，并且环孢菌素A与眼睛表面的接触时间可通过形成微米颗粒和纳米颗粒而增加。已经报道α-环糊精、甲基化的α-环糊精和甲基化的β-环糊精改善环孢菌素A的水溶性(Miyake,K.,Arima,H.,Irie,T.,Hirayama,F.,Uekama,K.,1999.Enhanced absorption of cyclosporin Aby complexation withdimethyl-beta-cyclodextrin in bile duct-cannulated and-noncannulatedrats.Biological&Pharmaceutical Bulletin 22,66-72)。
环糊精是含有通过α-1,4-糖苷键连接的6个(α-环糊精)、7个(β-环糊精)和8个(γ-环糊精)吡喃葡萄糖单体的环状低聚糖。α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精是由淀粉的微生物降解形成的天然产物。环状环糊精分子的外表面是亲水性的，带有许多羟基，但是它们的中央腔则有些亲脂性(Kurkov,S.V.,Loftsson,T.,2013.Cyclodextrins.Int J Pharm453,167-180；Loftsson,T.,Brewster,M.E.,1996.Pharmaceutical applications ofcyclodextrins.1.Drug solubilization and stabilization.Journal ofPharmaceutical Sciences 85,1017-1025)。除了这三种天然环糊精外，已经合成并作为药物载体测试了许多水溶性环糊精衍生物，包括环糊精聚合物(Stella,V.J.,He,Q.,2008.Cyclodextrins.Tox.Pathol.36,30-42)。
在水性溶液中，环糊精能够通过将药物分子或更经常地将该分子的某一亲脂性部分纳入到中央腔中而与许多药物形成包结络合物。这一性质已被用于药物配制和药物递送目的。已经综述了药物/环糊精包结络合物的形成、它们对药物理化性质的影响、药物透过生物膜的能力以及环糊精在药物产品中的使用(Loftsson,T.,Brewster,M.E.,2010.Pharmaceutical applications of cyclodextrins:basic science and productdevelopment.Journal of Pharmacy and Pharmacology 62,1607-1621；Loftsson,T.,Brewster,M.E.,2011.Pharmaceutical applications of cyclodextrins:effects ondrug permeation through biological membranes”J.Pharm.Pharmacol.63,1119-1135；Loftsson,T.,T.,1999.Cyclodextrins in ophthalmic drugdelivery.Advanced Drug Delivery Reviews 36,59-79)。
已知环糊精增加蛋白质和肽在水性溶液中的化学和物理稳定性。此外，已知环糊精增加溶解性差的蛋白质和肽类药物的水溶性(J.Horsky and J.Pitha,Inclusioncomplexes of proteins:interaction of cyclodextrins with peptides containingaromatic amino acids studies by competitive spectrophotometry.J.InclusionPhenom.Mol.Recognit.Chem.,18,291-300,1994)。环糊精和环糊精络合物自缔合以形成聚集体(aggregates)，并且已经将药物/环糊精络合物聚集体配制成药物载体(Bonini,M.,Rossi,S.,Karlsson,G.,Almgren,M.,Lo Nostro,P.,Baglioni,P.,2006.Self-assemblyof beta-cyclodextrin in water.Part 1:Cryo-TEM and dynamic and static lightscattering.Langmuir 22,1478-1484；He,Y.,Fu,P.,Shen,X.,Gao,H.,2008.Cyclodextrin-based aggregates and characterization by microscopy.Micron39,495-516；Loftsson,T.,2014.Self-assembled cyclodextrin nanoparticles anddrug delivery.J Incl Phenom Macro 80,1-7；Messner,M.,Kurkov,S.V.,Jansook,P.,Loftsson,T.,2010.Self-assembled cyclodextrin aggregates and nanoparticles.IntJ Pharm 387,199-208)。先前已表明，药物/环糊精聚集体增强局部药物递送至眼睛(Thorsteinn Loftsson和Einar Stefánsson,Cyclodextrin nanotechnology forophthalmic drug delivery,US专利号7,893,040(2011年2月22日)；Thorsteinn Loftsson和Einar Stefánsson,Cyclodextrin nanotechnology for ophthalmic drug delivery,US专利号8,633,172(2014年1月21日)；Thorsteinn Loftsson和Einar Stefánsson,Cyclodextrin nanotechnology for ophthalmic drug delivery,US专利号8,999,953(2015年4月7日))。并非所有药物，尤其不是所有的肽和蛋白质都能够形成在局部施用后具有足以保留在眼睛表面上的尺寸的药物/环糊精聚集体。
现已令人惊讶地发现，尽管α-环糊精是优异的环孢菌素增溶剂，但向水性环孢菌素/α-环糊精溶液添加γ-环糊精促进了含有环孢菌素/环糊精络合物的纳米颗粒和微米颗粒的形成。
发明概述
在第一方面中，本文提供了一种水性眼科组合物，其包含：
(a)眼科有效的环孢菌素；
(b)有效地与所述环孢菌素形成水溶性络合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的环孢菌素/环糊精颗粒，其包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂；
