CN107964066B - 功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在（ptm）蛋白质检测中的应用 - Google Patents

功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在（ptm）蛋白质检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在(PTM)蛋白质检测中的应用。该功能化温度敏感型聚合物的结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ中，R为CH2，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；为辣根过氧化物酶单元。本发明的功能化温度敏感型聚合物是通过自由基聚合反应得到的带有大量可修饰位点的线型聚合物，经功能化修饰后可得到携带多个HRP和大量三苯基磷基团的温度敏感型聚合物。与传统方法中使用只携带单个HRP的抗体策略相比，HRP和三苯基磷基团数量的增加可有效提高其与叠氮标记目标蛋白的结合能力以及化学发光的信号放大效果。

Description

功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在（PTM）蛋白质检 测中的应用
技术领域
本发明涉及功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在(PTM)蛋白质检测中的应用，属于分析技术领域。
背景技术
蛋白质免疫印迹法(Western Blot，WB)是一种检测复杂生物样本中蛋白质表达与分布的分析技术，已在生物学研究中广泛应用数十年，可以进行定性及半定量分析，是现代生物医学、生物化学及免疫遗传学等领域研究的有力工具。在此技术中，目标蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜，使用抗体进行孵育识别目标蛋白，并通过抗体连接酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))与底物进行化学发光反应，从而显色产生颜色信号达到检测目的。传统的WB技术是基于抗体对目标蛋白的特异性识别进行检测，因此WB检测的特异性和灵敏度主要依赖于抗体的质量和所连接HRP的性能。在WB检测中抗体可能会对其他非目标蛋白产生非特异性吸附而出现假阳性结果，而且抗体本身存在制备周期长和批次不稳定等缺点，特别是针对蛋白质翻译后修饰 (Post-translational modifications，PTMs)的WB检测仍然存在很多难点。PTMs是指在蛋白质的不同氨基酸侧链发生的各种动态化学修饰，参与各种细胞进程并对蛋白质进行功能调控，修饰种类和修饰含量的异常与多种人类重大疾病密切相关，因此深入检测分析PTMs能够为疾病的发生发展研究、疾病诊断标志物的发现提供有意义的靶点信息。但因其种类繁多且丰度普遍较低，对其分析手段提出了严峻的挑战。研究发现在使用抗体进行蛋白质PTMs的WB分析时，抗体往往对蛋白质的氨基酸序列和结构域存在一定依赖和偏性，难以高特异性的识别和分辨体积较小的PTMs，例如磷酸化修饰或O-GlcNAc糖基化修饰等。此外，对于糖基化修饰或精氨酸/组氨酸磷酸化修饰，因其免疫原性差或高度不稳定，开发抗体本身就极具挑战，因此极大的限制了 WB技术在PTMs研究中的应用。同时抗体所连接的HRP数量少，信号放大倍数有限，因此其检测灵敏度较差。近年来针对这些问题也发展了以纳米颗粒、石墨烯氧化物等作为固相载体固载多种抗体并连接大量HRP以增强其化学发光信号，从而提高WB 灵敏度的策略。然而在孵育时固载在不溶性载体上的抗体与PVDF膜上的目标蛋白形成异相反应体系，导致显著的界面传质阻力、非线性反应动力学以及空间位阻，从而限制了WB的检测灵敏度和定量精度。因此，针对WB技术，迫切需要发展针对目标蛋白新的识别机制和信号放大策略。
发明内容
本发明的目的是提供功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与在(PTM)蛋白质检测中的应用，通过自由基聚合反应和化学修饰三苯基磷基团和HRP的方式制备得到功能化温度敏感型聚合物，利用该聚合物的温度响应特性能够实现高特异性和高灵敏度的叠氮标记(PTM)蛋白质WB检测。
本发明提供的功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ中，R为CH2，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120 之间的任意自然数；为辣根过氧化物酶单元。
在本发明的实施例中，式Ⅰ所示聚合物具体可为下述式Ⅰ-A所示聚合物，
式Ⅰ-A中，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；为辣根过氧化酶单元。
