CN107981322A - 调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及保健品领域，具体提供了一种调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣及其饮品。本发明所述调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣采用如下方法制备得到：将纳豆菌和蛹虫草菌分别接菌至液体培养基，向液体培养基中分别加入酵母葡聚糖，各自经发酵培养后分离液态产物，合并所述液态产物，即得。本发明所述活醣饮品含有上述活醣，其同样具有突出的调节免疫力，增强孩童脑细胞发育以及抗氧化，保护肝脏等多重功效。

Description

调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣
技术领域
本发明涉及保健品领域，具体涉及一种调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣及其饮品。
背景技术
根据联合国世界卫生组织定义，65岁以上老年人口总数达全国总人口数的7％以上即属于“高龄化社会”。而台湾老龄人口已远超过 WHO规定之比例。然而，随着生活品质的提升与医疗技术的发展，已使得现代人的平均寿命获得延长，加上全球老年人口逐年增加，“老化管理”已成为国际上的重要健康议题。
年龄的增加，各器官及组织内的正常功能逐渐减退，导致活动力、抗氧化系统的防御功能下降，体内氧化物质增加而引起与年龄相关之疾病产生，如：动脉粥状硬化、心血管疾病、糖尿病、癌症及失智症等。失智症是一群症状的组合，属于神经退化性疾病，随着年龄增长，罹患此病症的比例随之增加。根据98年经建会公布98～145年人口推估的资料表示，台湾到145年失智人口将达62万人，而失智症中以阿兹海默症为最大宗，约占失智症的60～70％。AD主要症状为记忆力衰退，对时间、地点和人物的辨认出现问题，此症状对于照顾者、社会及医疗资源皆是一沉重负担，因此，为避免及减少家庭、经济、医疗方面之负担，如何老的健康，保持健康体态与认知能力，是未来人类共同面对的新课题。而目前老化理论指出，人会老化，与体内氧化压力产生的自由基有关，“自由基老化学说”是1954年由德罕哈门博士所提出，他认为自由基的不安定性会攻击细胞伤害细胞中主要产生能量之胞器——粒线体，是老化与疾病的主要原因。因此目前主要研究方向也着重于增加体内抗氧化酵素活性、减少体内氧化压力与自由基的产生。
现有技术虽公开了多种可用于缓解上述症状的饮品，但效果甚微，迄今为止，未得到一种理想的兼具提高免疫力、抗氧化及护肝保肝等多种功效的产品。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种制备调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣的方法，具体为：将纳豆菌和蛹虫草菌分别接菌至液体培养基，向液体培养基中分别加入酵母葡聚糖，各自经发酵培养后分离液态产物，合并所述液态产物，即得。
本发明所述的方法，优选纳豆菌和蛹虫草菌分别接菌至液体培养基并向其中加入酵母葡聚糖调配液后，以100±50rpm的速度搅拌充分再分别进行发酵培养，制的含有相应多醣体的发酵产物。
优选地，所述液体培养基包括：蔗糖：20～80g/L；麦芽萃取物： 5～40g/L；玉米浆：5～40g/L；硫酸镁：0.1～2g/L；磷酸氢钾：0.1～2g/L；更优选所述液体培养基的pH值为5～7。上述培养基尤其适用于纳豆菌和蛹虫草菌的发酵培养。
本发明所述的方法将酵母葡聚糖调配液加入到发酵体系作为营养源，进一步促进了多醣体的大量形成，有助于保障发酵产物质量。所述的酵母葡聚糖相对于所述液体培养基的用量为10-20g/L。
本发明所述的方法，分别将纳豆菌和蛹虫草菌分别接菌至液体培养基并各自进行发酵培养。
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，简称纳豆菌，是从日本的传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的，纳豆菌作为一种已知菌株目前已在多种领域中得到应用。蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)又叫北冬虫夏草菌，其为冬虫夏草菌同属的真菌。本发明所使用的菌种均可以在市场上购买得到，也可从相关机构获取，如中国微生物菌种保藏中心或由教育部工业微生物工程中心免费提供。此外，本发明所述纳豆菌和蛹虫草菌也可采用常规方法分离得到(如自市售购得的纳豆中分离纳豆菌)，本发明对此没有特别限定和要求，能够满足发酵并产生多醣体的纳豆菌和蛹虫草菌均可以用于实现本发明。
其中，纳豆菌和蛹虫草菌的接菌量均可采用本领域的常规值，可供参考的合适范围为5-15％或使每升培养基中含有效活菌数为 106-108，具体的提供形式(如种子液)和接菌量选择可由本领域技术人员酌情。
本发明所述方法，优选在所述发酵培养的中后期向体系(发酵体系)内加入0.05～0.5％的维他命B群；和/或，在所述发酵培养的中后期向体系内加入0.5～5％的麸胺酸钠。尤其当二者同时使用时，可数倍提高多醣体的产量，在上述添加量范围内都有理想的应用效果。
优选地，所述发酵培养的为24～32℃；培养时间为190±20hr。
本发明所述方法还包括对发酵培养结束后的发酵体系(发酵产物)进行的灭菌处理，所述灭菌处理的条件为121±10℃下15～20分钟。
本发明所述的方法可选择已知的发酵装置实现，优选采用台湾专利发明第I302473号，发明名称为“分离液体中之固体成分之方法”所公开的设备，以更有利于培养与发酵产物中的固液分离。