在所述组合物中所述环孢菌素的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中所述α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素部分为不小于约10％。
在第二方面中，本文提供了在有需要的受试者中引起或诱导或增强泪液形成的方法，所述方法包括向所述受试者的眼睛局部施用有效引起或诱导泪液形成的量的如前面段落所定义的组合物。
在第三方面中，本文提供了一种水性眼科组合物，其包含：
(a)眼科有效量的环孢菌素A；
(b)有效地与环孢菌素A形成水溶性络合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素A/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的环孢菌素/环糊精颗粒，其包含所述γ-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂，
在所述组合物中所述环孢菌素A的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中所述α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素A部分为不小于约10％。
在第四方面中，本文提供了一种用于形成环孢菌素(尤其是环孢菌素A)的聚集体的方法，所述方法包括将治疗有效的环孢菌素(尤其是环孢菌素A)任选地与聚合物稳定剂一起溶解在水中足以基本上完全溶解所述环孢菌素的量的α-环糊精，并添加足以形成环孢菌素(尤其是环孢菌素A)/α-环糊精络合物聚集体的γ-环糊精，以制备包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者的直径为约100nm至约100μm的环孢菌素(尤其是环孢菌素A)/环糊精颗粒。本文和本申请通篇中的术语“基本上完全”是指至少75％至约100％溶解。在示例性实施方案中，这可以是指至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％，并且在优选实施方案中为至少约90％。
在第五方面中，提供了一种水性眼科组合物，用于通过将有效量的该水性眼科组合物局部施用于需要泪液形成的受试者的眼睛而引起或增强泪液形成，所述水性眼科组合物包含：
(a)眼科治疗有效量的环孢菌素，优选环孢菌素A；
(b)有效地与所述环孢菌素形成水溶性络合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的环孢菌素/环糊精颗粒，其包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂；
在所述组合物中所述环孢菌素的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中所述α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素部分为不小于约10％。
更进一步地，在第六方面中，本文提供了环孢菌素在制备水性眼科组合物中的用途，该水性眼科组合物用于通过将有效量的水性眼科组合物局部施用于需要泪液形成的受试者的眼睛而引起泪液形成，所述水性眼科组合物包含：
(a)眼科治疗有效量的环孢菌素，优选环孢菌素A；
(b)有效地与所述环孢菌素形成水溶性络合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的的环孢菌素/环糊精颗粒，其包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂；
在所述组合物中所述环孢菌素A的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中所述α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素部分为不小于约10％。
发明详述
本文提及的专利、公开申请和科学文献建立了本领域技术人员的知识，并且通过引用的方式将其全部内容并入本文，其程度如同每一个都被具体地且单独地通过引用的方式并入。本文引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突应以后者为准。同样，在词语或短语的本领域已知的定义与该词语或短语如本说明书中具体教导的定义之间的任何冲突应以后者为准。
如本文所使用的，无论是在过渡性短语中还是在权利要求的主体中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都被解释为具有开放式含义。也就是说，这些术语将被解释为与短语“至少具有”或“至少包括”同义。当在方法的上下文中使用时，术语“包括(comprising)”是指该方法至少包括所述步骤，但是还可以包括其它步骤。当在组合物的上下文中使用时，术语“包含”意指组合物至少包括所述特征或组分，但也可包括其它特征或组分。
术语“基本上由...组成(consists essentially of)”或“基本上由...组成(consisting essentially of)”具有部分封闭的含义，即，它们不允许包含将显著改变方法或组合物的基本特征的步骤或特征或组分；例如，将明显干扰本文所述的化合物或组合物的期望性质的步骤或特征或组分，即，所述方法或组合物限于指明的步骤或材料以及不会实质上影响方法或组合物的基本和新颖特性的那些。
术语“由......构成(consists of)”和“由......组成(consists)”是封闭的术语并且仅允许包括所述的步骤或特征或组分。
如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”明确地还包括它们所指的术语的复数形式。
术语“约”在本文中意指大概、在…左右、大致或大约。当术语“约”与数字范围结合使用时，它通过延伸边界高于和低于所述数值来修饰该范围。一般而言，术语“约”或“大概”在本文中用于修饰数值高于或低于所述值20％。
如本文所使用的，对变量的数值范围的表述旨在表达该变量可以等于该范围内的任何值。因此，对于固有离散的变量，变量可以等于该数值范围的任何整数值，包括范围的端点。类似地，对于固有连续的变量，变量可以等于数值范围的任何实际值，包括范围的端点。举例来说，被描述为具有0至2的值的变量，对于固有离散的变量可以是0、1或2，对于固有连续的变量可以为0.0、0.1、0.01、0.001或者任何其他的实际值。
在说明书和权利要求中，单数形式包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。如本文中所使用的，除非另外明确指出，否则词语“或”以“和/或”的“包含”意思而不是以“任一/或”的“排他”意思使用。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本说明书所属领域的技术人员通常理解的含义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法和材料。阐述药理学一般原理的标准工具书包括：Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics,10th Ed.,McGraw Hill Companies Inc.,New York(2001)。