本发明提供的上述功能化温度敏感型聚合物(式Ⅰ所示聚合物)的制备方法，包括如下步骤：
(1)在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到式Ⅱ所示温度敏感型聚合物；
所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)；
所述功能单体为丙烯酸(AA)或丁烯酸；
式Ⅱ中，R为CH2，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120 之间的任意自然数；
(2)式Ⅲ所示辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)和式Ⅳ所示施陶丁格试剂(NHS-triarylphosphine，NHS-Phosphine)发生亲核取代反应，得到式Ⅴ所示功能试剂；
(3)式Ⅱ所示温度敏感型聚合物与式Ⅴ所示功能试剂经氨基-羧基偶联反应，得到式Ⅰ示聚合物。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述温敏单体与所述功能单体的摩尔比可为1： 1～7：1，具体可为4：1。
所述引发剂可为过硫酸钾、过硫酸铵和过硫酸钠中任一种。
所述引发剂的用量可为所述温敏单体质量的5％～50％，具体可为10％。
所述自由基聚合反应的温度可为50～80℃，具体为70℃，时间可为8～12小时，具体为10小时。
所述自由基聚合反应在水中进行。
所述自由基聚合反应在惰性气氛中进行，如氮气或氩气气氛。
所述自由基聚合反应的pH值控制在7.0～7.5，具体可为7.0。
上述的制备方法，步骤(2)中，式Ⅳ所示施陶丁格试剂与式Ⅲ所示辣根过氧化物酶的比例可为(0.5～2)mM：(5～20)mg/mL，具体可为2mM：20mg/mL。具体地，所述施陶丁格试剂的反应浓度可为0.5～2mM，具体为2mM；所述辣根过氧化物酶的反应浓度可为5～20mg/mL，具体为20mg/mL。
所述亲核取代反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃；时间可为0.5～2小时，具体可为2小时。
所述亲核取代反应可在磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)与有机溶剂的混合液中进行；所述有机溶剂可为二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺；所述磷酸盐缓冲液与所述有机溶剂的体积可比为20：1～4：1，具体可为4：1。
所述亲核取代反应的具体步骤如下：将溶液A和溶液B混合即可完成所述亲核取代反应；所述溶液A由所述辣根过氧化酶和磷酸盐缓冲溶液组成；所述溶液B由所述施陶丁格试剂和所述有机溶剂组成。
上述的制备方法，步骤(3)中，式Ⅱ所示温度敏感型聚合物与式Ⅴ所示功能试剂的质量比为1：1～1：6，具体可为1：1。
所述氨基-羧基偶联反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃；时间可为2～12小时，具体可为12小时。
所述氨基-羧基偶联反应在2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液(MES缓冲溶液)中进行；
所述氨基-羧基偶联反应的pH值，活化阶段应控制在4.7～6.0，具体可为5.0，, 反应阶段应控制在7.2～7.5，具体可为7.2。
本发明进一步提供了一种上述式Ⅰ所示聚合物在温度为33～45℃形成的自组装产物。所述自组装产物为亚微米级颗粒。
本发明进一步提供了上述式Ⅰ所示聚合物或其自组装产物在采用蛋白质免疫印迹法(WB)对叠氮标记的蛋白质或其翻译后修饰的检测分析中的应用。
一种利用上述式Ⅰ所示聚合物或其自组装产物采用蛋白质免疫印迹法(WB)对叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰的检测分析的方法，其通过式Ⅰ所示聚合物中的三苯基磷与所述叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰中的叠氮基团之间的施陶丁格连接反应，与吸附于PVDF膜上的叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰进行特异性结合，并利用式Ⅰ所示聚合物的温度响应特性导致的自组装行为，实现所述叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰的检测分析。
所述方法的具体步骤如下：
(1)将叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰样品进行SDS-PAGE分离并转移到PVDF 膜上，封闭；
(2)将式Ⅰ所示聚合物溶解于含有表面活性剂的缓冲溶液中，将其与PVDF膜接触孵育进行所述施陶丁格连接反应，升高温度使式Ⅰ所示聚合物在目标蛋白区域内自组装聚集；