本发明的第二目的在于提供上述方法制备得到的调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣，其具有突出的调节免疫力，增强孩童脑细胞发育以及抗氧化，保护肝脏等多重功效。
本发明的第三目的在于提供含有上述调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣的活醣饮品，基于该饮品中含有上述活醣，其同样具有突出的调节免疫力，增强孩童脑细胞发育以及抗氧化，保护肝脏等多重功效。
优选地，所述调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣在所述饮品中的质量百分比含量为40-45％；在该用量范围内，尤其有利于人体吸收，且口感和营养价值尤为理想。
本发明所述的活醣饮品中除含有调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣外，还可以进一步加入其他成分，通常以水作为溶剂为宜，酌情可加入的物质包括但不局限于果汁或其浓缩液、海藻糖、果胶、食用香料、维生素、蔗糖素等等。
上述配方中的各原料均可市售购得，本领域技术人员可以依据口感或营养价值等喜好加以选择。
本发明所述的活醣饮品可采用常规方法制备得到，如将各组分混合后充分搅拌既得，本发明对此不做特别限定。
本发明所述活醣饮品的保健功能突出，特别是能够调节免疫功能，修护肝损伤及促脑力发展等，是一款极具市场前景的保健类产品。
附图说明
图1为实验前后IL-2的变化示意图；
图2为实验前后免疫球蛋白M的变化示意图；
图3为实验前后免疫球蛋白G的变化示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中，所使用的原料均为已知的市售产品。
实施例1
本实施例提供了一种调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣，其采用如下方法制备得到：
1)将纳豆菌和蛹虫草菌分别接菌至液体培养基(接菌量分别使每升培养基中含有效活菌数约为8×107和5.6×107，接种后向其中加入酵母葡聚糖作为营养源，以100±50rpm的速度搅拌；
所述液体培养基的配方为：蔗糖50g/L；麦芽萃取物30g/L；玉米浆30g/L；硫酸镁2g/L；磷酸氢钾2g/L；pH值为6；
上述酵母葡聚糖相对于所述液体培养基的用量为15g/L；
2)将步骤1)所得体系分别在室温下培养200hr左右，并在发酵中后期向体系中加入0.5％的维他命B群和5％的麸胺酸钠。
待发酵结束后对发酵产物分别进行灭菌处理，灭菌条件为121℃下20分钟；经固液分离发酵产物，取上述两个体系液态发酵产物合并即得所述活醣。
经检测，本实施例所得活醣中多醣体的含量为200-300g/100c.c。
为了验证本发明所述调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣的技术效果，本发明进一步提供了最具代表性的若干试验例。
试验例1
本试验例验证了实施例1所得调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣在对肝功能的保健方面的效果。
试验对象：雄性大白鼠
实验试剂(除特殊说明外)：
对照组A(也可以下简称A组，或正常控制组，下同)：正常饮食
对照组B(也可称为负对照组)：酒精处理
对照组C(也可称正对照组)：含200mg silymarin/kg bw
实验组D(也可称实验组I)：含85mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物(由实施例1所得活醣经浓缩干燥后得到，下同)
实验组E(也可称实验组II)：含255mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物(人体建议剂量)
实验组F(也可称实验组III)：含510mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物
具体实验组及对照组的饮食模式如表1所示。
除特殊说明外，各组n＝12。数据以mean±SD表示。
同栏各组若无享有同字母上标表示具统计差异(p≤0.05)。
表1实验分组及饮食模式
组别 饮食模式
对照组A 正常液态饲料
对照组B 液态酒精饲料
对照组C 液态酒精饲料+silymarin(200mg/kg bw)
实验组D 液态酒精饲料+桐核麦多醣体干燥物(85mg/kg bw)
试验组E 液态酒精饲料+桐核麦多醣体干燥物(255mg/kg bw)
试验组F 液态酒精饲料+桐核麦多醣体干燥物(510mg/kg bw)
实验方法：
雄性大白鼠饲养于台北医学大学实验动物中心，维持12小时明暗循环，温度控制在23±2℃，湿度控制在55％±10％。以Laboratory rodent diet 5001固态饲料(由美国PMI公司制造)预养一周，再以液态饲料适应两周后，进行为期八周之实验。液态饲料成分如表2。
表2液态饲料成分
1.动物饲料配制
实验动物之液态饮食参考Lieber-DeCarli之方法(Lieber and DeCarli,1994)，酒精液体饲料中酒精提供36％之热量(50g/L)，脂质提供22％热量，蛋白质提供18％热量，醣类则提供25％热量。正常液态饲料以麦芽糊精取代酒精的热量。各组之液态饲料以二次水每日制备当日用量，对照组C、实验组D、实验组E及实验组F分别于饲料中添加silymarin(200mg/kg bw)、85mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物、255 mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物及510mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物，需记录大鼠每日摄食量，并记录每周体重变化，以调整桐核麦多醣体干燥物之添加量。
