CN108004242A

CN108004242A - 烟草硝酸还原酶nia1启动子、其表达载体及其应用

Info

Publication number: CN108004242A
Application number: CN201711395855.9A
Authority: CN
Inventors: 杨惠娟; 王景; 史宏志; 周炎; 张玉宁; 赵莉
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CN108004242B

Abstract

本发明公开了一种烟草硝酸还原酶NIA1启动子、其表达载体及其应用。该NIA1启动子的核苷酸序列为：如SEQ ID NO.1所示序列；或在保留如SEQ ID NO.1所示序列的核心启动子序列的基础上，经去除或加倍调控NIA1表达的、与信号响应元件序列高度相似的关键元件；或由SEQ ID NO.1所示序列衍生的具有同等功能的核酸序列。一种具有NIA1启动子序列的用于植物遗传转化的真核表达载体。一种具有NIA1启动子序列的用于植物遗传转化的工程菌。NIA1启动子在启动目的基因表达中的应用，目的基因为GUS基因。本发明为验证NIA1启动子硝酸信号响应功能研究打下基础，对提高植物氮效率、节约氮肥用量以及发展资源节约型环境友好型农业具有广阔前景。

Description

烟草硝酸还原酶NIA1启动子、其表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种烟草硝酸还原酶NIA1启动子、其表达载体及其应用。

背景技术

硝态氮和铵态氮是作物的两种主要氮源，其中硝态氮可以诱导和调控1000多个基因的表达，这些基因涉及磷酸戊糖氧化、糖酵解、氨基酸代谢等多种重要的生理途径。因此，植物对硝态氮的吸收和利用是影响植物产量和氮肥利用率的重要因素。由于外界氮营养的不断变化，植物需要不断的调节自身的生长及体内的代谢过程以适应可利用氮营养成份的波动。在这一调节过程中，硝酸根（）是植物体内感应外界氮营养变化的一个关键信号分子。

硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NIA）基因和亚硝酸还原酶（Nitritereductase，NIR）基因是典型的受调节的基因，同时信号也对其它一些生长发育相关代谢途径的基因具有重要的调节作用。这种硝酸盐诱导的基因表达变化在NIA基因功能丧失的突变体中仍然存在；因此，植物体内的本身被认为是一种信号分子，并介导了这一调节过程。硝态氮以形式进入植物体后，首先被细胞质中的NIA还原为亚硝酸根（），然后在NIR作用下还原为铵（），在一系列酶的作用下合成各种氨基酸。

NIA是植物体内硝态氮代谢的第一个关键酶，与的积累关系密切，直接影响到植物氮肥的利用率。NIA基因和NIR基因的高表达也可影响到植物的氮代谢过程，NIA基因的高表达可以增加种子蛋白质的积累量，在烟草中高表达NIR基因后，叶片的碳氮代谢受到显著影响，叶片的持绿时间延长，叶片中NIA活性也有升高，同时、脯氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的含量都有下降。

启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合从而起始基因转录的DNA序列，是重要的顺式作用元件，位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。真核基因的表达和调控是植物基因工程研究的中心内容之一，启动子是转录水平上一种重要的调控元件。

文献报道，在多种植物的NIR基因启动子中都存在一个43bp长的保守序列，经研究发现该序列是一个响应的顺式作用元件（NRE），该元件的核心序列为tGaCCcTT-N(9-10)-AAGaG，该序列对于介导的信号转导途径中的基因表达调控是必需的，在水稻、玉米和高粱等植物中NIR的启动子也发现了该元件的存在。最新的研究结果表明，在水稻硝酸转运蛋白NAR2.1中也存在一个20bp长的类似元件，对该基因响应信号的过程具有调节作用。在拟南芥NIA1基因的3’-flanking区域也含有两个类似的NRE序列，也同样受到响应信号的NIR转录因子的调控。也有研究发现，在NIA基因的启动子区域存在有3个非NRE序列的基序（Motif），对于NIA基因的表达调控非常重要，为MYB结合基序（C-G/C-GTT-G/A），ALFINI结合基序（核心序列为C/A-CAC）和E-box基序（CAAGTG）。

然而，目前尚未明确作用于NIA基因启动子区域的信号响应元件，亟待研究NIA基因的启动子调控元件以及是否存在信号响应元件，为进一步验证其信号响应功能的研究打下基础，对提高植物氮效率、节约氮肥用量以及发展资源节约型环境友好型农业具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种烟草硝酸还原酶NIA1启动子、其表达载体及其应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术思路如下：

本发明以模式植物烟草为材料，克隆、鉴定了烟草NIA1基因的启动子序列，发现在NIA1基因启动子位置为-281bp～-262bp区域中存在有GACCCTA-N（10）-AAG序列，该序列与已报道的NIR1基因启动子中NRE的核心序列GACCCTT-N（9-10）-AAG仅有一个核苷酸差别，即“T”突变为“A”，并进一步验证该调控元件能够调控GUS基因的表达，删除或加倍（4倍）该调控元件对GUS活性有一定的影响。

