CN108004163A - 适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物修复石油烃污染土壤技术领域,具体涉及适于中温好氧生物堆系统中深度治理石油烃污染土壤的混合菌剂及其制备和应用。混合菌剂由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)两种石油烃组分功能降解菌混合并固定化制成,当某时段内石油烃降解效率下降为初始时段降解效率的50%以下时,追加补给由地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌按1:3~1:5(V:V)的比例混合并固定化制成的混合菌剂B,并维持堆体内细菌总量达初始含量的80%~100%,从而实现污染土壤中石油烃污染物的深度降解作用,有效降解污染物及其降解产物毒性。
Description
技术领域
本发明属于微生物修复石油烃污染土壤技术领域,具体涉及适于中 温好氧生物堆系统中深度治理石油烃污染土壤的混合菌剂及其制备和应 用。
背景技术
随着石油开采强度的不断加大,石油烃类物质进入环境中的含量和 几率也出现激增,严重危害生态环境乃至威胁人们的正常生活。此种状 况下,多种以期应用于石油污染土壤修复中的治理技术得到开发和研究。 然而,修复技术的昂贵价格、繁琐的实施过程、有限的处理量以及潜在 的二次污染风险,均制约着土壤修复技术的市场化应用。目前,在最为 经济可靠的石油烃污染土壤修复技术中,微生物修复技术仍然是诸多修 复案例所青睐的技术形式之一。
众所周知,微生物修复技术具有修复周期长、高效修复过程短暂、 微生物修复活性难以长期维持、修复范围具有特异性等应用短板,但其 经济的修复成本和简单的实施过程仍然使其受到更多的青睐。对此,有 效改善和提高微生物修复过程,优化微生物修复实施方式,增强微生物 修复效率已成为发展微生物修复技术的突破口。对此,多种微生物修复 技术优化方向不断提出,如功能微生物代谢活性的提高,微生物代谢谱 的拓宽,多功能代谢菌群的构建,微生物修复形式的多样化等。在这其 中,生物堆修复技术是较早提出的一种新型的微生物修复技术处理石油 污染土壤的形式。通过菌剂注入、营养物质添加、强制通风等手段,改 善微生物生长代谢影响因子。然而,传统生物堆修复技术仍然存在微生物代谢活性易丢失,修复效率逐渐降低的弊端。对此,针对土壤环境中 的温度、湿度、含氧量等指标进一步做出优化,开发了中温好氧生物堆 修复技术。可有效提高石油烃污染物的初始修复效率,并将高效修复过 程维持在较优的水平。但是,在已有应用案例中发现,在各环境因素得 到有效调节的情况下,也会出现微生物数量减少,活性降低等现象,这 与石油烃污染物经生物代谢降解过程所产生的毒性中间产物相关。
脂肪酸作为石油烃生物氧化降解过程的主要中间产物,也是微生物 代谢的限速步骤。脂肪酸降解的β氧化过程需在原核生物胞内完成,大 量的脂肪酸积累引起微环境内pH的降低,这都不利于诸多功能微生物的 生长代谢,也阻碍了一般功能微生物对脂肪酸的进一步代谢降解,进而 阻碍了石油烃的整体快速降解过程及其深度降解效率。
发明内容
本发明目的在于提供一种适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油 烃污染土壤的混合菌剂及其制备和应用。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌 剂,混合菌剂由地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)与 蜡样芽孢杆菌W1(Bacilluscereus W1)两种石油烃组分功能降解菌混 合并固定化制成,其中,地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)已于2011年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为武 汉市武昌珞珈山,保藏登记号为CCTCC NO:M 2011261;蜡样芽孢杆菌W1 (Bacilluscereus W1)已于2015年12月3日保藏于中国典型培养物 保藏中心,地址为武汉市武昌珞珈山,保藏登记号为CCTCC NO:M 2015705。
所述地衣芽孢杆菌具有石油烃代谢功能,所述蜡样芽孢杆菌具有脂 肪酸降解功能。二者均可在中温(35~40℃)条件下生长繁殖,并具有底 物代谢功能活性。