2.实验流程
实验为期八周，所有实验动物分别于第零周、第二周、第四周及第六周，以尾静脉采血方式监测血液中肝功能指数aspartate aminotransferase(AST)及alanineaminotransferase(ALT)活性，并检测血中脂质triglycerides(TG)，及total cholesterol(TC)浓度。最后于第八周结束时进行牺牲，麻醉后开腹并抽取腹腔大静脉血检测肝脏相关生化指标(AST及ALT)及血脂(TG及TC)情形，并以50mL左右之0.9％生理食盐水进行肝脏灌流后取出肝脏，以生理食盐水清洗后擦干秤重，之后将最大右叶肝割取1cm×1cm固定于4％的中性福尔马林(formaline) 液中至少48小时，石蜡包封切片后分别作H&E、Masson及silver stain 进行病理学观察。另外将其余肝脏依解剖相关位置分为五袋，冰存于 -80℃，以进行检测抗氧化成分glutathione(GSH)与glutathione peroxidase(GSH Px)、glutathione reductase(GSH Rd)、superoxide dismutase(SOD)、catalase等酵素活性。
3.测定项目
3.1血清
测定与肝伤害相关之成分或酵素活性，包括：AST、ALT、TG 及TC。所有大白鼠血液样品在室温下放置一小时以使其凝结。再以冷冻离心机于4℃下每分钟12000rpm离心5分钟，来分离血清(Linet al., 1997)。
(1)AST与ALT活性以市售商业试剂组(Randox laboratories kit)进行分析。在反应剂中加入适量缓冲液混匀备用，之后取100μL血清加入1mL的稀释反应剂，于37℃、340nm下读取第0-4分钟的吸光值。
计算公式：U/L＝1746×1分钟内吸光值变化量。
(2)TG以市售商业试剂组(LabAssayTM Triglyceride，购自Wako)进行分析。在反应剂中加入适量缓冲液混匀备用，之后取2μL血清加入 300μL的稀释反应剂，于373℃、340nm下读取第0-4分钟的吸光值。
(3)TC以市售商业试剂组(Randox laboratories kit)进行分析。分别取10μLddH2O(blank)、standard或血清加入1000μL反应试剂，于 37℃培养5分钟，之后读取500nm下之吸光值数据。
计算公式：
Standard浓度:553(mg/dL)或14.3(mmol/L)
3.2肝脏
测定各种与抗氧化功能相关之成分或酵素系统，包括：glutathione (GSH)、glutathione peroxidase(GSH Px)、glutathione reductase(GSH Rd)、superoxidedismutase(SOD)及catalase。
(1)麸胱甘肽(glutathione,GSH)浓度之分析
将肝组织用冰生理食盐水(ice–cold saline)洗净，取0.3g肝脏，加入1.2mL之均质缓冲液(5％metaphosphoric acid,MPA)，使用组织均质机将肝脏均质化。将均质液于4℃下以高速离心机10000×g离心10 分钟，取上清液至1.5mL微量离心管中，储存于-80℃中待测。
使用商业试剂组(Catalog No.900-160,SH-420TM，购自OxisResearchTM)进行分析。分析原理为：加入Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)，会导致GSSG还原成GSH，加入呈色剂(4-chloro-1-methyl-7-trifluoromethyl-quinoliniummethylsulfate)，与样品所有的thiols形成thioethers，再加入碱性溶液(pH 值大于13)，进行β-elimination反应，在波长420nm下测量吸光值变化量。
反应如下:
实验步骤为加入200μL calibrator、ddH2O或肝脏上清液于离心管或cuvette中，分别加入200μL缓冲液、200μL Reducing Agent、200μL Chromogen及200μL colordeveloper混合均匀，于室温下避光培养30 分钟，读取420nm下之吸光值。
(2)麸胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH Px)活性分析
将肝组织用冰生理食盐水(ice–cold saline)洗净，取0.3g肝脏，加入1.2mL之均质缓冲液(5％metaphosphoric acid,MPA)，使用组织均质机将肝脏均质化。将均质液于4℃下以高速离心机10000×g离心10分钟，取上清液至1.5mL微量离心管中，储存于-80℃中待测。
使用商业试剂组(GPx-420TM，购自Oxis ResearchTM) 进行分析。分析原理为利用试剂组提供之药品与检体内所含之GSH Px启动下列反应：
以适当缓冲液稀释均质液，之后分别加入75μL缓冲液、75μL NADPH试剂、15μL之均质液及75μL稀释的tert-butyl hydroperoxide于 96-well盘中，读取340nm下3钟内之吸光值。
计算公式：
1mU/mL＝1nmol NADPH/min/mL＝(A340/min)/0.00622
(3)麸胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GSH Rd)活性分析