该元件可能同样像NRE元件一样响应信号并对NIA1基因的转录及表达调控起作用，也可能一个核苷酸发生改变的位置恰好是关键位点导致该序列会起到不同于NRE元件的调控功能，该元件具体的作用需要进一步的研究和确认。

本发明采用具体技术方案如下：

一种烟草硝酸还原酶NIA1启动子，其核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.1所示的核酸序列；或

（2）在保留如SEQ ID NO.1所示的核酸序列的核心启动子序列的基础上，经去除或加倍调控NIA1表达的、与信号响应元件序列高度相似的关键元件；或

（3）由SEQ ID NO.1所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。

优选的，所述加倍的倍数为3～5。

设计一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体具有所述的烟草硝酸还原酶NIA1启动子序列。

设计一种用于植物遗传转化的工程菌，该工程菌具有所述的烟草硝酸还原酶NIA1启动子序列。

所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子在启动目的基因表达中的应用。

优选的，所述目的基因为GUS基因。

所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子启动GUS基因表达的方法，包括以下步骤：

（1）将所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子插入含GUS基因的表达载体，以替换所述表达载体中已有的启动子，得到重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入出发植物并进行培育，在所述出发植物中由所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达；

（3）对培育植物的叶片进行GUS染色，并定量分析。

优选的，所述出发植物为双子叶植物。

优选的，所述双子叶植物为本氏烟草。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明首次分离了烟草氮代谢关键酶NIA1基因的启动子序列。

2.本发明首次对启动子中可能的信号响应元件进行改造（删除或加4倍），提供的启动子序列均可以启动GUS基因在烟草中表达。

3.本发明提供的启动子序列及可能的信号响应元件在提高植物氮效率、节约氮肥用量上具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1：烟草硝酸还原酶NIA1启动子的PCR扩增电泳图。

图2：烟草硝酸还原酶NIA1启动子、可能的信号响应元件改造片段的GUS瞬时表达载体构建方案图。

图3-1：烟草硝酸还原酶NIA1启动子、可能的信号响应元件改造启动子的重组载体构建示意图之一。

图3-2：烟草硝酸还原酶NIA1启动子、可能的信号响应元件改造启动子的重组载体构建示意图之二。

图3-3：烟草硝酸还原酶NIA1启动子、可能的信号响应元件改造启动子的重组载体构建示意图之三。

图4：烟草硝酸还原酶NIA1启动子、可能的信号响应元件改造启动子的GUS表达载体质粒提取电泳图。

图5：含重组质粒的农杆菌EHA105注射本氏烟草图。

图6：注射本氏烟草的叶片GUS染色图。

图7：染色的本氏烟草叶片中GUS基因表达量的荧光定量PCR分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所涉及的试剂，如无特别说明，则均为常规市售产品。以下实施例中所涉及的试验方法，如无特别说明，则均为常规方法。

实施例1：获得启动子片段

在NCBI数据库中找到烟草氮代谢关键酶NIA1基因的ATG上游序列，截取937bp的碱基序列，具体序列详见SEQ ID NO.1，设计引物，以烟草基因组为模板，通过PCR扩增技术获得片段，扩增片段的引物序列：

上游引物为NIA1-F：TATATATATGACCCTGCAATGAAAG；

下游引物为NIA1-R：AGATTATTCTAAAAAAGAAAGAGAGAT；

结果：参见图1，获得937bp目的片段后通过TA克隆连接载体，测序比对，与数据库中记载的序列中对应碱基序列相一致。

实施例2：启动子信号响应元件改造片段的获得

根据发明人的前期研究和预测，发现了一段可能的信号响应元件，序列为：GACCCTACGGGCGTAAAAAG，该元件在NIA1基因启动子中的位置为-281bp～-262bp。

对该元件进行改造，如图2所示，分别构建删除该元件的启动子和加倍（4倍）该元件的启动子，烟草硝酸还原酶NIA1启动子、可能的信号响应元件改造启动子的重组载体构建示意图如图3所示。

扩增改造的启动子时，上下游引物与实施例1所用引物相同。

结果：获得删除、加倍启动子目的片段后，通过TA克隆连接载体，测序比对，与数据库中记载的序列中对应碱基序列相一致。

实施例3：启动子重组表达载体的构建

（1）将pCAMBIA-NPT-GUS载体用EcoRⅠ/Hind Ⅲ酶切后，切下35S启动子，回收大片段待用；

（2）将实施例1和实施例2中测序正确的各类T载体上的启动子序列用EcoRⅠ/HindⅢ酶切后，回收、纯化，将该目的片段用T4 DNA连接酶连接至酶切后的pCAMBIA-NPT-GUS载体中；

（3）连接产物转化到大肠杆菌E.coli DH5α感受态中，用菌落PCR方法鉴定阳性重组子，从而使NIA1启动子与GUS基因融合；

（4）对重组质粒进行PCR鉴定，确认序列大小正确后，提取质粒备用，得到表达GUS基因的植物重组表达载体pCAMBIA-NPT-NIA1–P-GUS，电泳图如图4所示。