所述两种石油烃组分功能降解菌按6:1~10:1(V:V)和1:3~1:5(V:V) 的比例制成混合菌液A和混合菌液B,混合菌液分别经碳化稻壳固定化, 即得混合菌剂A和混合菌剂B。
所述碳化稻壳固定化为将碳化稻壳与混合菌剂按7:1~9:1(w/w,g/g) 的比例混合,放置12~16h后离心收集固定化菌剂。
一种适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌 剂的制备,混合菌剂由地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5) 与蜡样芽孢杆菌W1(Bacillus cereus W1)两种石油烃组分功能降解菌 混合并固定化制成。
所述两种石油烃组分功能降解菌按6:1~10:1(V:V)和1:3~1:5(V:V) 的比例制成混合菌液A和混合菌液B,混合菌液分别经碳化稻壳固定化, 即得混合菌剂A和混合菌剂B。
所述碳化稻壳固定化为将碳化稻壳与混合菌剂按7:1~9:1(w/w,g/g) 的比例混合,放置12~16h后离心收集固定化菌剂。
一种适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌 剂的应用,所述混合菌剂在中温好氧生物堆系统中对石油烃污染土壤进 行深度修复中的应用。
所述混合菌剂A施加于初始生物堆修复系统中,细菌微生物数量达 5~9×108CFU·g-1;当石油烃降解效率下降时,混合菌剂B补充施加于中 温好氧生物堆体内,并维持堆体内细菌总数达初始含量的80%~100%。
所述石油烃降解效率下降,为某时段内石油烃降解效率下降为初始 时段降解效率的50%以下。
所述的当石油烃降解率下降时进行混合菌剂B的补加,为当某时段 内石油烃降解效率下降为初始时段降解效率的50%以下时,进行混合菌剂 B的补给。中温好氧生物堆修复全程保持了较高的石油烃降解效率,并对 土壤内整体的微生物代谢群落组成和细菌微生物丰度具有良好维持稳态 的作用。
本发明所具有的优点包括:
1)本发明中的地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌分别具有石油烃代谢能 力与脂肪酸代谢功能,多功能混合菌株的搭配,有效解决了作为石油烃 生物代谢中间产物的脂肪酸积累所引起的毒性作用,在促进石油烃降解 菌株进一步代谢石油烃污染物的同时,对烃类物质的降解程度进一步加 深,促进了脂肪酸后续的代谢过程,一定程度上增强了石油烃代谢的矿 化作用。
2)本发明中的地衣芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌均可在中温(35~40℃) 条件下进行生长代谢,适宜于在中温好氧生物堆修复过程中施用并发挥 降解活性。
3)本发明中的混合菌剂A与混合菌剂B分别兼具石油烃与脂肪酸的 代谢能力,其中混合菌剂A侧重于石油烃代谢菌株的活性,混合菌剂B 侧重于脂肪酸代谢的活性,当石油烃降解速率下降时,表明功能微生物 数量及活性出现弱化,此时应用混合菌剂B补充施加,一方面补充石油 烃降解菌丰度与活性的损失,另一方面解决脂肪酸累积的毒害问题,同时可维持土壤整体微生物群落组成的稳定。
4)本菌剂所采用的菌株适于在35~40℃条件下存活,能维持土壤堆 体内微生物群落组成稳定,保持微生物丰度,延续微生物代谢石油烃的 高效快速过程。为中温好氧生物堆修复技术提供条件。
附图说明
图1为本发明实施例提供的中温好氧生物堆立体模式图。
图2为本发明实施例提供的混合菌剂在各试验处理中应用后生物堆 体微生物数量的变化图
图3为本发明实施例提供的混合菌剂在各试验处理中应用后微生物 群落组成变化图。
图4为本发明实施例提供的混合菌剂在各试验处理中应用后石油烃 降解率变化图。
图5为本发明实施例提供的混合菌剂在各试验处理中应用后正十八 烷和正十八烷酸的含量变化图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
深度降解石油烃污染物混合菌剂A与混合菌剂B的制备
本实施例所用菌源样品采自辽河油田石油污染土壤,称取2.0g污 染土壤土壤,加入50ml无机盐培养基,震荡10min后室温静置5min, 吸取上清液分别至含有1.0g·L-1石油烃或含有0.5g·L-1正十八烷酸的 无机盐液体培养基中富集培养6d,在含有1.0g·L-1石油烃或含有0.5 g·L-1正十八烷酸的无机盐固体培养基上分离纯化,挑选长势较好的单一 菌落保存,并接种至含有30g·kg-1石油污染土壤或含有10g·kg-1正十 八烷酸污染土壤中,以50ml无机盐培养基为液体介质,进行摇瓶培养 功能验证试验。