将肝组织用冰生理食盐水(ice–cold saline)洗净，取0.3g肝脏，加入1.2mL之均质缓冲液(5％metaphosphoric acid,MPA)，使用组织均质机将肝脏均质化。将均质液于4℃下以高速离心机10000×g离心10分钟，取上清液至1.5mL微量离心管中，储存于-80℃中待测。
使用商业试剂组(Randox laboratories kit)进行分析。加入适当稀释之sample40μL于cuvette中，接着加入GSSG(2.2mM)100μL， NADPH(0.17mM)200μL混合，并测5分钟内37℃环境下340nm吸光值的变化。
计算公式：U/L＝4983×△A340nm/min
(4)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性分析
将肝组织用冰生理食盐水(ice–cold saline)洗净，取0.3g肝脏，加入1.2mL之均质缓冲液(0.25M sucrose,50mM Tris HCl,5mM EDTA)，使用组织均质机将肝脏均质化。将均质液于4℃下以高速离心机10000×g离心10分钟，取上清液至1.5mL微量离心管中，储存于 -80℃中待测。
使用商业试剂组(kit，Catalog Number K028-H1，购自Arbor Assays)进行分析。本试剂组是利用SOD抑制O2 ·-(reactive oxygen species,ROS)产生之原理进行分析。
分析过程中先以SOD标准品作出标准线(standard curve)再进行分析。在96-well中加入10μL准液或均质液，再加入50μL之substrate preparation及25μL xanthineoxidase preparation至每孔中，于室温下培养20分钟，读取450nm下之吸光值。对照标准品吸光值曲线计算出样品中SOD活性。
(5)过氧化氢酶(catalase,CAT)活性分析
将肝组织用冰生理食盐水(ice–cold saline)洗净，取0.3g肝脏，加入1.2mL之均质缓冲液(0.25M sucrose,50mM Tris HCl,5mM EDTA)，使用组织均质机将肝脏均质化。将均质液于4℃下以高速离心机10000×g离心10分钟，取上清液至1.5mL微量离心管中，储存于 -80℃中待测。
使用商业试剂组(Catalog Number 707002，购自Cayman ChemicalCompany)进行分析。以H2O2分解速率评估catalase之酵素活性。
分析过程中先以CAT标准品作出标准线(standard curve)再进行分析。依序加入100μL assay buffer、30μL methanol及20μL samples。再加入20μL稀释的hydrogenperoxide，于室温下摇晃20分钟，接着加入30μL potassium hydroxide及30μL catalasePurpald，于室温下摇晃10 分钟，最后加入catalase potassium，于室温下摇晃5分钟，测量540nm 之吸光值。对照标准品吸光值曲线计算出样品中catalase活性。
(6)蛋白质浓度测定
实验参照Lowry等人(1951)之方法进行。取适量蛋白质样品，并以1N NaOH来调整使其最终体积为100μL，加入200μL去离子水及 100μL反应混合液(25％Na2CO3:2％Na-K-tartarate:1％CuSO4＝8:1:1, v/v/v)，然后在室温下静置10分钟，加入1ml Folinreagent(Folin:H2O＝ 1:19.5)后于37℃水浴20分钟，并在室温下冷却，最后在分光亮度计以 660nm下测其吸光值(25℃)。然后将标准曲线做线性回归，得一方程式，将所得样品之吸光值代入此一元一次方程式，换算后即可得知样品之蛋白质含量。
4.病理切片观察
为了观察慢性肝损伤时，肝细胞的受损、脂肪变性、坏死、纤维化等变化，因此除了将肝组织做H&E stain之外，还做网状纤维及胶原纤维的特殊染色(silver stain&Massonstain)，以便评估肝脏受损的程度。
在进行组织病理学的比较时，以Jonker等人(1992)的半定量方法，对慢性肝损伤时，肝细胞发炎的程度、脂质变性、肝细胞坏死及胆管增生等予以半定量分析。评估分数是由0到4分，其中0代表没有 (absent)；1代表少量(trace)；2分代表轻微(weak)；3分代表中等程度(moderate)；4分代表极严重(strong)。而对肝纤维化的半定量分析，则可以依据Ruward等人(1989)及Gabriele(1997)的方法，将肝纤维化区分为以下五个等级：0分代表正常肝组织、没有任何肝纤维化；1分代表有胶原的增生，但没有形成中隔(在中央静脉或门脉区有放射状纤维增生)；2分代表在中央静脉和门脉区二者间，形成不完全的中隔(此中隔彼此没有交会)；3分代表形成完整的中隔，中间彼此交会，并将肝实质分割成许多节片断，但此中隔尚很薄；4分代表形成完全的中隔，且中隔变厚，亦即完全的肝硬化。
为了避免观察主观上的偏差，所有的组织病理切片皆由最大右叶肝的同一位置切取保存，再以病理染色进行分析。病理半定量分析之评估，则委请病理学科医师，在不清楚本实验设计的情况下，对所有切片进行评分比较，最后再以统计分析方法进行各组差异性的分析。
5.统计分析
所有数值皆以mean±SD表示，各项组间数据结果利用SAS (StatisticalAnalysis System,version 9.1,SAS Institute,Cary,NC,USA) 软体以单因子变异数分析法(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)分析所得之数据，并以Fisher’sleast significant difference test 分析组间差异，当p≤0.05表示具有统计上的意义。