实施例4：农杆菌转化本氏烟草

（1）通过热激转化法，将实施例3构建的各种启动子植物重组表达载体pCAMBIA-NPT-pNIA1–GUS转化到农杆菌EHA105感受态中，涂到固体YEB培养基上，暗培养2～3天；

（2）挑取单克隆菌，接入液体YEB培养基中，摇床培养至OD值约0.4时，用1ml注射器吸取20µl菌液缓慢注入生长40天的本氏烟草叶片中，如图5所示。

实施例5：GUS活性分析

待实施例4中注射本氏烟草叶片48小时后，用GUS染色法鉴定启动子活性。

使用GUS染色试剂盒（购自中科瑞泰生物科技有限公司）进行GUS活性分析，染色原理是用双抗体夹心法测定标本中植物β-葡萄糖苷酸酶（GUS）水平。

将注射后的本氏烟草叶片浸泡在GUS染色液中，于25～37℃保温1小时至过夜。转入70％乙醇中脱色2～3次，至阴性对照材料呈白色。

结果：如图6所示，显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。烟草NIA1启动子、删除和加倍元件启动子均能诱导GUS基因的表达。

实施例6：GUS酶联免疫反应定量分析

用植物GUS酶联免疫分析试剂盒（购自上海诺渊生物科技有限公司）进行GUS酶联免疫反应定量分析。

详细步骤如下：

（1）根据说明书稀释标准品，分别得到5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml和80ng/ml的标准品；

（2）在酶标孔包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍），用膜封板后置37℃温育30分钟；

（3）去膜后，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

（4）每孔加入酶标试剂50μl，37℃温育30分钟，弃去液体，洗5遍；

（5）每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

（6）每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）；

（7）以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

结果：如图7所示，烟草NIA1启动子能够诱导GUS基因的表达量为81ng/mg，删除烟草NIA1启动子能够诱导GUS基因的表达量为50ng/mg，加倍NIA1启动子能够诱导GUS基因的表达量为70ng/mg。GUS表达活性以未改造的启动子最高。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 烟草硝酸还原酶NIA1启动子、其表达载体及其应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 937

<212> DNA

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 1

tatatatatg accctgcaat gaaagaggaa gctaacctgt ttgcctttgt cgtattctgc 60

aaatttcagt ttaaaagccc atttgagatt gaattaattc gttataacta acgatatcaa 120

agaaaacaat tagttaaatg cttgtgtaat ttgaagaatt tttttggacg tggtcgctga 180

aaacagagaa atactttctg aaaagttggt cttgttcaaa aacgtaataa gagagttgat 240

tttttttcgt aaaaagtcac tttctggaat ttttcacttg atataccagg taaatagtta 300

ctgatattta atatttatac caaacaaatg aaagtaaaat atgtgtgtct ttcatacata 360

tatttatcta tcatagttaa tgatatatat atattttaac cttaaatttt gactactaaa 420

atgtaattat atttaatttg ggtagatatc agatgccact aaacatttac ctagccactc 480

ctccgaaaat aaattgagaa ggaaattaga gttagtggag ccataataat gtttaatgtg 540

accataactc agtgaaaacc acggccagaa caagaaacag ctgttagtcc taaccaacag 600

ctgcatatct ttaagccatt tgctattacc ccaatcccgc atcttcctct gatcccgacc 660

ctacgggcgt aaaaagtgta aatcattaga attgttttat tttgtgatgt cactattttt 720

ttaaaatcaa aattaaattg gggtgtcgat ttttttgggt cccacttatg tatagtatgg 780

gggctatgga ggcattgaga gagtccgtaa cgtttctata taaggccacc ccacgcattc 840

acaaacttcg ttcgaaaatc aaatcttaga gagagagaga gagaaatatt ttgagagaga 900

aatacagaaa atctctcttt cttttttaga ataatct 937

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tatatatatg accctgcaat gaaag 25

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agattattct aaaaaagaaa gagagat 27

Claims

1.一种烟草硝酸还原酶NIA1启动子，其特征在于，其核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.1所示的核酸序列；或

2.根据权利要求1所述的烟草硝酸还原酶NIA1启动子，其特征在于，所述加倍的倍数为2～5。

3.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，其特征在于，该载体具有权利要求1所述的烟草硝酸还原酶NIA1启动子序列。

4.一种用于植物遗传转化的工程菌，其特征在于，该工程菌具有权利要求1所述的烟草硝酸还原酶NIA1启动子序列。

5.权利要求1所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子在启动目的基因表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目的基因为GUS基因。

7.权利要求1所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子启动GUS基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述烟草硝酸还原酶NIA1启动子插入含GUS基因的表达载体，以替换所述表达载体中已有的启动子，得到重组质粒；

（3）对培育植物的叶片进行GUS染色，并定量分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述出发植物为双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述双子叶植物为本氏烟草。