所述无机盐液体培养基的组成为:0.3g·L-1NaCl,0.2g·L-1MgSO4, 1.5g·L- 1NH4NO3,1.0g·L-1K2HPO4,0.5g·L-1KH2PO4,0.02g·L-1CaCl2, 0.01g·L-1FeSO4,1L蒸馏水,pH值7.0-7.5,121℃灭菌25min。
所述无机盐固体培养基的组成为:0.3g·L-1NaCl,0.2g·L-1MgSO4, 1.5g·L- 1NH4NO3,1.0g·L-1K2HPO4,0.5g·L-1KH2PO4,0.02g·L-1CaCl2, 0.01g·L-1FeSO4,15g·L-1琼脂,1L蒸馏水,pH值7.0-7.5,121℃ 灭菌25min。
功能验证实验表明,所分离的两种菌株,地衣芽孢杆菌对石油烃具 有较好的代谢活性,蜡样芽孢杆菌对于正十八烷酸的代谢具有较好的活 性。所分离的地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌分别提交至中国典型培养物 保藏中心,保藏登记号分别为CCTCC NO:M2011261和M 2015705。
将保存的两株菌株分别挑取单一菌落接种在5ml牛肉膏蛋白胨液体 培养基中,39℃震荡培养12h,获得两株菌株种子液。分别吸取500ul 菌株培养种子液接种至牛肉膏蛋白胨扩大培养基中,39℃震荡培养72h, 8000rpm·min-1离心并分别收集菌体。将收集所得菌体分别采用无机盐 培养基进行清洗,并使用无机盐培养基分别进行菌体重悬制成菌液。将两株菌株菌悬液分别按6:1~10:1(V:V)体积比例混合制成混合菌液A, 再按1:3~1:5(V:V)的体积比例混合制成混合菌液B。两混合菌液分别 经碳化稻壳固定化后分别得混合菌剂A和混合菌剂B备用。两种混合菌 剂均兼具石油烃和脂肪酸降解活性,其中,混合菌剂A具有更强的石油 烃代谢功能,混合菌剂B具有更强脂肪酸代谢活性。
实施例2混合菌剂在中温好氧生物堆修复技术中对石油烃污染土壤 的深度降解作用
中温好氧生物堆系统由分水营养调配系统、强制通风系统、堆体基 础及防渗系统等组成。堆体水分及无机营养补给由分布在堆体顶部的液 体补给管线输送完成;堆体内通风分为强制注气与强制抽气,分别由注 气管道和抽气管道完成,注气管道同时补给35~40℃热空气,保证堆体的 中温环境条件;堆体底部铺设防渗土工布,顶部覆盖防渗膜。堆体运行 时采取注气30min,停止通气10min,抽气30min的方式进行进行强 制通气处理(参见图1)。
将混合菌剂A加入初始生物堆修复系统中,使土壤内细菌微生物数 量达6.5×108CFU·g-1,参照前述中温好氧生物堆运行参数进行石油烃 污染土壤的修复。当石油烃修复效率达到21.5%时,此时段5d内的石油 烃降解效率为初始时段(第一个5d内)降解效率的45%,进行混合菌剂 B的补给,补给后土壤内细菌微生物总数达初始细菌总数的96%。以传统 微生物修复作为对照(CK),以未进行混合菌剂B的补加作为处理1 (Biopile-1),以补加混合菌剂B作为处理2(Biopile-2),分别测定 石油烃降解率,生物堆体内微生物数量及群落结构组成等指标(参见表1 和图2)。
表1
结果表明,CK中微生物数量随处理进行显著降低,Biopile-1处理 组在中温好氧生物堆调控的适宜环境下,细菌微生物丰度得到了有效的 维持,表明,混合菌剂A适用于中温好氧生物堆条件下的应用,Biopile-2 处理组细菌微生物数量得到显著提升。混合菌剂的应用有效维持了生物 堆体内细菌微生物群落结构的稳定,特别是在Biopile-2中,具有代谢 脂肪酸功能的蜡样芽孢杆菌丰度得到增强。处理40d后,Biopile-2中 的石油烃总降解率达到43.1±2.9%。
实施例3混合菌剂在中温好氧生物堆修复技术中对正十八烷污染土 壤的深度降解作用
将混合菌剂A加入至实施例2中所述的中温好氧生物堆修复系统中, 堆体系统采用正十八烷污染土壤搭建,初始堆体内细菌微生物数量达7.3 ×108CFU·g-1,当正十八烷降解效率达到29.5%时,此时段7d内(28d 时)的降解效率为初始时段(第一个7d内)降解效率的49.9%,进行混 合菌剂B的补给,补给后土壤内细菌微生物总数达初始细菌总数的91%。 以传统微生物修复作为对照(CK),以未进行混合菌剂B的补加作为处 理1(Biopile-1),以补加混合菌剂B作为处理2(Biopile-2),分别 测定烷烃降解率,中间产物生成量及生物堆体内微生物群落结构组成等 指标(参见表2和图3、4、5)。