实验结果：
A大鼠摄食量、酒精摄取量与萃取物摄取量
摄食量方面各组无显著差异，平均每日摄食量为76.4±1.9g之液态饲料。而以酒精诱导肝伤害的B组至F组则平均每日摄取3.8±0.1g酒精。给予silymarin之正对照组C组每日实际摄取180.4±14.2mg之 silymarin。给予桐核麦多醣体干燥物组别(D组、E组及F组)每日实际摄取量分别为79.0±13.2mg、225.8±29.7mg及435.2±58.6mg桐核麦多醣体干燥物。
B大鼠体重变化情形
表3显示为实验期间各组之生长情形，其中B组的最终体重及体重变化量(酒精组，441.9±47.5g；104.0±30.5g)与A组(控制组，461.6±41.2 g；124.2±25.0g)、C组(silymarin 200mg/kg bw组，425.6±20.7g； 87.8±10.8g)、D组(桐核麦多醣体干燥物85mg/kg bw组，423.7±42.7g； 84.5±35.8g)、E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组，423.9±38.0g； 78.5±29.2g)或F组(桐核麦多醣体干燥物510mg/kg bw组，426.1±34.1g；85.7±17.9g)没有显著差异。而C组、D组、E组及F组相较于A组，体重则有显著较低的情形。以上结果显示酒精可能会影响老鼠食欲，造成摄食量降低。
表3各组老鼠体重变化
C肝脏重量与相对肝重
表4为各组老鼠之肝重及相对肝重。B组(酒精组，12.5±1.4g)、D 组(桐核麦多醣体干燥物85mg/kg bw组，11.9±1.0g)、E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组，12.0±0.7g)及F组(桐核麦多醣体干燥物510 mg/kg bw组，11.8±1.4g)之肝脏重量显著大于A组(控制组，10.8±1.2 g)，而C组(silymarin 200mg/kg bw组，11.3±0.7g)相较于A组之肝重则无显著差异。相对肝重方面，A组(13.4±0.8g)之数值显著低于其余给予酒精之组别，而给予酒精之组别中，C组(26.5±1.6g)相较于B组 (28.4±1.7g)可显著降低其相对肝重，但无法回复至A组状态，而D组 (28.1±1.4g)、E组(28.5±1.8g)及F组(27.7±1.7g)相较于B组则无显著差异。
表4各组老鼠肝脏总重及相对肝脏重量
D血液生化分析
表5为六组之aspartate aminotransferase(AST)血液检测值。在经过2周酒精喂食后，可发现B组AST值(酒精组，160.9±30.9U/L)显著高于A组(控制组，130.2±28.2U/L)，显示喂予大鼠酒精会造成血液中 AST显著增加。而以酒精喂食8周后，E组(桐核麦多醣体干燥物 255mg/kg bw组，115.5±27.8U/L)与F组(桐核麦多醣体干燥物510 mg/kg bw组，120.5±37.1U/L)之AST活性与B组(酒精组，147.9±39.3 U/L)相较显著较低，且与A组(124.8±24.0U/L)无显著差异。显示E组及F组皆可显著降低酒精诱发肝伤害之大鼠血清中AST活性。
表5AST血液检测值(U/L)(AST:aspartate aminotransferase)
表6为六组之alanine aminotransferase(ALT)血液检测值。在经过2 周酒精喂食后，可发现B组ALT值(60.1±9.0U/L)显著高于A组(控制组， 47.2±9.7U/L)，显示喂予大鼠酒精会造成血液中ALT显著增加。而以酒精喂食8周后，D组(桐核麦多醣体干燥物85mg/kgbw组，50.6±7.6 U/L)、E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组，49.5±13.0U/L)与F 组(桐核麦多醣体干燥物510mg/kg bw组，46.3±8.3U/L)之AST活性与B组(酒精组，64.3±34.1U/L)相较显著较低，且F组与A组(36.4±9.1 U/L)无显著差异。喂予桐核麦多醣体干燥物之三组间亦无显著差异。显示桐核麦多醣体干燥物可以显著降低酒精诱发肝伤害之大鼠血清中ALT活性。
表6ALT血液检测值(U/L)(ALT:alanine aminotransferase)
表7为六组之三酸甘油酯血液检测值。喂予酒精之组别，其血清中TG浓度显著低于A组(控制组，53.1±17.0mg/dL)。实验8周后B组 (酒精组，41.1±12.7mg/dL)与C组(silymarin 200mg/kg bw组，36.2±9.0 mg/dL)、D组(桐核麦多醣体干燥物85mg/kg bw组，35.7±7.2mg/dL)、 E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组，45.0±15.7mg/dL)及F组(桐核麦多醣体干燥物510mg/kg bw组，47.8±10.0mg/dL)间TG浓度均无显著差异，显示C组、D组、E组及F组对血清中TG并无显著影响。
表7TG血液检测值(mg/dL)(TG:triglycerides)