(3)使用所述含有表面活性剂的缓冲溶液清洗PVDF膜除去非特异性吸附的式Ⅰ所示聚合物及其自组装，对清洗后的PVDF膜进行化学发光检测。
步骤(1)中，所述叠氮标记蛋白质样品通过对蛋白质或其翻译后修饰(PTM) 进行叠氮标记制备得到；
所述标记采用细胞代谢标记或体外酶催化标记；
所述细胞代谢标记的具体步骤如下：培养细胞时，在培养液内添加带有叠氮标签的代谢标记底物(如乙酰化N-叠氮乙酰葡萄糖胺(Ac3-6AzGlcNAC)、L-叠氮高丙氨酸(AHA)或叠氮棕榈酸(APD)等)，浓度为50-200μM，优选200μM，代谢标记 4-24h，优选24h；然后提取细胞全蛋白。
步骤(2)中，所述孵育步骤中，三苯基磷与叠氮反应，使式Ⅰ所示聚合物与PVDF 模上的目标蛋白共价结合。
所述孵育步骤中，所述式Ⅰ所示聚合物的浓度可为0.1～1.0mg/mL，优选0.5 mg/mL。
所述孵育的时间可为2～12小时，优选4小时。
所述含有表面活性剂的缓冲溶液为pH为7～8的含有0.05wt％吐温20的PBS缓冲溶液(PBST)和Tris-HCl缓冲溶液(TBST)中任一种，优选PBST。
所述孵育温度为0～30℃，优选25℃；所述升高温度为40-60℃，优选40℃。
上述方法可用于叠氮标记的标准(PTM)蛋白或叠氮标记的复杂(PTM)蛋白质样本的Western-Blot检测。
本发明还提供了用于蛋白质免疫印迹法的试剂盒：其活性成分为上述式Ⅰ所示聚合物。
用于蛋白质翻译后修饰的蛋白质免疫印迹法的试剂盒：其活性成分为上述式Ⅰ所示聚合物。
本发明提供的基于功能化温度敏感型聚合物的叠氮标记(PTM)蛋白的WB检测基于如下原理：功能化温度敏感型聚合物可通过三苯基磷与叠氮基团之间高选择性和生物正交的施陶丁格连接反应，与吸附于PVDF膜上的叠氮标记(PTM)蛋白质进行特异性结合；且此聚合物上负载了多个HRP，可有效放大HRP催化的化学发光反应的信号。更为重要的是，该聚合物具有温度响应特性。升高温度，可使温度敏感型聚合物发生自组装，大量聚合物团聚生成亚微米级颗粒。PVDF膜经反复清洗后，只有包含与PVDF膜上叠氮标记(PTM)蛋白共价偶联的聚合物链的聚合物团聚亚微米颗粒仍保留在PVDF膜上，而其他非特异性吸附在PVDF膜上的聚合物团聚亚微米颗粒则被清洗去除。基于以上原理，温度敏感型聚合物团聚亚微米颗粒只存在于叠氮标记的目标(PTM)蛋白所在的区域内，不会与其它非标记的蛋白发生非特异性结合。聚合物团聚亚微米颗粒包含大量HRP，从而进一步大幅度放大了基于HRP的化学发光信号，因此该两级信号放大策略显著提高了叠氮标记低丰度(PTM)蛋白质的WB检测灵敏度。
本发明具有以下优点：
1)本发明的温度敏感型聚合物是通过自由基聚合反应得到的带有大量可修饰位点的线型聚合物，经功能化修饰后可得到携带多个HRP和大量三苯基磷基团的温度敏感型聚合物，即功能化温度敏感型聚合物。与传统方法中使用只携带单个HRP的抗体策略相比，HRP和三苯基磷基团数量的增加可有效提高其与叠氮标记目标蛋白的结合能力以及化学发光的信号放大效果；
2)本发明对叠氮标记PTM蛋白质的检测原理是基于叠氮与三苯基磷间的施陶丁格连接反应，此反应具有特异性好、生物正交性强，在水溶液中产率高，不需要催化剂等优势，特别适合用于复杂样本中目标蛋白质的检测，与传统抗体检测方法相比，可降低非特异性吸附和假阳性结果；同时叠氮标签的细胞代谢标记可应用于多种蛋白质PTM，如糖基化、甲基化等，说明该功能化温度敏感型聚合物检测方法具有良好的通用性；
3)本发明功能化温度敏感型聚合物是水溶性线性聚合物，与其他固相/不溶性载体材料相比显著降低了与PVDF膜孵育过程中的传质阻力和空间位阻，有利于三苯基磷与叠氮的反应连接，提高反应效率；
4)利用本发明功能化温度敏感型聚合物的温度响应特性，通过改变外界温度准确控制该温敏聚合物在水溶液中的溶解性，升高温度引发聚合物自组装团聚为亚微米颗粒，使得目标蛋白周围的聚合物及其所携带HRP的数量显著增加，同时通过反复洗涤除去其他未与PVDF膜上的叠氮标记目标蛋白共价结合的聚合物团聚，在大幅度提高化学发光的信号和检测灵敏度的同时，保证WB检测的特异性。
附图说明
图1为本发明所述功能化温度敏感型聚合物的合成路线图。
图2为实施例中式Ⅰ-A所示功能化温度敏感型聚合物的凝胶渗透色谱曲线，其中，自上至下第一条曲线为功能化温度敏感型聚合物的凝胶渗透色谱曲线。
图3为HRP和本发明所述功能试剂HRP-Phosphine的反相液相色谱图。
图4为实施例中式Ⅰ-A所示功能化温度敏感型聚合物的X射线光电子能谱分析曲线，其中，自上至下第二条曲线为温度敏感型聚合物，自上至下第一条曲线为三苯基磷基团和HRP修饰的温度敏感型聚合物，也即所述功能化温度敏感型聚合物。
图5为不同温度条件下功能化温度敏感型聚合物的水合半径分析曲线及相应温度响应图片。
图6为使用本发明所述功能化温度敏感型聚合物检测叠氮标记蛋白质的实验流程图。
图7a为使用功能化温度敏感型聚合物对叠氮标记的标准O-GlcNAc修饰蛋白α-crystallin的WB检测分析图；图7b为使用商业化抗体对标准O-GlcNAc修饰蛋白α-crystallin的WB检测分析图。