如本文所用，“治疗”意指与未施用本文所述的组合物的个体的症状相比，在已施用本文所述的组合物的个体中减少、阻碍或抑制了一种或多种症状的发展或控制、抑制、缓解和/或逆转了一种或多种症状。从业者将会理解，本文所述的组合物和方法将被技术熟练的从业者(医师或兽医)连同连续临床评估一起使用以确定后续治疗。这种评估将辅助和告知评价是否增加、减少或继续特定治疗剂量和/或是否改变施用方式。
本文描述的方法旨在用于可能获得其益处的任何受试者/患者。因此，术语“受试者”以及“患者”、“个体”和“温血动物”和“哺乳动物”包括人类以及非人类受试者，例如可能经受相同或相似眼部病症的非人类动物，特别是狗、马和猫。特别地，像人类一样，这些动物可能遇到泪液产生太少的状况，并且可能受益于本文所述的引起或诱导泪液形成的方法。
以下定义和解释也与本申请有关。
眼部状况是影响或涉及眼睛、眼睛的一个部位或区域、或周围组织(如泪腺)的疾病、小病(ailment)或其他状况。广义地说，眼睛包括眼球和构成眼球的组织和流体、眼周肌肉(如斜肌和直肌)、眼球内部或附近的视神经部分和周围组织如泪腺和眼睑。
眼前部状况是影响或涉及眼前部(即眼睛前面)区域或部位(例如位于晶状体囊或睫状肌后壁前面的眼周肌肉、眼睑、泪腺或眼球组织或液体)的疾病、小病或状况。
因此，眼前部状况主要影响或涉及以下一项或多项：结膜、角膜、前房、虹膜、后房(在视网膜的后面但在晶状体囊后壁的前面)、晶状体或晶状体囊以及使眼前部区域或部位血管化或受神经支配的血管和神经。眼前部状况在本文中也被认为是延伸到泪器，特别是分泌泪液的泪腺，以及它们的排泄管，该排泄管将泪液流体运送到眼睛表面。
眼后部状况是主要影响或涉及眼后部区域或部位如脉络膜或巩膜(在通过晶状体囊后壁的平面后面的位置)、玻璃体、玻璃体腔、视网膜、视神经(即视盘)以及使眼后部区域或部位血管化或受神经支配的血管和神经的疾病、小病或状况。
因此，眼后部病症可以包括以下疾病、小病或状况，例如如黄斑变性(如非渗出型年龄相关性黄斑变性和渗出型年龄相关性黄斑变性)；脉络膜新生血管；急性黄斑区神经视网膜病变；黄斑水肿(如黄斑囊样水肿和糖尿病性黄斑水肿)；白塞氏病(Behcet’sdisease)、视网膜病症、糖尿病性视网膜病变(包括增殖性糖尿病性视网膜病变)；视网膜动脉阻塞性疾病；视网膜中央静脉阻塞；葡萄膜炎性视网膜疾病；视网膜脱落；影响眼后部部位或位置的眼创伤；由眼部激光治疗引起的或受到眼部激光治疗影响的眼后部状况；由光动力治疗引起或受其影响的眼后部状况；光凝；放射性视网膜病变；视网膜前膜病症；视网膜分支静脉阻塞；前部缺血性视神经病变；非视网膜病变糖尿病性视网膜功能障碍、色素性视网膜炎和青光眼。因为治疗目标是防止由于视网膜细胞或视神经细胞的损伤或损失而引起的视力损失或减少视力损失的发生(即神经保护)，所以可将青光眼认为是眼后部状况。
眼前部状况可以包括以下疾病、小病或状况，例如如无晶状体；假晶状体；散光；眼睑痉挛；白内障；结膜疾病；结膜炎；角膜疾病；角膜溃疡；干眼综合征；眼睑疾病；泪器疾病；泪管阻塞；近视；老花眼；瞳孔失调；屈光病症和斜视。因为青光眼治疗的临床目标可以是降低眼睛前房中的房水的高张力(即降低眼内压)，所以也可将青光眼认为是眼前部状况。
本说明书是关于并且涉及用于局部药物递送到眼睛的眼科组合物以及用于治疗眼部状况(例如眼前部状况或眼后部状况或可以既表征为眼前部状况又表征为眼后部状况的眼部状况)的方法。
干眼综合征(DES)也称为干眼病(DED)、干燥性角膜结膜炎(KCS)和干燥性角膜炎，其是由泪液产生减少引起的常见眼部状况，导致不适和视觉障碍。干眼综合征具有多因素病因，包括泪膜不稳定、泪膜渗透压增加和眼表面炎症，并且对眼表面具有潜在的损伤。干眼的治疗取决于其严重程度。人工泪液可以暂时改善眼睛刺激和视力模糊的症状。皮质类固醇可以用来减少眼表面炎症。然而，针对干眼综合征最有前景的治疗是局部施用环孢菌素A，其增加泪液产生并因此减轻炎症。在临床试验中，与5％在安慰剂中相比，商用的0.05％环孢菌素A/油性载体在6个月后对15％的患者有效。
环孢菌素A是抑制T细胞活化并因此抑制炎性细胞因子产生(选择性抑制IL-1)的肽。另外，环孢菌素A通过阻断线粒体通透性转换孔的打开和通过增加结膜杯状细胞的密度来抑制细胞凋亡(Kunert,K.S.,Tisdale,A.S.,Gipson,I.K.,2002.Goblet cell numbersand epithelial proliferation in the conjunctiva of patients with dry eyesyndrome treated with cyclosporine.Archives of Ophthalmology 120,330-337)。与干眼相关的状况也可以受益于环孢菌素A的局部施用。例如，角膜的屈光手术在干眼患者中几乎是禁忌的。手术前后环孢菌素A的治疗可以帮助这些患者就其屈光不正获得手术矫正，且没有干眼风险。市售的滴眼剂含有0.05％(w/v)的环孢菌素A眼用乳液(Alcon,Texas)。滴眼剂一天施用两次。然而，使用油和表面活性剂来局部递送环孢菌素A导致药物生物利用度低，并且可导致视力模糊、烧灼感、瘙痒和结膜刺激。可以通过以水性滴眼剂形式递送环孢菌素A来避免这些副作用。此外，如果滴眼剂中的环孢菌素A浓度可以增加10倍，从0.05％增加到0.5％(w/v)，那么环孢菌素A滴眼剂的治疗功效将会增加。环孢菌素A也被称为环孢素或环孢霉素。
用于眼部递送的微米颗粒
本说明书涉及通过维持被药物饱和的水性泪液流体增长的持续时间而获得的增强的递送到眼睛和周围组织的局部肽和蛋白质药物(特别是环孢菌素，尤其是环孢菌素A)递送。当泪液流体被药物饱和时，则药物分子具有从该流体分配到与泪液流体接触的角膜、结膜/巩膜和其他组织中的最大倾向。这些组织被亲脂性膜覆盖。被动药物扩散通过这些膜是由膜内的化学势梯度驱动的，因此膜表面的高药物浓度将增强药物递送通过这些膜并进入到周围组织中。在正常情况下，作为滴眼剂水性溶液施用于眼睛的药物将通过泪液流体的恒定流动而从眼表面快速稀释和洗出。药物在眼睛表面的稀释减少了从表面流入眼睛到和周围组织中的药物。许多眼科药物是溶解性差的化合物，其在水性泪液流体中不具有足够的溶解度。这些药物有时以水性滴眼剂悬浮液的形式施用，这将导致在眼睛表面有所持续的药物浓度。但是，由于其水溶性低，其从眼睛表面的吸收将受溶出速率的限制，即药物吸收进入眼睛将受到固体药物缓慢溶出的阻碍。以水溶性更好的药物/环糊精络合物来施用此类亲脂性药物确实增加了固体药物在泪液流体中的溶出速率，防止溶出速率限制的药物吸收。眼科滴眼剂悬浮液中的颗粒比溶解的药物分子更缓慢地从眼表面洗出，这部分地是由于颗粒与周围组织的粘附。通过引入更有利的用于被动药物扩散的物化条件而获得增强的吸收。施用含有固体药物/环糊精络合物的水性药物/环糊精滴眼剂悬浮液将确保在延长的时间段内在水性泪液流体中具有恒定高浓度的溶解的药物。