表8为六组之总胆固醇(total cholesterol,TC)血液检测值。喂予酒精6周后，B组(酒精组，194.1±28.6mg/dL)、C组(silymarin 200mg/kg bw 组，184.9±26.5mg/dL)、D组(桐核麦多醣体干燥物85mg/kg bw组， 186.6±32.0mg/dL)及E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组， 185.1±21.4mg/dL)大鼠血清TC值显著高于A组(控制组，154.7±28.2mg/dL)，F组(桐核麦多醣体干燥物510mg/kg bw组，148.0±28.1mg/dL) 之TC则显著降低与A组无异。8周后喂予sylimarin或桐核麦多醣体干燥物的组别：C组(118.2±21.6mg/dL)、D组(120.8±20.8mg/dL)、E组(109.3±21.9mg/dL)及F组(109.6±20.0mg/dL)相较于B组皆可以显著降低血清中TC浓度，且与A组无显著差异。显示silymarin及桐核麦多醣体干燥物可以降低酒精诱发肝伤害之大鼠血清中TC浓度，并回复至正常的数值。
表8TC血液检测值(mg/dL)
E肝脏中抗氧化物质浓度与抗氧化酵素活性
表9为肝脏中抗氧化物glutathione(GSH)之浓度。相较于A组(控制组，1156.8±183.7μM)，大鼠喂予酒精8周后，glutathione有显著降低的情形，B-F组分别为855.8±87.7μM、733.3±129.6μM、649.9±111.5 μM、666.1±97.1μM及727.6±101.6μM。而喂予silymarin或桐核麦多醣体干燥物皆无明显提升其肝脏glutathione之浓度。
表9肝脏抗氧化物浓度
组别 Total glutathione(μM)
A 1156.8±183.7a
B 855.8±87.7b
C 733.3±129.6c
D 649.9±111.5c
E 666.1±97.1c
F 727.6±101.6c
表10为肝脏中麸胱甘肽氧化还原状态。麸胱甘肽过氧化酶 (glutathioneperoxidase,GSH Px)活性方面，相较于A组(控制组， 33.8±16.6mU/mg protein)，B组(酒精组，10.4±4.2mU/mg protein)之GSH Px活性显著下降，而喂予桐核麦多醣体干燥物的D组(桐核麦多醣体干燥物85mg/kg bw组，18.2±3.9mU/mg protein)及F组(桐核麦多醣体干燥物510mg/kg bw组，18.1±6.6mU/mg protein)，可以提升肝脏GSH Px活性，而E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组，16.5±5.8 mU/mg protein)相较于B组虽没有显著上升，但E组相较于D组及F组，亦无显著差异。而麸胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GSH Rd)方面，在喂予sylimarin或桐核麦多醣体干燥物的组别(C-F组)，相较于B 组(酒精组，2.0±0.8U/mg protein)有提升肝脏GSH Rd活性的趋势，分别上升为2.4±0.8U/mg protein、2.9±0.8U/mg protein、2.6±0.5U/mg protein和2.8±1.0U/mg protein，而其中D组相较于B组显著提升肝脏 GSH Rd活性。
表10肝脏麸胱甘肽氧化还原状态
表11为肝脏中抗氧化酵素活性变化情形。其中超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase,SOD)之活性，相较于A组(控制组，146.9±39.8 U/g protein)，大鼠喂予酒精8周后，SOD之活性有显著降低的情形， B-F组分别为69.3±33.7U/g protein、71.1±38.7U/g protein、73.5±33.4 U/g protein、76.8±27.3U/g protein及77.7±45.9U/gprotein。喂予桐核麦多醣体干燥物的组别(D-F组)则随剂量增加，SOD活性有上升趋势。而过氧化氢酶(catalase)之活性，在喂予sylimarin或桐核麦多醣体干燥物的组别，相较于B组(酒精组，7.2±1.9nmol/min/mg protein)可以显著提升其catalase之活性，分别上升为10.4±3.1nmol/min/mg protein、11.1±2.6nmol/min/mg protein、11.4±3.2nmol/min/mg protein和11.2±2.0 nmol/min/mg protein，且与A组(控制组，9.4±1.8nmol/min/mgprotein) 无统计上差异。显示sylimarin或桐核麦多醣体干燥物有显著于提升肝脏catalase活性。
表11肝脏抗氧化酵素的活性
组别 SOD(U/g protein) Catalase(nmol/min/mg protein)
A 146.9±39.8a 9.4±1.8a
B 69.3±33.7b 7.2±1.9b
C 71.1±38.7b 10.4±3.1a
D 73.5±33.4b 11.1±2.6a
E 76.8±27.3b 11.4±3.2a
F 77.7±45.9b 11.2±2.0a
F肝脏组织病理切片
表12为肝脏之中央静脉区及中央区切片分析结果。其中B组(酒精组，1.0±0.2)中央静脉区脂肪之微量变化显著高于A组(控制组， 0.2±0.2)，喂予sylimarin或桐核麦多醣体干燥物后，则可以显著降低其微量脂肪变化，数值分别为0.4±0.4、0.4±0.3、0.2±0.3和0.2±0.2。而喂予sylimarin、E组(桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw组)及F组 (桐核麦多醣体干燥物510mg/kg bw组)，亦可以显著抑制其肝脏脂肪的巨量变化，数值分别为0.1±0.2、0.0±0.0和0.0±0.0。而相较于B组 (酒精组，0.8±0.3)，E组及F组也能有效降低肝脏中央静脉区的发炎情形，分别为0.3±0.1及0.4±0.4。分析肝脏纤维化之H&E、Masson及Silver染色结果发现，喂予酒精(B组)诱导肝伤害的模式，会导致脂肪堆积在肝脏中，造成轻微脂肪肝，但较不易造成纤维化的伤害。而中央区的结果也显示B组(酒精组)会显著提升脂肪量及发炎情形，喂予 sylimarin或桐核麦多醣体干燥物后，则有降低中央区脂肪变化的趋势，且C组(silymarin 200mg/kbw)及D组(桐核麦多醣体干燥物85 mg/kg bw组)可以显著抑制中央区的发炎情形。