图8为使用功能化温度敏感型聚合物对叠氮标记的O-GlcNAc修饰标准蛋白α-crystallin和牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、碳酸酐酶混合物检测分析图。
图9为通过细胞代谢标记得到的叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白，图9a为使用功能化温度敏感型聚合物经过加热处理的WB检测分析图；图9b为使用功能化温度敏感型聚合物无加热处理的WB检测分析图。
图10为通过细胞代谢标记，并使用O-GlcNAc修饰水解酶抑制剂处理细胞前(-)、后(+)，得到的叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白；图10a为使用功能化温度敏感型聚合物的WB检测分析图；图10b使用商业化抗O-GlcNAc修饰抗体的WB检测分析图。
图11a为通过代谢标记在新生蛋白质上引入叠氮标签，并使用叠氮标记抑制剂处理细胞前(-)、后(+)，使用功能化温度敏感型聚合物的WB检测分析图；图11b为通过代谢标记在蛋白质棕榈酰化修饰上引入叠氮标签，并使用氨水处理蛋白质样品前 (-)后(+)，使用功能化温度敏感型聚合物的WB检测分析图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)的配制步骤如下：称取氯化钠8g，氯化钾200mg，磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾270mg于1L烧杯中，加入800mL 去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调至7.4，最后使用去离子水定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存备用。
MES缓冲溶液(pH＝5.0)的配制步骤如下：称取2.132g MES溶于190mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加1M NaOH将pH调至5.0，最后使用去离子水定容至200 mL，4℃保存备用。
PBST缓冲溶液(pH＝7.4)的配制步骤如下：取50μL吐温20加入到100mLPBS 中，混匀后使用，现用现配。
100mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)的配制步骤如下：称取Hepes 1.3g，NaCl 1.6g，Na2HPO4 21mg溶于80mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加0.5M NaOH将pH调至 7.9，最后使用去离子水定容至100mL，高温高压灭菌后4℃保存，使用时用去离子水稀释至20mM。
实施例1、功能化温度敏感型聚合物的制备以及性能测试
1、制备
按照图1所示合成路线制备功能化温度敏感型聚合物，具体步骤如下
(1)温度敏感型聚合物的合成：在引发剂存在的条件下，温敏单体与功能单体进行自由基聚合反应，得到式Ⅱ-A所示温度敏感型聚合物Poly(NIPAM-co-AA)。具体如下：
称取0.8g N-异丙基丙烯酰胺于50mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水使其充分溶解，加入0.12mL丙烯酸，搅拌混匀，用1M NaOH调节pH＝7.0。然后通N2磁力搅拌1h以充分除去O2，1h后，撤去N2装置，将圆底烧瓶进行密封，瓶口塞上塞子并包上封口膜，升温至70℃。称取过硫酸钾80mg溶于一定量的除氧后的去离子水中，通过注射器缓慢滴入上述圆底烧瓶中，磁力搅拌，70℃聚合10h。聚合完成后，使用旋转蒸发仪进行悬蒸浓缩，最终产物转移至分子量为3000的透析袋中，去离子水透析，每2h更换一次去离子水，透析48h后，使用冷冻干燥机冷冻干燥成白色絮状固体，-20℃保存，备用。
式Ⅱ-A中，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数。
(2)功能试剂的合成：利用式Ⅳ所示NHS-Phosphine上的N-羟基琥珀酰亚胺基与式Ⅲ所示HRP上的氨基发生亲核取代反应，得到式Ⅴ所示功能试剂HRP-Phosphine。具体如下：
1mg NHS-Phosphine溶于0.2mL DMF中，20mg HRP溶于0.8mL PBS缓冲溶液 (pH＝7.4)中，两种溶液混合均匀，室温(25℃)反应2h，反应完成后使用30KDa 超滤管除去未反应的反应物及杂质，得到HRP-Phosphine，-20℃保存，备用。
(3)功能试剂修饰的温度敏感型聚合物的合成：利用式Ⅴ所示功能试剂中HRP 上的氨基与式Ⅱ所示温度敏感型聚合物上的羧基进行氨基-羧基偶联反应进行功能试剂修饰。具体如下：