表2
结果表明,混合菌剂B补加后,正十八烷降解率较未补加的Biopile-1 处理组在49d时提高了7.3%。气相色谱检测正十八烷酸生成率结果表明, 混合菌剂B补加后,正十八烷酸的含量与Biopile-1组处理的结果相仿, 而正十八烷的降解率却较Biopile-1组的结果明显提高,这表明,混合 菌剂B的施加,有效促进的正十八烷酸的进一步代谢,从而同时增强的 正十八烷的降解作用。由此表明,本专利所述的混合菌剂适于中温好氧 生物堆对石油烃污染土壤的修复,所述的应用方式同样促进了修复效率 的提升。
Claims (9)
1.一种适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂,其特征在于:混合菌剂由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)与蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)两种石油烃组分功能降解菌混合并固定化制成,其中,地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2011年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为武汉市武昌珞珈山,保藏登记号为CCTCC NO:M 2011261;蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)已于2015年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为武汉市武昌珞珈山,保藏登记号为CCTCCNO:M 2015705。
2.按权利要求1所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂,其特征在于:所述两种石油烃组分功能降解菌按6:1~10:1(V:V)和1:3~1:5(V:V)的比例制成混合菌液A和混合菌液B,混合菌液分别经碳化稻壳固定化,即得混合菌剂A和混合菌剂B。
3.按权利要求1所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂,其特征在于:所述碳化稻壳固定化为将碳化稻壳与混合菌剂按7:1~9:1(w/w,g/g)的比例混合,放置12~16h后离心收集固定化菌剂。
4.一种权利要求1所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂的制备,其特征在于:混合菌剂由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)两种石油烃组分功能降解菌混合并固定化制成。
5.按权利要求4所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂的制备,其特征在于:所述两种石油烃组分功能降解菌按6:1~10:1(V:V)和1:3~1:5(V:V)的比例制成混合菌液A和混合菌液B,混合菌液分别经碳化稻壳固定化,即得混合菌剂A和混合菌剂B。
6.按权利要求4或5所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂的制备,其特征在于:所述碳化稻壳固定化为将碳化稻壳与混合菌剂按7:1~9:1(w/w,g/g)的比例混合,放置12~16h后离心收集固定化菌剂。
7.一种权利要求1所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂的应用,其特征在于:所述混合菌剂在中温好氧生物堆系统中对石油烃污染土壤进行深度修复中的应用。
8.按权利要求7所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂的应用,其特征在于:所述混合菌剂A施加于初始生物堆修复系统中,细菌微生物数量达5~9×108CFU·g-1;当石油烃降解效率下降时,混合菌剂B补充施加于中温好氧生物堆体内,并维持堆体内细菌总数达初始含量的80%~100%。
9.按权利要求8所述的适于中温好氧生物堆系统中深度修复石油烃污染土壤的混合菌剂的应用,其特征在于:所述石油烃降解效率下降,为某时段内石油烃降解效率下降为初始时段降解效率的50%以下。
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