表12肝脏切片的中央静脉区及中央区比较
表13为肝脏之门脉区切片分析结果。本实验结果发现喂予大鼠8 周酒精对于肝脏门脉区并无显著影响。
表13肝脏切片的门派区比较
结果分析：
由结果显示喂予Wistar大鼠每日平均3.8±0.1g酒精，8周后会造成大鼠肝重及相对肝重增加，增加其血清中AST及ALT活性与TC浓度，降低血清中TG浓度。肝脏中抗氧化物质glutathione会显著降低，抗氧化相关酵素，如：SOD、catalase、GSH Px及GSH Rd活性降低，且经由肝脏切片结果显示，脂肪会堆积在肝脏中，产生轻微脂肪肝，造成酒精性肝伤害。
经过8周实验期后，喂予酒精性肝伤害之Wistar大鼠桐核麦多醣体干燥物255mg/kg bw及510mg/kg bw，可以显著降低其血清中AST及 ALT活性与TC浓度。且85mg/kg bw-510mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物有助于提升肝脏catalase及GSH Px活性。而肝脏切片结果也显示，喂予85mg/kg bw-510mg/kg bw桐核麦多醣体干燥物后，则有降低中央区脂肪变化的趋势，且桐核麦多醣体干燥物85mg/kg bw组可以显著抑制中央区的发炎情形。
上述实验结果表明，本发明所述活醣在保护肝脏的功能方面具有显著/突出的效果。
试验例2
本试验例验证了实施例1所述活醣在延缓衰老及增强记忆力方面方面的效果
试验对象：小鼠
对照组无服用、
实验组1低剂量组B Group(7.69mg/day)、(实施例1所制得活醣的干燥物，下同)
实验组2中剂量组C Group(15.38mg/day)
实验组3高剂量组D Group(30.76mg/day)
实验方法：
(1)活动量测试：首先将小鼠置于25cm3的铝箱中央，测其局部行为活动量的情形，小鼠在环境光线微弱且寂静的环境下操作，各组小鼠进行此测试，全程录影观测小鼠平面移动的时间之活动量，每 5分钟透过记录器记录，每只老鼠全程为10分钟，主要目的为了解小鼠平面步移之情形，作为其活动量评估之依据，并筛选活动异常的小鼠予以淘汰；
(2)老化指数评估：评估项目包括有行为方面：观察小鼠30秒内的探索反应及捏颈背皮肤时的逃避反应；外表方面：观察毛发的光泽度、粗糙度、毛发脱落的情形及皮肤溃疡的状况；眼睛方面：观察眼睛周围处黏膜炎或眼睑的水肿情形；以及视察和触摸脊柱前后弯的变化，每个项目各有5个等级，分别是0、1、2、3及4，依各项等级之定义给予评分，分数愈高者，则表示老化现象越严重，下表为老化指数判定标准。
(3)单次被动回避试验：经过活动量测试之后，进行单次被动回避试验，以观察其学习记忆能力，此乃使用一35W×17D×20H cm3之铝箱，分成明室及暗室，其中央有一7.5W×6.5D cm2之小闸门相隔并可相通，箱底设有间隔1cm平行排列的金属杆，并接上电流器，测试时，先将小白鼠放在明室，待10秒环境适应后，打开两室间的小闸门，使其自由探索，由于小白鼠有趋暗的夜行性行为，一旦小白鼠进入暗室，迅速关上小闸门，五秒钟后给于0.5微安培0.5秒之电击，每次间隔5秒连续三次，并记录其在明室中滞留的时间，即完成学习训练。此后在训练完成后分别测其24小时、48小时、72小时及 7天的记忆能力，测试时采同样方法操作，但此时不再给予任何电击，每次测试时间最大期限为180秒，滞留明室的时间越长，表示小鼠记忆能力越佳；
(4)主动回避试验：经过活动量测试后，进行主动回避试验，此乃使用一35W×17D×20H cm3之铝箱，分成两个箱室，其中央有一 7.5W×6.5D cm2之小闸门相隔并可相通，箱底设有间隔1cm平行排列的金属杆，并接上电流器，实验流程全由电脑程序设计控制时间、声光及电击，测试时，先将小白鼠放置一边，待适应10秒钟后，电脑随即出现10秒钟的光及声音的刺激，假如小白鼠处在CS系统下，仍然停留在同一边无任何反应，则电脑随即给予5秒钟0.3毫安的电击一次；若小白鼠在CS系统下进入另一边，即不给予电击，电脑会依老鼠的反应自动出现CS及UCS的状态，每只老鼠一次接受5回的 CS及UCS的测试，然后将老鼠放回鼠笼中，间隔15-20分钟后以相同的CS及UCS的操作流程4次，连续4天，此测试求其于CS系统下回避反应的次数，判定喂食不同剂量后，对小白鼠学习记忆能力之影响。
试验结果：
生化分析
血液：于第12周采集血液于离心管中以作分析。采血前一天小鼠禁食8小时，使用麻醉剂麻醉后，经由眼窝抽取血液样本。血液采集完毕后牺牲，于3000rpm、4℃下离心15分钟，将上清液之血清取出分装，并进行血液生化分析，分析项目如下：白蛋白(Albumin)、总蛋白(total protein)、丙酮酸转胺酶(GPT)、天门冬胺酸转胺酶(GOT)、尿素氮(BUN)、胆固醇(cholesterol)、三酸甘油酯(Triglycerides)。分析结果显示补充菇蕈多醣体不会造成营养不足引发之营养失调现象，也不会对血脂或肾脏功能造成不良影响。
肝脏：小鼠牺牲后取出肝脏组织，进行肝脏抗氧化分析：麸胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase；GPx)、超氧歧化酶(superoxide dismutase；SOD)、丙二醛(malondialdehyde；MDA)，分析结果显示显示补充菇蕈多醣体可提高体内sod活性，增加抗氧化之能力并且减少过氧化物的生成。