如上文背景技术中所述，各种角膜前因素将通过缩短施加药物的角膜接触时间来限制眼睛吸收。最重要的因素是滴入的溶液的排出、非角膜吸收和诱导的流泪。这些因素以及膜屏障本身将限制局部施用的眼科药物的渗透。结果，只有几个百分比的施加剂量被递送到眼内组织中。施用剂量的主要部分(50-100％)将被吸收到全身血液循环中，这可导致各种副作用。在将施加的滴眼剂(25-50μl)滴到眼睛的角膜前区域之后，较大部分的药物溶液快速地从眼睛表面排出，并且溶液体积回到正常驻留泪液体积，即约7μl。此后，眼前部溶液体积保持恒定，但药物浓度由于泪液更新引起的稀释以及角膜和非角膜吸收而降低。在人体中从角膜前部区域排出滴眼剂的一级速率常数值通常为约1.5min-1，且泪液更新速率为约1.2μl/min，因此，局部施加的药物的角膜前半衰期仅为在滴眼剂开始从眼睛表面排出后的1至3分钟。
药物/环糊精颗粒的形成
环糊精和药物/环糊精络合物能够在水性溶液中自组装形成纳米尺寸的聚集体和胶束样结构，其也能够通过非包结络合和胶束样增溶来溶解溶解性差的药物(Messner,M.,Kurkov,S.V.,Jansook,P.,Loftsson,T.,2010.Self-assembled cyclodextrinaggregates and nanoparticles.Int J Pharm 387,199-208)。已知环糊精在水性溶液中溶解环孢菌素A，并且已经描述了水性环孢菌素A滴眼剂溶液(Kanai,A.,Alba,R.M.,Takano,T.,Kobayashi,C.,Nakajima,A.,Kurihara,K.,Yokoyama,T.,Fukami,M.,1989.Theeffect on the cornea of alpha cyclodextrin vehicle for cyclosporin eyedrops.Transplant.Proc.21,3150-3152)。以前我们已经开发和测试了在环糊精纳米颗粒中含有地塞米松(Johannesson,G.,Moya-Ortega,M.D.,Asgrimsdottir,G.M.,Lund,S.H.,Thorsteinsdottir,M.,Loftsson,T.,Stefansson,E.,2014.Kinetics ofγ-cyclodextrinnanoparticle suspension eye drops in tear fluid.Acta Ophthalmologica 92,550-556；Tanito,M.,Hara,K.,Takai,Y.,Matsuoka,Y.,Nishimura,N.,Jansook,P.,Loftsson,T.,Stefansson,E.,Ohira,A.,2011.Topical dexamethasone-cyclodextrinmicroparticle eye drops for diabetic macular edema.Invest Ophth Vis Sci 52,7944-7948)和多佐胺(Johannesson,G.,Moya-Ortega,M.D.,Asgrimsdottir,G.M.,Lund,S.H.,Thorsteinsdottir,M.,Loftsson,T.,Stefansson,E.,2014.Kinetics ofγ-cyclodextrin nanoparticle suspension eye drops in tear fluid.ActaOphthalmologica 92,550-556；Gudmundsdottir,B.S.,Petursdottir,D.,Asgrimsdottir,G.M.,Gottfredsdottir,M.S.,Hardarson,S.H.,Johannesson,G.,Kurkov,S.V.,Jansook,P.,Loftsson,T.,Stefansson,E.,2014.γ-Cyclodextrin nanoparticle eye drops withdorzolamide:effect on intraocular pressure in man.J.Ocul.Pharmacol.Ther.30,35-41)和厄贝沙坦(Muankaew,C.,Jansook,P.,Stefansson,E.,Loftsson,T.,2014.Effectofγ-cyclodextrin on solubilization and complexation of irbesartan:influenceof pH and excipients.Int J Pharm 474,80-90)的基于环糊精的滴眼剂。研究表明，纳米颗粒增加药物与眼表面的接触时间和药物的眼部生物利用度。
本申请涉及基于水的环孢菌素滴眼剂的配制，其中使用α-环糊精来增加环孢菌素A的水溶性，并且使用γ-环糊精来形成药物/环糊精纳米颗粒和微米颗粒。尽管α-环糊精能够通过形成水溶性环孢菌素A/α-环糊精络合物来溶解环孢菌素A，但形成的络合物几乎不倾向于形成纳米颗粒和微米颗粒。γ-环糊精具有小得多的与环孢菌素A形成络合物的倾向。但是，出乎意料地观察到，向水性环孢菌素A/α-环糊精络合物溶液中加入γ-环糊精促进了环孢菌素A/环糊精络合物聚集体的形成。
虽然环孢菌素A滴眼剂是本申请的主要焦点，但是其他脂溶性和水溶性差的肽类药物可以包括在描述的基于环糊精的药物递送系统中，例如其他环孢菌素、生长抑素和生长抑素类似物，以及脂溶性肽前药。
本文的水性滴眼剂组合物含有在环糊精络合物中的环孢菌素，该络合物含有α-环糊精和γ-环糊精的混合物以及一种或多种任选的稳定化聚合物。α-环糊精溶解环孢菌素，而γ-环糊精促进环孢菌素/环糊精络合物聚集体的形成。至少一种聚合物稳定水性纳米悬浮液和微米悬浮液。
聚合物稳定剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯烷基醚、纤维素衍生物(烷基纤维素、羟烷基纤维素和羟烷基烷基纤维素)、羧乙烯基聚合物(即卡波姆例如卡波普971(Carbopol 971)和卡波普974(Carbopol 974))、聚乙烯基聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮以及下面所示的有关聚合物稳定剂。