称取20mg的Poly(NIPAM-co-AA)溶于1mL MES缓冲溶液(pH＝5.0)中，同时加入2mMEDC和5mM NHS室温(25℃)活化15min，活化完成后加入20mg HRP-Phosphine和2mM EDC和5mM NHS混匀，用1M NaOH调节pH＝7.2，室温(25℃) 下反应12h，反应完成后，用100KD超滤管进行纯化以除去未反应物质，得到三苯基磷和HRP修饰的温度敏感型聚合物(式Ⅰ-A所示聚合物)，即功能化温度敏感型聚合物。
式Ⅰ-A中，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；其中，为辣根过氧化酶单元。
2、表征
对所制备的温度敏感型聚合物的分子量进行分析，所得结果如图2。由图2通过保留时间换算出其分子量为138KDa，分散度为1.333。可知该温度敏感型聚合物的分子量分布较窄，可具有较为均一的温度响应性质。
对所制备的功能试剂HRP-Phosphine和HRP进行C4反向液相色谱分析，所得结果如图3。由于NHS-Phosphine带有大量的疏水基团，因此在反相液相色谱中 HRP-Phosphine的保留时间会较原有的HRP有所延迟。由图3可知修饰NHS-Phosphine 后的HRP保留时间为10.4min，而未修饰的HRP保留时间为10.2min，说明HRP上成功修饰了三苯基磷基团，得到功能试剂HRP-Phosphine。
对所制备的功能化温度敏感型聚合物在各个合成阶段的产物分别进行X射线光电子能谱分析，所得结果见图4。由图4可知，经HRP-Phosphine修饰后的温度敏感型聚合物(从上至下第1条)在130～135eV处有明显的磷元素的特征峰出现，第一步合成的温度敏感型聚合物(从上至下第2条)在此处没有磷元素的特征峰出现，由此证明了三苯基磷基团和HRP已成功修饰到了温度敏感型聚合物上。
3、性能测试
使用动态光散射仪对所制备的功能化温度敏感型聚合物在不同温度条件下的水合半径和温度响应进行分析，所得结果见图5。由图5可知，当环境温度低于材料的最低临界响应温度时，聚合物链的亲水性酰胺基团可以与水形成氢键，从而可以与水相具有良好的互溶，直观表现是形成澄清透明的溶液。从33℃左右开始，聚合物的水合半径随温度升高不断增大，说明聚合物开始团聚。随着温度的进一步升高，聚合物的水合半径继续增大，说明溶液中的聚合物团聚规模进一步提高并逐渐从溶液中析出，直至温度达到39℃左右，聚合物的水合半径达到最大值并趋于稳定，说明聚合物已从水溶液中完全析出，此时氢键逐渐断裂，疏水性的异丙基基团暴露在聚合物链的外侧，聚合物在水溶液中发生相转变，从水溶液中析出，生成悬浊液。上述结果表明所制备的功能化温度敏感型聚合物具有良好的温度响应特性。
实施例2、功能化温度敏感型聚合物检测叠氮标记蛋白质
按照图6所示流程图采用实施例1中制备得到的功能化温度敏感型聚合物检测叠氮标记蛋白质，具体步骤如下：
(1)对蛋白质或其PTM进行叠氮标记：
通过细胞代谢标记方式；或使用体外酶催化标记方式。
●细胞代谢标记：HeLa细胞培养在37℃培养箱中，待密度合适后将培养基倒掉，使用PBS清洗3次，在含有10％胎牛血清和1％青链霉素混合液的10mL DMEM培养基中加入叠氮代谢试剂使其终浓度为200μM，代谢培养24h后使用10mL PBS清洗3 次，去除多余的叠氮代谢试剂，收集细胞后提取蛋白，得到叠氮标记的PTM蛋白。
●体外酶催化标记：称取适量含有O-GlcNAc修饰蛋白质的样品，使用20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)溶解，配制成浓度为3.5μgμL-1的蛋白溶液。
表1叠氮标记试剂及用量
按照表1中的顺序依次加入试剂盒中各种试剂，且每加一种试剂都要进行涡旋使其混合均匀后再加下一种试剂。最后管口封上封口膜，4℃过夜进行叠氮标记。 O-GlcNAc修饰蛋白质叠氮标记完后，依次在管中加入600μL甲醇，150μL氯仿，400 μL去离子水，涡旋混匀，14000g离心5min，用移液枪吸出上层溶液，从而除去过量的UDP-GalNAz，继续在管中加入450μL甲醇，涡旋混匀，14000g离心5min，用移液枪吸出上层溶液，用氮气将多余的甲醇吹干。最后将上述蛋白溶解于20μL 20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)中，-80℃冰箱保存备用。
(2)基于功能化温度敏感型聚合物的叠氮标记蛋白质WB检测：
利用功能化温度敏感型聚合物上修饰的三苯基磷与叠氮标记蛋白的施陶丁格连接反应，实现特异性结合。与其他固相/不溶性载体材料相比，该聚合物可完全溶解于水溶液中，与PVDF膜上的目标蛋白结合时，具有更小的空间位阻和界面传质阻力，从而有效提高与低丰度PTM蛋白的反应效率。此外聚合物上负载了大量的HRP，而且可通过温度响应引发聚合物自组装，进一步增加叠氮标记蛋白所在区域中HRP的含量，达到两级信号放大的目的，从而实现叠氮标记低丰度(PTM)蛋白质的超灵敏检测。