脑：小鼠牺牲后摘取完整脑部置于冰上迅速分为皮质与海马回，储存于-80℃之冷冻柜，尽快进行iNOS分析。而8羟基-2’-脱氧鸟票呤核甘(8-hydroxy-2-deoxy Guanosine；8-OHdG)则利用全脑测定，测定结果显示补充活醣可以减少脑部皮质与海马回中iNOS含量，减少脑部发炎反应与氮自由基造成的氧化伤害。
试验例3
本试验例验证了实施例1所述活醣在免疫调节方面的效果
试验对象：
负对照组蒸馏水
实验组1低剂量组B Group(2.6mL/KG)(实施例1所制得活醣，下同)
实验组2中剂量组C Group(5.2mL/KG)
实验组3高剂量组D Group(13mL/KG)
实验方法：
1.免疫细胞增生能力:
在喂食试验物质连续十周并在喂食期间给予两次OVA(卵蛋白，作为致敏物质)后，取出试验动物之脾脏细胞，以刺激物(Concanavalin A,ConA:Lipopolysaccharide,LPS或Ovalbumin,OVA)刺激后，再以 CellTiter96Aqueous One Solution Reagent测定，比较个剂量组与负对照组有无差异性存在。
2.细胞激素分泌功能:
在喂食试验物质连续十周并在喂食期间给予两次OVA，取出试验动物之脾脏细胞，以刺激物(ConA、LPS或OVA)培养48-72小时，以酵素连结免疫分析法(ELISA)测得细胞激素分泌量，比较个剂量组与负对照组有无差异存在。
3.细胞表面抗原生成:
在喂食试验物质连续十周并在喂食期间给予两次OVA后，取出试验动物之免疫细胞，加入专一性表面抗体作用后，以流式细胞仪分析细胞表面抗原之百分比，比较各剂量组与负对照组有无差异性存在。
4.OVA诱发特异性抗体生成
于试验前、OVA致敏前、第二次致敏前与试验动物牺牲时采血，利用ELISA以追踪血清中OVA特异性IgG、IgM及IgE浓度，比较各剂量组与负对照组有无差异性存在。
实验结果：
细胞激素IL-2具有调节T细胞功能，增强其抑杀肿瘤或外来病菌的活性及促进T细胞增殖，IL-2也可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞长期生长。肿瘤病人经IL-2治疗后，血中NK细胞数量明显增加，进而提升整体免疫系统的防御能力。
IgM(Immunoglobulin M)是抗原刺激诱导体液免疫反应中最先产生Ig的，IgM不是细胞，但可结合补体，主要分布于血清中。由于 IgM有较高的结合价，所以是高效能的抗生物抗体，其杀菌、溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG高500-1000倍，IgM在有机体的早期防御中起着重要的作用。
IgG(Immunoglobulin G)是血清免疫球蛋白的主要成分，它占总的免疫球蛋白的75％，是初级免疫中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中是主要一群，它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用(调理作用)，中和细菌毒素的毒性(中和毒素)和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力(中和病毒)。IgG在机体合成的年龄要晚于 IgM，在出生后第3个月开始合成，3-5岁接近成年人水平。它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用。
具体实验数据详见图1-图3，图1-图3的实验数据表明，实施例1 所述活醣在免疫调节方面具有显著效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种制备调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣的方法，其特征在于，将纳豆菌和蛹虫草菌分别接菌至液体培养基，向所述液体培养基中分别加入酵母葡聚糖，各自经发酵培养后分离液态产物，合并所述液态产物，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基包括：蔗糖：20～80g/L；麦芽萃取物：5～40g/L；玉米浆：5～40g/L；硫酸镁：0.1～2g/L；磷酸氢钾：0.1～2g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养基的pH值为5～7。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述酵母葡聚糖相对于所述液体培养基的用量为10-20g/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养的中后期向体系内加入0.05～0.5％的维他命B群。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养的中后期向体系内加入0.5～5％的麸胺酸钠。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度均为24～32℃；培养时间均为190±20hr。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括发酵培养结束后对发酵体系进行的灭菌处理，所述灭菌处理的条件为121±10℃下15～20分钟。
9.权利要求1-8任一项方法制备得到的调节免疫、修护肝损伤及促脑力发展的活醣。
10.一种含有权利要求9所述活醣的活醣饮品。
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