可用的聚合物稳定剂包括聚乙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇二硬脂酸酯、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯豆蔻基醚、聚氧乙烯油烯基醚、脱水山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚(例如聚乙二醇醚如聚西托醇1000(cetomacrogol 1000))、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如吐温20和吐温80(ICISpecialty Chemicals))、聚乙二醇(例如Carbowax 3550和934(Union Carbide))、聚氧乙烯硬脂酸酯、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、纤维素、聚乙烯醇(PVA)、泊洛沙姆(例如Pluronics F68和FI08，其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；泊洛沙胺(poloxamines)(例如Tetronic 908，也称为Poloxamine908，其是通过将环氧丙烷和环氧乙烷循序加入至乙二胺而得到的四官能嵌段共聚物(BASFWyandotte Corporation,Parsippany,N.J.))；Tetronic 1508(T-1508)(BASF WyandotteCorporation)、Tritons X-200，其为烷基芳基聚醚磺酸酯(Rohm and Haas)；PEG衍生化的磷脂、PEG衍生化的胆固醇、PEG衍生化的胆固醇衍生物、PEG衍生化的维生素A、PEG衍生化的维生素E、乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的无规共聚物等。
特别可用的稳定剂是泊洛沙姆。泊洛沙姆可以包括本领域已知的任何类型的泊洛沙姆。泊洛沙姆包括泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403、泊洛沙姆407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯。泊洛沙姆还可以其商品名Pluronic提及，例如Pluronic 10R5、Pluronic 17R2、Pluronic 17R4、Pluronic25R2、Pluronic 25R4、Pluronic 31R1、Pluronic F 108Cast Solid Surfacta、Pluronic F108NF、Pluronic F 108Pastille、Pluronic F 108NF Prill Poloxamer 338、Pluronic F127、Pluronic F 127NF、Pluronic F 127NF 500BHT Prill、Pluronic F 127NF PrillPoloxamer 407、Pluronic F 38、Pluronic F38 Pastille、Pluronic F 68、Pluronic F68Pastille、Pluronic F 68LF Pastille、Pluronic F 68NF、Pluronic F 68NF PrillPoloxamer 188、Pluronic F 77、Pluronic F 77Micropastille、Pluronic F 87、PluronicF 87NF、Pluronic F 87NF Prill Poloxamer 237、Pluronic F 88、Pluronic F88Pastille、Pluronic F 98、Pluronic L 10、Pluronic L 101、Pluronic L 121、PluronicL 31、Pluronic L 35、Pluronic L 43、Pluronic L 44NF Poloxamer 124、Pluronic L 61、Pluronic L 62、Pluronic L 62LF、Pluronic L 62D、Pluronic L 64、Pluronic L 81、Pluronic L92、Pluronic L44 NF INH表面活性剂Poloxamer 124View、Pluronic N 3、Pluronic P 103、Pluronic P 104、Pluronic P 105、Pluronic P 123Surfactant、Pluronic P 65、Pluronic P 84和Pluronic P 85。
以下实施例仅以举例说明的方式进行详细描述，其不应解释为在精神或范围上是限制性的；对于本领域技术人员而言，在材料和方法两方面中的许多修改都是显而易见的。
实施例1
研究了环糊精对环孢菌素A在水中的溶解度的影响。将过量的药物加入到含有高达20％(w/v)环糊精的水性溶液中。将溶液在密封的玻璃小瓶中在40-50℃下超声处理45-60分钟，然后使其冷却至室温(22-23℃)。然后将少量的固体药物加入到每个小瓶中，将小瓶重新密封并使其在恒定的搅拌下平衡，并在室温下避光7天。当溶液已达到平衡时，将其通过0.45μm膜滤器过滤并通过高压液相色谱法分析。使用Higuchi和Connors开发的相溶解度方法测定环孢菌素A/环糊精络合物的表观络合常数(K1:1)(Higuchi,T.,Connors,K.A.,1965.Phase solubility techniques.Advanced Analytical Chemistry ofInstrumentation 4,117-212)。络合效率(CE)根据相溶解度图(药物总溶解度相对于总CD浓度(单位为mol/l)所作的图)的斜率确定，其中S0为药物的固有溶解度：
表1
溶解度研究结果。三次测定的平均值±标准偏差。在这些相同的条件下，环孢菌素A在纯水中的溶解度经测定为0.043±0.004mg/ml。
表1中的结果表明，环糊精对环孢菌素A具有增溶作用，并且溶解度随着水性介质中环糊精浓度的增加而增加。与测试的其他环糊精相比，α-环糊精对环孢菌素A具有更大的增溶作用，并且显示更高的CE。在含有15％(w/v)α-环糊精的纯水性溶液中，环孢菌素A的溶解度显示为4.2mg/ml。相溶解度图是Bs型(Higuchi,T.,Connors,K.A.,1965.Phasesolubility techniques.Advanced Analytical Chemistry of Instrumentation 4,117-212)。在室温下天然β-环糊精在纯水中的溶解度仅为2％(w/v)，并且环孢菌素A在2％(w/v)β-环糊精水性溶液中的最大溶解度是0.094mg/ml。对于γ-环糊精和2-羟丙基-γ-环糊精，在20％(w/v)的γ-环糊精下的最高溶解度估计为0.14mg/ml，在20％的2-羟丙基-γ-环糊精下的最高溶解度估计为0.066mg/ml。测试的2-羟丙基-α-环糊精和无规甲基化β-环糊精的最高浓度为15％(w/v)，并且在该环糊精浓度下，环孢菌素A的溶解度经测定分别为0.46mg/ml和0.72mg/ml。选择α-环糊精用于进一步的开发，因为其与测试的其他环糊精相比对环孢菌素A的增溶作用大得多。由于γ-环糊精具有优异的形成纳米颗粒的能力，也进一步测试了γ-环糊精。