具体步骤如下：对蛋白质进行定量后，按照蛋白溶液：5倍浓度的SDS-PAGE上样缓冲液＝4：1的体积比例混合，配制成1μg/μL蛋白溶液。95℃水浴5min，冷却至室温，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白然后将蛋白转至PVDF膜上，使用1％(质量比)的BSA进行封闭1h。之后使用含有0.5mg/mL功能化温度敏感型聚合物的PBST 缓冲溶液(pH＝7.4)于室温(25℃)下孵育4h，使聚合物上的三苯基磷基团与蛋白质上的叠氮基团共价偶联，然后缓慢升温至40℃，使功能化温度敏感型聚合物与叠氮标记的目标蛋白共价结合并在相应条带处自组装聚集。并使用PBST缓冲溶液清洗6遍，除去非特异性吸附的功能化温度敏感型聚合物及其团聚，最后使用显影液进行化学发光检测和成像。
实施例3、利用功能化温度敏感型聚合物对叠氮标记O-GlcNAc修饰标准蛋白质进行检测
(1)按照实施例2中所述体外酶催化方法，对标准O-GlcNAc蛋白α-crystallin 进行叠氮标记。α-crystallin标准蛋白叠氮标记完成并纯化后，将其溶解于20mM Hepes 缓冲溶液(pH 7.9)中，-80℃保存备用。
(2)采用实施例2中所述的SDS-PAGE蛋白质分离、转膜和基于功能化温度敏感型聚合物的WB分析策略，对不同上样量的叠氮标记α-crystallin蛋白进行WB分析，所得结果如图7a所示。随叠氮标记α-crystallin的上样量从2μg降低至0.01μg，其在 WB检测中的条带灰度/强度也随之减弱，具有良好的信号响应，说明该策略可用于叠氮标记PTM蛋白的半定量分析。在上样量为0.01μg时，仍能鉴定到清晰的条带。与使用商业化的抗O-GlcNAc抗体(RL2)进行WB检测的结果相比(图7b)，商业化抗体需要2μg的α-crystallin蛋白才能达到类似的条带灰度/强度。此外，考虑到α-crystallin 蛋白只有一个主要的O-GlcNAc修饰位点，而且修饰蛋白的含量不超过10％。因此当上样量为0.01μg时，叠氮标记的O-GlcNAc修饰α-crystallin蛋白实际约为1ng。说明此功能化温度敏感型聚合物具有较高的WB检测灵敏度，比商业化抗体提高约100倍。
实施例4、使用功能化温度敏感型聚合物对混合蛋白质样本中叠氮标记O-GlcNAc修饰标准蛋白质进行检测
(1)按照实施例2中所述体外酶催化方法制备叠氮标记的标准O-GlcNAc修饰蛋白α-crystallin。
(2)按照实施例2中所述的SDS-PAGE蛋白质分离、转膜和基于功能化温度敏感型聚合物的WB分析策略，对叠氮标记的O-GlcNAc修饰α-crystallin和牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、碳酸酐酶混合物样本进行分析，所得结果如图8所示。由图可知， lane b是考马斯亮蓝染色后4种蛋白的凝胶成像，表明4种蛋白分布在20-66KDa分子量区域。lane c是将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上后，使用功能化温度敏感型聚合物进行检测后的结果。从图中可以明显看到PVDF膜上lane c只有叠氮标记的O-GlcNAc修饰α-crystallin被检测到，其他三种非标记的蛋白没有产生任何假阳性信号。上述结果证明了功能化温度敏感型聚合物对叠氮标记的修饰蛋白具有良好的检测选择性，其他非标记蛋白不会与功能化温度敏感型聚合物产生非特异性结合。
实施例5、使用功能化温度敏感型聚合物对复杂样本中叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白质进行检测
(1)按照实施例2中所述方法进行细胞代谢标记，得到叠氮标记的O-GlcNAc 修饰复杂蛋白质样本。
(2)按照实施例2中所述方法进行SDS-PAGE蛋白质分离、转膜和基于功能化温度敏感型聚合物的WB检测，所得结果如图9a所示。当蛋白上样量为10μg时，lane 2是未进行叠氮标记的蛋白，lane 3是进行叠氮标记的蛋白。lane 2中未检测到任何条带；而lane 3中检测到多条明显的蛋白质条带。同时随叠氮标记蛋白的上样量从10μg 降低至0.1μg，其在WB检测中的条带灰度/强度也随之减弱，且每条泳道中蛋白条带的灰度/强度与蛋白上样量大致成正比。上述数据说明三苯基磷与叠氮的生物正交反应在复杂蛋白质体系中仍然具有高度的特异性，功能化温度敏感型聚合物与非叠氮标记蛋白质无非特异性吸附，可以高选择性的鉴定叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白，并进行半定量分析。同时考虑到O-GlcNAc蛋白在总蛋白中的含量通常小于1％，当上样量为0.1μg时，叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白的实际含量小于1ng，说明此功能化温度敏感型聚合物在复杂样本中具有较高的检测灵敏度，可以在两个数量级的动态范围内提供纳克级别的O-GlcNAc蛋白半定量检测。与未进行加热处理的WB检测结果相比(图9b)，未加热处理的WB检测灵敏度明显降低，当蛋白上样量为5μg时，几乎检测不到蛋白质条带。两者检测灵敏度的差异主要因为功能化温度敏感型聚合物独有的温度诱导自组装行为，因为每个叠氮标记O-GlcNAc蛋白只能与一条携带多个HRP 的功能化温度敏感型聚合物聚合物链共价偶联，其信号放大有限。而当孵育温度升高时，功能化温度敏感型聚合物发生自组装，大量聚合物链聚集，大幅度增加了叠氮标记蛋白所在区域中HRP的含量；同时可通过反复洗涤除去与PVDF膜非特异性吸附的功能化温度敏感型聚合物及其自组装团聚，以防止产生假阳性信号。因此该功能化温度敏感型聚合物的温度响应能力可实现两级信号放大，检测灵敏度显著提高。
实施例6、使用功能化温度敏感型聚合物对O-GlcNAc水解酶抑制剂处理的复杂样本中叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白质进行检测
(1)按照实施例2中所述方法进行细胞叠氮代谢标记，并加入O-GlcNAc修饰水解酶(OGA)的抑制剂Thiamet G使其终浓度为50μM作为对照实验。代谢培养24h 后使用10mL PBS清洗3次，去除多余的叠氮代谢试剂，收集细胞后提取蛋白。
(2)采用实施例2中所述的方法进行SDS-PAGE蛋白质分离、转膜和基于功能化温度敏感型聚合物的WB分析，所得结果如图10a所示。Thiamet G可抑制OGA活性，从而提高蛋白质的O-GlcNAc修饰水平。如图10a使用抑制剂Thiamet G处理(lane 3)比未进行抑制剂Thiamet G处理(lane 2)得到的蛋白质条带的数量及灰度都明显增加，进一步证明了基于功能化温度敏感型聚合物的WB检测的可靠性和选择性。使用商业化的抗O-GlcNAc的抗体(RL2)检测抑制剂Thiamet G处理前、后的O-GlcNAc 修饰蛋白，得到类似的结果(图10b)，但信号强度明显减弱，再次证明功能化温度敏感型聚合物的检测高灵敏度。同时，比较图10a和图10b，功能化温度敏感型聚合物在10-55KDa区域内可检测到更多蛋白条带，说明其在检测低分子量O-GlcNAc修饰蛋白时具有明显优势，而RL2更偏向于检测高分子量的蛋白。这是由于RL2是以高分子量的核孔蛋白混合物为抗原而产生的抗体，而基于蛋白质/肽为抗原产生的PTM抗体往往存在氨基酸序列依赖性。而功能化温度敏感型聚合物对蛋白质PTM的识别是基于三苯基磷与叠氮的施陶丁格连接反应，不存在偏向性，因此检测灵敏度和选择性明显提高。
实施例7、使用功能化温度敏感型聚合物对复杂样本中叠氮标记新生蛋白质和棕榈酰化修饰蛋白质进行WB检测。
代谢标记底物AHA(L-azidohomoalanine)、Palmtic acid,azide可通过体内生物合成途径在新生蛋白质上或蛋白质棕榈酰化修饰上引入叠氮标签。
(1)细胞的叠氮代谢标记：HeLa细胞培养在37℃培养箱中，待密度合适后将培养基倒掉，用PBS清洗3次，在含有10％胎牛血清和1％青链霉素混合液的10mL DMEM 培养基分别加入AHA(L-azidohomoalanine)、Palmtic acid,azide两种叠氮代谢标记试剂使其终浓度为200μM。并加入相应抑制剂蛋氨酸使其终浓度为50μM，抑制AHA 的代谢标记作为对照实验。代谢培养4h后使用10mL清洗3次，去除多余的叠氮代谢试剂，收集细胞后提取蛋白。
(2)采用实施例2中所述的方法进行SDS-PAGE蛋白质分离、转膜和基于功能化温度敏感型聚合物的WB分析，所得结果如图11所示。如图11a所示，AHA标记后，使用功能化温度敏感型聚合物进行WB检测，在未加入叠氮标记抑制剂蛋氨酸的情况下可清晰的检测到叠氮标记蛋白质对应的条带；而加入抑制剂蛋氨酸之后则显著降低了相应修饰条带的灰度/强度。如图11b所示，Palmtic acid,azide标记后，使用功能化温度敏感型聚合物进行检测，在未使用氨水处理蛋白质样品去除蛋白质棕榈酰化修饰前，可清晰的检测到叠氮标记的棕榈酰化修饰蛋白质对应的条带；而加入氨水处理蛋白质样品后，相应条带的灰度/强度显著降低，多数条带完全消失。两种叠氮标记蛋白质样品使用功能化温度敏感型聚合物进行WB检测得到的结果与理论预期相符，说明该功能化温度敏感型聚合物对叠氮标记的多种蛋白质及其翻译后修饰具有良好的 WB检测效果和特异性，在蛋白质组和翻译后修饰组研究中具有广泛的应用潜力。

Claims (10)

1.一种聚合物，其特征在于：所述聚合物如式Ⅰ所示：
式Ⅰ中，R为CH2，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；为辣根过氧化物酶单元。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物为下述式Ⅰ-A所示聚合物，
式Ⅰ-A中，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；