环孢菌素A的定量分析在来自Dionex Softron GmbH(Germering，德国)的反相高效液相色谱组件系统Ultimate 3000系列上进行，所述系统由DGP-3600A泵、SRD-3600溶剂架和脱气器、WPS-3000TLS孔板取样器、TCC-3100柱箱、光电二极管阵列检测器和Phenomenex Luna C-18 150mm×4.60mm和5微米柱组成并具有匹配的保护柱。流动相由乙腈、甲醇和水组成(60:20:20)，流速为1ml/min，柱箱温度为80℃，并且检测波长为205nm。
实施例2
测定在水性滴眼剂介质中在环孢菌素A/环糊精聚集体中存在的环孢菌素A部分。通过将苯扎氯铵(20mg)和乙二胺四乙酸二钠脱水物(100mg)溶解在70ml的1.4％(w/v)聚乙烯醇水性溶液中来制备0.05％(w/v)环孢菌素A滴眼剂水性微米悬浮液。然后将50mg环孢菌素A和测得量的不同环糊精(即纯α-环糊精、纯γ-环糊精或α-环糊精和γ-环糊精的混合物)加入到该溶液中，并振荡直至获得均匀的悬浮液。然后用1.4％(w/v)聚乙烯醇水性溶液将体积调节至100.0ml，并在密封容器中在高压釜中于121℃加热20分钟。超声下将悬浮液冷却至室温。然后，从超声波仪中取出悬浮液，并使其在室温恒定搅拌下平衡7天，避光。表2列出了测试的不同环孢菌素A滴眼剂水性悬浮液(F1至F7)的组成。还制备了不含某些赋形剂的滴眼剂制剂5(F5)以试图评估赋形剂对环孢菌素A的环糊精增溶作用和环孢菌素A/环糊精络合物的聚集的影响。表3中给出了这些滴眼剂的组成(F8到F10)。
表2
环孢菌素A滴眼剂制剂的组成。除了环糊精外，每种制剂含有0.05％(w/v)环孢菌素A、1.4％(w/v)聚乙烯醇、0.02％(w/v)苯扎氯铵和0.1％(w/v)乙二胺四乙酸二钠脱水物。
表3
测试制剂的组成。除了列出的赋形剂外，每种制剂还含有0.05％(w/v)环孢菌素A、10％(w/v)γ-环糊精和4％(w/v)α-环糊精。
制剂 赋形剂
F8 无赋形剂
F9 1.4％(w/v)聚乙烯醇
F10 0.020％(w/v)苯扎氯胺和0.10％(w/v)EDTA
被测试的制剂(4ml)在室温(22-23℃)下以6000rpm离心20-30分钟。如果制剂分成两层，则通过高效液相色谱法分析上层(参见实施例1)。固相中的药物含量按照下式进行计算：
测定了七种制剂中的每一种的固体药物部分(表4)。此外，在包含和不含其他赋形剂(即聚乙烯醇、苯扎氯铵和乙二胺四乙酸二钠脱水物)的情况下测试了制剂F5(其含有10％w/v的γ-环糊精和4％w/v的α-环糊精)以评估赋形剂对聚集的影响。
表4
不同环孢菌素A制剂中的固体药物部分。
对于仅含有α-环糊精的制剂F7，固体药物部分低且大部分药物处于液相中。当制剂含有γ-环糊精和α-环糊精的混合物时，固体药物部分增加；当制剂仅含有γ-环糊精时，大部分药物处于固相中。包含最低量的α-环糊精和最高量的γ-环糊精的制剂F1、F2和F3在离心时分成3层，其中顶层仅含有环孢菌素A。这表明一些药物未与环糊精形成络合物，并因此不溶于水性介质。其他制剂在离心过程中分成2层，这表明制剂必须含有至少3％的α-环糊精以完全溶解环孢菌素A。与制剂F7相比，在制剂F4、F5和F6中更多的药物处于固相中，但似乎是全部环孢菌素A均已溶解。这意味着一些环孢菌素A在环孢菌素A/环糊精络合物中，以及形成的络合物聚集成颗粒，该颗粒在离心过程中沉淀。这也表明γ-环糊精增加了聚集。
还研究了赋形剂对聚集的影响。选择含有10％(w/v)γ-环糊精和4％(w/v)α-环糊精的制剂F5进行这些研究，其中所有环孢菌素A都溶解，并且其中固体药物部分处于合适范围内。对于含有环糊精但不含赋形剂的制剂F8，固体药物部分类似于含有所有赋形剂的制剂，如F5。在含有环糊精和聚乙烯醇的制剂F9中，聚集稍微增多。在含有环糊精以及苯扎氯铵和乙二胺四乙酸二钠脱水物但不含聚乙烯醇的制剂F10中发现最大的固体药物部分。这表明赋形剂对聚集有一些影响。
测定F1、F5和F7的理化性质。在室温(22-23℃)下测定制剂的pH值。使用Brookfield DV-1+型(USA)粘度计在25±2℃下进行滴眼剂制剂的粘度测量，并在25℃下操作的蒸汽压渗压计中测定制剂的渗透压(表5)。
表5
制剂F1、F5和F7的粘度、pH值和渗透压。三次测定的平均值±SD。
制剂 F1 F5 F7
pH值 5.03 5.24 5.33
粘度 3.49±0.0770cP 3.86±0.0160cP 2.23±0.0159cP
渗透压 129±1.04mOsm/kg 127±2.34mOsm/kg 67.4±0.881mOsm/kg
实施例3
通过动态光散射(DLS)进行滴眼剂制剂的粒径表征。在测量之前将每种制剂通过0.45μm膜滤器过滤(以排除大于0.45μm的颗粒)，所述测量在25℃、180°散射角和780nm激光束下进行，并且每个测量以一式三份进行。在未进行样品过滤的情况下使用光学显微镜目测粒径，这更好地了解悬浮液中有多少颗粒以及它们有多大。表6显示来自DLS测量的尺寸分布数据。
表6
对于制剂F1-F10的环孢菌素A/环糊精络合物尺寸分析的DLS结果，数据作为纳米级范围内的流体动力学直径(d)、群宽度和强度分布(％I)报告
基于强度分布，制剂F1、F2和F3的DLS测量给出2个或3个尺寸群，并且平均直径是200-400nm。当通过显微镜观察时，这三种制剂比其他制剂含有更大量的相对较大的颗粒。这主要是由于存在固体药物颗粒，而不是由于药物/环糊精络合物的聚集。
在制剂F4、F5和F6中，环孢菌素A基本上完全溶解，并且尺寸分布大于其他制剂中的尺寸分布，检测到几个尺寸群，并且主要粒径经测定为4.9-5.3nm和150-250nm。在仅含有α-环糊精的制剂F7中，出现两个尺寸群，其中主要粒径为6nm和155nm。当通过光学显微镜测量这一制剂时，制剂显示为清澈的。这些结果表明，当制剂仅含有α-环糊精时，环孢菌素A/环糊精络合物不具有形成较大聚集体的强趋势。当制剂含有α-环糊精和γ-环糊精二者时，络合物具有更强的形成聚集体的趋势，并且形成的聚集体也更大。
在制剂F8、F9和F10中测试赋形剂对聚集的影响。当通过光学显微镜测量时，所有这些制剂显示为大部分清澈，具有非常少的1-5μm的大颗粒。仅在通过DLS观察时，可检测到一些差异。在除了环糊精之外不包括其他赋形剂的制剂F8中，检测到两个尺寸群，主要粒径为33.1nm和156nm。当制剂含有苯扎氯铵和乙二胺四乙酸二钠脱水物(F10)时，出现四个尺寸群，主要粒径经测定为1.53、246、362和611nm。当制剂仅含有聚乙烯醇(F9)时，检测到5个尺寸群，主要粒径为1.22、5.37、201、434和850nm。这些结果表明赋形剂增加了水性滴眼剂介质中的聚集体形成。
实施例4
透射电子显微镜(TEM)是检测药物/环糊精络合物(包括其聚集体)的形态和尺寸的分析方法选择。分析所选择的环孢菌素A水性滴眼剂悬浮液(即F1、F5和F7)中聚集体的形态和尺寸。首先，将样品在4000rpm、20℃下离心30分钟(型号Rotina 35R，Hettuch，德国)，然后用移液器吸取出上清液，并将聚醋酸甲基乙烯脂涂覆(formvar-coated)的格栅浮在上的制剂液滴上，以允许将纳米颗粒吸附到格栅上。用滤纸吸干格栅后，通过在恒定的真空下使用乙酸双氧铀水性溶液(1％)将格栅转移到一滴负染色剂上。最后，在JEM-2100型透射电子显微镜(JEOL，东京，日本)中检查样品。所选择的环孢菌素A滴眼剂悬浮液的TEM显微照片显示在F1和F5中存在直径分别为40-140nm和20-100nm的环孢菌素A/环糊精络合物的球形聚集体。F7中环孢菌素A/环糊精聚集的纳米颗粒的优势尺寸为小于10nm。然而，也检测到少量较大的颗粒(120-140nm)。TEM显微照片的聚集体尺寸与DLS技术一致。球形聚集体的观察表明，环孢菌素A/环糊精络合物的聚集体可以通过非包结络合物和/或胶束样结构来提高药物溶解性。F5中组装的纳米颗粒的直径范围为100-400nm。通过TEM观察的粒径与通过DLS得到的粒径一致。
使用扫描电子显微镜(SEM)进一步分析F5的形态。轻轻搅拌后，将水性滴眼剂悬浮液的固体物质层铺在载玻片上，并使样品在室温下在干燥器中干燥过夜。随后，在室温下在氩气氛下用金涂覆该层。然后用SEM(型号JSM-5410LV，JEOL，东京，日本)观察样品的表面形态。SEM显示纳米颗粒的直径为100-400nm，这与DLS和TEM的结果一致。
实施例5
在由供体和受体室组成的Franz扩散池装置中测量F1、F5和F7的环孢菌素A通过一系列半透膜的渗透。供体和受体室被MWCO为20、50或100kDa且扩散面积为1.77cm2的单层半透膜隔开。在渗透研究之前，将膜在Milli-Q水中浸泡过夜。供体相由2ml待测试的制剂(即F1、F5或F7)组成。制剂F7的受体相(12ml)由不含环孢菌素A和聚乙烯醇的制剂F7组成，制剂F1和F5的受体相由不含环孢菌素A和聚乙烯醇的制剂F5组成。这是由于以下事实：需要至少3％(w/v)的α-环糊精来溶解0.5mg/ml的环孢菌素A，以及制剂F1和F5具有相似的渗透压。聚乙烯醇被排除在受体相之外，因为聚乙烯醇粘附在流动池上，导致紫外光密度低和HPLC测量差。在将受体相放入受体室之前将受体相脱气以除去溶解的空气。该研究在室温下在以300rpm旋转的磁力搅拌棒连续搅拌受体相下进行。在第5、6、7、8和9小时取出100μl受体介质样品，并且立即用新鲜的受体相替换。通过HPLC测量受体样品中环孢菌素A的浓度(参见实施例1)。根据渗透曲线(即受体室中环孢菌素A的量(q)相对于时间(t)的曲线)的线性部分的斜率(dq/dt)计算通量(J)，并且根据该通量计算渗透系数(Pc)：
其中A是膜的表面积(1.77cm2)，并且Cd是供体相中溶解的环孢菌素A的初始浓度。
环孢菌素A的分子量为1202.6Da，α-环糊精和γ-环糊精的分子量分别为972.84和1297.12Da。单体环孢菌素A分子和环孢菌素A/环糊精(1:1)络合物能够容易地渗透通过这些膜。该研究表明，环孢菌素A主要作为环孢菌素A/环糊精络合物存在，所述络合物已经聚集成直径大于20kDa的颗粒，因此不能透过MWCO 20kDa膜。对于仅含有γ-环糊精的制剂F1来说，供体介质中有限量的溶解的药物也可能是在受体相中检测这一缺乏的原因，因为药物必须溶解以透过膜。所有三种制剂中的环孢菌素A透过MWCO 50和100kDa的膜，表明大多数聚集体小于50kDa。计算每种制剂的通量和渗透系数(表7)。制剂F5和F7给出相似的通量值，但是制剂F1给出较低的通量值。再一次，这主要是由于供体介质中溶解的环孢菌素A的浓度较低，以及只有溶解的游离环糊精A(游离的或在环糊精络合物中)能渗透通过膜。
表7
制剂F1、F5和F7中的环孢菌素A通过MWCO 50.000和100.000Da的半透膜的通量和渗透系数(Pc)。
实施例6
进一步研究环孢菌素A/药物聚集体行为。少量F5样品通过0.45μm膜滤器过滤-用等体积的流动相稀释或仅在室温下以6000rpm离心20-30分钟。然后通过HPLC测定所得溶液的环孢菌素A浓度(参见实施例1)。还使过滤后的制剂静置一天，然后在室温下离心20-30分钟，并通过HPLC测定环孢菌素A的浓度。当样品被稀释时，所有的聚集体都被溶解，环孢菌素A的浓度代表悬浮液中药物的总量。当悬浮液被过滤时，滤液中环孢菌素A的浓度应接近于悬浮液被离心时或与悬浮液被离心时相同，因为大多数聚集体应当从溶液中被滤出，如同在离心过程中一样。然而情况并非如此，过滤后的悬浮液的环孢菌素A浓度接近于稀释的悬浮液，而不是接近于离心的悬浮液(表8)。而且，当悬浮液被过滤时，它变成透明的，但是，有趣的是，当将过滤后的悬浮液静置一天时，发生了一些聚集，并且溶液再次变为不透明的。因此，将过滤后的制剂在室温下静置1天后进行离心，然后测量溶解的环孢菌素A的浓度。然后环孢菌素A的浓度接近于离心的悬浮液，而不是接近于稀释的悬浮液。这表明环孢菌素A/环糊精络合物发生聚集，但是将这些络合物一起保持在聚集体中的力是非常弱的，并且在过滤期间被打断，但是随后在滤液中重新形成。
表8
在稀释、离心、过滤、过滤并在1天后离心后制剂F5中的环孢菌素A的浓度
实施例7
制备三种滴眼剂制剂，并如实施例2所述测定它们的理化性质(表9)。存在于滴眼剂中的α-环糊精的量，即4％、12.5％和15％，高于足以溶解滴眼剂制剂中存在的所有环孢菌素A，即分别为0.05％、0.2％和0.4％。α-环糊精和γ-环糊精的水溶解度分别为13％和25％(w/v)。加入γ-环糊精后，形成小的纳米颗粒并且水性滴眼剂变成乳白色的。滴眼剂以相对低的速度离心，从滴眼剂悬浮液中仅去除较大颗粒(在低的微米颗粒范围内)，同时纳米颗粒保留在溶液中(实施例3)。由环孢菌素A/环糊精络合物微米颗粒组成的固体部分为23％至29％。
表9
滴眼剂的组成
两名健康志愿者(一位男性和一位女性，均为30岁)在左眼接受一滴制剂B。未观察到烧灼感、视力模糊、瘙痒或其他副作用。滴眼剂耐受性良好。制剂B含有4倍于0.05％浓度的环孢菌素A，该0.05％浓度的环孢菌素A作为滴眼剂商业销售。期待进一步的测试以确定甚至更高的浓度，如0.50％，也具有良好的耐受性。
尽管不希望被任何特定的理论或机制所束缚，但据信本文所述的水性滴眼剂每剂量提供更大和更有效量的环孢菌素，特别是环孢菌素A，其可以在常规给药方案中(例如每天两次)可以更快更彻底地实现比其他可能的采用较低剂量的基于油的市售产品更快且更有效的泪液产生。这可能是由于更好地渗透到分泌泪液的泪器(包括泪腺)及其排泄管，所述排泄管将泪液流体运送到眼睛表面以覆盖结膜和角膜。这也可能是由于所述滴眼剂以持续释放的方式提供环孢菌素以及聚集体在眼睛表面上提供的保护和舒缓作用。
尽管为了清楚理解的目的，通过举例说明、实施例和优选实施方案详细描述了本发明说明书，但是本领域普通技术人员应该理解，可以在不背离其精神的情况下进行各种修改、替换、省略和改变。因此，旨在本发明的范围仅受到以下权利要求及其等同方案的范围的限制。

Claims (17)

1.一种水性眼科组合物，包含：
(a)眼科有效量的环孢菌素A；