为辣根过氧化酶单元。
3.权利要求1或2所述的聚合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到式Ⅱ所示温度敏感型聚合物；
所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺；
所述功能单体为丙烯酸或丁烯酸；
式Ⅱ中，R为CH2，r值为0或1，m为20～750之间的任意自然数，n为110～1120之间的任意自然数；
(2)式Ⅲ所示辣根过氧化物酶和式Ⅳ所示施陶丁格试剂发生亲核取代反应，得到式Ⅴ所示功能试剂；
(3)式Ⅱ所示温度敏感型聚合物与式Ⅴ所示功能试剂经氨基-羧基偶联反应，得到所述聚合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述温敏单体与所述功能单体的摩尔比为1：1～7：1；和/或，
所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸铵和过硫酸钠中任一种；所述引发剂的用量为所述温敏单体质量的5％～50％；和/或，
所述自由基聚合反应的温度为50～80℃，时间为8～12小时；和/或，
所述自由基聚合反应在水中进行；和/或，
所述自由基聚合反应在惰性气氛中进行；和/或，
步骤(2)中，式Ⅳ所示施陶丁格试剂与式Ⅲ所示辣根过氧化物酶的比例为(0.5～2)mM：(5～20)mg/mL；和/或，
所述亲核取代反应的温度为20～25℃，时间为0.5～2小时；和/或，
所述亲核取代反应在磷酸盐缓冲液与有机溶剂的混合液中进行；所述有机溶剂为二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺；所述磷酸盐缓冲液与所述有机溶剂的体积比为20：1～4：1；和/或，
步骤(3)中，所述温度敏感型聚合物与所述功能试剂的质量比为1：1～1：6；和/或，
所述氨基-羧基偶联反应的温度为20～25℃，时间为2～12小时；和/或，
所述氨基-羧基偶联反应在2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中进行。
5.权利要求1或2所述的聚合物在温度为33～45℃形成的自组装产物。
6.权利要求1或2所述的聚合物或权利要求5所述的自组装产物在利用蛋白质免疫印迹法对叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰分析检测中的应用。
7.利用权利要求1或2所述的聚合物或权利要求5所述的自组装产物采用蛋白质免疫印迹法对叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰进行分析检测的方法，其特征在于：所述方法通过所述聚合物中的三苯基磷与所述叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰中的叠氮基团之间的施陶丁格连接反应，与吸附于聚偏二氟乙烯膜上的叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰进行特异性结合，并利用所述聚合物的温度响应特性导致的自组装行为，实现所述叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰的检测分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)将叠氮标记蛋白质或其翻译后修饰样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭；
(2)将所述聚合物溶解于含有表面活性剂的缓冲溶液中，将其与聚偏二氟乙烯膜接触孵育进行所述施陶丁格连接反应，升高温度使所述聚合物在目标蛋白区域内自组装聚集；
(3)使用所述含有表面活性剂的缓冲溶液清洗聚偏二氟乙烯膜除去非特异性吸附的所述聚合物及其自组装，对清洗后的聚偏二氟乙烯膜进行化学发光检测。
9.用于蛋白质免疫印迹法的试剂盒，其活性成分为权利要求1或2所述的聚合物。
10.用于蛋白质翻译后修饰的蛋白质免疫印迹法的试剂盒，其活性成分为权利要求1或2所述的聚合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Nanobody Based Immunoassay for Human Soluble Epoxide Hydrolase Detection Using Polymeric Horseradish Peroxidase (PolyHRP) for Signal Enhancement: The Rediscovery of PolyHRP?;Li Dongyang et al;《ANALYTICAL CHEMISTRY》;20170606;第89卷(第11期);6248-6256 *

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