(b)有效地与所述环孢菌素A形成水溶性复合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素A/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的环孢菌素A/环糊精颗粒，其包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂；
在所述组合物中所述环孢菌素A的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中所述α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素部分为不小于约10％。
2.如权利要求1所述的眼科组合物，其中所述稳定剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基醚。
3.如权利要求1所述的眼科组合物，其中所述稳定剂是选自水溶性纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物、聚乙烯基聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。
4.如权利要求1所述的眼科组合物，其中：
(a)环孢菌素A以约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的量存在；
(b)α-环糊精以约4％(w/v)至约20％(w/v)的量存在；
(c)γ-环糊精以约4％(w/v)至约25％(w/v)的量存在；并且
(d)固体药物部分包含直径为约200nm至约50μm的环孢菌素/环糊精颗粒。
5.一种在有需要的受试者中诱导或增强泪液形成的方法，所述方法包括向所述受试者的眼睛局部施用有效诱导泪液形成的量的权利要求1所述的组合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述受试者患有干眼。
7.一种形成环孢菌素A聚集体的方法，所述方法包括将治疗有效量的环孢菌素A，任选地与聚合物稳定剂一起，溶解于水、足以基本上完全溶解所述环孢菌素A的量的α-环糊精和足以形成环孢菌素A/α-环糊精络合物聚集体的γ-环糊精中，以制备包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者的直径为约100nm至约100μm的环孢菌素A/环糊精颗粒。
8.一种水性眼科组合物，用于通过将有效量的所述水性眼科组合物局部施用于需要泪液形成的受试者的眼睛而引起泪液形成，所述水性眼科组合物包含：
(a)眼科治疗有效量的环孢菌素A；
(b)有效地与所述环孢菌素A形成水溶性络合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素A/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的环孢菌素A/环糊精颗粒，其包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂；
在所述组合物中所述环孢菌素A的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中所述α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素A部分为不小于约10％。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述受试者患有干眼。
10.环孢菌素A在制备水性眼科组合物中的用途，所述水性眼科组合物用于通过将有效量的所述水性眼科组合物局部施用于需要泪液形成的受试者的眼睛而引起泪液形成，所述水性眼科组合物包含：
(a)眼科治疗有效量的环孢菌素A；
(b)有效地与所述环孢菌素A形成水溶性络合物的量的α-环糊精；
(c)有效形成环孢菌素A/α-环糊精络合物聚集体的量的γ-环糊精；
(d)直径为约100nm至约100μm的环孢菌素A/环糊精颗粒，其包含所述α-环糊精和所述γ-环糊精二者；
(e)水；和
(f)任选地，聚合物稳定剂；
在所述组合物中环孢菌素A的总浓度为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)，在所述组合物中α-环糊精的总浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，在所述组合物中总γ-环糊精浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)，且在直径大于约300nm的颗粒中总环孢菌素A部分为不小于约10％。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述受试者患有干眼。
12.如权利要求8所述的水性眼科组合物，其中所述稳定剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基醚。
13.如权利要求8所述的水性眼科组合物，其中所述稳定剂是选自水溶性纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物、聚乙烯基聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。
14.如权利要求8所述的水性眼科组合物，其中：
(a)环孢菌素A以约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的量存在；
(b)α-环糊精以约4％(w/v)至约20％(w/v)的量存在；
(c)γ-环糊精以约4％(w/v)至约25％(w/v)的量存在；并且
(d)固体药物部分包含直径为约200nm至约50μm的环孢菌素/环糊精颗粒。
15.如权利要求10所述的用途，其中所述稳定剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基醚。
16.如权利要求10所述的用途，其中所述稳定剂是选自水溶性纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物、聚乙烯基聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。
17.如权利要求10所述的用途，其中：
(a)环孢菌素A以约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的量存在；
(b)α-环糊精以约4％(w/v)至约20％(w/v)的量存在；
(c)γ-环糊精以约4％(w/v)至约25％(w/v)的量存在；并且
(d)固体药物部分包含直径为约200nm至约50μm的环孢菌素/环糊精颗粒。
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